CN107619827A - 一种组合物及其制备方法与在全血游离dna保存领域的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸保存技术领域，尤其涉及一种组合物及其制备方法与在全血游离DNA保存领域的应用。本发明提供了一种组合物，组合物的原料包括：渗透性保护剂、稳定剂、离子通道阻断剂以及抗凝剂。本发明还提供了一种上述组合物的制备方法，本发明还提供了一种上述组合物或上述制备方法得到的产品在全血游离DNA保存领域的应用。经模拟运输检测以及实验检测可得，本发明提供的技术方案制得的产品，在模拟运输的实验条件下，可有效的稳定血细胞膜，减少红细胞和白细胞的破裂，同时，对于全血游离的DNA起到良好的保护作用，进一步地，确保了将全血游离DNA用于临床检测时，其检测结果的准确性和可靠性，拓宽了全血游离DNA在临床的应用范围。

Description

一种组合物及其制备方法与在全血游离DNA保存领域的应用
技术领域
本发明属于核酸保存技术领域，尤其涉及一种组合物及其制备方法与在全血游离DNA保存领域的应用。
背景技术
自从1948年游离DNA被首次发现以来，随着分子检测技术的发展，人们发现游离DNA的水平和组成与多种疾病密切有关。游离DNA作为一种生物标志物，逐步应用于疾病的早期诊断、预后以及监测各领域，尤其在肿瘤诊断与无创产前筛查领域最为成熟。离体血液中的游离DNA受到巨噬细胞清除、酶降解、有核细胞的释放等多种因素的影响，无论是数量和种类，都会在样本储存过程中发生变化，影响检测结果的准确性。
为了最大程度的减少游离DNA的离体变异，降低储存和运输成本，在应用过程中需要特殊的保存液，发挥下述三种作用：1、抑制DNA酶的活性，保护游离DNA不降解；2、抑制巨噬细胞活性，防止巨噬细胞对游离DNA的清除；3、维持细胞完整性，减少细胞的凋亡和坏死，防止基因组DNA释放，造成的背景污染。现有技术中，目前常采用的EDTA抗凝血血浆提取游离DNA，对温度和储存时间都有严格的贮存条件，极大的限制了临床的使用。
因此，研发出一种组合物及其制备方法与在全血游离DNA保存领域的应用，用于解决现有技术中，游离DNA对于温度和储存时间都有严格的贮存条件，极大的限制了临床应用的技术缺陷，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种组合物及其制备方法与在全血游离DNA保存领域的应用，用于解决现有技术中，游离DNA对于温度和储存时间都有严格的贮存条件，极大的限制了临床应用的技术缺陷。
本发明提供了一种组合物，所述组合物的原料包括：渗透性保护剂、稳定剂、离子通道阻断剂以及抗凝剂。
优选地，以质量份计，所述组合物的原料包括：渗透性保护剂0.05～1份、稳定剂5～50份、离子通道阻断剂1～10份以及抗凝剂8～16份。
优选地，以质量份计，所述组合物的原料包括：渗透性保护剂0.1份、稳定剂20份、离子通道阻断剂5份以及抗凝剂10份
优选地，所述渗透性保护剂为DMSO和/或甘油。
优选地，所述稳定剂为肌醇和/或海藻糖。
优选地，所述离子通道阻断剂选自：四乙胺、4-氨基吡啶、奎尼丁、奎宁、氯化钡、DIDS以及NPPB中的一种或多种。
优选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾和/或乙二胺四乙酸三钾。
本发明还提供了一种包括以上任意一项所述组合物的制备方法，所述制备方法为：
步骤一、稳定剂、离子通道阻断剂以及抗凝剂混合得第一混合物，加水搅拌得第一产物；
步骤二、所述第一产物与渗透性保护剂混合得第二混合物，加水搅拌，通过滤膜过滤后得产品。
优选地，步骤一中，所述第一混合物与水的质量投料比为(17～64)：(60～90)；
步骤二中，所述第二混合物与水的体积投料比为(4～12)：(1～4)。
本发明还提供了一种包括以上任意一项所述的组合物或以上任意一项所述的制备方法得到的产品在全血游离DNA保存领域的应用。
