CN109997843A - 一种循环游离dna和血细胞保存介质 - Google Patents

一种循环游离dna和血细胞保存介质 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种循环游离DNA和血细胞保存介质，所述保存介质含有以下组分：1)一种或多种保护剂；2)一种或多种螯合稳定剂；3)一种或多种代谢抑制剂；4)一种或多种酶抑制剂；5)一种或多种防吸附剂；6)缓冲液。本发明对循环游离DNA和细胞保护效果明显，可以在常温下长期保存血液制剂或生物样品，该保存介质体系不含游离醛类物质，降低了人体接触添加有本保存介质的液体样品、生物样品时的过敏反应、毒性反应，降低了保存介质潜在的致癌风险，有利于保持产品制剂、生物样品中的核酸的完整性，确保核酸类物质检测的准确性、科学性，给出更接近于真实的检测结果。

Description

一种循环游离DNA和血细胞保存介质
技术领域
本发明公开了一种保存介质，具体为一种循环游离DNA和血细胞保存介质，属于生物制剂技术领域。
背景技术
血液因其取样方便、操作简单，是目前生命科学研究和临床诊断中应用最广的样本，并且血液制品也广泛应用于临床。传统的抗凝管如EDTA抗凝管、肝素抗凝管等具有保存血样的作用，但保存时间较短，即使在4℃的环境下保存12小时，细胞活性丢失达30-40％之多，使得样本在一些要求更为苛刻的实验中无法满足要求。
液态活检作为体外诊断的一个分支，以循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)检测、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)检测、外泌体及循环RNA(Circulating RNA)检测是检测肿瘤、辅助治疗的突破性技术，同时也是生殖健康领域的无创产前诊断的突破性技术。液态活检包括循环游离DNA循环游离DNA(cell free DNA，cfDNA)和CTC。目前市场上虽有相应保存血液样本的产品，但其功能具有单一性，无法同时满足cfDNA、CTC或血细胞功能检测，并且保存效果随时间增加下降严重。如强生cellsave细胞保存管、罗氏cell free DNA collection tube血浆游离DNA保存管。两种产品在不同程度上满足使用者要求，但因其高昂的价格，功能单一性使得使用者承担高额费用的同时无法得到更好的效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明公开了一种循环游离DNA和血细胞保存介质。
本发明所采用的技术方案如下：
一种循环游离DNA和血细胞保存介质，所述保存介质含有以下组分：
1)一种或多种保护剂；
2)一种或多种螯合稳定剂；
3)一种或多种代谢抑制剂；
4)一种或多种酶抑制剂；
5)一种或多种防吸附剂；
6)缓冲液。
优选的：
所述保护剂选自已内酰脲、噁唑烷酮类、重氮烷基脲、咪唑烷基脲、羟甲基甘氨酸钠中的一种或多种；
所述螯合稳定剂选自乙二胺四乙酸盐、草酸盐、枸橼酸盐中的一种或多种；
所述代谢抑制剂选自甘露聚糖、衣霉素、金精三羧酸、苦豆碱中的一种或多种；
所述酶抑制剂选自氟化钠或者甘油醛；
所述防吸附剂选自聚乙烯醇、甜菜碱、海藻糖中的一种或多种；
所述缓冲液为甘氨酸-磷酸缓冲液；
保存介质的pH值范围为3.0～8.0。
优选的，保护剂与代谢抑制剂的摩尔比为1:0.5～1:5.0。更为优选的是，保护剂与代谢抑制剂的摩尔比为1:1。
优选的，保护剂与酶抑制剂的摩尔比为1:0.5～1:4.0。更为优选的是，保护剂与酶抑制剂的摩尔比为1:1。
优选的，所述的保护剂在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂添加1～600g/L保护剂的剂量添加；所述的螯合稳定剂在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂添加1～5g/L螯合稳定剂的剂量添加；所述防吸附剂在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂添加1-100g/L防吸附剂的剂量添加；所述缓冲液，在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂1～5％的体积百分数添加。
优选的，所述的甘氨酸在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂添加1～100g/L甘氨酸的剂量添加。
本发明的有益效果如下：
本发明所述的保护介质对循环游离DNA和细胞保护效果明显，可以在常温下长期保存血液制剂或生物样品，该保存介质体系不含游离醛类物质，降低了人体接触添加有本保存介质的液体样品、生物样品时的过敏反应、毒性反应，降低了保存介质潜在的致癌风险，有利于保持产品制剂、生物样品中的核酸的完整性，确保核酸类物质检测的准确性、科学性，给出更接近于真实的检测结果。
附图说明
图1为本发明血液样本保存介质处理与常规EDTA抗凝常温保存后溶血对比图。
图2为本发明血液样本保存介质处理与常规EDTA抗凝常温保存后血浆中游离DNA浓度对比图。
图3为本发明血液样本保存介质处理与常规EDTA抗凝常温保存后SRY含量变化的对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1。
