CN109730053A - 一种常温保存全血中cfDNA的血液保护液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种常温保存全血中cfDNA的血液保护液。本发明提供了全血中cfDNA的血液保护液，包括如下溶质：抗凝剂、防腐剂、核酸酶抑制剂、代谢抑制剂、细胞稳定剂和膜稳定剂；本发明提供的血液游离DNA保存剂，可抑制核酸酶活，保护血液中游离DNA；稳定白细胞，防止白细胞破裂，避免细胞基因组污染游离DNA；可以保证外周血在常温下保存14天，常温运输至少14天，在此期间内不会发生明显变化，有效延长血液样本在室温下的存储时间，对血液样本长距离运输具有极大的帮助，从而节约了游离DNA检测成本，更有利于游离DNA相关检测技术的应用推广。

Description

一种常温保存全血中cfDNA的血液保护液

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种常温保存全血中cfDNA的血液保护液。

背景技术

循环游离DNA(Circulating cell free DNA，cfDNA)是存在于人体血液中一种无细胞状态的胞外DNA。作为细胞死亡的标记物，近年来，外周血中的游离DNA在临床上的应用越来越多：在无创伤性产前诊断中，孕妇外周血中的胎儿游离DNA的发现为无创伤性产前遗传病诊断提供了重要的研究方法；与此同时，越来越多的研究表明，外周血游离DNA最有可能成为肿瘤早期诊断的液态活检标志物。与美国相比，虽然其肿瘤发病率为中国的1.6倍，但5年生存率为中国的1.8倍，造成该差异的主要原因之一在于美国肿瘤早期筛查诊断的普及率更高，肿瘤早期筛查主要采取内镜、血液、影像学等检查方法，而对血液中的cfDNA进行早期筛查是很重要且方便的一项检测方法。此外，cfDNA检测已用于多种急性或慢性疾病的诊断和预后评价中，在自身免疫性疾病，中风，败血症，先兆子痫和器官移植排斥中，cfDNA较健康个体呈显著的高水平。

在动物或者人体内采集到的血液称为全血，全血不抗凝分离得到的液体称为血清，全血中加入抗凝剂后，分离所得到的液体称为血浆。在实际检测过程中，无论全血、血清、血浆都有一定的保存期限，在常温液体形势下很容易失效，而外周血中游离DNA的量的多少是一个关键的指标，人外周血中游离DNA含量极少，半衰期短，极易被血液中的DNA酶降解，如果外周血中有白细胞或者核红细胞破裂，那么基因组DNA将降解进入到血浆中污染游离DNA，这会严重影响检测结果。因此，很有必要提供一种用于保护外周血中游离DNA的血液保护液，旨在解决采用现有的外周血中游离DNA的保存方法，外周血中游离DNA保存时间短，易降解，易污染，保存温度低，经济成本高等问题。

发明内容

为了解决现有外周血中游离DNA保存时间短，易降解，易污染，保存温度低，经济成本高等问题，本发明提供一种外周血中游离DNA的保护剂，该保护剂可有效抑制细胞代谢，抑制核酸酶活性，防止血细胞破裂，保护血液中游离DNA。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

本发明的一个目的是提供一种用于全血中cfDNA的血液保护液。

本发明提供全血中cfDNA的血液保护液，包括如下溶质：抗凝剂、防腐剂、核酸酶抑制剂、代谢抑制剂、细胞稳定剂和膜稳定剂；用于常温保存。

进一步，所述抗凝剂包括EDTA盐、柠檬酸钠及枸杞酸钠中的一种或多种组合。抗凝剂的主要作用为防止血液凝固。上述EDTA盐可为EDTA钠盐或EDTA钾盐。

进一步，所述防腐剂包括Proclin300、叠氮钠、二唑烷基脲、咪唑烷基脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基-1，3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸及金刚烷季铵中的一种或多种组合。防腐剂的主要作用是防止血液变质。在本发明的一个实施例中，所述防腐剂为Proclin300。

进一步，所述代谢抑制剂包括ATA(金精三羧酸)、丙酮酸、甘油醛、磷酸二羟丙酮、3-磷酸-2-磷酸甘油酸、甘油醛-3-磷酸磷酸、氟化钠及钾代谢抑制剂中的一种或多种组合。代谢抑制剂可以减缓细胞代谢，减少细胞基因组裂解，使基因组DNA更少地混入到游离DNA中。优选的，所述代谢抑制剂为ATA、丙酮酸及甘油醛中的一种或多种任意组合。

