CN110226591A - 细胞保存液及其应用和成纤维细胞注射针剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞保存领域，具体而言，提供了一种细胞保存液及其应用和成纤维细胞注射针剂。细胞保存液，按体积百分比计，主要由以下组分组成：25‑35％血小板裂解液和0.01‑0.5％透明质酸，生理盐水补足100％。通过在生理盐水中添加成分明确的血小板裂解液和透明质酸实现细胞活力的保持，同时降低了细胞制剂的成本。通过检测发现，随着保存时间的延长，本发明提供的细胞保存液相较于细胞培养基和生理盐水，细胞活力保持效果显著。

Description

细胞保存液及其应用和成纤维细胞注射针剂
技术领域
本发明涉及细胞保存领域，具体而言，涉及一种细胞保存液及其应用和成纤维细胞注射针剂。
背景技术
随着人们生活水平的提高，人们对于皮肤抗衰老的意识逐渐增强。人皮肤真皮层中含有大量的成纤维细胞，这些细胞具有合成和分泌胶原蛋白、弹性纤维蛋白、网状纤维和多种细胞因子的功能，它们在维持皮肤弹性和韧性方面发挥着重要作用，并对衰老或受损后的皮肤有一定修复作用。临床级别的自体成纤维细胞移植具有组织相容性高、无免疫排斥反应的优点，在美容、皮肤组织损伤修复等领域有巨大的应用潜力。但体外培养的临床级别的人皮肤成纤维细胞在移植过程中如何保持良好的细胞活力及相关的细胞功能是移植成功的关键影响因素。
目前自体成纤维细胞移植过程中，所使用的细胞外基液主要有细胞培养上清或生理盐水。细胞培养上清虽能较好的保持成纤维细胞的活力，但由于培养基本身成分复杂，且在培养过程中添加胎牛血清等异源物质，注射人体后易引起皮肤不同程度的过敏反应。而使用医用级的生理盐水作为细胞外基液，虽然其不易引起皮肤的过敏反应，但由于其成分单一，无法提供细胞所需的营养外环境，易造成细胞活力丧失，使移植后的成纤维细胞失去应有的作用。并且，现有技术中，制剂的缺点是需要添加较多种类的添加剂，成本较高，且需要在GMP级环境下操作，对人员素质和环境的要求较高。因此，现有的保持成纤维细胞活力的制剂技术存在技术要求高，成本高等问题，制约了成纤维细胞的大规模培养，对成纤维细胞制剂的产业化和商业竞争力存在一定局限性。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种细胞保存液，以缓解现有技术中临床用细胞制剂制备复杂，易过敏，成本高或细胞活性保持差等技术问题。
本发明的第二目的在于提供上述细胞保存液在制备细胞美容制剂中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种成纤维细胞注射针剂，该注射针剂细胞活性持久，保质期长，成本低。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种细胞保存液，按体积百分比计，主要由以下组分组成：25-35％血小板裂解液和0.01-0.5％透明质酸，生理盐水补足100％。
进一步的，按体积百分比计，主要由以下组分组成：27-34％血小板裂解液和0.05-0.4％透明质酸，生理盐水补足100％。
进一步的，按体积百分比计，主要由以下组分组成：28-32％血小板裂解液和0.05-0.2％透明质酸，生理盐水补足100％。
进一步的，细胞的种类包括：成纤维细胞，脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
进一步的，所述血小板裂解液为人血小板裂解液。
上述细胞保存液在制备细胞美容制剂中的应用。
进一步的，所述细胞美容制剂包括注射针剂。
一种成纤维细胞注射针剂，主要由以下组分组成：成纤维细胞和细胞保存液，其中，细胞保存液为上述细胞保存液。
进一步的，所述成纤维细胞注射针剂的细胞含量为1×106-1×107个/mL。