保存介质含有以下组份：
1)已内酰脲、咪唑烷基脲作为保护剂；
2)乙二胺四乙酸三钾二水合物作为螯合稳定剂；
3)衣霉素、金精三羧酸作为代谢抑制剂；
4)甘油醛作为酶抑制剂；
5)聚乙烯醇、海藻糖作为防吸附剂；
6)甘氨酸-磷酸作为缓冲液。
保存介质按16g/L乙二胺四乙酸三钾二水合物、24g/L已内酰脲、16g/L咪唑烷基脲、33.6g/L衣霉素、101.6g/L金精三羧酸、80g/L聚乙烯醇、120g/L海藻糖、120g/L甘油醛、8×甘氨酸-磷酸缓冲液(50g/L甘氨酸)配置，最终pH为7.4，与保存介质与血液样品或制品按1：7混合。
用常规EDTA抗凝管采血，采血后进行分装，分装14管，每管加入2mL血，其中7管中分别加入285.6μL上述所配置的保存介质，另外7管不添加保存介质，均室温(25-28℃)存放，分别放置0天、2天、3天、4天、7天、10天和14天，共7个时间点。每个时间点分别取出一管不含保存介质的血和一管加入了本发明实施例1中保存介质的血，1200g离心15min分离血浆，观察并拍照记录分离出的血浆的颜色。
结果如图1所示，在8组试验中，加本发明保护介质处理的血浆颜色变化较小，而不加保护介质处理的血浆随着存放时间的延长，颜色也越来越深，出现了严重的溶血现象。这一结果表明本发明保存介质能够有效防止溶血。
实施例2
保存介质按表1剂量配置，最终pH为7.4，与保存介质与血液样品或制品按1：7混合。
用常规EDTA抗凝管采集非妊娠期女性血液，采血后进行分装，分装21管，每管加入2mL血，并且每管血中加入相同量的男性白细胞悬浮液。其中14管中分别加入571.4μL上述表1中所配置的保存介质1和2，每种保存介质各7管，另外7管不添加保存介质，均室温(25-28℃)存放，分别放置0天、2天、3天、4天、7天、10天和14天，共7个时间点。每个时间点分别取出一管不含保护介质的血和一管加入了各种保存介质的血，1200g离心15min分离血浆，分离的血浆再1200g离心15min，取上清血浆。
用游离核酸DNA提取试剂盒(CWBIO，目录号CW2612M)提取血浆中的DNA，用QUBITDSDNA HS ASSAY KIT SET OF 500(life，Q32854)检测血浆游离DNA的浓度。
结果如图2所示，cfDNA浓度在加本发明保存介质处理的条件下随着储存时间的延长基本没有什么变化，而在不加保存介质处理的cfDNA浓度随着储存时间的延长而升高。cfDNA含量显著低于对照组。
以提取的cfDNA为模板，利用引物SRY-F(5’-AGTATCGACCTCGTCGGAAG-3’)和SRY-R(5’-TCTTGAGTGTGTGGCTTTCG-3’)进行荧光定量PCR检测血浆游离DNA中SRY的含量，内存基因为ACTB(ACTB-F:5’-TGAGCGCGGCTACAGCTT；ACTB-R：5’-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’)，检测试剂盒为TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，目录号RR820A)，扩增程序为95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。计算△Ct＝CtSRY-CtACTB，△Ct值越小，cfDNA含量越高。
如图3所示，对照组的△Ct显著小于实验室，说明SRY含量在加本发明保护介质处理的cfDNA中的相对含量随着储存时间的延长基本维持稳定，而在不加保护介质处理的cfDNA中的相对含量随着储存时间的延长明显升高了。
SRY为男性特异性基因，这一结果也就说明，男性白细胞在本发明保护介质的作用下基本维持原始状态，基本上没有发生破裂释放DNA到血浆DNA中，因此SRY的含量维持稳定。而在没有本发明保护介质的作用下男性白细胞可能发生了严重的破裂，导致男性白细胞中的DNA释放到了血浆中，因此其在血浆中SRY的含量升高。这也就表明，本发明保护介质能够很好的保护全血中白细胞的完整性，并且在两周内基本不发生破裂。
上述结果说明，保存介质成分越多，对cfDNA的保存效果越好。
实施例3
用常规EDTA抗凝管采血，采血后进行分装，分装21管，每管加入2mL。其中14管中分别加入285.6μL实施例2中的保存介质1和2，每种保存介质各7管，另外7管不添加保存介质，均室温(25-28℃)存放，分别放置0天、2天、3天、4天、7天、10天和14天，共7个时间点。每个时间点分别取出一管不含保护介质的血和一管加入了本发明实施例1中保存介质的血，进行细胞活性的检测分析。检测使用仪器为美国Nexcelom公司CellometerAUTO2000全自动双荧光细胞活性计数分析仪，使用复合型染料AO/PI，调其浓度至2×，使用1×PBS溶液将保存后的稀释10倍，与2×复合染料1:1混合后，在荧光细胞计数仪下分别在7个时间点观察计活率。
如表2所示，随着保存时间的延长，经本发明保护介质处理的细胞存活的百分比上显著高于对照组，且稳定性较好，细胞形态正常。
表2
以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的基本结构的情况下，本发明可以作任何形式的修改。