进一步，所述核酸酶抑制剂包括硫酸铵、尿素、十二烷基硫酸钠、异硫氰酸胍中的一种或多种组合。核酸酶抑制剂可抑制核酸酶活性，防止基因组DNA和游离DNA降解，影响游离DNA的质量和数量。优选的，所述核酸酶抑制剂为甲醛释放剂、硫酸铵、异硫氰酸胍中的一种或多种任意组合。

进一步，所述细胞稳定剂为1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因，羟甲基甘氨酸钠，尼泊金甲酯钠，尼泊金乙酯钠或尼泊金丙酯钠中的至少一种，

进一步，所述膜稳定剂为丙三醇，能增强细胞膜的稳定性，与其他成分通过协同作用更好地起到保护效果。

上述血液保护液中，所述细胞稳定剂、所述防腐剂、所述抗凝剂、所述核酸酶抑制剂、所述代谢抑制剂和所述膜稳定剂的配比分别为10-100g：0.1-1mL：10-100g：1-10g：1-10g：1-10mL；

或，所述细胞稳定剂、所述防腐剂、所述抗凝剂、所述核酸酶抑制剂、所述代谢抑制剂和所述膜稳定剂的配比分别为10-50g：0.1-0.2mL：10-20g或10-15g：1-2.5g：1-2g：1-5mL；

或所述细胞稳定剂、所述防腐剂、所述抗凝剂、所述核酸酶抑制剂、所述代谢抑制剂和所述膜稳定剂的配比分别为50-100g：0.2-1mL：20-100g或15-100g：2.5-10g：2-10g：5-10mL。

上述cfDNA的血液保护液，包括如下溶质：10-100g/L的1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因、0.1-1mL/L的Proclin300、10-100g/L的EDTA盐、1-10g/L硫酸铵、1-10g/L ATA和1-10mL/L的丙三醇。

或，上述cfDNA的血液保护液，包括如下溶质：50g/L的1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因、0.2mL/L的Proclin300、20g/L的EDTA-K2、1g/L硫酸铵、1g/L ATA和5mL/L丙三醇；

或上述cfDNA的血液保护液，包括如下溶质：50g/L的1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因、0.2mL/L的Proclin300、15g/L的EDTA-K2、2.5g/L硫酸铵、2g/L ATA和5mL/L的丙三醇。

上述血液保护液还包括溶剂，所述溶剂为缓冲液，缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或PBS缓冲液中的一种，缓冲液的pH值范围在6.8～8.0。缓冲液可以给保护液提供一个稳定酸碱环境。在本发明的一个实施例中，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

所述溶剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或PBS缓冲液中的一种；

或，所述缓冲液的PH值为6.8-8.0；

或，所述血液保护液由所述溶质和所述溶剂组成。

上述溶剂为浓度10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值为8。

本发明另一个目的是提供一种制备上述血液保护液的方法。

本发明提供的方法，为按照上述的血液保护液中的溶质和溶剂混匀，得到血液保护液。

上述血液保护液在提高离体全血中cfDNA的运输稳定性中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述血液保护液在制备提高离体全血中cfDNA的运输稳定性产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述血液保护液在提高离体全血中cfDNA的存放稳定性中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述血液保护液在制备提高离体全血中cfDNA的存放稳定性产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第3个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，包括上述血液保护液；所述产品具有如下1)或2)功能：1)提高离体全血中cfDNA的放稳定性；2)提高离体全血中cfDNA的运输稳定性。

上述产品为试剂盒。

本发明的有益效果：本发明提供的血液游离DNA保存剂，可抑制核酸酶活，保护血液中游离DNA；稳定白细胞，防止白细胞破裂，避免细胞基因组污染游离DNA；可以保证外周血在常温下保存14天，常温运输至少14天，在此期间内不会发生明显变化，有效延长血液样本在室温下的存储时间，对血液样本长距离运输具有极大的帮助，从而节约了游离DNA检测成本，更有利于游离DNA相关检测技术的应用推广。

附图说明

图1为EDTA采血管静置0，1，4，7，9，12，14，15天。

图2为本发明采血管静置0，1，4，7，9，12，14，15天。

图3为EDTA采血管摇晃0，1，4，7，9，12，14，15天。

图4为本发明采血管摇晃0，1，4，7，9，12，14，15天。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1、常温保存全血中cfDNA的血液保护液的制备

全血中cfDNA的血液保护液由10-100g/L的1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因、0.1-1mL/L的Proclin300、10-100g/L的EDTA盐、1-10g/L硫酸铵、1-10g/L ATA，1-10mL/L的丙三醇和缓冲液组成，所述缓冲液为浓度10mM(PH值8.0)的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液。

浓度10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，溶质为10mM三羟甲基氨基甲烷-盐(Tris)，溶剂为水。

