CN101138654A - 含有外周血干细胞的组织工程皮肤及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种含有外周血干细胞的组织工程皮肤及其制备方法，本发明是将外周血干细胞、皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成具有活性的含外周血干细胞的组织工程皮肤。所制备的组织工程皮肤与天然皮肤组织的结构类似，与目前的皮肤替代产品相比，具有改善创面血供并促进创面愈合的功能，可增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧性和机械耐磨性，减少瘢痕增生，改善愈合质量，提高人工皮肤移植的成功率；有效的用于修复难愈性皮肤缺损。
Description
技术领域
本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及一种含有外周血干细胞的组织工程皮肤的制备方法。
背景技术
皮肤作为人体与外界的屏障具有多种重要功能，由于烧伤、创伤、慢性溃疡等原因造成的皮肤缺损轻则引起感染，重则可导致脱水、电解质流失以及免疫功能下降乃至死亡等严重后果。传统治疗使用的自体皮肤移植存在有很多难以克服的缺点，组织工程皮肤的出现为治疗提供了新途径。目前组织工程皮肤的产品化研究中种子细胞的选择是关键问题之一。体细胞由于在体外增殖速度慢、培养周期长，对于一些难愈性溃疡的疗效不佳，因此寻找合适的种子细胞就成为研究焦点。随着干细胞研究的进展，能够从患者自体取材的多种成体干细胞由于其多向分化的特性得到了重视。
外周血中也存在着多种干细胞成分，如造血干细胞、循环成纤维细胞、血管内皮祖细胞、间充质干细胞等。与身体其他部位来源的成体干细胞相比，它们的最大优点是取材方便、对病人造成的痛苦少、不会有病毒感染和免疫排斥等，是较理想的组织工程种子细胞。循环成纤维细胞(Bucala R，Spiegel LA，Chesney J，et al.[J].Mol Med，1994，1(1)：71-81)是一类特殊的白细胞亚群，具有造血干细胞的表面标记，有生成和分泌胶原和其他细胞外基质的功能，在体外培养条件下可以分化为成熟的成纤维细胞和肌成纤维细胞。循环成纤维细胞在转换生长因子β诱导下表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，而α-SMA是肌成纤维细胞的特殊标记，并且它们与胶原生成关系密切。同时循环成纤维细胞能合成分泌血管生成因子，如基质金属蛋白酶9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子A(PDGF-A)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和结缔组织生长因子(CNTGF)等，能够促进新血管的形成(Hartlapp I，Abe R，Saeed RW，et al.[J].FASEB Journal，2001，15(12)：2215-2224)。除了以上提到的成熟成纤维细胞和肌成纤维细胞，循环成纤维细胞还具有向血管内皮细胞、神经细胞、表皮细胞等多种全层皮肤相关细胞分化的能力(Yong Zhao，David Glesne，and Eliezer Huberman.PNAS.2003；100：2426-2431)。这更有利于组织工程皮肤产品的血管化、表皮化和皮肤附件的构建。外周血干细胞中的造血干细胞和血管内皮祖细胞等也有利于组织工程皮肤的构建。
随着对外周血干细胞研究的深入，该细胞在组织重建中发挥的重要作用越来越受到研究者的重视。外周血干细胞的种种特性非常适合作为组织工程产品的种子细胞，参与组织工程皮肤的构建。经检索，目前尚未见有循环成纤维细胞参与的组织工程皮肤产品及其应用的报道。
发明内容
针对上述状况，本发明的目的就是提供一种含有外周血干细胞的组织工程皮肤及其制备方法，使所获得的组织工程皮肤具有防止体液流失、保护创面、改善创面血供并促进创面愈合的功能，适用于修复难愈性皮肤缺损。
本发明所提出的含有外周血干细胞的组织工程皮肤，其特征在于：是由外周血干细胞、皮肤成纤维细胞、表皮细胞和生物支架材料制成，是将外周血干细胞、皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成的具有活性的含外周血干细胞的组织工程皮肤。所述的生物支架材料是机体可接受的生物可降解材料，包括胶原、细胞外基质复合物、透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、聚乳酸或聚羟基乙酸的任一种或是几种的混合；其中的细胞外基质复合物包含胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的成分。所述的外周血干细胞是自体来源的外周血干细胞。所述的皮肤成纤维细胞为自体或是同种异体来源的皮肤成纤维细胞，或是可向皮肤成纤维细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。所述的表皮细胞是自体或是同种异体来源的皮肤表皮细胞，或是可向表皮细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。
本发明含有外周血干细胞的组织工程皮肤的制备方法，包括有培养基配制、生物支架材料制备、以及组织工程皮肤的三维培养，具体步骤如下，
