CN106947812A

CN106947812A - 一种基于spexin的胃癌诊断试剂盒及其应用

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Publication number: CN106947812A
Application number: CN201710164853.2A
Authority: CN
Inventors: 陈卫东; 吕双瑜; 王艳东; 吕心瑞; 聂小博; 程小霞
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2017-03-20
Filing date: 2017-03-20
Publication date: 2017-07-14
Anticipated expiration: 2037-03-20
Also published as: CN106947812B

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒及其应用。所述试剂盒包括引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ、探针引物Ⅴ、探针引物Ⅵ、试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ以及溶液组。操作步骤如下：从胃组织或血液中抽提总RNA；检测样本和对照中SPEXIN的表达水平；分别对样本和对照中SPEXIN的表达水平进行评估。本发明提供了一种基于SPEXIN可用于检测受试者，是否患有胃癌的诊断试剂盒和该试剂盒的相关检测方法，可用于检测胃癌，具体的，以基因SPEXIN表达量变化作为胃癌早期诊断标志；作为胃癌预后判断标志以及作为胃癌治疗检测的辅助标志，该方法灵敏度高、特异性强、操作简便，有利于胃癌的诊治。

Description

一种基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒及其应用。

背景技术

利用分子生物学技术，能够有效地进行分子水平检测和诊断，进而为早期治疗这些疾病提供便利。

胃癌(gastric cancer或stomach cancer)在世界上的恶性肿瘤中占第二位，在我国居各类恶性肿瘤之首。因为胃癌起病隐匿，发病早期症状不明显，不易被觉察，使得胃癌早期发现困难，并且早期诊断率较低。尽管诊断技术在不断提高，以手术治疗为主的综合治疗手段越来越丰富，但胃癌仍是全球主要癌症致死疾病之一，总体疗效依然较差。由于以胃镜为基础的早期胃癌筛查依赖于检查者的经验，且有一定的创伤风险，导致其无法推广。目前临床上常用的生物大分子肿瘤标志物如癌胚抗原(CEA)，糖蛋白类抗原(CA19-8、CA72-4、CA125)能提高体内胃肠道恶性肿瘤的检出率，但这些标志物并不能高灵敏度、高特异性地诊断胃癌。

近年来，随着分子遗传学和分子生物学的不断发展以及基因工程技术的不断进步，基因的诊断和治疗已逐步成为一种新的肿瘤诊断和治疗手段。近年来，胃癌的基因诊断和基因治疗在基础研究方面已经取得了较明显的进展。肿瘤基因标志指基因的异常表达和本身突变，可反映癌症发病前或发病过程中的相关变化，因此，敏感性和特异性理想的肿瘤基因作为标志物可尽早的发现肿瘤疾病的发生，亦可以作为监测疾病发展指标，在提高肿瘤治愈率方面将有重要意义。

人SPEXIN蛋白最早是由Mirabeau等人通过Markov modeling analysis方法从人蛋白组序列中发现的。人SPEXIN基因(Ch12,orf39；～17,333bp)位于染色体12p12.1。研究发现SPEXIN蛋白参与多种生理功能的调节。SPEXIN参与金鱼生殖和食欲调节，参与啮齿类动物的血管/肾功能和痛觉调节，循环系统SPEXIN的水平与肥胖儿童呈负相关。迄今为止，SPEXIN基因或蛋白对胃癌的作用尚未见报道。

发明内容

本发明为解决胃癌检测灵敏度低、特异性差的技术问题，公开了一种基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒，所述试剂盒包括引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ、探针引物Ⅴ、探针引物Ⅵ、试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ以及溶液组。

所述的SPEXIN指SPEXIN基因、SPEXIN蛋白质、SPEXIN多肽及SPEXIN蛋白的功能类似物。

所述溶液组包括溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e、溶液f、溶液g、溶液h、溶液i、溶液j、溶液k、溶液l、溶液m、溶液n、溶液o、溶液p、溶液q；

所述SPEXIN蛋白质和SPEXIN多肽均含有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

所述引物Ⅰ的序列如SEQ ID NO：1所示，引物Ⅱ的序列如SEQ ID NO：2所示，引物Ⅲ的序列如SEQ ID NO：3所示，引物Ⅳ的序列如SEQ ID NO：4所示，探针引物Ⅴ的序列如SEQID NO：6所示，探针引物Ⅵ的序列如SEQ ID NO：7所示。

