CN113729008A - 一种粪便保存液、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供的粪便保存液，包括三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、乙醇和余量的去离子水，本申请提供的粪便保存液，具有不同作用试剂，可以对粪便中人体脱落细胞起到有效保护作用，防止脱落细胞进一步降解，以便于进行针对脱落细胞的下一步检测；且能有效保存粪便样本中脱落细胞，可以在常温下长时间保存样本，有效抑制样本中细胞受损、核酸降解以及微生物活性，不影响后续检测。另外，本申请还提供了一种粪便保存液的制备方法及其应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种粪便保存液、制备方法及其应用。
背景技术
结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤，在中国其发病率和死亡率均位居前列。我国每年新发结直肠癌患者约38万人，因肠癌死亡人数高达18万。由于结直肠癌早期症状不明显，初次确诊时20％的患者就已发生癌转移，未发生转移的结直肠癌患者经过积极治疗后5年生存率高达90％，一旦发生转移，其5年生存率降为10％。由此可见结直肠癌的早期诊断尤为重要。
当前阶段，高通量测序技术的运用进一步推动了结直肠癌早期诊断的发展。通过血液和粪便两种途径均可获得人的基因，但癌细胞直接脱落进入粪便比直接进入血液早，所以从粪便样本中提取脱落细胞的DNA能更早的进行结直肠癌的初筛普查。
而粪便中含有大量复杂的成分，如蛋白酶、DNA酶等各种核酸降解酶使得粪便样本中的细胞及核酸容易受到破坏和降解。目前常用的保存方法是将样本采集后置于-20℃或者更低的温度中，以避免脱落细胞的降解或其它生化反应，但样本在采集过程中到低温保存仍避免不了在常温中放置，从而导致脱落细胞的进一步损失，提取失败影响后续的检测。目前的粪便样本保存方法存在保存时间短，保存后样本可利用率不高，保存条件苛刻等缺陷。
发明内容
鉴于此，有必要针对现有技术存在的缺陷提供一种能有效保存粪便样本中脱落细胞的粪便保存液。
为解决上述问题，本发明采用下述技术方案：
本申请提供了一种粪便保存液，包括：三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、乙醇和余量的去离子水。
在其中一些实施例中，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1-0.5mol/L。
在其中一些实施例中，所述乙二胺四乙酸的浓度为0.02-0.05mol/L。
在其中一些实施例中，所述氯化钠的浓度为0.1-0.2mol/L。
在其中一些实施例中，所述聚乙二醇辛基苯基醚的体积浓度为1％-2％。
在其中一些实施例中，所述乙醇的体积浓度为5-10％。
另外，本申请还提供了一种所述的粪便保存液的制备方法，包括下述步骤：
将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚及乙醇和溶解于去离子水中；
将上述溶液进行过滤得到所述粪便保存液。
此外，本申请还提供了一种所述的粪便保存液的应用方法，所述粪便保存液用于保存人体粪便。
本申请采用上述技术方案具备下述效果：
本申请提供的粪便保存液，包括三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、乙醇和余量的去离子水，本申请提供的粪便保存液，具有不同作用试剂，可以对粪便中人体脱落细胞起到有效保护作用，防止脱落细胞进一步降解，以便于进行针对脱落细胞的下一步检测；且能有效保存粪便样本中脱落细胞，可以在常温下长时间保存样本，有效抑制样本中细胞受损、核酸降解以及微生物活性，不影响后续检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1中样本提取后荧光定量PCR检测β-actin的扩增曲线。
图2为本申请实施例2中样本提取后荧光定量PCR检测β-actin的扩增曲线。
图3为本申请对照例1中样本提取后荧光定量PCR检测β-actin的扩增曲线。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本申请提供的粪便保存液，包括：三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(NaCl)、聚乙二醇辛基苯基醚(TX-100)、乙醇和余量的去离子水。
在其中一些实施例中，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1-0.5mol/L。
可以理解，所述三羟甲基氨基甲烷可以作为细胞缓冲液，为人体脱落细胞提供了合适的存储环境，防止脱落细胞破裂、核酸降解。
在其中一些实施例中，所述乙二胺四乙酸的浓度为0.02-0.05mol/L。
可以理解，所述乙二胺四乙酸作为金属离子螯合剂可以使微量金属离子被螯合有效抑制酶的活性。
在其中一些实施例中，所述氯化钠的浓度为0.1-0.2mol/L。
可以理解，氯化钠作为离子强度维持剂可有效维持总离子强度的稳定。
在其中一些实施例中，所述聚乙二醇辛基苯基醚的体积浓度为1％-2％。
可以理解，所述聚乙二醇辛基苯基醚作为细胞固定剂可以固定粪便样本中的脱落细胞。
在其中一些实施例中，所述乙醇的体积浓度为5-10％。
可以理解，乙醇作为抑菌剂可有效抑制微生物滋生。
本申请还提供了一种所述的粪便保存液的制备方法，包括下述步骤：
将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚及乙醇和溶解于去离子水中；将上述溶液进行过滤得到所述粪便保存液。
所述粪便保存液用于保存人体粪便。
本申请提供的粪便保存液，具有不同作用试剂，可以对粪便中人体脱落细胞起到有效保护作用，防止脱落细胞进一步降解，以便于进行针对脱落细胞的下一步检测；且能有效保存粪便样本中脱落细胞，可以在常温下长时间保存样本，有效抑制样本中细胞受损、核酸降解以及微生物活性，不影响后续检测。
以下结合具体实施例对本申请上述技术方案进行进一步描述。
