CN112315978A - 外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物及其制备方法和应用。复合物包括多潜能细胞活性物、富血小板血浆裂解液和盐酸法舒地尔，多潜能细胞活性物为外周血多潜能细胞活性物。外周血处理后得到外周血干细胞；然后外周血干细胞体外培养，破碎细胞后离心，收集上清过滤得到外周血多潜能细胞活性提取液，与富血小板血浆裂解液混合，然后加入盐酸法舒地尔。本发明提供的外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物的制备方法和应用，采用外周血多潜能细胞活性与富血小板血浆相互作用的结果，外周血多潜能细胞活性因子的使用可有效促进皮肤创伤愈合，有效促进皮肤溃疡创伤的愈合。

Description

外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物及其制备方法和应用。
背景技术
慢性皮肤溃疡是一种常见的难治性疾病，病因复杂，病程长，并且反复发作，容易引起皮肤表皮和部分真皮甚至皮下脂肪缺损。间充质干细胞是中胚层来源的成体干细胞，由于来源广泛、扩增潜能巨大、横向分化能力强，以及可以逃避免疫识别和抑制免疫反应等其它干细胞无法比拟的优势，目前备受研究人员的关注。间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一种成体干细胞，具有自我复制和定向分化潜能特点，由于其可通过旁分泌效应和向类皮细胞分化参与创伤愈合的各个阶段。干细胞活性物质是从人体干细胞中提炼而成，蕴含有多种干细胞分泌的再生活性因子、各型胶原蛋白及各种溶菌酶等物质。目前还没有利用干细胞活性物治理皮肤溃疡。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物及其制备方法，用于治理皮肤溃疡。
为解决上述的技术问题，具体技术方案：
外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物，包括多潜能细胞活性物、富血小板血浆裂解液和盐酸法舒地尔，所述多潜能细胞活性物为外周血多潜能细胞活性物。
进一步的，所述复合物中盐酸法舒地尔的终浓度为15～30μmol/L。
该外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)外周血处理后得到外周血干细胞；
取外周血用磷酸缓冲溶液、清洗并稀释，将外周血加入至0.2％的I型胶原酶中，置于37℃的温度下恒温的水浴箱中，消化处理40min；
然后加入含有10％胎牛血清的LG-DMEM终止消化；
消化后的外周血中加入细胞裂解液，静置后过滤、离心，取出下层沉淀得到外周血干细胞；
(2)外周血干细胞体外培养；
将外周血干细胞接种于血清细胞培养基上，置于37℃的温度下，含有5％CO2的培养箱中培养，24h后第一次换液，之后每48h换液一次，待细胞生长融合至90％时，以1∶3比例接种于血清细胞培养基中进行扩增培养；
(3)细胞培养完成后，收集上清至离心管，过滤上清除菌；
(4)加入生理盐水继续培养12～24小时，破碎细胞后离心，收集上清过滤得到外周血多潜能细胞活性提取液；
(5)制备富血小板血浆裂解液；
(6)外周血多潜能细胞活性提取液与富血小板血浆裂解液混合，然后加入盐酸法舒地尔。
其中，步骤(2)中所述的血清细胞培养基为含有双抗的LG-DMEM，其中含有10％胎牛血清。
进一步的，外周血多潜能细胞活性提取液与富血小板血浆裂解液按照体积比1∶8～10进行混合即得。
本发明提供的外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物的制备方法和应用，采用外周血多潜能细胞活性与富血小板血浆相互作用的结果，外周血多潜能细胞活性因子的使用可有效促进皮肤创伤愈合，有效促进皮肤溃疡创伤的愈合。
具体实施方式
为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
1、制备外周血多潜能细胞活性物：
取外周血用磷酸缓冲溶液、清洗并稀释，将外周血加入至0.2％的I型胶原酶中，置于37℃的温度下恒温的水浴箱中，消化处理40min；
然后加入含有10％胎牛血清的LG-DMEM终止消化；
消化后的外周血中加入细胞裂解液，静置后过滤、离心，取出下层沉淀得到外周血干细胞；将细胞悬液和0.4％台盼兰溶液等体积混合，轻轻混匀；1分钟后，在显微镜下用血球计数板计数；活细胞排斥台盼兰，染成蓝色的细胞是死细胞；
