CN106676065A - 一种脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用，其特征在于：包括脂肪组织外泌体和溶剂，脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1‑3：1，所述溶剂为水凝胶。制备方法包括脂肪组织的处理、脂肪组织提取液的获取、脂肪组织来源外泌体的获取和脂肪组织来源外泌体胶的制备等步骤，主要在促进脂肪再生中的应用。本发明具体涉及了从脂肪组织提取的外泌体，将其应用于裸鼠体内，可以新生出成熟的脂肪组织。这一发明克服了传统组织工程中种子细胞的来源不足，潜在恶性转变及成瘤的缺点，且这种外泌体具有容易保存和运输的优点。发明为组织工程脂肪的获取提供了一条新的思路。

Description

一种脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用，具体是用脂肪组织来源的外泌体在体内促进脂肪再生中的应用。
背景技术
软组织缺损在创伤、肿瘤切除术后、先天畸形等情况下多有发生，整形美容领域，需要大量的软组织修复和重建患者的容貌与功能。组织工程技术的出现为整形美容修复开启了新的里程。传统组织工程认为组织再生需要三个关键要素，即种子细胞、支架材料与再生所需要的微环境。而由于脂肪组织来源广泛，获取方便且不受到医学伦理的限制，从脂肪组织中提取的间充质干细胞由于其多项分化潜能，被广泛应用于组织工程领域。然而干细胞的应用仍然有不少限制，例如干细胞获取程序的繁琐、细胞的衰老以及潜在的恶性转变及致瘤的可能性。
1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。外泌体是由细胞分泌的一种双层膜状结构的小囊泡，直径约40-150nm，携带了母细胞重要的信号分子，例如蛋白质、mRNA、miRNA和脂质等，通过与靶细胞的结合而调控细胞功能，参与细胞间交流。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
研究发现，脂肪组织除储存能量外，还具有活跃的内分泌功能，通过分泌众多激素和脂肪因子，参与调控多种病理生理过程。脂肪组织外泌体可以保持着与其母细胞相似的生物学功能，脂肪干细胞来源的外泌体在促进脂向分化及血管形成方面具有积极的促进作用。
目前脂肪组织外泌体的提取方法多样，比如超速离心，膜过滤，免疫磁珠等方法，在提取过程中，但都会存在着有其他来源的蛋白及脂质的污染的技术问题和难点。
脂肪组织外泌体在应用过程中也存在着许多难题，比如首先是外泌体支架材料的筛选，理想的支架材料首先需要安全无害，并且能够粘附外泌体，在体内可以逐渐吸收而不影响宿主的体内微环境；其次，因为外泌体的提取过程中会有一系列的物理化学操作，能否保证其安全无害上具有一定的难度。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种脂肪组织来源的外泌体胶及制备方法，及其在体内促进脂肪组织再生中的应用，本发明中用化学试剂法提取组织来源外泌体，提取过程相对简单且组织来源外泌体的量相对大，将其与操作性强的胶混合，具有操作性强，储存方便等效果，在体内应用方面也证实了这一混合物的促进成脂的特性。
解决以上技术问题的一种脂肪组织来源外泌体胶，其特征在于：包括脂肪组织外泌体和溶剂，脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1-3：1，所述溶剂为水凝胶。
所述脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1：1
所述溶剂为基质胶。
细胞与基底膜间的相互作用是调控细胞行为的重要因素之一。基质胶富含生长因子，可认为是一种可溶性的基底膜基质。主要成分包括：层黏连蛋白、胶原IV等，同时含TGF-β成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子以及其它在EHS肿瘤中自然表达的生长因子等。
