CN109666742B - 一种新的胃癌标志基因circ-CC2D1A的应用 - Google Patents

一种新的胃癌标志基因circ-CC2D1A的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新的胃癌标志基因circ‑CC2D1A的应用，涉及circ‑CC2D1A分子标志物的发现、检测、应用，设计并合成出特异性用于实时定量PCR的检测引物。针对目标人群对胃癌内镜筛查依从性差，以及临床上确诊的胃癌患者绝大多数都是中晚期的现状提出，在胃癌癌变进程中找到理想的分子预警信号，有针对性的进行内镜检查，病理确诊，以减轻病人痛苦，避免过度医疗，节省医疗资源。本发明发现血circ‑CC2D1A可作为胃癌患者淋巴结转移和监测预后的标志物。

Description

一种新的胃癌标志基因circ-CC2D1A的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体为一种新的胃癌标志基因circ-CC2D1A的应用。
背景技术
目前，胃癌仍然在全球癌症相关死亡排名第三位，是社会的主要健康负担之一。在中国，胃癌是第二大流行癌症，也是导致癌症死亡的第二大原因，2015年估计有679,100新病例和498,000人死亡。虽然手术技术和联合化疗方案有所进步，但在大多数国家，胃癌的5年总生存仍低于30％，因为缺乏胃癌早期诊断标志物。因此，有必要仔细探索胃癌相关分子特征，并开发出合理的胃癌早期检测方法。
环状RNA(circRNA)被认为是由线性前体mRNA的非经典剪接产生的，在病毒样感染性颗粒如类病毒、圆形卫星病毒及丁型肝炎病毒被广泛发现。环状RNAs似乎是错误的RNA剪接的结果，一直没发现它的关键作用和功能，直到最近才发现并且已经永久地改变了我们对癌症的观点，特别是癌变和癌症进展。迄今为止，在哺乳动物细胞中已经发现了一些内源性的circRNA，并且它们在肿瘤进展中可以高丰度存在以及进化保守性。另外，已经有大量研究证实环状RNA可能调节转录及操控microRNA的通路。有几种circRNA被认为是造成癌细胞恶性生物学行为的原因。然而，由于我们对于circRNA的理解是有限的，许多可以作为microRNA起作用的circRNA可能还没有被发现。越来越多的证据表明，circRNA可能在包括胃癌在内的癌症的发生和发展中起重要作用，并且可能成为癌症的新生标志物。Zhang J的团队发现circLARP4在胃癌组织中下调，并且通过扩增miR-424靶向作用于LATS1基因，抑制胃癌细胞的生物学行为，这是胃癌患者总生存的独立预后因素。
目前，现有技术中，通通过检测患者血液中CEA/CA199/CA153等肿瘤指标来评估患者的病情，这些指标特异性和灵敏性均较差。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种新的胃癌标志基因circ-CC2D1A的应用，针对目标人群对胃癌内镜筛查依从性差，以及临床上确诊的胃癌患者绝大多数都是中晚期的现状提出，在胃癌癌变进程中找到理想的分子预警信号，有针对性的进行内镜检查，病理确诊，以减轻病人痛苦，避免过度医疗，节省医疗资源。本发明发现血circ-CC2D1A可作为胃癌患者淋巴结转移和监测预后的标志物。
为了达到以上目的，本发明供如下技术方案：
本发明公开了一种新的胃癌标志基因circ-CC2D1A的应用，所述circ-CC2D1A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述circ-CC2D1A作为胃癌诊断和预后的标志物。
在本发明中，用于胃癌诊断的试剂为实时定量PCR试剂盒。
在本发明中，根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的circ-CC2D1A设计了2对引物用于检测该序列，引物核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
使用GAPDH作为内部对照，GAPDH(F)，5'-GCATCCTGGGCTACACTG-3'，核苷酸序列为SEQ ID NO.2；GAPDH(R)，5'-ACTTCAGGAGCATCTGAAATAGGT-3'，核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
