CN108893524A - 血浆中游离dna的保护剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血浆中游离DNA的保护剂，属于生物技术领域。血浆中游离DNA的保护剂，为以下组分的无菌水溶液：50‑600g/L的防腐剂、30‑100g/L的核酸酶抑制剂、20‑200g/L的代谢抑制剂、和1‑120g/L的防吸附剂。将采集的血液与保护剂按照5‑1000：1的比例混合，在常温条件下能够保护血液游离DNA长达14天，在37度下能够保护血液游离DNA长达4天，能够保护血液游离DNA连续运输两天。本发明通过优选各组分及其含量，可以有效的保存和提取血液中的游离核酸，同时避免在抽取血液后由于血细胞的裂解而掺入血细胞中的核酸。

Description

血浆中游离DNA的保护剂
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种血液中游离DNA的保护剂。
背景技术
近年来，随着测序技术的高速发展以及国家一系列利好政策的推动，以血浆中的游离DNA(cell free DNA,cfDNA)为研究对象的无创产前诊断和肿瘤液体活检产业蓬勃发展。由于血浆内胎儿DNA和循环肿瘤DNA(irculating tumor DNA，ctDNA)含量较低，低频突变或超低频突变的检测仍困难重重。
在母亲血浆中，单胎妊娠早期的胎儿释放的游离cfDNA浓度小于10％。随着保存时间的延长，白细胞降解及随之而来的母体基因组DNA(gDNA)的释放将严重影响低含量的胎儿游离DNA的比例及完整性。对于循环肿瘤DNA而言，这一问题更为突出。在癌症早期，突变等位基因的频率(mutant allele frequencies,MAFs)可能低至1/10,000。cfDNA样本本身在保存过程中如果被“背景”gDNA干扰，会造成检测灵敏度的大幅度降低以及大量数据的浪费。因此如何稳定血浆中的白细胞，降低其在保存过程中因降解而释放大量gDNA造成的“污染”，是液体活检的重要一环。
对于cfDNA的保存，利用超高速离心分离血浆是最直接有效的避免白细胞gDNA干扰的方法。但是实际样品采集中，往往不具备高速离心和冷冻保存的条件。游离核酸采血管便在这种情况下应运而生。这些保存管的目的就是尽可能长时间的在常温状态下保存血浆中的游离核酸。目前商业化的游离核酸采血管，有些利用甲醛等交联剂稳定白细胞减缓背景gDNA的释放。但是这些交联剂会损伤cfDNA，并且会降低测序检出率。
因此，研制“采样、保存、运输”为一体的新一代游离核酸采血管，其特有的超长期保存和有效抑制背景gDNA污染将进一步解决现有cfDNA样本保存的难点问题，方便了样本储存和运输，简化了临床实验室的运作。
发明内容
针对上述领域中的需求，本发明提供一种新型保存剂，能够高效固定血液细胞，不但保护血液中cfDNA的稳定性，而且长时间防止血液细胞破裂，避免基因组DNA释放造成对cfDNA的污染，可以确保低频突变的有效检出。
血浆中游离DNA的保护剂，是以下组分的无菌水溶液：50-600g/L的防腐剂、30-100g/L的核酸酶抑制剂、20-200g/L的代谢抑制剂、和1-120g/L的防吸附剂。
所述防腐剂为下列中的一种或几种：DTT、NaF、DU、恶唑烷、羟甲基甘氨酸钠、IDU、ATA、草酸钠。优选：DU和IDU，或其它化合物与它们的组合。
所述核酸酶抑制剂为下列中的一种或几种：ATA、EDTA、DTT、甲酰胺、酒精、蛋白酶K、肝素、半胱氨酸、二价阳离子化合物，所述二价阳离子为下述金属二价阳离子Mg,Mn,Zn，Fe，Ca，Cu。优选：EDTA。
所述代谢抑制剂为下列中的一种或几种：草酸钠、氟化钠、甘油醛、丙酮酸盐、磷酸烯醇丙酮、草酸钾、磷酸烯醇丙酮酸盐。优选：氟化钠和甘油醛。
所述防吸附剂为下列中的一种或几种：聚乙烯醇，甜菜碱，海藻糖，吐温20。优选聚乙烯醇和海藻糖，或者吐温20与它们的组合。
更优选：30-100g/L的EDTA，100g-350g/L的IDU，150g-400g/L的DU，1g-100g/L的海藻糖，10g-100g/L的甘油醛，10-100g/L的NaF，0.1-30g/L的聚乙烯醇。