综上所述，本发明提供了一种组合物，所述组合物的原料包括：渗透性保护剂、稳定剂、离子通道阻断剂以及抗凝剂。本发明还提供了一种上述组合物的制备方法及上述制备方法得到的产品在全血游离DNA保存领域的应用。经模拟运输检测以及实验检测可得，本发明提供的技术方案制得的产品，在模拟运输的实验条件下，可有效的稳定血细胞膜，减少红细胞和白细胞的破裂，同时，对于全血游离的DNA起到良好的保护作用，进一步地，确保了将全血游离DNA用于临床检测时，其检测结果的准确性和可靠性。本发明提供的一种组合物及其制备方法与在全血游离DNA保存领域的应用，解决了现有技术中，游离DNA对于温度和储存时间都有严格的贮存条件，极大的限制了临床应用的技术缺陷。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种组合物及其制备方法与在全血游离DNA保存领域的应用，用于解决现有技术中，游离DNA对于温度和储存时间都有严格的贮存条件，极大的限制了临床应用的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更详细说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种组合物及其制备方法与在全血游离DNA保存领域的应用，进行具体地描述。
实施例1
本实施例为制备保存剂产品的具体实施例。
称取稳定剂10g、离子通道阻断剂2g、抗凝剂10g混合后，加入80mL水搅拌均匀，得第一产物1；其中，稳定剂为肌醇，离子通道阻断剂为四乙胺，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾。第一产物1与0.1g渗透性保护剂混合，加水定容至100mL，搅拌均匀，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得产品1；其中，渗透性保护剂为DMSO。
称取稳定剂5g、离子通道阻断剂2g、抗凝剂10g混合后，加入60mL水搅拌均匀，得第一产物2；其中，稳定剂为海藻糖，离子通道阻断剂为4—氨基吡啶，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾。第一产物1与0.1g渗透性保护剂混合，加水定容至100mL，搅拌均匀，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得产品2；其中，渗透性保护剂为甘油。
称取稳定剂肌醇20g，海藻糖2g、离子通道阻断剂1g、抗凝剂8g混合后，加入90mL水搅拌均匀，得第一产物1；其中，稳定剂为肌醇和海藻糖的混合物，离子通道阻断剂为奎尼丁，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾。第一产物3与0.05g渗透性保护剂混合，加水定容至100mL，搅拌均匀，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得产品3；其中，渗透性保护剂为DMSO。
称取稳定剂20g、离子通道阻断剂5g、抗凝剂10g混合后，加入80mL水搅拌均匀，得第一产物4；其中，稳定剂为肌醇，离子通道阻断剂为奎宁，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾。第一产物1与0.1g渗透性保护剂混合，加水定容至100mL，搅拌均匀，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得产品4；其中，渗透性保护剂为甘油。
称取稳定剂50g、离子通道阻断剂2g、抗凝剂12g混合后，加入80mL水搅拌均匀，得第一产物5；其中，稳定剂为肌醇，离子通道阻断剂为氯化钡，抗凝剂为乙二胺四乙酸三钾。第一产物1与0.1g渗透性保护剂混合，加水定容至100mL，搅拌均匀，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得产品5；其中，渗透性保护剂为甘油。
称取稳定剂30g、离子通道阻断剂3g，抗凝剂16g混合后，加入80mL水搅拌均匀，得第一产物6；其中，稳定剂为肌醇，离子通道阻断剂为DIDS，抗凝剂为乙二胺四乙酸三钾。第一产物1与1g渗透性保护剂混合，加水定容至100mL，搅拌均匀，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得产品6；其中，渗透性保护剂为甘油。
称取稳定剂5g、离子通道阻断剂10g、抗凝剂12g混合后，加入80mL水搅拌均匀，得第一产物7；其中，稳定剂为海藻糖，离子通道阻断剂为NPPB，抗凝剂为乙二胺四乙酸三钾。第一产物1与1g渗透性保护剂混合，加水定容至100mL，搅拌均匀，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得产品7；其中，渗透性保护剂为DMSO。
实施例2
本实施例为利用实施例1制得的产品1～7用于模拟运输的情况下，产品对于全血游离DNA保存效果的具体实施例。