使用引物对，上游引物:5'-GGACTGTAAGCGGAGCATGG-3'，核苷酸序列为SEQ IDNO.4。下游引物5'-GCAGGCGGCACTTGATGAC 5-3'，核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
本发明还公开了circ-CC2D1A的检测方法，RNA的提取、反转录和实时定量PCR。具体步骤包括，通过使用TRIzol试剂提取组织中总RNA，并且通过TIANamp Virus RNA试剂盒提取血浆中的总RNA。使用Prime-Script将RNA逆转录成cDNA TM一步法RT-PCR试剂盒，甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作内部对照。使用以下引物对：Forward primer:5'-GGACTGTAAGCGGAGCATGG-3'；Reverse primer；5'-GCAGGCGGCACTTGATGAC 5-3'.通过qRT-PCR确定circ-CC2D1A表达水平。使用GAPDH作为内部对照，使用引物对5'-GCATCCTGGGCTACACTG-3'(F)和5'-ACTTCAGGAGCATCTGAAATAGGT-3'(R)。使用ABI7500系统和SYBR Green PCR Master Mix进行所有qRT-PCR反应。为了准确验证GC组织中circ-CC2D1A表达的倍数变化，将计算的Ct值相对于从相同样品扩增的GAPDH(ΔCt＝Cttested-CtGAPDH)标准化，并且使用-ΔCt方法来估计变化的价值。每个样本重复三次，所有反应独立重复三次以确保所有数据的可重复性。circ-CC2D1A的Cutoff值为-13.49，当检测出的-ΔCt大于这个值时为胃癌，其特异性为56.45％，敏感性为87.1％。
本发明还公开了一种用于胃癌诊断的实时定量PCR检测试剂盒，包括根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的circ-CC2D1A分子标志物设计并合成出特异性用于实时定量PCR的检测引物。
在本发明中，进一步的，所述特异性引物包括SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQID NO.5所示的下游引物。
本发明还公开了一种用于胃癌诊断的分子标志物，所述分子标志物为核苷酸序列为SEQ ID NO.1的circ-CC2D1A分子标志物。
用于检测circ-CC2D1A分子标志物的特异性引物，所述特异性引物包括SEQ IDNO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物。
本发明具有如下优点：
(1)提出了circ-CC2D1A的用途。(2)环状RNA具有机构稳定、丰度度和组织特异性表达等特征。且circ-CC2D1A在胃癌与癌旁组织中表达量存在差异，并且与淋巴结转移相关，因此circ-CC2D1A具有成为胃癌生物标志物的应用前景。
本发明是针对目标人群对胃癌内镜筛查依从性差，以及临床上确诊的胃癌患者绝大多数都是中晚期的现状提出，在胃癌癌变进程中找到理想的分子预警信号，有针对性的进行内镜检查，病理确诊，以减轻病人痛苦，避免过度医疗，节省医疗资源。本发明发现血circ-CC2D1A可作为胃癌患者淋巴结转移和监测预后的标志物。
附图说明
图1，显示circ-CC2D1A来源于CC2D1Aexons 15-17，将扩增产物插入用于Sanger测序的T-载体中以确定它们的全长；
图2，用RNase R处理的GC细胞中circ-CC2D1A和CC2D1mRNA的丰度；
图3，circ-CC2D1A表达水平的表达显着高于GC患者的相邻非癌组织；
图4，ROC曲线已用于评估circ-CC2D1A潜在诊断价值，ROC曲线下面积(AUC)为0.7357；
图5，Kaplan-Meier总生存曲线显示具有高circ-CC2D1A表达的患者显示存活时间缩短；
图6，circ-CC2D1A在GC血液中表达水平的表达显着高于正常患者。
图中：**P<0.01，***P<0.0001。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明公开了一种新的胃癌标志基因circ-CC2D1A的应用，circ-CC2D1A分子标志物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述circ-CC2D1A作为胃癌诊断和预后的标志物。以下实验方法为具体实施例，实验结果如图1至图6所示。