步骤1.培养基的配制：按9∶1的体积比将RPMI1640商用培养液与胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素2～50ng，氢化可的松10～500μg，表皮细胞生长因子2～10μg，碱性成纤维细胞生长因子2～50ng，腺嘌呤12～17mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度。
培养基a：基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml+巨噬细胞集落刺激
因子50ng/ml
培养基b：基础培养基+氯化钙0.1～1mM
培养基c：基础培养基+氯化钙0.2～2mM
培养基d：基础培养基+氯化钙0.3～3mM
步骤2.生物支架材料制备：在4℃条件下，按质量比将胶原7～10∶壳聚糖0.5～1∶透明质酸2～3∶硫酸软骨素0.5～1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为10mg/ml～20mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为110mg/ml的RPMI1640商用培养液，调pH至7.2～7.4，制成凝胶溶液，即支架材料；再将尼龙膜浸透凝胶溶液后，置于培养器皿中固化，形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的外周血干细胞和成纤维细胞分别按1×105～5×105个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化后形成真皮细胞层，加入基础培养基培养2～4天，每天换液；
步骤4.在真皮层表面，按1×105～5×105个/cm2的密度接种表皮细胞，加入培养基a培养1天，形成皮肤雏形；
步骤5.皮肤的成熟和角化：取培养支架置于另一培养器皿中，把制备的皮肤雏形取出放在培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐，培养1～2天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐，培养2～4天，培养期间每天换液；完成含外周血干细胞的组织工程皮肤的制备。
本发明所述外周血干细胞可按(王继峰等.外周血中一种分泌胶原的新型细胞——循环成纤维细胞.[J]解剖学报，2005，(06)：670-674)获取，也可按以下方法获取：用生理盐水与肝素按2∶1的体积比混合稀释，将患者新鲜血液与稀释后的肝素溶液按1∶1的体积比混合均匀，采用Percoll密度梯度离心法，分离出血液中的外周血干细胞。
本发明所制备含外周血干细胞的组织工程皮肤，表皮层层次清晰、基底膜连续完整、成纤维细胞和外周血干细胞混杂排列在一起，不仅具有一定的弹性和韧性，而且没有免疫排斥反应，与天然皮肤结构有高度的一致性。所制备的组织工程皮肤中的外周血干细胞在生物支架材料中呈三维方向生长，在培养过程中，外周血干细胞分泌生长因子促进表皮细胞的增殖和分化，同时抑制了成纤维细胞的过分增殖，调节其合成并分泌胶原蛋白，防止皮肤的收缩，最终形成与天然皮肤相近的结构。
按本发明制备方法获得的含外周血干细胞的组织工程皮肤，与目前已有的皮肤替代产品相比，具有以下优点：本发明的组织工程皮肤具有改善创面血供并促进创面愈合的功能，可增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧性和机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制挛缩，改善愈合质量，提高人工皮肤移植的成功率。所制备的组织工程皮肤可直接应用于炎症、溃疡、烧创伤及医源性等原因造成的皮肤缺损的修复，有效修复难愈性的皮肤缺损。在临床治疗中主要功能有：(1)作为烧伤患者的创面覆盖和自体皮替代物；(2)修复难愈性创面。在难治性溃疡创面使用本发明制备的组织工程皮肤移植可改善创面血供、促进愈合、防止瘢痕形成。
具体实施方式
以下结合实验将本发明技术方案作进一步的详细说明。
步骤1.获取外周血干细胞：将生理盐水与肝素按2∶1的体积比混合稀释，取患者静脉血，与稀释后的肝素溶液按1∶1的体积混合均匀，采用Percoll密度梯度离心法，分离出血液中的外周血干细胞，具体操作如下：
取1.073％(m/v)的Percoll分离液7ml加入离心管，吸取稀释后的静脉血，按1∶1(V/V)的量缓慢滴加于Percoll液面上，保持两液间界面清楚，避免静脉血沉底；2000转/分钟离心20分钟后离心管内分为四个层次，包括最上层的血清，其下的单核细胞与淋巴细胞的混合细胞层，以及下方的淋巴细胞分离液层和红细胞层；吸取混合细胞层，用磷酸盐缓冲液(PBS)和RPMI1640商用培养液分别清洗，清洗后的细胞用含有7％胎牛血清的RPMI1640商用培养液悬浮细胞，移入细胞培养板；于培养体系中加入巨噬细胞集落刺激因子(50ng/ml)，有利于加速细胞生长。培养2～4天后将贴壁细胞(即外周血干细胞)继续以原培养体系培养7～14天。在培养中加有血小板生成素(50ng/ml)可促进细胞增殖，使外周血干细胞加速生长直至汇合；细胞形态呈星形、拉长形或纺锤形，随着培养时间的延长，在14天左右时细胞形态呈现为均匀的纺锤形；在细胞汇合至80％～90％后，可进行传代培养。细胞传代消化方法可采用0.02％EDTA溶液于4℃条件下消化，得到的细胞以PBS溶液清洗，用无因子培养液重悬，进行传代培养。
