CN109497045A - 一种保存液及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种保存液及其制备方法与应用。本发明公开了一种保存液，由以下原料组成：血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂、渗透性保护剂、pH调节剂和抗凝剂。该保存液可保持循环肿瘤细胞的活性、减少红细胞或血小板聚集。

Description

一种保存液及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种保存液及其制备方法与应用。

背景技术

自从1869年澳大利亚病理学家John Ashworth首次提出循环肿瘤细胞这一概念，随着对循环肿瘤细胞研究的发展，人们发现通过检验循环肿瘤细胞可实时监测肿瘤动态、对个体化治疗、评估治疗效果和患者预后判断都有着重要的指导作用。循环肿瘤细胞检测与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，有显著的优势，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速地评价治疗方案的效果。但传统的采血管并不能长时间保存循环肿瘤细胞的活性，在长时间的运输过程中，会导致循环肿瘤细胞死亡甚至破裂，影响检测结果。

为了最大程度的保存循环肿瘤细胞的活性，降低储存和运输成本，在应用过程中需要特殊的保存液，发挥下述作用：1、保持循环肿瘤细胞的活性，使下游检测能获得最准确的结果；2、减少血液中出现的红细胞或血小板的聚集，防止在收集循环肿瘤细胞时堵塞管道，影响收集效率。目前使用频率较高的保存液为EDTA抗凝管，但其在长时间保存循环肿瘤细胞中，循环肿瘤细胞活性差，且容易出现红细胞或血小板的聚集，极大的限制了临床的使用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种保存液及其制备方法与应用，该保存液可保持循环肿瘤细胞的活性、减少红细胞或血小板聚集。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种保存液，由以下原料组成：血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂、渗透性保护剂、pH调节剂和抗凝剂。

优选地，按重量份计，由以下原料组成：

血小板凝集抑制剂2～20份、细胞膜保护剂1～15份、渗透性保护剂0.05～10份、pH调节剂3～20份、抗凝剂8～20份。

优选地，按重量份计，由以下原料组成：

血小板凝集抑制剂2～10份、细胞膜保护剂1～6份、渗透性保护剂0.05～2份、pH调节剂3～5份、抗凝剂8～12份。

更优选为，血小板凝集抑制剂2.5份、细胞膜保护剂6份、渗透性保护剂0.2份、pH调节剂4份、抗凝剂12份。

优选地，所述血小板凝集抑制剂为乙酰水杨酸、噻氯匹定、茶碱、腺苷和双嘧达莫中的一种或多种，更优选为噻氯匹定。

优选地，所述细胞膜保护剂为维生素E、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇、丙烯乙二醇和聚乙二醇中的一种或多种，更优选为蔗糖。

优选地，所述渗透性保护剂为DMSO和/或甘油，更优选为甘油；

所述pH调节剂为三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸一钠、磷酸盐、硫酸钙、乳酸钙、乙酸钠、氢氧化钙、氢氧化钾和氢氧化钠中的一种或多种，更优选为磷酸盐；

所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾和乙二胺四乙酸二钠的一种或多种，乙二胺四乙酸二钠。

本发明还提供了上述保存液的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂、pH调节剂和抗凝剂混合得到第一混合物，加水搅拌后得到第一产物；

步骤2：将所述第一产物与渗透性保护剂混合得到第二混合物，加水搅拌后得到保存液。

需要说明的是，步骤1中，第一产物pH为7.4，与血液的pH相似；细胞膜保护剂能有效保护血液中细胞的细胞膜，维持细胞的完整性，血小板凝集抑制剂能有效抑制血小板聚集，防止分离时堵塞管道。

优选地，步骤2加水搅拌后，得到保存液前还包括：用孔径为0.22um的过滤膜进行过滤。

优选地，步骤1中所述第一混合物与所述水的质量比为(0.1-0.9):1，更优选为0.3:1。

优选地，步骤2中所述第二混合物与所述水的体积比为(4～19):1，更优选为5.7:1。

本发明还提供了上述保存液或上述制备方法制得的保存液在全血循环肿瘤细胞保存中的应用。

上述应用具体为：将上述保存液加入采血管中，采集血液后进行保存，其中，每个10ml采血管的血液中含有几个到几百个循环肿瘤细胞，保存的时间为0～3天。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种保存液，由以下原料组成：血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂、渗透性保护剂、pH调节剂和抗凝剂。该保存液可保持循环肿瘤细胞的活性、减少红细胞或血小板聚集。由实验数据可知，该保存液保存后的循环肿瘤细胞从血液中较易分离，且保存后的第3天分离率达到89％以上，分离后的循环肿瘤细胞具备良好的细胞活性可用于培养，满足临床检测的需求。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