1.RNA桑格测序
(1)将扩增产物插入用于桑格(Sanger)测序的T-载体中以确定它们的全长。设计不同的引物以确认circ-CC2D1的回剪接点。引物由Invitrogen公司(中国上海)合成，桑格测序由中国南京的Realgene公司完成。
2.RNase R消化
将2mg总RNA在37℃下温育20分钟，加入或不加入3U/mg RNase R，随后使用RNeasyMinElute试剂盒。
3.患者及病例筛选
从GC患者中共收集到62个GC组织和相应的相邻非肿瘤组织样品，所有组织样品均来自南京医科大学附属南京医院普外科(2012年1月至2017年12月期间)。所有入组患者在术前均行放疗和化疗，并将他们的组织样本立即储存在RNA固定试剂中，并立即放入-80℃冰箱中保存。配对的相邻非肿瘤组织需通过病理分析没有肿瘤细胞，并且定位在距离瘤体边缘5cm处。根据国际抗癌联盟的肿瘤-淋巴结转移(TNM)分期系统，所有肿瘤均准确分期。每位患者均签署书面知情同意书，当地医疗道德委员会批准了该研究方案。
本研究中GC癌症患者血样26例，正常人血样13例。
4.临床组织样本取样
(1)准备事项：
液氮罐(检查液氮容积，事先及时充装液氮)、冰盒、冰生理盐水、无菌无酶冻存管(分装好RNA保护液并编号备用)、消毒手套(不含滑石粉)、口罩、帽子、镊子、剪刀、低温记号笔等。
(2)操作流程：
A.确定在患者术前已留取其血液样本，并按照血液样本提取流程处理，后将提取的血清移入Greiner冻存管中并以红色低温记号笔标记编号，保存于低温冰箱，并记录于病例资料表及其电子版本中。
B.预先填写组织标本病例资料表(记录有效的联系方式以便于随访)，注意填写内容的完整性。预先确定留取癌与癌旁组织的冻存管的编号，并将其编号记录于病例资料表中。
C.组织离体后立即置于弯盘中，迅速用冰盐水冲淋(低温可暂时抑制RNA酶活性以争取取样时间；洗涤组织样本中混杂的血液，减少污染；维持组织样本的渗透性以利于RNA保护液迅速渗透并发挥抑酶作用)。
D.选取胃粘膜组织并将其分解成约黄豆大小的小块分装，注意取样顺序：取2～4块癌旁正常组织和2～4块肿瘤组织，厚度不超过5mm,先取正常组织，再取肿瘤组织，一根冻存管仅适宜存放一块样本，勿混淆肿瘤与瘤旁正常组织的冻存管编号。
E.取样完成后拧紧冻存管(如未旋紧瓶盖液氮渗入冻存管中，常温状态下取出冻存管时易引发冻存管爆裂)，轻柔倒置并摇晃冻存管，使组织与保护液混匀，后迅速置于液氮罐中。
F.检查组织标本病例资料表填写是否完善，在《冰箱标本定位表》中预先确定并录入样本在深低温冰箱中的存储位置，及时将液氮罐中的样本移入深低温冰箱。避免因疏忽遗忘，导致液氮挥发殆尽后样本浪费不可用。
G.术后一周追踪病理报告结果，并及时录入病例资料表中，确定样本是否能够入组研究。
5.RNA的提取、反转录和实时定量PCR
通过使用TRIzol试剂提取组织中总RNA，并且根据制造商的说明书通过TIANampVirus RNA试剂盒提取血浆中的总RNA。使用Prime-Script将RNA逆转录成cDNA TM一步法RT-PCR试剂盒，甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作内部对照。使用以下引物对：Forwardprimer:5'-GGACTGTAAGCGGAGCATGG-3'；Reverse primer：5'-GCAGGCGGCACTTGATGAC 5-3'。通过qRT-PCR确定circ-CC2D1A表达水平。使用GAPDH作为内部对照，使用引物对5'-GCATCCTGGGCTACACTG-3'(F)和5'-ACTTCAGGAGCATCTGAAATAGGT-3'(R)。使用ABI7500系统和SYBR Green PCR Master Mix进行所有qRT-PCR反应。为了准确验证GC组织中circ-CC2D1A表达的倍数变化，将计算的Ct值相对于从相同样品扩增的GAPDH(ΔCt＝Cttested-CtGAPDH)标准化，并且使用-ΔCt方法来估计变化的价值。每个样本重复三次，所有反应独立重复三次以确保所有数据的可重复性。circ-CC2D1A的Cutoff值为-13.49，当检测出的-ΔCt大于这个值时为胃癌，其特异性为56.45％，敏感性为87.1％。