步骤2.按9∶1的体积比将RPMI1640商用培养液与胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素10ng，氢化可的松100μg，表皮细胞生长因子6μg，碱性成纤维细胞生长因子10ng，腺嘌呤15mg，转铁蛋白3mg，维生素C10mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a：基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml+巨噬细胞集落刺激
因子50ng/ml
培养基b：基础培养基+氯化钙0.8mM
培养基c：基础培养基+氯化钙1.9mM
培养基d：基础培养基+氯化钙2.6mM
步骤3.在4℃条件下，按质量比将胶原10∶壳聚糖0.8∶透明质酸2∶硫酸软骨素1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为16mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为110mg/ml的RPMI1640商用培养液，调pH至7.2～7.4，制成凝胶溶液，即支架材料；将尼龙膜浸透凝胶溶液后，置于培养器皿中固化30分钟，形成支撑膜；
步骤4.将体外培养的外周血干细胞与成纤维细胞分别按5×105个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化30分钟形成真皮细胞层，加入基础培养基培养3天，每天换液；
步骤5.在真皮层表面，按1×105个/cm2的密度接种表皮细胞，加入培养基a培养1天，形成皮肤雏形；
步骤6.皮肤的成熟和角化：取培养支架置于另一培养皿中，把制备的皮肤雏形取出放在培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐，培养1天后更换为培养基d，液面与支架表面平齐，培养4天，培养期间每天换液；培养条件均为37℃，5％CO2环境。完成含外周血干细胞的组织工程皮肤的制备。
Claims (4)
1.一种含有外周血干细胞的组织工程皮肤，其特征在于：是由外周血干细胞、皮肤成纤维细胞、表皮细胞和生物支架材料制成，是将外周血干细胞、皮肤成纤维细胞复合于生物支架材料内部，在表面接种表皮细胞构建而成；所述的外周血干细胞是由自体来源的外周血干细胞。
2.根据权利要求1所述的组织工程皮肤，其特征在于：所述的生物支架材料是机体可接受的生物可降解材料，包括胶原、细胞外基质复合物、壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、聚乳酸、聚羟基乙酸的一种或是几种的组合；其中细胞外基质复合物包含有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的成分。
3.按照权利要求1所述含有外周血干细胞的组织工程皮肤的制备方法，包括有培养基配制、生物支架材料制备、以及组织工程皮肤的三维培养，其特征在于，具体步骤如下，
步骤1.按9∶1的体积比将RPMI1640商用培养液与胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素2～50ng，氢化可的松10～500μg，表皮细胞生长因子2～10μg，碱性成纤维细胞生长因子2～50ng，腺嘌呤12～17mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：
培养基a 基础培养基+牛垂体提取液25μg/ml+巨噬细胞集落刺激
因子50ng/ml
培养基b 基础培养基+氯化钙0.1～1mM
培养基c 基础培养基+氯化钙0.2～2mM
培养基d 基础培养基+氯化钙0.3～3mM
步骤2.在4℃条件下，按质量比将胶原7～10∶壳聚糖0.5～1∶透明质酸2～3∶硫酸软骨素0.5～1混合，用0.5M的醋酸将其配制成浓度为10mg/ml～20mg/ml的溶液，冰浴下紫外线照射，再按其体积分别加入10％的胎牛血清和10％的浓度为110mg/ml的RPMI1640商用培养液，调pH至7.2～7.4，制成凝胶溶液；将尼龙膜浸透凝胶溶液后，置于培养皿中固化形成支撑膜；
步骤3.将体外培养的外周血干细胞和成纤维细胞分别按1×105～5×105个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，将其滴加至已固化的支撑膜表面，固化后形成真皮细胞层，加入基础培养基培养2～4天，每天换液；
步骤4.在真皮层表面，按1×105～5×105个/cm2的密度接种表皮细胞，加入培养基a培养1天，形成皮肤雏形；
步骤5.取培养支架置于另一培养器皿中，把制备的皮肤雏形取出放在培养支架表面，加入培养基a淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养基b，淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养基c，液面与皮肤表面平齐，培养1～2天后更换为培养基d，液面与培养支架表面平齐，培养2～4天，培养期间每天换液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述外周血干细胞按以下方法获取：将生理盐水与肝素按2∶1的体积比混合稀释，将患者新鲜血液与稀释后的肝素溶液按1∶1的体积比混合均匀，采用Percoll密度梯度离心法，分离出血液中的外周血干细胞。
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