本发明中一种脂肪组织来源外泌体胶的制备方法：包括以下步骤：
(1)脂肪组织的处理：
取已处死大鼠体，做腹股沟切口获取SD大鼠双侧腹股沟脂肪组织，冲洗后将脂肪组织剪碎成1-2mm3；剪碎后的组织相对面积增大且有利于悬浮培养的搅拌，利于外泌体的产生与收集。
(2)脂肪组织提取液的获取：
将由步骤(1)获取的剪碎的脂肪组织转移到Celstir悬浮培养瓶中，加入α-MEM培养基，保持悬浮培养基为100-110rpm的转速，存放于35-38℃，4-5％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心、过滤上清液，离心、过滤上清液后再用0.20-0.25微米的滤器过滤取过滤液放于3KD膜的离心过滤器中，温度3-5℃，4500-5200g转速离心28-32min，获得脂肪组织提取液；α-MEM培养基不含有血清，悬浮培养体系放在孵箱中，保持100rpm的转速连续转动3天，保持脂肪组织悬浮的状态，获取的外泌体的量比较多且稳定；细胞筛孔径为150目，目的在于过滤掉组织残渣而获取液体。
优化方案中脂肪组织与培养基的体积比为1:3-4；
优化方案中保持悬浮培养基为100rpm的转速，存放于35℃，5％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心、过滤上清液后再用0.20-0.25微米的滤器过滤；再取过滤液放于3KD膜的离心过滤器中，温度4℃，5000g转速离心30min。
放于悬浮培养瓶中保持悬浮的状态培养相对于传统的贴壁法(即为静止状态)获取的外泌体的量比较多且稳定。
上清液分别两次离心转速，第一次离心目的是为了去除细胞筛未过滤干净的组织块残留和细胞碎片，而第二次离心加上了膜过滤，为的是初步筛选含有分子量接近外泌体的因子的液体，同时进行浓缩。
(3)脂肪组织来源外泌体的获取：
将由步骤(2)获得的脂肪组织提取液中加入外泌体提取试剂，脂肪组织提取液和外泌体提取试剂用量比例为1.8-2.2：1，3-5℃过夜后以3-5℃、8000-12000g离心50-70min，取沉淀，即得脂肪组织来源外泌体；过夜和3-5℃为让提取溶剂与提取液充分混合溶剂。
优化方案中脂肪组织提取液和外泌体提取试剂用量比例为2：1，4℃过夜后以4℃、10000g离心1h。
(4)基质胶复合脂肪组织来源外泌体植入物的制备：
将溶剂置于冰上，3-5℃冰箱过夜融化，同时预冷操作工具；取脂肪组织来源外泌体用融化后的液态溶剂重悬，外泌体最终浓度为0.8-1.2mg/ml，将获得的混有脂肪组织来源外泌体的液态溶剂转移入预冷的一次性医用注射器中，置于冰上保存。优化方案中外泌体最终浓度为1mg/ml。
置于冰上预冷，温度保持在4摄氏度左右，保证溶剂为可注射液态时间在进行体内实验注入溶剂截止，一般在1h以内。
混有脂肪组织来源外泌体的液态溶剂为粘性较大的液体状态，可被注射器吸取注射，呈流动状态，滴出不能成形，湿润角小于九十度。
外泌体提取试剂可为Total Exosome IsolationTM reagent(Life Technologies,USA)、Exo Quick-TC(SBI)或exoEasy Maxi Kit(qiagen)等。
本发明中的制备方法中直接组织来源，无需额外培养，有着悬浮培养的应用，从整体技术方案和效果上都有好的作用。
所述步骤(2)中脂肪组织提取液的浓度为2-5mg/ml。
所述步骤(2)中上清液以2100-2200g,离心22-28min，再取上清液用0.20-0.25微米的滤器过滤；优化方案中上清液以2180g,离心25min，再取上清液用0.22微米的滤器过滤。纯度上，要求在提取外泌体之前，没有细胞残留，没有细胞碎片，这样可以减少其他来源的蛋白及脂质污染。