实验操作步骤：
(1)Trizol提取组织RNA：
A.戴口罩及手套，打开4℃低温离心机，设置好温度备用。计算所需提取的样本数，准备双份数量的1.5ml无菌无酶EP管，置于EP管架上备用。
B.研磨器皿中倒入适量液氮预冷，取50-100mg组织置入液氮中，研磨组织至粉末状。
C.加入1ml Trizol到研磨器皿中，继续研磨凝固状的组织与Trizol的混合物。
D.静置待其液化，转移至Rnase free 1.5ml EP管中。
E.室温下静置5min,每1ml Trizol加入200ul氯仿。
F.剧烈震荡15s，室温下静置2-3min。
G.4℃，12000g-14000g，离心15min。
H.转移水相至新的Rnase free 1.5ml EP中，每1ml Trizol加入500ul异丙醇，室温放置10min。
I.4℃，12000g，离心10min。预配清洗RNA的75％乙醇(需用DEPC水配制)。
J.小心弃去上清，每管加入至少1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，涡旋混合。
K.4℃，7500-10000g，离心5-10min。小心弃去上清。
L.风干RNA沉淀(风干后RNA为无色)，使用DEPC-水溶解沉淀(依据沉淀大小加入10-80ul左右)，用枪头吸打吹匀。
(2)Trizol提取细胞RNA：
A.待提取细胞用PBS清洗两遍。
B.加入适量Trizol到培养器皿中(小瓶/六孔板每孔1ml,大皿3ml,大瓶5ml)。
C.反复吹打几次，转移至Rnase free 1.5ml EP管中。
D.室温下静置5min,每1ml Trizol加入200ul氯仿。
E.剧烈晃动15s，室温下静置2-3min。
F.4℃，12000-14000g，离心15min。
G.转移水相至新的Rnase free 1.5ml EP中，每1ml Trizol加入500ul异丙醇，室温放置10min。
H.4℃，12000g，离心10min。
I.弃去上清，加入至少1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，涡旋混合。
J.4℃，7500-10000g，离心5-10min。
K.风干RNA沉淀，使用DEPC-水溶解沉淀(依据沉淀大小加入10-80ul左右)。
(3)检测所提取的样本RNA浓度：
A.按照1％浓度在新的Rnase free200ul EP管中配置每个待测样本(每个待检测样本1ul+99ulDEPC水)。
B.打开紫外分光光度计，清洗比色皿，取100ulDEPC水设置空白对照。
C.依次注入待测样本检测并记录样本浓度、OD260/280比值。
(4)RNA逆转录：
A.从-20℃冰箱中取出逆转录试剂盒，将2种酶插入冰盒冰中，其它试剂冰上融化，RNase Free水常温融化备用。
B.根据所测RNA浓度，计算逆转录每管所需RNA体积，并同时计算出DEPC水体积。
C.取PCR管架置于冰上，按需要放入无菌无酶200ul PCR管并按编号标记。移液器吸取适量RNA后，将枪头垂直插入PCR管底，匀速轻柔打出液体。
D.移液器吸取适量DEPC水，枪头贴着后壁打入PCR管内。
E.逆转录Step1：每管加入gDNA Eraser 1ul及5x gDNA Eraser Buffer 2ul。
F.置于八联管离心机上，轻轻弹掉管底或管壁气泡，短时离心。
G.RT-PCR仪上42℃2分钟,反应后产物置于冰上备用。
H.逆转录Step2：取1.5ml EP管，按照以下配方，配置每管反应Mix
Figure BDA0001964090320000061
设定反应条件：37℃，15min；85℃，5sec；4℃维持。
I.扣紧管盖，将其从管架上取下来，置于离心管架上，有气泡者可轻弹管底，短时离心，确认每管的液平一致且管内无气泡后，复置于冰上。
J.设置反应条件：37℃，15min；85℃，5sec；4℃维持。上机操作，15-20min后将cDNA置于-20℃保存。
(5)qRT-PCR步骤：
A.准备好冰盒，从-20℃冰箱中取出待测样本的cDNA、引物、PCR试剂，冰上解冻。
B.备好八联管及管盖、八联管架、镊子、无菌1.5ml EP管、EP管架、适宜量程的移液器、无菌薄膜手套。
C.将解冻好的cDNA、引物、PCR试剂先依次短时振荡离心，冰上静置备用。
D.依据检测样本及指标数量，划分不同目的基因加样区域。将八联管架置于冰上，用镊子夹取八联管并将其铺置于八联管架上。