具体配方如下：

cfDNA的血液保护液配方一：50g/L的1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因、0.2mL/L的Proclin300、20g/L的EDTA-K2、1g/L硫酸铵、1g/L ATA、5mL/L的丙三醇和缓冲液组成，缓冲液为浓度10mM(pH值8.0)的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；

cfDNA的血液保护液配方二：50g/L的1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因、0.2mL/L的Proclin300、15g/L的EDTA-K2、2.5g/L硫酸铵、2g/L ATA、5mL/L的丙三醇和缓冲液组成，缓冲液为浓度10mM(pH值8.0)的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液。

实施例2、血液保护液室温稳定性检测

血液样品与cfDNA的血液保护液按5:1充分混匀，防止由于接触不充分，导致凝血。

根据实施例1中配方一组分配制抗凝剂，并与普通EDTA采血管进行对比试验，具体步骤如下：

1、用EDTA采血管和添加有实施例1提供的血液保护液的真空采血管分别采取等量的外周血，采血管总体积为5mL；血液保护液与外周血体积比为1：5，真空度误差≤10％；

2、采集的血液放置在室温中；

3、在第0，1，4，7，9，12，14，15天分别分离血浆；分离血浆的步骤选择的是将血液放入离心管中，3000×g离心10min，小心的移取上清到一个新的离心管中，如果取到白细胞或红细胞，则重新进行离心后移取上清。将第一次离心后获得的上清再次放入离心机中，12000×g离心10min，小心的移取上清到一个新的离心管中，这样获得的溶液就是血浆样本；

4、提取分离后的血浆中的DNA；

5、将获得的DNA进行管家基因β-actin(选取最稳定的管家基因β-actin：从新鲜血浆中分离出来的基因组主要都是来自血浆游离DNA,即cfDNA；当全血中血细胞破裂后，如有核白细胞中的基因组会释放出来，这时检测的β-actin量其实是总量，在稀有突变或胎儿游离DNA检测中，这就是干扰背景，故其检测β-actin的Ct较有保护液保护血细胞的体系中会更小)的q-PCR验证；

引物如下：

H-actb-GFO：CGTGGACATCCGCAAAGAC

H-actb-GRE：TGCATCCTGTCGGCAATG

H-actb-GPR-1：FAM-TCTGGCGGCACCACCATGTACCCT-BHQ1检测探针为taqman探针，5’荧光报告基团，3’荧光猝灭基团。

根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。

正常的未受污染的血浆中管家基因的DNA片段较少，扩增的Ct值较大，而当白细胞破裂后，白细胞中的核酸大量释放到血浆中，血浆中管家基因的DNA片段数量增加，扩增的Ct值逐渐减小。通过管家基因的q-PCR验证，可以判断出白细胞破裂的程度，进而判定血液保护液保护效果。

结果如表1及图1-2所示，添加有实施例1中保护剂的血液样本经室温放置管家基因β-actin的Ct值都比较接近，均值为30.88，说明血浆游离DNA的量稳定；普通EDTA采血管中血液样本管家基因β-actin的Ct值对应放置天数(0，1，4，7，9，12，14，15)Ct值分别为32.32，30.96，29.36，28.82，28.38，25.6，26.43，24.81，说明随放置天数增加，白细胞逐渐破裂，大量基因组中β-actin释放到血浆中，增加了总的β-actin浓度，故Ct呈现逐步变小趋势。

表1为EDTA采血管与本发明血液保护液真空采血管静置不同时间Ct值

实施例3、血液保护液运输稳定性

根据实施例1中配方二配制的血液保护液的真空采血管及普通EDTA采血管分别采取等量的外周血进行模拟运输稳定性对比试验：

1、采集的血液放置在室温中，每日将血液轻柔颠倒混匀两次，模拟运输环境，以便观察血液在运输环境中细胞及血浆DNA的变化情况。

2、在第0，1，4，7，9，12，14，15天分别分离EDTA采血管与添加有血液保护液的真空采血管中的血浆；

3、提取分离后的血浆中的DNA；

4、将获得的DNA进行管家基因β-actin的q-PCR验证，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。

正常的未受污染的血浆中管家基因的DNA片段较少，扩增的Ct值较大，而当白细胞破裂后，白细胞中的核酸大量释放到血浆中，血浆中管家基因的DNA片段数量增加，扩增的Ct值逐渐减小。通过管家基因的q-PCR验证，可以判断出白细胞破裂的数量多少。