基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒的应用，操作步骤如下：

(1)从胃组织或血液中抽提总RNA；

(2)检测样本和对照中SPEXIN的表达水平；

(3)分别对样本和对照中SPEXIN的表达水平进行评估。

所述步骤(1)中胃组织为胃癌组织或癌旁组织。

所述步骤(2)中，检测SPEXIN样本和对照中的表达水平的方法为PCR、逆转录PCR或实时定量PCR，操作为：将步骤(1)制备的总RNA反转录成的cDNA作为模板，以引物Ⅰ和引物Ⅱ为模板时的检测结果作为对照、以引物Ⅲ和引物Ⅳ为模板时的检测结果作为样本。

所述步骤(2)中，检测SPEXIN样本和对照中的表达水平的方法为Northern印迹，其中基因探针为探针引物Ⅴ和探针引物Ⅵ。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种基于SPEXIN可用于检测受试者，是否患有胃癌的诊断试剂盒和该试剂盒的相关检测方法，可用于检测胃癌，具体的，以基因SPEXIN表达量变化作为胃癌早期诊断标志；作为胃癌预后判断标志以及作为胃癌治疗检测的辅助标志，该方法灵敏度高、特异性强、操作简便，有利于胃癌的诊治。

(2)本发明首次公开了SPEXIN与胃癌的相关性，为以SPEXIN为基础的临床诊断提供依据。

附图说明

图1为正常组与胃癌组SPXIN基因表达量的统计结果图。

具体实施方式

所述溶液组包括溶液a、溶液b、溶液c、溶液d、溶液e、溶液f、溶液g、溶液h、溶液i、溶液j、溶液k、溶液l、溶液m、溶液n、溶液o、溶液p、溶液q。

基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒的应用，操作步骤如下：

(1)从胃组织或血液中抽提总RNA；

(2)检测样本和对照中SPEXIN的表达水平；

(3)分别对样本和对照中SPEXIN的表达水平进行评估。

所述步骤(1)中胃组织为胃癌组织或癌旁组织。

本发明将在下面的实施例中进一步描述，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1基于SPEXIN基因的检测胃癌患者诊断试剂盒的制备(100次反应)

根据SPEXIN基因的表达丰度与胃癌的相关性，可以通过检测SPEXIN基因的表达水平作为胃癌诊断的辅助指标。基于此，本发明提供了一种检测SPEXIN基因表达的胃癌诊断试剂盒，该诊断试剂盒的主要组分包括：扩增SPEXIN基因和beta-actin基因的引物对、SYBRGreen PCR反应体系。扩增SPEXIN基因引物对：正向引物序列，如SEQ NO：3所示；反向引物序列，如SEQ NO：4所示；扩增产物的长度为306bp。扩增beta-actin基因引物对：正向引物序列，如SEQ NO：1所示；反向引物序列，如SEQ NO：2所示；扩增产物的长度为434bp。探针引物序列，如SEQ NO：7和SEQ NO：8所示。实时定量PCR诊断法还包含溶液(a至g)；Northern印迹诊断法包含溶液(h至r)和试剂(Ⅰ至Ⅲ)。

本试剂盒所包含的试剂及其含量如表1所示：

表1.基于SPEXIN基因的检测胃癌患者诊断试剂盒成分

实施例2胃癌组织中SPEXIN mRNA的检测(实时定量PCR)

(1)胃癌组织的收集与保存：收集河南大学淮河医院科2013-2015年间胃癌病人标本，胃癌组织及癌旁组织数对，分别置于1.5mL的RNase/DNase-free离心管中，经液氮桶转移至–80℃低温冰箱保存。

(2)胃癌组织RNA的提取：常规方法提取受试者待测组织mRNA。[Sambrook J,萨姆布鲁克,Russell DW,et al.,分子克隆实验指南.2002:科学出版社.]，具体地：

①取胃癌和癌旁组织(约50mg)，加入溶液a 1000μL，组织破碎，室温放置5min；

②每管(1.5mL PE管灭菌)加入100μL的溶液b(TRI Reagent体积的1/10)，涡旋混匀15sec；

③室温放置8min后，4℃下12000g离心15min；

④取上清，加入等体积的溶液c，颠倒混匀10余次，室温静置10min，4℃下12000g离心10min；

⑤吸除上清后，加入1mL溶液d，轻吹悬浮清洗RNA，4℃下7500g离心5min，洗两遍；

⑥吸除上清液后，置于超净工作台中干燥5min左右；

⑦加入适量溶液e(20～50μL)溶解RNA，置于55℃水浴10min，转弹管壁，点离。

⑧用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，确保OD260/280比值在1.8-2.0之间，贮存—80℃备用。