进一步的，所述成纤维细胞为自体成纤维细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的细胞保存液，按体积百分比计，主要由以下组分组成：25-35％血小板裂解液和0.01-0.5％透明质酸，生理盐水补足100％。通过在生理盐水中添加血小板裂解液和透明质酸实现细胞活力的保持，无需其他添加剂，成分简单，同时对制备操作环境要求低从而降低了细胞制剂的成本。用血小板裂解液代替胎牛血清，能够在细胞美容移植过程中使细胞保持较高的活力，同时避免了胎牛血清进入人体可能引起的排异反应和规避了潜在病原体。在细胞保存液中添加透明质酸可促进细胞移植后的皮肤柔嫩、光滑。通过检测发现，随着保存时间的延长，本发明提供的细胞保存液相较于细胞培养基和生理盐水，细胞活力保持效果显著。
本发明提供的成纤维细胞注射针剂中细胞保存液采用的是上述细胞保存液，该注射针剂中成纤维细胞活力持久，注射针剂的成本低，适合大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试验例1中细胞活力检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
一种细胞保存液，按体积百分比计，主要由以下组分组成：25-35％血小板裂解液和0.01-0.5％透明质酸，生理盐水补足100％。
通过在生理盐水中添加血小板裂解液和透明质酸实现细胞活力的保持，无需其他添加剂，成分简单，同时对制备操作环境要求低从而降低了细胞制剂的成本。用血小板裂解液代替胎牛血清，能够在细胞美容移植过程中使细胞保持较高的活力，并且避免了胎牛血清进入人体可能引起的排异反应也同时规避了潜在病原体。在细胞保存液中添加透明质酸可促进细胞移植后的皮肤柔嫩、光滑。通过检测发现，随着保存时间的延长，本发明提供的细胞保存液相较于细胞培养基和生理盐水，细胞活力保持效果显著。
细胞美容是从人的整体观出发，从细胞结构特征及代谢功能入手，采用纯天然生物活性物质，通过高新生物技术手段，使人获得自然的健康，并表现出自然的美丽。细胞美容采用注射细胞的方法促使全身美白因子的细胞更新，从而改善缺氧性晦暗、粗糙皮肤等一系列青春消逝现象，令全身肌肤由内至外的改善。
血小板裂解液为含有高浓度的生长因子和细胞因子的细胞培养添加剂，本发明中血小板裂解液为人源，可以是自体或异体，可以自制也可以购买商品化产品，当细胞保存液用于细胞美容制剂时，血小板裂解液优先为商品化的人血小板裂解液。血小板裂解液的体积含量典型但非限制性的为25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％。
透明质酸又称玻尿酸，广泛应用于医美行业，用于除皱、填充等医美项目，透明质酸可以促进细胞的生长、分化与修复等，还可以填补细胞因子半衰期短的缺陷。透明质酸的体积含量典型但非限制性的为0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％。
“生理盐水补足100％”是指，细胞保存液中除了含有血小板裂解液和透明质酸外，可以含有其他的组分，此时，再用生理盐水补足100％。
需要说明的是，本发明中细胞保存液的组分均为临床医用级试剂。
在优选地实施方式中，按体积百分比计，主要由以下组分组成：27-34％血小板裂解液和0.05-0.4％透明质酸，生理盐水补足100％。
在更优选地实施方式中，按体积百分比计，主要由以下组分组成：28-32％血小板裂解液和0.05-0.2％透明质酸，生理盐水补足100％。进一步优选为：30％血小板裂解液和0.1％透明质酸，生理盐水补足100％。
通过对细胞保存液组分配比的进一步优化，可以实现更好的细胞保存效果。
在一些实施方式中，细胞的种类包括：成纤维细胞，脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。对于用于细胞美容领域的细胞，本发明的细胞保存液都有显著的保存效果，良好的保持细胞活性。
在一些实施方式中，血小板裂解液为人血小板裂解液(HPL)。当本发明的细胞保存液用于细胞美容制剂中时，由于最后要进入人体，采用人血小板裂解液可以更好的降低排斥反应风险。人血小板裂解液优选为市售产品。