结果如表2及图3-4所示：添加有实施例1中血液保护液的血液样本经模拟运输放置管家基因β-actin的Ct值都比较接近，均值为31.4；并与0天放置的普通EDTA采血管中血液样本管家基因β-actin的Ct接近，说明在添加有实施例中保护剂的血浆游离DNA的量在模拟运输环境中依然能保持稳定，而普通EDTA采血管中的样品随着储存时间的加长，其Ct值与第0天的数据相比显著缩小，说明游离细胞DNA被降解严重。可见，使用本发明可有效缓解DNA降解，有利于后续的DNA提取等操作。

表2为EDTA采血管与本发明血液保护液真空采血管摇晃不同时间的Ct值

Claims (10)

1.一种cfDNA的血液保护液，包括如下溶质：抗凝剂、防腐剂、核酸酶抑制剂、代谢抑制剂、细胞稳定剂和膜稳定剂；

所述抗凝剂包括EDTA盐、柠檬酸钠及枸杞酸钠中的一种或多种组合；

所述防腐剂包括Proclin300、叠氮钠、二唑烷基脲、咪唑烷基脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基-1，3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸及金刚烷季铵中的一种或多种组合；

所述代谢抑制剂包括ATA、丙酮酸、甘油醛、磷酸二羟丙酮、3-磷酸-2-磷酸甘油酸、甘油醛-3-磷酸磷酸、氟化钠及钾代谢抑制剂中的一种或多种组合；

所述核酸酶抑制剂包括硫酸铵、尿素、十二烷基硫酸钠、异硫氰酸胍中的一种或多种组合；

所述细胞稳定剂为1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因，羟甲基甘氨酸钠，尼泊金甲酯钠，尼泊金乙酯钠或尼泊金丙酯钠中的至少一种；

所述膜稳定剂为丙三醇。

2.根据权利要求1所述的血液保护液，其特征在于：

所述EDTA盐为EDTA钠盐或EDTA钾盐。

3.根据权利要求1或2所述的血液保护液，其特征在于：

所述细胞稳定剂、所述防腐剂、所述抗凝剂、所述核酸酶抑制剂、所述代谢抑制剂和所述膜稳定剂的配比分别为10-100g：0.1-1mL：10-100g：1-10g：1-10g：1-10mL；

或，所述细胞稳定剂、所述防腐剂、所述抗凝剂、所述核酸酶抑制剂、所述代谢抑制剂和所述膜稳定剂的配比分别为10-50g：0.1-0.2mL：10-20g或10-15g：1-2.5g：1-2g：1-5mL；

或所述细胞稳定剂、所述防腐剂、所述抗凝剂、所述核酸酶抑制剂、所述代谢抑制剂和所述膜稳定剂的配比分别为50-100g：0.2-1mL：20-100g或15-100g：2.5-10g：2-10g：5-10mL。

4.根据权利要求1-3中任一所述的血液保护液，其特征在于：

所述cfDNA的血液保护液，包括如下溶质：10-100g/L的1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因、0.1-1mL/L的Proclin300、10-100g/L的EDTA盐、1-10g/L硫酸铵、1-10g/L ATA和1-10mL/L的丙三醇。

5.根据权利要求1-4中任一所述的血液保护液，其特征在于：

所述cfDNA的血液保护液，包括如下溶质：50g/L的1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因、0.2mL/L的Proclin300、20g/L的EDTA-K2、1g/L硫酸铵、1g/L ATA和5mL/L丙三醇；

或所述cfDNA，包括如下溶质：50g/L的1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因、0.2mL/L的Proclin300、15g/L的EDTA-K2、2.5g/L硫酸铵、2g/L ATA和5mL/L的丙三醇。

6.根据权利要求1-5中任一所述的血液保护液，其特征在于：所述血液保护液还包括溶剂，所述溶剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或PBS缓冲液中的一种；

或，所述缓冲液的PH值为6.8-8.0；

或，所述血液保护液由所述溶质和所述溶剂组成。

7.根据权利要求6所述的血液保护液，其特征在于：

所述溶剂为浓度10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值为8。

8.一种制备权利要求1-7中任一所述的血液保护液的方法，为按照权利要求1-7中任一所述的血液保护液中的溶质和溶剂混匀，得到血液保护液。

9.权利要求1-7中任一所述的血液保护液在提高离体全血中cfDNA的运输稳定性中的应用；

或，权利要求1-7中任一所述的血液保护液在制备提高离体全血中cfDNA的运输稳定性产品中的应用；

或，权利要求1-7中任一所述的血液保护液在提高离体全血中cfDNA的存放稳定性中的应用；

或，权利要求1-7中任一所述的血液保护液在制备提高离体全血中cfDNA的存放稳定性产品中的应用。

10.一种产品，包括权利要求1-7中任一所述的血液保护液；所述产品具有如下1)或2)功能：1)提高离体全血中cfDNA的放稳定性；2)提高离体全血中cfDNA的运输稳定性。