(3)逆转录得到cDNA：取2μg总RNA作为模板进行逆转录合成cDNA，采用25μL反应体系，在PCR管中加入溶液f和2μg总RNA，用溶液e使之补齐至25μL。

将上述反转录体系置于PCR仪中，42℃延伸1.5h，95℃ 5min灭火反转录酶，得到cDNA在–20℃条件下保存。

(4)实时定量PCR：采用20μL反应体系，每个样品设置3个复孔，以保证结果的可靠性。所有反应体系均在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行。

外参基因反应体系：

SPEXIN基因反应体系：

操作时，保证所有试剂都在冰上操作，按照上述反应体系用移液枪将PCR反应液加入到PCR管中，封盖后，放入ABI 7500荧光定量PCR仪中进行扩增，PCR扩增程序设定如下：

其中，从步骤2至步骤4持续40个循环。

(5)数据分析：以SBYR Green作为荧光定量标记物，通过溶解曲线和电泳确定目的条带。测得样品SPEXIN基因扩增的CT值以外参基因的CT值进行校正。计算方法采用2^-ΔΔCT法。ΔΔCT＝(CT1-CT2)-(CT3-CT4)，CT1指胃癌组织样品SPEXIN基因扩增的CT值；CT2指胃癌组织样品外参基因beta-actin扩增的CT值；CT3指癌旁组织/正常组织样品SPEXIN基因扩增的CT值；CT2指癌旁/正常组织样品外参基因beta-actin扩增的CT值。数据利用SPSS16.0软件进行分析，P<0.05认为差异具有显著性。

表2实时定量PCR检测胃癌组织和正常组织SPEXIN mRNA的表达水平(部分病例)

样品编号	胃癌	SPEXIN相对表达水平
			1	–	0.372
2	–	0.996
			3	–	0.812
4	–	0.852
			5	–	1.466
6	–	1.502
			7	+	0.076
8	+	0.305
			9	+	0.992
10	+	0.056
			11	+	0.101
12	+	0.114
			……

注：“–”表示正常组织；“+”表示胃癌组织。

实施例3胃癌组织中SPEXIN mRNA的检测(Northern印迹)

(1)总RNA提取:

受试者组织中总RNA提取采用TRIzol方法(详见实施例2的操作步骤说明),紫外分光度计测定总RNA浓度。

(2)制备变性胶：取试剂Ⅰ0.2g，加入溶液h12.4mL，加热熔化，加入溶液I 4.0mL、溶液j 3.6mL，混匀、制胶。胶凝固后，置5倍稀释的溶液i中预电泳5min。

(3)电泳：取总RNA 4.5μL(30μg)，加入4.0μL溶液i，3.6μL溶液j，10μL溶液k，65℃温育15min，冰浴5min。然后加入1μL溶液l，2μL溶液m，上样，50V电泳，2h。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录条带的位置(离加样孔的距离)。

(4)SPEXIN基因探针制备

合成SPEXIN基因探针引物，引物Ⅴ序列如SEQ：7所示；引物Ⅵ序列如SEQ：8所示。应用地高辛(DIG)进行SPEXIN基因探针的标记，取1μL胃组织cDNA进行PCR反应，PCR反应体系20μL，包括17μL溶液n；1μL溶液o；1μL引物Ⅴ(10μM)；1μL引物Ⅵ(10μM)。PCR反应条件：(1)95℃ 3min；(2)95℃ 30sec；(3)55℃ 30sec；(4)72℃1min；(5)72℃ 5min；其中，从步骤(2)至步骤(4)持续35个循环。