实施例1
本实施例提供了一种人粪便中脱落细胞的保存液及其应用，包括：0.2mol/L的Tris、0.025mol/L的EDTA、0.14mol/L的NaCl、1.5％的曲拉通X-100、5％的乙醇和去离子水。
所述的粪便中脱落细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
1)分别将200摩尔份的Tris、25摩尔份的EDTA、140摩尔份的NaCl、15体积份的曲拉通X-100和50体积份的乙醇溶解在去离子水中，体积定容为1L。定容后的粪便保存液中Tris的浓度为0.2mol/L，EDTA的浓度为0.025mol/L，NaCl的浓度为0.14mol/L，曲拉通X-100的浓度为1.5％，乙醇的浓度为5％。其中，摩尔份、体积份的比为mmol:mL。
2)用一次性滤膜装置过滤步骤1)得到的粪便保存液，于容量瓶中保存。
在粪便样本保存管中加入15ml粪便保存液。取样时加入3-5g粪便样本到保存管中，盖紧管盖，常温放置保存。分别在保存0、5、10、15天后将粪便样本和保存液充分混匀，放入离心机高速离心10min后收集上清液，使用核酸提取试剂盒对上清进行核酸提取。
实施例2
本申请提供了一种人粪便中脱落细胞的保存液及其应用，包括：0.3mol/L的Tris、0.03mol/L的EDTA、0.14mol/L的NaCl、1.5％的曲拉通X-100、10％的乙醇和去离子水。
所述的粪便中脱落细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
1)分别将300摩尔份的Tris、30摩尔份的EDTA、140摩尔份的NaCl、15体积份的曲拉通X-100和100体积份的乙醇溶解在去离子水中，体积定容为1L。定容后的粪便保存液中Tris的浓度为0.3mol/L，EDTA的浓度为0.03mol/L，NaCl的浓度为0.14mol/L，曲拉通X-100的浓度为1.5％，乙醇的浓度为10％。其中，摩尔份、体积份的比为mmol:mL。
3)用一次性滤膜装置过滤步骤1)得到的粪便保存液，于容量瓶中保存。
在粪便样本保存管中加入15ml粪便保存液。取样时加入3-5g粪便样本到保存管中，盖紧管盖，常温放置保存。分别在保存0、5、10、15天后将粪便样本和保存液充分混匀，放入离心机高速离心10min后收集上清液，使用核酸提取试剂盒对上清进行核酸提取。
对照例1-使用去离子水代替粪便保存液
在粪便样本保存管中加入15ml去离子水。取样时加入3-5g粪便样本到保存管中，盖紧管盖，常温放置保存。分别在保存0、5、10、15天后将粪便样本和保存液充分混匀，放入离心机高速离心10min后收集上清液，使用核酸提取试剂盒对上清进行核酸提取。
采用上述实施例1、2和对照例1中分别在保存0、5、10、15天后所取得的DNA样本进行浓度测定以及qPCR检测β-actin基因Ct值，结果如下：
表1：DNA样本定量结果
表2：样本qPCR检测(Ct值)
从表1和表2可以看出实施例1和实施例2使用本粪便保存液保存的样本中，提取的DNA总含量呈现下降趋势。β-actin检测的Ct值在保存0天至14天均保持稳定趋势，在保存21天后有细微增高，本保存液保存的样本在保存三周后仍可以检测到稳定的β-actin基因，这说明本保存液中的脱落细胞在保存3周后依然呈稳定状态。因此本粪便保存液可以有效保存粪便样本中脱落细胞，防止脱落细胞降解并能抑制样本中微生物的过度繁殖。
未使用本粪便保存液保存的对照例1中，提取的DNA浓度随着时间增加呈升高趋势，含量增加明显。β-actin检测的Ct值随时间增加而升高，在保存21天后未检测到。Ct值越大说明靶DNA的含量越低。因此，随着时间的增加，使用去离子水保存的对照组粪便样本中脱落细胞就会加速降解；而DNA总量的增加说明样本中微生物的数量也在增加。
实施例1、实施例2和对照例1中样本荧光定量PCR扩增曲线如图1、图2和图3所示，分别是保存0天、7天、14天和21天后β-actin基因的扩增曲线，从扩增结果可以看出，实施例1和实施例2中的样本，在保存0天、7天、14天和21天后β-actin基因均可以稳定扩增，说明本粪便保存液可以有效保存粪便中脱落细胞，有效抑制降解。未使用本保存液的对照例1中的样本，在保存0天和7天后均可以检出β-actin基因，但在保存14天之后则未检出，说明该样本中的人体脱落细胞已经完全降解。
以上仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (8)
1.一种粪便保存液，其特征在于，包括：三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚、乙醇和余量的去离子水。
2.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.1-0.5mol/L。
3.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述乙二胺四乙酸的浓度为0.02-0.05mol/L。
4.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述氯化钠的浓度为0.1-0.2mol/L。
5.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述聚乙二醇辛基苯基醚的体积浓度为1％-2％。
6.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述乙醇的体积浓度为5-10％。
7.一种根据权利要求1所述的粪便保存液的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
将三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇辛基苯基醚及乙醇和溶解于去离子水中；
将上述溶液进行过滤得到所述粪便保存液。
8.一种根据权利要求1所述的粪便保存液的应用方法，其特征在于，所述粪便保存液用于保存人体粪便。
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