将外周血干细胞接种于血清细胞培养基上，置于37℃的温度下，含有5％CO2的培养箱中培养，24h后第一次换液，之后每48h换液一次，待细胞生长融合至90％时，以1∶3比例接种于血清细胞培养基中进行扩增培养；
细胞培养完成后，收集上清至离心管，过滤上清除菌；
加入生理盐水继续培养24小时，破碎细胞后离心，收集上清过滤得到外周血多潜能细胞活性提取液。
2、制备富血小板血浆裂解液
富血小板血浆裂解液的制作全过程严格无菌，取患者静脉血10ml，离心处理20min，收集上层清液，即为富血小板血浆。富血小板血浆经过-80℃冰箱和37℃水浴锅快速冷冻、解冻，离心后的上清液即是富血小板血浆裂解液。
3、混合得到复合物
将上述血小板血浆裂解液添加至上述外周血多潜能细胞活性提取液中，边添加，边混合，按照体积比1∶10进行混合，同时，加入盐酸法舒地尔；复合物中盐酸法舒地尔的终浓度为20μmol/L，各成分混合均匀。
为进一步验证本发明提供的复合物的治理效果，通过以下实验进行具体说明。
实验动物分组和模型构建：
SD免疫缺陷的小白鼠20只，雌雄各10只，体重在200～250g范围内，随机分为两组，通过化学方法灼伤建立皮肤损伤模型，分别隔离相同环境下饲养。分别为治疗组和对照组，治疗组采取的治疗措施为注射本发明实施例所得的复合物，对照组采取的治理措施为注射单纯的干细胞制剂。两组治疗开始后的第3d、第7d、第14d分别观察创伤的伤口愈合情况，计算伤口愈合指数WCI，计算方法为WCI(％)＝(1一现创面面积/原创面面积)×100％。计算两组鼠的WCI的平均值，实验结果数据见表1：
表1为实验结果
分组 样本量 伤后3d 伤后7d 伤后14d
对照组 5 3.15±1.47 4.94±1.27 14.73±1.42
治疗组 5 4..86±1.43 21.64±1.12 39.42±1.67
从以上表格中的数据可以看出，随着治理天数的增加，治疗组的伤口愈合指数越来越大，而对照组伤口愈合指数变化不大，说明本发明复合物的治疗效果逐渐显效，伤口愈合速度快于对照组，能促进皮肤溃疡创伤的愈合。
以上仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物，其特征在于，包括多潜能细胞活性物、富血小板血浆裂解液和盐酸法舒地尔，所述多潜能细胞活性物为外周血多潜能细胞活性物。
2.根据权利要求1所述的外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物，其特征在于，所述复合物中盐酸法舒地尔的终浓度为15～30μmol/L。
3.根据权利要求1所述的外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外周血处理后得到外周血干细胞；
取外周血用磷酸缓冲溶液、清洗并稀释，将外周血加入至0.2％的I型胶原酶中，置于37℃的温度下恒温的水浴箱中，消化处理40min；
然后加入含有10％胎牛血清的LG-DMEM终止消化；
消化后的外周血中加入细胞裂解液，静置后过滤、离心，取出下层沉淀得到外周血干细胞；
(2)外周血干细胞体外培养；
将外周血干细胞接种于血清细胞培养基上，置于37℃的温度下，含有5％CO2的培养箱中培养，24h后第一次换液，之后每48h换液一次，待细胞生长融合至90％时，以1∶3比例接种于血清细胞培养基中进行扩增培养；
(3)细胞培养完成后，收集上清至离心管，过滤上清除菌；
(4)加入生理盐水继续培养12～24小时，破碎细胞后离心，收集上清过滤得到外周血多潜能细胞活性提取液；
(5)制备富血小板血浆裂解液；
(6)外周血多潜能细胞活性提取液与富血小板血浆裂解液混合，然后加入盐酸法舒地尔。
4.根据权利要求3所述的外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的血清细胞培养基为含有双抗的LG-DMEM，其中含有10％胎牛血清。
5.根据权利要求3所述的外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物的制备方法，其特征在于，外周血多潜能细胞活性提取液与富血小板血浆裂解液按照体积比1∶8～10进行混合即得。
6.根据权利要求1所述的外周血多潜能细胞活性物与富血小板血浆复合物的应用，其特征在于，用于治疗慢性皮肤溃疡。
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