所述步骤(3)中进行先提纯浓缩后再加入外泌体提取试剂，提纯步骤为脂肪组织提取液用3KD分子量膜过滤后采用高速离心，即3-5℃以8000-12000g离心50-70min在优化方案中提纯步骤为脂肪组织提取液用3KD分子量膜过滤后采用高速离心，即4℃以10000g离心60min。
本发明中一种脂肪组织来源外泌体胶的应用，在体内促进脂肪再生中的应用，也在各种损伤造成的软组织缺损模型上的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明应用的是组织来源的外泌体，不但避免了应用干细胞带来的耗时、潜在恶性癌变等弊端，而且创新性应用组织来源外泌体提高提取效率的同时使得成脂微环境更加地接近体内真实环境。结果显示在脂肪组织来源外泌体的促进下，体内能够形成成熟的脂肪组织，这为组织工程脂肪的获取提供了有效可靠的新思路。
本发明脂肪组织来源外泌体，不仅包含了脂肪干细胞分泌的外泌体，同时也包含了其他细胞例如内皮细胞、成纤维细胞、血管周细胞等细胞分泌的外泌体。我们运用的这一外泌体的混合物比起单一细胞来源的外泌体更加接近体内的成脂微环境。且由于外泌体不含有主要组织相容性复合体，避免了以干细胞为基础的再生中面临的免疫源性问题，加之外泌体易于储存与运输，这一非细胞生物活性物质在脂肪组织再生中显示出良好的运用前景。
本发明利用脂肪组织来源外泌体可以促进宿主来源细胞增殖分化形成新生脂肪组织的特性，克服了传统组织工程技术中干细胞的免疫源性、潜在恶性转变及致瘤的可能，为获取组织工程脂肪提供了新的思路，为整形美容领域的发展奠定了基础。
附图说明
图1以流程图形式显示了脂肪组织外泌体的获取过程图
图2A为脂肪组织外泌体的透射电镜图
图2B是脂肪组织来源外泌体的粒度分析图
图3为植入的硅胶管形态图
图4A为植入8周后的大体图
图4B为去除外围硅胶管后样本的大体观图
图4C为HE染色图
具体实施方式
以下有具体实施例来对本发明作进一步的说明，其中本发明用的外泌体提取试剂为Total Exosome IsolationTM reagent(Life Technologies,USA)，
实例1脂肪组织外泌体的获取(图1)
步骤一、脂肪组织的处理
取已处死4周龄SD大鼠体，75％乙醇Ⅰ消毒30min，75％乙醇Ⅱ消毒30min。转入无菌操作台，做腹股沟切口获取SD大鼠双侧腹股沟脂肪组织，无菌PBS冲洗，用组织剪将脂肪组织剪碎(1-2mm3)，能以巴氏管正常抽取为宜。
步骤二、脂肪组织提取液的获取
将由步骤一获取的剪碎的脂肪组织转移到Celstir悬浮培养瓶中，加入无血清的α-MEM培养基，脂肪组织与培养基的体积比为1:3.5，保持悬浮培养为100rpm的转速，存放于37℃，5％CO2的培养箱，三天后150目细胞筛过滤去脂肪组织收集上清液。收集到的上清液以2180g，25min去除死细胞和大的碎片，弃沉淀，上清液以0.22微米的滤器过滤去除大颗粒杂质，再用0.22微米的滤器过滤，过滤液可以保存于-80℃转移至3KD膜的离心过滤器中，4℃，5000g转速离心30min，获得的上清液即为脂肪组织提取液，提取液的浓度可用BCA试剂盒测定，提取液可于-80℃保存；脂肪组织提取液的浓度为4mg/ml。
步骤三、脂肪组织来源外泌体的获取
将由步骤二获得的脂肪组织提取液中加入1/2体积的外泌体提取试剂(TotalExosome IsolationTM)，4℃过夜，过夜的样本4℃，10000g离心1h，弃去上清，获得的沉淀即为外泌体。外泌体的浓度运用BCA试剂盒检测，外泌体沉淀可重悬于PBS中-80℃保存。
实例2脂肪组织来源外泌体的鉴定
步骤一、透射电镜形态学鉴定
外泌体用1％戊二醛固定，4℃过夜，洗去固定剂后将混匀的外泌体滴加到载样铜网上，然后滴加水磷钨酸负染外泌体1min，透射电镜(Hitachi H-7650)成像并拍照，可见到直径为100nm左右的圆形囊泡状结构(图2A)。
步骤二、粒度分布鉴定
取50微升样品注射入专用通道测定外泌体的粒度分布，可见粒度分布的高峰位于100nm左右，粒度主要分布于60-150nm之间(图2B)。结果证明了获取的样品为外泌体，也说明了从脂肪组织获取的外泌体符合外泌体的形态特征。