进一步优选：50-80g/L的EDTA，100g-200g/L的IDU，200g-300g/L的DU，10g-50g/L的海藻糖，5g-50g/L的甘油醛，20-80g/L的NaF，10-25g/L的聚乙烯醇。
更进一步优选：60g/L的EDTA，150g/L的IDU，250g/L的DU，40g/L的海藻糖，40g/L的甘油醛，70g/L的NaF，20g/L的聚乙烯醇。
上述保护剂的使用方法，将即时抽出的血液与保护剂混合均匀，室温保存。
所述血液与保护剂的体积比为5-1000：1。
优选：20-100：1。
所述保护剂先行保存在真空采血管中，抽出血液盛装入真空采血管中，再混合均匀。
一种采血管，内盛装有上述保护剂。
本发明的血浆中游离DNA的保护剂由一定浓度的防腐剂、核酸酶抑制剂、代谢抑制剂和防吸附剂组成。
所述防腐剂中包含一种或几种甲醛供体。可以用作防腐剂的试剂可以包括但不局限于以下试剂。例如DTT、NaF、DU、恶唑烷，羟甲基甘氨酸钠，IDU、ATA或草酸钠。作为防腐剂的试剂可以是以上所述试剂的一种或几种的组合。例如作为防腐剂的试剂可以选择DU，IDU，或其它化合物与它们的组合。用作防腐剂的试剂浓度一般在50-600g/L，举例来说，防腐剂中可以是含有150-400g/L DU和上述的其它试剂。
保护剂中应含有一种或几种核酸酶抑制剂。酶抑制剂的用量应该能够保护血液中的DNA不被降解，保护程度至少要达到50％-90％，核酸酶抑制剂浓度为30-100g/L。核酸酶抑制剂可以选用但不局限于以下试剂，例如ATA，EDTA，DTT，甲酰胺，酒精，蛋白酶K，肝素，半胱氨酸或者二价阳离子化合物(例如Mg,Mn,Zn，Fe，Ca，Cu等)。所用的酶抑制剂可以是上述中的一种或几种的组合，所用的酶抑制剂的量要能有效的防止核酸酶的活性。通过酶抑制剂保护的血液中的游离DNA的可回收率要达到50％以上，优选EDTA。
保护剂中应含有一种或几种代谢抑制剂。代谢抑制剂的用量应该能有效抑制血液中细胞的代谢，浓度为为20-200g/L。代谢抑制剂可以选用但不局限于草酸钠，氟化钠，甘油醛，丙酮酸盐，磷酸烯醇丙酮，草酸钾，磷酸烯醇丙酮酸盐。所用的代谢抑制剂可以是上述十几种的一种或几种的组合。比如代谢抑制剂可以含有氟化钠和甘油醛，氟化钠和甘油醛的浓度可以是10-100g/L。所用的代谢抑制剂可以有效防止血液中的游离DNA的降解和防止细胞的裂解，这样可以保证血浆中的游离DNA不被基因组DNA所污染。
所述防吸附剂可以选用但不限于聚乙烯醇，甜菜碱，海藻糖，吐温20。所用的防吸附剂可以是上述一种或几种的组合。防吸附剂的作用主要在于防止血液中极少量的游离DNA吸附与容器管壁上而造成的有效游离DNA的降低和损失。防吸附剂的浓度为1-120g/L。防吸附剂可以选用聚乙烯醇，海藻糖，吐温20的混合物，其中聚乙烯醇的浓度可以是0.1g-30g/L，海藻糖的浓度可以是1g-100g/L。
本发明的保护剂由防腐剂、DNA酶抑制剂、代谢抑制剂和防吸附剂构成，将每一个组分称取一定量到容器中，用无菌水溶解所有组分，然后全量转移到到容量瓶中，多次冲洗容器并把冲洗液体转入容量瓶中，最后定容到最终体积。将采集的血液与保护剂按照5：1－1000：1的比例混合，在常温条件下能够保护血液游离DNA长达14天，在37度下能够保护血液游离DNA长达4天，能够保护血液游离DNA连续运输两天。本保护剂可以用于游离DNA的保护和储存。通过此方法可以最大限度的保护血液中的游离DNA，增加血液中游离DNA的回收效率，为接下来的疾病诊断提供足够的检测样本。
发明提供的保护剂可以保护血液中游离核酸，主要是游离DNA，将血液中的核酸样本存在于血浆中。这项发明提供的方法可以有效的保存和提取血液中的游离核酸，同时避免在抽取血液后由于血细胞的裂解而掺入血细胞中的核酸。提高了从血液中提取cfDNA的效率，从抽取血液与保护剂的接触开始就有效保存了血液中的游离核酸。血液直接抽取到装有保护剂的采血管中，保护作用从血液与保护剂接触开始，保护作用可以持续7天到14天。