Claims (8)

1.一种循环游离DNA和血细胞保存介质，其特征在于，所述保存介质含有以下组分：
1)一种或多种保护剂；
2)一种或多种螯合稳定剂；
3)一种或多种代谢抑制剂；
4)一种或多种酶抑制剂；
5)一种或多种防吸附剂；
6)缓冲液。
2.根据权利要求1所述的保存介质，其特征在于：
所述保护剂选自已内酰脲、噁唑烷酮类、重氮烷基脲、咪唑烷基脲、羟甲基甘氨酸钠中的一种或多种；
所述螯合稳定剂选自乙二胺四乙酸盐、草酸盐、枸橼酸盐中的一种或多种；
所述代谢抑制剂选自甘露聚糖、衣霉素、金精三羧酸、苦豆碱中的一种或多种；
所述酶抑制剂选自氟化钠或者甘油醛；
所述防吸附剂选自聚乙烯醇、甜菜碱、海藻糖中的一种或多种；
所述缓冲液为甘氨酸-磷酸缓冲液；
保存介质的pH值范围为3.0～8.0。
3.根据权利要求1-2任一项所述的保存介质，其特征在于，保护剂与代谢抑制剂的摩尔比为1:0.5～1:5.0。
4.根据权利要求1-2任一项所述的保存介质，其特征在于，保护剂与代谢抑制剂的摩尔比为1:1。
5.根据权利要求1-2任一项所述的保存介质，其特征在于，保护剂与酶抑制剂的摩尔比为1:0.5～1:4.0。
6.根据权利要求1-2任一项所述的保存介质，其特征在于，保护剂与酶抑制剂的摩尔比为1:1。
7.根据权利要求1-2任一项所述的保存介质，其特征在于，所述的保护剂在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂添加1～600g/L保护剂的剂量添加；所述的螯合稳定剂在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂添加1～5g/L螯合稳定剂的剂量添加；所述防吸附剂在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂添加1-100g/L防吸附剂的剂量添加；所述缓冲液，在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂1～5％的体积百分数添加。
8.根据权利要求1-2任一项所述的保存介质，其特征在于，所述的甘氨酸在处理血液样品或制剂时，按占血液样品或制剂添加1～100g/L甘氨酸的剂量添加。
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