实例3基质胶复合脂肪组织来源外泌体植入物的制备
将标准型的基质胶置于冰上，4℃冰箱过夜融化，同时预冷所需枪头与1ml一次性医用注射器。取新鲜离心获取的200微克外泌体沉淀用200微升融化的液态基质胶重悬(外泌体最终浓度为1mg/ml)。将获得的混有脂肪组织来源外泌体的液态基质胶转移入预冷的1ml一次性医用注射器中，置于冰上备用。
标准型的基质胶指的是未对基质胶中所含有的蛋白和生长因子进行干预的基本型基质胶，模拟了体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能。
基质胶体积稀释不可过高，比如不能大于3:1，以免在37℃的体内环境中不可交联成固态，外泌体一般注射量取决于实验动物的体型大小，以动物能耐受为限制。
实施例4
脂肪组织来源外泌体胶，包括脂肪组织外泌体和基质胶，脂肪组织外泌体和基质胶体积比为1：3。
其制备方法中的其它内容如实施例1和3中的内容，其中：
脂肪组织提取液的获取：
将由步骤(1)获取的剪碎的脂肪组织转移到Celstir悬浮培养瓶中，加入α-MEM培养基，脂肪组织与培养基的体积比为1:3，保持悬浮培养基为105rpm的转速，存放于36℃，4％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心过滤上清液，即以2100g,离心28min，再取上清液用0.20微米的滤器过滤，取过滤液于3KD膜的离心过滤器中，温度3℃，4500g转速离心32min，获得脂肪组织提取液；脂肪组织提取液的浓度为2mg/ml。脂肪组织来源外泌体的获取：
将由步骤(2)获得的脂肪组织提取液加入外泌体提取试剂，脂肪组织提取液和外泌体提取试剂用量比例为1.8：1，3℃过夜后以3℃、8000g离心70min，取沉淀，即得脂肪组织来源外泌体；
脂肪组织来源外泌体胶的制备：
将基质胶置于冰上，3℃冰箱过夜融化，同时预冷操作工具；取脂肪组织来源外泌体用融化后的液态基质胶重悬，外泌体最终浓度为0.8mg/ml，将获得的混有脂肪组织来源外泌体的液态基质胶转移入预冷的一次性医用注射器中，置于冰上保存。
实施例5
脂肪组织来源外泌体胶，包括脂肪组织外泌体和基质胶，脂肪组织外泌体和基质胶量体积比为1：2。
其制备方法中的其它内容如实施例1和3中的内容，其中：
脂肪组织提取液的获取：
将由步骤(1)获取的剪碎的脂肪组织转移到Celstir悬浮培养瓶中，加入α-MEM培养基，脂肪组织与培养基的体积比为1:4，保持悬浮培养基为110rpm的转速，存放于38℃，4.5％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心过滤上清液，即以2200g,离心22min，再取上清液用0.25微米的滤器过滤，取过滤液于3KD膜的离心过滤器中，温度5℃，5200g转速离心28min，获得脂肪组织提取液；脂肪组织提取液的浓度为5mg/ml。脂肪组织来源外泌体的获取：
将由步骤(2)获得的脂肪组织提取液加入外泌体提取试剂，脂肪组织提取液和外泌体提取试剂用量比例为2.2：1，5℃过夜后以5℃、12000g离心50min，取沉淀，即得脂肪组织来源外泌体；
脂肪组织来源外泌体胶的制备：
将基质胶置于冰上，5℃冰箱过夜融化，同时预冷操作工具；取脂肪组织来源外泌体用融化后的液态基质胶重悬，外泌体最终浓度为1.2mg/ml，将获得的混有脂肪组织来源外泌体的液态基质胶转移入预冷的一次性医用注射器中，置于冰上保存，即可。
实例6体内促进脂肪再生的应用
步骤一、裸鼠体内脂肪再生模型的建立
取6-8周龄的裸鼠5只，按每千克10ml 1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后分别于裸鼠背部左右两侧，前后肢中线部位皮下植入一个内径为4.77mm，高5mm的硅胶管(图3)，缝合术创，缝线环绕固定硅胶管，同期将准备好的置于冰上的混有脂肪组织来源外泌体的200微升液态基质胶注射到右侧硅胶管中，左侧硅胶管中直接注射200微升液态基质胶作为空白对照。