附图说明
图1为全血在室温情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂，国产cfDNA保存管V和进口cfDNA保存管S中及EDTA采血管中14天期间进行cfDNA提取，提取后对cfDNA进行浓度检测的结果，
图2为全血在室温情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂，国产cfDNA保存管V和进口cfDNA保存管S中14天期间进行cfDNA提取，提取后对cfDNA进行浓度检测的结果，
图3为全血在室温情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂，国产cfDNA保存管V和进口cfDNA保存管S中及EDTA采血管中运输3天进行cfDNA提取，提取后对cfDNA进行浓度检测的结果，
图4为全血在室温情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂，国产cfDNA保存管V和进口cfDNA保存管S中运输3天进行cfDNA提取，提取后对cfDNA进行浓度检测的结果，
图5为全血在37度情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂，国产cfDNA保存管V和进口cfDNA保存管S中及EDTA采血管中保存4天进行cfDNA提取，提取后对cfDNA进行浓度检测的结果，
图6为全血在37度情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂，国产cfDNA保存管V和进口cfDNA保存管S中保存4天进行cfDNA提取，提取后对cfDNA进行浓度检测的结果，
图7为全血在常温运输情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂中运输三天期间进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的扩增结果，
图8为全血在常温运输情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂和EDTA采血管中运输三天期间进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的扩增结果，
图9为全血在室温条件下，置于本文所述的游离核酸保护剂中保存0天，4天，7天，10天，14天分别进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的扩增结果，
图10为全血在室温条件下，置于本文所述的游离核酸保护剂中保存0天，4天，7天，10天，14天分别进行核酸提取，以及置于EDTA保存管中保存0天，4天，7天提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的扩增结果，
图11为全血在37℃条件下，置于本文所述的游离核酸保护剂中保存0天，1天，2天，3天分别进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的扩增结果，
图12为全血在37℃条件下，分别置于本文所述的游离核酸保护剂和EDTA保存管中保存0天，1天，2天，3天后，分别进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的扩增结果，
图13为全血在37℃条件下，分别置于本文所述的游离核酸保护剂和保存剂S中保存0天，1天，2天，3天后，分别进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的扩增结果，
图14为全血在37℃条件下，分别置于本文所述的游离核酸保护剂和保存剂V中保存0天，1天，2天，3天后，分别进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的扩增结果，