称取血小板凝集抑制剂2g，细胞膜保护剂15g、pH调节剂10g以及抗凝剂10g混合后，加入95ml水搅拌均匀，得到第一产物1，其中血小板凝集抑制剂为乙酰水杨酸，细胞膜保护剂为维生素E，pH调节剂为柠檬酸和柠檬酸钠，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠。第一产物1与0.02g渗透性保护剂混合，加水定容至100ml，搅拌均匀，用孔径为0.22um的滤膜过滤，得到保存液，其中渗透性保护剂为甘油。

实施例2

称取血小板凝集抑制剂2.5g，细胞膜保护剂6g、pH调节剂4g以及抗凝剂12g混合后，加入85ml水搅拌均匀，得到第一产物2；其中血小板凝集抑制剂为噻氯匹定，细胞膜保护剂为蔗糖，pH调节剂为磷酸盐，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠。第一产物2与0.2g渗透性保护剂混合，加水定容至100ml，搅拌均匀，用孔径为0.22um的滤膜过滤，得到保存液，其中渗透性保护剂为甘油。

实施例3

称取血小板凝集抑制剂5g，细胞膜保护剂1.5g、pH调节剂3g以及抗凝剂20g混合后，加入85ml水搅拌均匀，得到第一产物3；其中血小板凝集抑制剂为噻氯匹定，细胞膜保护剂为聚乙烯吡咯烷酮，pH调节剂为氢氧化钾，抗凝剂为乙二胺四乙酸三钾。第一产物3与0.1g渗透性保护剂混合，加水定容至100ml，搅拌均匀，用孔径为0.22um的滤膜过滤，得到保存液，其中渗透性保护剂为DMSO。

实施例4

称取血小板凝集抑制剂10g，细胞膜保护剂2.5g、pH调节剂18g以及抗凝剂12g混合后，加入80ml水搅拌均匀，得到第一产物4；其中血小板凝集抑制剂为乙酰水杨酸，细胞膜保护剂为聚乙烯乙二醇，pH调节剂为三羟甲基氨基甲烷，抗凝剂为乙二胺四乙酸三钾。第一产物4与3g渗透性保护剂混合，加水定容至100ml，搅拌均匀，用孔径为0.22um的滤膜过滤，得到保存液，其中渗透性保护剂为甘油。

实施例5

称取血小板凝集抑制剂1.3g，细胞膜保护剂10g、pH调节剂3.6g以及抗凝剂8g混合后，加入90ml水搅拌均匀，得到第一产物4；其中血小板凝集抑制剂为0.1g的茶碱、1g的腺苷和0.2g的双嘧达莫的混合物，细胞膜保护剂为蔗糖，pH调节剂为柠檬酸钠，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾。第一产物5与2g渗透性保护剂混合，加水定容至100ml，搅拌均匀，用孔径为0.22um的滤膜过滤，得到保存液，其中渗透性保护剂为DMSO。

实施例6

利用实施例1至5制得的保存液分别对全血循环肿瘤细胞进行保存进行模拟运输试验。

将实施例1至5提供的保存液作为添加剂分别加入到12个真空采血管中，分别分成5组，每组为同一实施例提供的保存液，全部保存液采集同一健康志愿者的外周静脉血，其中每管血液中加入100个肿瘤细胞，充分颠倒混匀后制成待检测的血液样本，组1的血液样本采用实施例1的保存液进行保存，组2的血液样本采用实施例2的保存液进行保存，组3的血液样本采用实施例3的保存液进行保存，组4的血液样本采用实施例4的保存液进行保存，组5的血液样本采用实施例5的保存液进行保存，组6的血液样本市售常规EDTA.K2保存液进行保存。每组中，血液样本与保存液的体积比为50:1。

将6组在保存液中保存的血液样本水平放置在摇床上，在25℃条件下，以60r/min的频率进行震荡，分别于采血后第0天(即采血当天)、采血后第3天分别取出1支采血管样品，分离循环肿瘤细胞，比较分离肿瘤细胞的难易程度，所得各样本的分离肿瘤细胞难易程度结果请参阅表1。

表1 分离肿瘤细胞难易程度结果统计表

	组1	组2	组3	组4	组5	组6
							第0天	1	1	1	1	1	1
第3天	2	1	2	1	2	4

表1中，1代表非常容易分离出循环肿瘤细胞，2代表较容易分离出循环肿瘤细胞，4代表分离过程中出现堵塞；从表1中可以得出，实施例1至5提供的组1～组5保存液，无论是在采血当天还是采血后第3天都能够较易分离出循环肿瘤细胞，没有出现堵塞现象，组6在采血当天能较易分离出肿瘤细胞，但当采血3天后，分离出现堵塞，对后续的临床检测会出现较大的影响。