将产品1～7作为添加剂分别加入到7个真空采血管中，采集同一血液样本，其中，组1的血液样本采用产品1进行保存，组2的血液样本采用产品2进行保存，组3的血液样本采用产品3进行保存，组4的血液样本采用产品4进行保存，组5的血液样本采用产品5进行保存，组6的血液样本采用产品6进行保存，组7的血液样本采用产品7进行保存，组8的血液样本市售常规EDTA.K2保存液进行保存。每组中，血液样本与保存液的体积比为50:1。
将八组在保存液中保存的血液样本水平放置在摇床上，在25℃条件下，以60r/min的频率进行震荡，分别于采血后第0天(即采血当天)、采血后第3天以及采血后第7天，分别取出1ml血液样本，分离血浆，观察血浆颜色，判断溶血等级，所得各样本的溶血等级结果请参阅表1。
表1溶血结果统计表
组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7 组8
第0天 0 0 0 0 0 0 0 0
第3天 1 0 0 0 1 1 1 3
第7天 2 1 1 1 1 2 2 4
表1中，0代表无明显溶血，1代表轻微溶血，2代表中等程度溶血，3代表严重溶血；在临床检验中，若溶血等级≤2，临床检验视为可接受。从表1中可以得出，该实施例中的组1～组7，无论是在采血当天还是采血后第3天、第7天都能够保护样本不溶血，满足临床需求，而且对样本的保护效果在采血后第3天和第7天明显优于组8。组8保存剂储存的血液样本在采血后第3天，已经发生比较严重的溶血，不能够用于临床检测。
同时，分别于采血后第0天(即采血当天)、采血后第3天以及采血后第7天，分别取出1ml血液样本，提取游离DNA，用实时荧光定量PCR的方法检测LINE1在血浆中的拷贝数，具体实验结果可参阅表2.
表2 LINE1拷贝数统计表(用CT值表示)
组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7 组8
第0天 19.001 18.931 19.045 19.189 19.154 19.039 18.974 19.034
第3天 18.918 19.069 19.374 19.046 19.272 19.375 19.214 17.319
第7天 18.736 19.186 19.174 19.180 19.377 18.855 18.992 16.425
从表2中可以得出，该实施例中的组1～组7，无论是在采血当天还是采血后第3天、第7天都能够保护样本不发生有核细胞的破裂，满足临床需求，而且对样本的保护效果在采血后第3天和第7天明显优于组8。组8保存剂储存的血液样本在采血后第3天和第7天，LINE1拷贝数明显升高(CT值降低)，说明有大量有核细胞破坏，基因组DNA释放到血浆中，提高背景，导致游离DNA比例降低，干扰检测。
结合表1和表2所得出的实验结果，在模拟运输的情况下，本发明提供的技术方案制得的产品，可有效的稳定血细胞膜，减少红细胞和白细胞的破裂，进一步地，确保了将全血游离DNA用于临床检测时，其检测结果的准确性和可靠性。
实施例3
本实施例为利用实施例1制得的产品1～7用于模拟运输的情况下，产品对于全血游离的DNA保护作用的具体实施例。
将产品1～7作为添加剂分别加入到7个真空采血管中，采集同一血液样本，其中，组1的血液样本采用产品1进行保存，组2的血液样本采用产品2进行保存，组3的血液样本采用产品3进行保存，组4的血液样本采用产品4进行保存，组5的血液样本采用产品5进行保存，组6的血液样本采用产品6进行保存，组7的血液样本采用产品7进行保存，组8的血液样本市售常规EDTA.K2保存液进行保存。每组中，血液样本与保存液的体积比为50:1。
将八组在保存液中保存的血液样本分别与同种、等量的外源基因混合后，水平放置在摇床上，在25℃条件下，以60r/min的频率进行震荡，分别于采血后第0天(即采血当天)、采血后第3天以及采血后第7天，分离血浆，提取游离DNA后，利用Qubit3.0测量血浆DNA总量，并且，利用实时荧光定量PCR的方法检测外源基因在血浆中的拷贝数，具体实验结果请参阅表3和表4。
表3血浆DNA含量(用ng/200ul血浆表示)
组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7 组8
第0天 0.68 0.68 0.66 0.68 0.66 0.66 0.68 0.65
第3天 0.66 0.64 0.64 0.67 0.67 0.63 0.67 1.66
第7天 0.84 0.67 0.62 0.67 0.62 0.74 0.71 14.12