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
本发明考虑了利用cfDNA鉴定，诊断疾病的流程和方法，流程包括采集新鲜血液和cfDNA保护剂接触并充分混合；从血液中分离血浆，然后从血浆中提取cfDNA,用定性及定量的方法检测cfDNA。所用保护剂的用量应该能够长时间保证血细胞的稳定和其中的染色体组DNA不泄露入血浆中；所用保护剂的用量应该能够长时间保证血浆中的cfDNA稳定不被DNA酶降解；所用保护剂应该能防止血浆DNA吸附到管壁上造成的cfDNA损失。
具体的保护剂配制及使用的流程方法和检测方案
一、保护剂的配制和采血管的制备：
技术方案为：50-80g/L的EDTA，100g-200g/L的IDU，200g-300g/L的DU，10g-50g/L的海藻糖，5g-50g/L的甘油醛，20-80g/L的NaF，10-25g/L的聚乙烯醇。
在下面所采用的实施例中，保护剂各组分实际配制浓度为：
60g/L的EDTA，150g/L的IDU，250g/L的DU，40g/L的海藻糖，40g/L的甘油醛，70g/L的NaF，20g/L的聚乙烯醇。
1.配制：各组分按计算量称取到容器中，用无菌水溶解所有组分，然后全量转移到到容量瓶中，多次冲洗容器并把冲洗液体转入容量瓶中，最后定容到最终体积。
2.分装：将保护剂分装到10ml玻璃管或pet管中，每管分装约180ul-220ul用胶塞盖上玻璃管。
3.加好保护剂的管子抽真空。
二.采血
使用上述真空采血管进行采血10ml后，缓慢混匀，然后轻柔颠倒混匀至少十次，置于室温。
三.血浆制备
1.将血液放入离心管中，1600转离心10分钟，吸取上清后转移到新管中
2.16000转，4度离心10分钟后吸取上清。
四.cfDNA提取
cfDNA的提取采用市面上(Tiangen)常用的提取试剂盒，严格按照说明书执行。
五.cfDNA的检测
本方案采用1.Qubit检测血浆中cfDNA的量；2.Agilent2100(生物芯片分析仪)检测提取DNA中是否混有基因组DNA；3.qPCR(实时荧光定量PCR)的方法，对看家基因GAPDH进行检测，
实施例1：使用本发明的保护剂与EDTA采血管及市面上的cfDNA采血管的对比实验
随机抽取8例全血样本，样本分为四组，分别放入装有本发明保护剂的采血管中以及只有抗凝剂EDTA的管中和市面上采购的国产cfDNA采血管S及进口cfDNA采血管V中。
1.样本置于室温，分别于0天，3天，7天，10天，14天对三种采血管中的血液进行cfDNA提取，然后检测cfDNA的量
2.样本置于37度，分别于1天，2天，3天，4天对三种采血管中的血液进行cfDNA提取，然后检测cfDNA的量
3.样本置于室温运输条件下，分别于1天，2天，3天对三种采血管中的血液进行cfDNA提取，然后检测cfDNA的量
4.同类产品比较(与S采血管及V采血管结果比较)
表一为全血在常温运输情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂和EDTA采血管中运输三天期间进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的ct值比较
表二为全血在室温情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂和EDTA采血管中0天，4天，7天，10天，14天分别进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的ct值比较
表三为全血在室温情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂和EDTA采血管中0天，1天，2天，3天分别进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的ct值比较
表四为全血在室温情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂和保护剂S中0天，1天，2天，3天分别进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的ct值比较