实施例7

分别计算实施例6中采血当天和采血3天分离出的肿瘤细胞数量，所得各样本的分离肿瘤细胞数量结果请参阅表2。

表2 分离肿瘤细胞数量结果统计表

	组1	组2	组3	组4	组5	组6
							第0天	95	97	97	94	93	92
第3天	92	90	89	90	88	41

从表2中可以得出，实施例1至5提供的组1～组5保存液，无论是在采血当天还是采血后第3天都能够分离出循环肿瘤细胞，且分离率达到89％以上，满足临床需求，而且对样本的保护效果明显优于组6。组6保存剂储存的血液样本在采血后第3天，分离出的循环肿瘤细胞已不足50％，对后续的临床检测产生较大影响。

实施例8

将实施例7每组分离出的循环肿瘤细胞进行细胞培养，观察细胞的增殖情况，所得各样本的分离肿瘤细胞的培养结果请参阅表3。

表3 分离肿瘤细胞培养结果统计表

组1

组2

组3

组4

组5

组6

第0天

++

+++

++

++

++

++

第3天

+

++

++

++

+

-

表3中，“+”代表细胞出现增殖，“+”越多，代表增殖越多，细胞状态良好，“-”代表细胞不增殖，细胞状态差。从表3中可以得出，实施例1至5提供的组1～组5保存液，无论是在采血当天还是采血后第3天分离出的循环肿瘤细胞，都有较高的存活率，且出现细胞增殖，表明细胞活性良好，可满足临床培养需求，而且对样本的保护效果明显优于组6。组6保存剂储存的血液样本在采血后第3天，分离出的循环肿瘤细胞活性较差，基本不增殖，不能满足临床培养需求。

实施例9

将实施例8中组1～组6的循环肿瘤细胞继续培养，用MTT法检测肿瘤细胞的活性，对比各组的OD值，所得各样本的肿瘤细胞的活性结果请参阅表4。

表4 肿瘤细胞活性结果统计表

	组1	组2	组3	组4	组5	组6
							第0天	0.725	0.874	0.801	0.712	0.752	0.784
第3天	0.718	0.812	0.786	0.723	0.741	/

表4中，OD值越高代表细胞活性越好。从表4中可以得出，实施例1至4提供的组1～组5保存液，采血后第3天分离出的肿瘤细胞的活性与采血当天分离出的肿瘤细胞的活性相差不大，都有较高的细胞活性，可满足临床检测需求。组6保存剂储存的血液样本在采血后第3天，分离出的肿瘤细胞数目不足，且培养后细胞基本不出现增殖，不能用于检测，无实验结果。

结合表1、表2、表3和表4所得出的实验结果，在模拟运输的情况下，本发明实施例1至5提供的组1～组5保存液，能够有效的保护全血中的循环肿瘤细胞的活性，该保存液保存性能好，确保了将全血中的循环肿瘤细胞用于临床检测时，其检测结果的准确性和可靠性。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种保存液，其特征在于，由以下原料组成：血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂、渗透性保护剂、pH调节剂和抗凝剂。

2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，按重量份计，由以下原料组成：

所述血小板凝集抑制剂2～20份、所述细胞膜保护剂1～15份、所述渗透性保护剂0.05～10份、所述pH调节剂3～20份、所述抗凝剂8～20份。

3.根据权利要求2所述的保存液，其特征在于，按重量份计，由以下原料组成：

所述血小板凝集抑制剂2～10份、所述细胞膜保护剂1～6份、所述渗透性保护剂0.05～2份、所述pH调节剂3～5份、所述抗凝剂8～12份。

4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述血小板凝集抑制剂为乙酰水杨酸、噻氯匹定、茶碱、腺苷和双嘧达莫中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述细胞膜保护剂为维生素E、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙二醇、丙烯乙二醇和聚乙二醇中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述渗透性保护剂为DMSO和/或甘油；

所述pH调节剂为三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸一钠、磷酸盐、硫酸钙、乳酸钙、乙酸钠、氢氧化钙、氢氧化钾和氢氧化钠中的一种或多种；

所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾和乙二胺四乙酸二钠的一种或多种。

7.权利要求1至6任意一项所述的保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将血小板凝集抑制剂、细胞膜保护剂、pH调节剂和抗凝剂混合得到第一混合物，加水搅拌后得到第一产物；

步骤2：将所述第一产物与渗透性保护剂混合得到第二混合物，加水搅拌后得到保存液。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述第一混合物与所述水的质量比为(0.1～0.9):1。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述第二混合物与所述水的体积比为(4～19):1。

10.根据权利要求1至6任意一项所述的保存液或权利要求7至9任意一项所述的制备方法制得的保存液在全血循环肿瘤细胞保存中的应用。