所得的产物纯化后，取2μL扩增产物，稀释5倍后在尼龙膜上点样，用化学发光法检测探针标记效率。

(5)Northern印迹测定mRNA的表达

①用传统毛细管将RNA转移至尼龙膜上；

②尼龙膜经紫外交联，80℃固定RNA 30min；

③用化学发光法检测杂交信号，加入5mL溶液p预杂交30min；

④将已经制备好的SPEXIN基因探针(浓度100ng/mL)加入杂交液(即溶液p)中，68℃杂交过夜，用5mL溶液q洗膜3次，用溶液r封闭；

⑤用溶液r按1∶5000的比例稀释试剂Ⅱ，将膜置于稀释后的抗体溶液中，室温下孵育30min，加1mL试剂Ⅲ；

⑥将膜放入暗盒中，用X胶片压片、显影，观察并拍摄，利用图像分析系统，检测SPEXIN的灰度值，以反映SPEXIN mRNA水平的变化。

结果表明，胃癌患者组织中SPEXIN mRNA相对表达量如表2所示。统计分析结果显示，与正常组相比，胃癌组SPXIN基因表达量明显下调，表达水平仅为正常组织的30％；差异具有统计学意义，P<0.05，参见图1。经临床进一步验证，该病例确实患有胃癌，说明，本发明制备的试剂盒的检测结果与临床检测结果一直。据此推断本试剂盒可以区分病人是否患有胃癌，可为进一步临床治疗提供线索和参考指标。此可见，SPEXIN基因可作为胃癌诊断的一个标志。

以上所述的实施例和具体实施方案对本发明做了相近的描述,但这并不能限制本发明的保护范围。对于本领域的技术人员，在本发明的基础上进行的若干改进或修改，也在本发明所要求的权利保护范围之内。

<110> 河南大学

<120> 一种基于SPEXIN基因的胃癌诊断试剂盒及其应用

<160> 7

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

acagagcctc gcctttgc 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

aggtctcaaa catgatctgg gt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

tcctgcaatg aagctccctg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

ctctccaaca gtctctgcgg 20

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 5

Met Lys Gly Leu Arg Ser Leu Ala Ala Thr Thr Leu Ala Leu Phe Leu

1 5 10 15

Val Phe Val Phe Leu Gly Asn Ser Ser Cys Ala Pro Gln Arg Leu Leu

20 25 30

Glu Arg Arg Asn Trp Thr Pro Gln Ala Met Leu Tyr Leu Lys Gly Ala

35 40 45

Gln Gly Arg Arg Phe Ile Ser Asp Gln Ser Arg Arg Lys Asp Leu Ser

50 55 60

Asp Arg Pro Leu Pro Glu Arg Arg Ser Pro Asn Pro Gln Leu Leu Thr

65 70 75 80

Ile Pro Glu Ala Ala Thr Ile Leu Leu Ala Ser Leu Gln Lys Ser Pro

85 90 95

Glu Asp Glu Glu Lys Asn Phe Asp Gln Thr Arg Phe Leu Glu Asp Ser

100 105 110

Leu Leu Asn Trp

115

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

ccctgtggac tcccaaactc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

tctctccaac agtctctgcg 20

Claims

1.一种基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒，其特征在于：所述基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒包括引物Ⅰ、引物Ⅱ、引物Ⅲ、引物Ⅳ、探针引物Ⅴ、探针引物Ⅵ、试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ以及溶液组；所述的SPEXIN指SPEXIN基因、SPEXIN蛋白质、SPEXIN多肽及SPEXIN蛋白的功能类似物；所述引物Ⅰ的序列如SEQ ID NO：1所示，引物Ⅱ的序列如SEQ ID NO：2所示，引物Ⅲ的序列如SEQ ID NO：3所示，引物Ⅳ的序列如SEQ ID NO：4所示，探针引物Ⅴ的序列如SEQ IDNO：6所示，探针引物Ⅵ的序列如SEQ ID NO：7所示。

2.如权利要求1所述的基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒，其特征在于：所述SPEXIN蛋白质和SPEXIN多肽均含有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒的应用，其特征在于，操作步骤如下：

（1）从胃组织或血液中抽提总RNA；

（2）检测样本和对照中SPEXIN的表达水平；

（3）分别对样本和对照中SPEXIN的表达水平进行评估。

4.如权利要求3所述的基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒的应用，其特征在于：所述步骤（1）中胃组织为胃癌组织或癌旁组织。

5.如权利要求3所述的基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒的应用，其特征在于：所述步骤（2）中，检测SPEXIN样本和对照中的表达水平的方法为PCR、逆转录PCR或实时定量PCR，操作为：将步骤（1）制备的总RNA反转录成的cDNA作为模板，以引物Ⅰ和引物Ⅱ为模板时的检测结果作为对照、以引物Ⅲ和引物Ⅳ为模板时的检测结果作为样本。

6.如权利要求3所述的基于SPEXIN的胃癌诊断试剂盒的应用，其特征在于：所述步骤（2）中，检测SPEXIN样本和对照中的表达水平的方法为Northern印迹，其中基因探针为探针引物Ⅴ和探针引物Ⅵ。