E.取1.5ml EP管，按以下每孔19ul配制八联管PCR Mix，并震荡离心。
F.按预设好每个样本及复孔在八联管的位置，依次加入样本的1ul cDNA及19ulPCR Mix。
G.离心去气泡，上机操作，设置反应条件。
(6)qRT-PCR反应体系：
Figure BDA0001964090320000071
(7)qRT-PCR反应条件：
Figure BDA0001964090320000072
Figure BDA0001964090320000081
6、数据分析：
实验结果如图1-图6所示，如表1、表2所示，采用t检验和卡方检验及生存分析的方法circ-CC2D1A与胃癌患者临床分期资料及预后的相关性。进行受试者工作特征(ROC)曲线来评估其诊断价值。所有统计分析均使用SPSS for Windows v.17.0进行。对于所有结果，P<0.05被认为有统计学意义。
表1.circ-CC2D1A的表达与淋巴结呈正相关
Figure BDA0001964090320000082
Figure BDA0001964090320000091
*P<0.05
表2，综合生存的单变量和多变量分析
Table 2.Univariate and multivariate analysis for overall survival
Figure BDA0001964090320000092
*P＜0.05
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏万成生物医学研究院有限公司
<120> 一种新的胃癌标志基因circ-CC2D1A的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aggactgtaa gcggagcatg gacattctga agcaagcctt cgtccggggt ctccccacgc 60
ccaccgcccg ctttgagcaa aggaccttca gcgtcatcaa gtgccgcctg cccctgtcaa 120
caaggacgac tttgccctgg tccagcggcc tggcccgggt ctgtctcagg aggccgcccg 180
gcgctatggt gaactcacca 200
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gcatcctggg ctacactg 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
acttcaggag catctgaaat aggt 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ggactgtaag cggagcatgg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gcaggcggca cttgatgac 19

Claims (4)

1.一种定量检测血液中circ-CC2D1A表达水平的试剂在制备胃癌诊断试剂中的应用，所述circ-CC2D1A的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所述circ-CC2D1A作为胃癌诊断和预后的标志物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂为实时定量PCR试剂盒。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述试剂包括核苷酸序列为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的引物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述定量检测血液中circ-CC2D1A表达水平，包括RNA的提取、反转录和实时定量PCR。
CN201910094144.0A 2019-01-30 2019-01-30 一种新的胃癌标志基因circ-CC2D1A的应用 Active CN109666742B (zh)

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