表五为全血在室温情况下，置于本文所述的游离核酸保护剂和保护剂V中0天，1天，2天，3天分别进行核酸提取，提取后的核酸进行GAPDH基因实时荧光定量PCR检测的ct值比较。
结果见附图。
结论：
1.加入保护剂后，血液在室温保存14天后，血液中的基因组DNA没有释放到血浆中，同时血浆中的cfDNA没有降解，通过这样保存的血液可以用于cfDNA的检测。而不加保护剂只加入EDTA的血液会有明显的基因组DNA释放。
2.加入保护剂后，血液在37度可以至少稳定保护3天，血液中的DNA没有释放到血浆中。同时血浆中的cfDNA没有降解，通过这样保存的血液可以用于cfDNA的检测。而不加保护剂只加入EDTA的血液在37度保存一天就会有明显的基因组DNA释放
3.加入保护剂后，血液在常温运输的条件下可以稳定保护至少3天，血液中的DNA没有释放到血浆中。同时血浆中的cfDNA没有降解，通过这样保存的血液可以用于cfDNA的检测。而不加保护剂只加入EDTA的血液在运输条件下会有明显的基因组DNA释放
4.通过我们的保护剂保护的血液，比同类产品在保护血液中的cfDNA方面具有明显的优点。尤其在37度保存中，我们的保护剂至少可以稳定保护3天。而所测试的两款同类产品在37度保存两天开始血液中的基因组就有释放，从浓度测定和qPCR的检测结果中可以看出明显不同
5.通过我们的保护剂保护的血液样本，可以在常温条件下稳定保存至少14天，在室温运输的过程中也可以使血液样本保持稳定，同时对于高温条件下也有优于同类产品的耐受性。对于保存全血样本起到很好的保护作用。

Claims (9)

1.血浆中游离DNA的保护剂，为以下组分的无菌水溶液：50-600g/L的防腐剂、30-100g/L的核酸酶抑制剂、20-200g/L的代谢抑制剂、和1-120g/L的防吸附剂。
2.根据权利要求1所述的保护剂，所述防腐剂为下列中的一种或几种：DTT、NaF、DU、恶唑烷、羟甲基甘氨酸钠、IDU、ATA、草酸钠；
所述核酸酶抑制剂为下列中的一种或几种：ATA、EDTA、DTT、甲酰胺、酒精、蛋白酶K、肝素、半胱氨酸、二价阳离子化合物，所述二价阳离子为下述金属二价阳离子Mg,Mn,Zn，Fe，Ca，Cu；
所述代谢抑制剂为下列中的一种或几种：草酸钠、氟化钠、甘油醛、丙酮酸盐、磷酸烯醇丙酮、草酸钾、磷酸烯醇丙酮酸盐；
所述防吸附剂为下列中的一种或几种：聚乙烯醇，甜菜碱，海藻糖，吐温20。
3.根据权利要求2所述的保护剂，其中所述防腐剂为DU和IDU，或其它化合物与它们的组合；所述核酸酶抑制剂为EDTA；所述代谢抑制剂为氟化钠和甘油醛；所述防吸附剂为聚乙烯醇和海藻糖，或者吐温20与它们的组合。
4.根据权利要求3所述的保护剂，为以下组分的无菌水溶液：30-100g/L的EDTA，100g-350g/L的IDU，150g-400g/L的DU，1g-100g/L的海藻糖，10g-100g/L的甘油醛，10-100g/L的NaF，0.1-30g/L的聚乙烯醇。
5.根据权利要求4所述的保护剂，为以下组分的无菌水溶液：50-80g/L的EDTA，100g-200g/L的IDU，200g-300g/L的DU，10g-50g/L的海藻糖，5g-50g/L的甘油醛，20-80g/L的NaF，10-25g/L的聚乙烯醇。
6.根据权利要求5所述的保护剂，为以下组分的无菌水溶液：60g/L的EDTA，150g/L的IDU，250g/L的DU，40g/L的海藻糖，40g/L的甘油醛，70g/L的NaF，20g/L的聚乙烯醇。
7.权利要求1－6任一所述保护剂的使用方法，将即时抽出的血液与所述保护剂混合均匀，室温保存。
8.根据权利要求7所述的使用方法，所述血液与保护剂的体积比为5-1000：1。
9.根据权利要求8所述的使用方法，所述血液与保护剂的体积比为20-100：1。
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