从表3中可以得出，该实施例中的组1～组7，无论是在采血当天还是采血后第3天、第7天都能够保护样本血浆DNA总量不发生明显变化，对样本的保存效果远远优于组8。而组8中，储存的血液样本在采血后第3天和第7天，血浆DNA总量明显升高，说明有核细胞破裂释放的基因组DNA对血浆DNA总量的影响起主导作用，无法观察出是否有DNA酶降解了样本中原有的游离DNA。
表4外源基因拷贝数统计表(用CT值表示)
组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7 组8
第0天 17.514 17.652 17.723 17.351 17.535 17.285 17.031 17.434
第3天 17.763 17.772 17.427 17.126 17.197 17.917 17.532 19.321
第7天 18.214 17.893 17.901 17.34 18.325 18.023 17.328 20.893
从表4中可以得出，该实施例中的组1～组7，无论是在采血当天还是采血后第3天、第7天都能够保护样本血浆中外源基因不降解。然而组8储存的血液样本在采血后第3天和第7天，血浆中外源基因数量明显减少(CT值升高)。该外源基因长度132bp，是人工合成的一段DNA序列，可以作为游离DNA的模拟物，并且有核细胞破裂不会释放相同的基因序列。
表4的结果证明，实施例中的产品1-7能够保存样本中游离DNA不降解，作用优于市售常规的保存剂。
结合表3和表4所得出的实验结果，在模拟运输的情况下，本发明提供的技术方案制得的产品，能够有效的保证游离DNA不被降解，进一步地，确保了将全血游离DNA用于临床检测时，其检测结果的准确性和可靠性。
综上所述，本发明提供了一种组合物，所述组合物的原料包括：渗透性保护剂、稳定剂、离子通道阻断剂以及抗凝剂。本发明还提供了一种上述组合物的制备方法及上述制备方法得到的产品在全血游离DNA保存领域的应用。经模拟运输检测以及实验检测可得，本发明提供的技术方案制得的产品，在模拟运输的实验条件下，可有效的稳定血细胞膜，减少红细胞和白细胞的破裂，同时，对于全血游离的DNA起到良好的保护作用，进一步地，确保了将全血游离DNA用于临床检测时，其检测结果的准确性和可靠性。本发明提供的一种组合物及其制备方法与在全血游离DNA保存领域的应用，解决了现有技术中，游离DNA对于温度和储存时间都有严格的贮存条件，极大的限制了临床应用的技术缺陷。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物的原料包括：渗透性保护剂、稳定剂、离子通道阻断剂以及抗凝剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以质量份计，所述组合物的原料包括：渗透性保护剂0.05～1份、稳定剂5～50份、离子通道阻断剂1～10份以及抗凝剂8～16份。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，以质量份计，所述组合物的原料包括：渗透性保护剂0.1份、稳定剂20份、离子通道阻断剂5份以及抗凝剂10份。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述渗透性保护剂为DMSO和/或甘油。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述稳定剂为肌醇和/或海藻糖。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述离子通道阻断剂选自：四乙胺、4-氨基吡啶、奎尼丁、奎宁、氯化钡、DIDS以及NPPB中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾和/或乙二胺四乙酸三钾。
8.一种包括权利要求1至7任意一项所述组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
步骤一、稳定剂、离子通道阻断剂以及抗凝剂混合得第一混合物，加水搅拌得第一产物；
步骤二、所述第一产物与渗透性保护剂混合得第二混合物，加水搅拌后，过滤得产品。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述第一混合物与水的质量投料比为(17～64)：(60～90)；
步骤二中，所述第二混合物与水的体积投料比为(4～12)：(1～4)。
10.一种包括权利要求1至7任意一项所述的组合物或权利要求8或9所述的制备方法得到的产品在全血游离DNA保存领域的应用。
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