该细胞保存液的制备方法为将血小板裂解液、透明质酸和生理盐水按照比例混合均匀即可。
本发明提供上述细胞保存液在制备细胞美容制剂中的应用。由于生理盐水可以保证细胞良好的渗透压，血小板裂解液和透明质酸配合使用可以良好的延长细胞活性，同时透明质酸也可以起到美容的功效，将本发明的细胞保存液用于细胞美容制剂中，保存细胞，具有良好的效果。
在一些实施方式中，细胞美容制剂为注射针剂。
一种成纤维细胞注射针剂，主要由以下组分组成：成纤维细胞和细胞保存液，其中，细胞保存液为上述细胞保存液。由于细胞保存液采用的是本发明提供的细胞保存液，该注射针剂中成纤维细胞活力持久，注射针剂的成本低，适合大规模生产。
在一些实施方式中，成纤维细胞注射针剂的细胞含量为1×106-1×107个/1mL。
在一些实施方式中，成纤维细胞为自体成纤维细胞。在细胞美容移植中，采用自体细胞可以最大限度的降低排斥反应和过敏的风险。
该成纤维细胞注射针剂的制备方法为将成纤维细胞悬浮于细胞保存液中，经细胞筛网过滤即可。该方法简单易操作，成本低，适合大规模生产。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下表1所示。
表1.实施例主要试剂信息
名称 型号 销售厂家
HPL RC-002-100 三一造血
高糖DMEM/12 11965092 GIBICO
accutase C-41310 promocell
DPBS SH30028.02 hyclone
HA(透明质酸) HA-EP2 华熙福瑞达
实施例1-7细胞保存液
实施例中的具体配方(各组分为体积百分比)如下表2所示：
表2.细胞保存液配方
血小板裂解液 透明质酸 生理盐水
实施例1 25％ 0.5％ 补足100％
实施例2 35％ 0.01％ 补足100％
实施例3 27％ 0.4％ 补足100％
实施例4 34％ 0.05％ 补足100％
实施例5 28％ 0.2％ 补足100％
实施例6 32％ 0.05％ 补足100％
实施例7 30％ 0.1％ 补足100％
对比例1
一种细胞保存液，体积百分数计算，血小板裂解液为30％，生理盐水70％。
对比例2
一种细胞保存液，体积百分数计算，透明质酸为0.1％，生理盐水99.9％。
对比例3
一种细胞保存液，体积百分数计算，血小板裂解液为20％，透明质酸为1％，生理盐水79％。
对比例4
一种细胞保存液，体积百分数计算，血小板裂解液为50％，透明质酸为0.005％，生理盐水49.995％。
对比例5
一种细胞保存液，体积百分数计算，DMSO(二甲基亚砜)10％，HPL90％。
试验例
1、皮肤组织块培养
取健康皮肤组织，用160U/ml庆大霉素浸泡1min后用生理盐水或者PBS再清洗三次。用已消毒的手术器械将上层的皮下组织和血管刮干净。将除去皮下组织和血管的剩余组织在皮肤成纤维细胞培养液(95％高糖DMEM/F12，5％HPL)中浸润1min后取出，在60mm培养皿中用虹膜剪切碎，用眼科镊子将每个组织块接种于100mm培养皿中，放入二氧化碳培养箱中培养24小时后，缓慢加入皮肤成纤维细胞培养液10ml，继续放入二氧化碳培养箱中培养。一般在培养后10天，可见有成纤维细胞从组织块中迁出。
2、成纤维样细胞的分离传代
组织块培养后第20天，从组织块中迁出的成纤维细胞成为培养物中的优势细胞，此时进行消化传代，收集成纤维细胞。DPBS洗两遍，每次1min；加入0.05％胰酶消化液2ml，在培养箱中孵育。每隔2分钟镜下观察，当见到培养物外围的成纤维细胞变圆并开始脱离培养面，而组织块周围的上皮样细胞无明显形态变化时，加入5ml皮肤成纤维细胞培养液终止消化，轻轻拍打培养瓶底面，收集细胞悬液。再加入5ml皮肤成纤维细胞培养液，轻轻拍打培养瓶底面，收集细胞悬液。将两次收集的细胞悬液混合，300g×5min收集细胞，弃去上清液。向装有细胞的15ml离心管中加入预温的皮肤成纤维细胞培养液，重悬细胞，细胞计数后，以1×104/cm2的细胞密度接种，置于二氧化碳培养箱中培养。
3、成纤维样细胞的冻存和质检
待P4代成纤维细胞生长至70％～80％汇合度时，此时进行消化传代，收集成纤维细胞。DPBS洗两遍，每次1min；加入0.05％胰酶消化液2ml，在培养箱中孵育。当镜下观察见到成纤维细胞变圆并开始脱离培养面时，加入5ml皮肤成纤维细胞培养液终止消化，轻轻拍打培养瓶底面，收集细胞悬液。再加入5ml皮肤成纤维细胞培养液，轻轻拍打培养瓶底面，收集细胞悬液。将两次收集的细胞悬液混合，取样计数，300g×5min收集细胞，加入50ml生理盐水重悬细胞，取样进行细胞计数，并同时留取5ml细胞悬液，剩余细胞悬液以300g×5min收集细胞，弃去上清液，加入细胞冻存液，按照4×106cells/管冻存。同时将细胞悬液样本，由第三方检验机构进行无菌和支原体检测，结果为阴性者，判定为合格。合格批次的成纤维细胞方可进行制剂制备。
4、成纤维细胞注射针剂制备
取一瓶200mL生理盐水，用无菌注射器抽出57.5ml生理盐水，再注入7.5ml人血小板裂解液，配制成150ml含5％人血小板裂解液的洗液。从液氮罐中取出已质检的成纤维细胞，于40℃洁净温水中迅速溶解，加入已预热的45ml洗液中，300g×5min收集细胞，弃去上清液，重复清洗2次。最后一次清洗完成后，细胞分别重悬于实施例1-7和对比例1-5的细胞保存液中，经细胞筛网过滤后，以1×107个/支制为注射针剂。
5、细胞活力检测
将制备得到的成纤维细胞注射针剂放置在4℃条件下，测试24小时后细胞活力的变化，检测方法为台盼蓝拒染法，对结果进行统计得到如表3所示的结果。可以看出，本发明提供的细胞保存液显著提高了细胞活力，维持细胞长时间的良好活性。
表3.细胞活力检测结果
将成纤维细胞分别使用完全培养基(是指DMEM培养基中添加10％胎牛血清)、生理盐水和实施例7细胞保存液制备得到的成纤维细胞注射针剂放置在4℃条件下，测试不同保存时间细胞活力的变化，检测方法为台盼蓝拒染法，对结果进行统计得到如图1所示的结果。可以看出，随着保存时间的延长，本发明提供的细胞保存液显著提高了细胞活力，维持细胞活性。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种细胞保存液，其特征在于，按体积百分比计，主要由以下组分组成：25-35％血小板裂解液和0.01-0.5％透明质酸，生理盐水补足100％。
2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，按体积百分比计，主要由以下组分组成：27-34％血小板裂解液和0.05-0.4％透明质酸，生理盐水补足100％。
3.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，按体积百分比计，主要由以下组分组成：28-32％血小板裂解液和0.05-0.2％透明质酸，生理盐水补足100％。
4.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，细胞的种类包括：成纤维细胞、脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
5.根据权利要求1-4任一项所述的细胞保存液，其特征在于，所述血小板裂解液为人血小板裂解液。
6.权利要求1-5任一项所述的细胞保存液在制备细胞美容制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞美容制剂包括注射针剂。
8.一种成纤维细胞注射针剂，其特征在于，主要由以下组分组成：成纤维细胞和细胞保存液，其中，细胞保存液为权利要求1-5任一项所述的细胞保存液。
9.根据权利要求8所述的成纤维细胞注射针剂，其特征在于，所述成纤维细胞注射针剂的细胞含量为1×106-1×107个/mL。
10.根据权利要求8所述的成纤维细胞注射针剂，其特征在于，所述成纤维细胞为自体成纤维细胞。
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