步骤二、移植材料的检测
术后8周，脱颈处死实验裸鼠，剥离裸鼠背部皮肤，可见植入物外覆有纤维包膜，与对照组相比，实验组可见硅胶管外有纤维包膜包裹，有明显的血管化与脂肪组织的形成,(图4A)，实验组去除外围硅胶管，可见管内为血管化良好的软组织，即血管化良好的脂肪组织形成(图4B)，获得的样本多聚甲醛固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋、按样本纵轴切片，行HE染色观察组织结构，可见实验组由富有血管的脂肪组织组成(图4C)，脂肪细胞大小较为一致，组织为一血管化良好的脂肪组织。以上实验结果都证实了脂肪组织来源外泌体在体内具有促进脂肪组织再生的作用。与只注射基质胶的对照组相比，注射混有外泌体的基质胶后，在两周就能在切片上看到脂肪细胞的形成，8周左右新生组织达到成熟状态。
本发明从脂肪组织提取的外泌体，将其应用于裸鼠体内，可以新生出成熟的脂肪组织。这一发明克服了传统组织工程中种子细胞的来源不足，潜在恶性癌变及成瘤的缺点，与传统细胞为基础的疗法相比，脂肪组织来源外泌体具有稳定性好、便于保存和运输，且应用方便快捷、副作用少的优点。本发明为组织工程脂肪的获取提供了一条新的思路。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种脂肪组织来源外泌体胶，其特征在于：包括脂肪组织外泌体和溶剂，脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1-3：1，所述溶剂为水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪组织来源外泌体胶，其特征在于：所述脂肪组织外泌体和溶剂质量体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪组织来源外泌体胶，其特征在于：所述溶剂为基质胶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种脂肪组织来源外泌体胶的制备方法：包括以下步骤：
(1)脂肪组织的处理：
取已处死大鼠体，做腹股沟切口获取SD大鼠双侧腹股沟脂肪组织，冲洗后将脂肪组织剪碎成1-2mm3；
(2)脂肪组织提取液的获取：
将由步骤(1)获取的剪碎的脂肪组织转移到Celstir悬浮培养瓶中，加入α-MEM培养基，保持悬浮培养为100-110rpm的转速，存放于35-38℃，4-5％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心过滤上清液，取过滤液放于3KD膜的离心过滤器中，温度3-5℃，4500-5200g转速离心28-32min，获得脂肪组织提取液；
优化方案中脂肪组织与培养基的体积比为1:3-4；
优化方案中保持悬浮培养基为100rpm的转速，存放于35℃，5％CO2的培养箱，连续三天后用细胞筛过滤并收集上清液，离心、过滤上清液后再用0.20-0.25微米的滤器过滤，过滤液进一步放于3KD膜的离心过滤器中，温度4℃，5000g转速离心30min；
(3)脂肪组织来源外泌体的获取：
将由步骤(2)获得的脂肪组织提取液中加入外泌体提取试剂，脂肪组织提取液和外泌体提取试剂用量比例为1.8-2.2：1，3-5℃过夜后以3-5℃、8000-12000g离心50-70minh，取沉淀，即得脂肪组织来源外泌体；
优化方案中脂肪组织提取液和外泌体提取试剂用量比例为2：1，4℃过夜后以4℃、10000g离心1h；
(4)脂肪组织来源外泌体胶的制备：
将溶剂置于冰上，3-5℃冰箱过夜融化，同时预冷操作工具；取脂肪组织来源外泌体用融化后的液态溶剂重悬，外泌体最终浓度为0.8-1.2mg/ml，将获得的混有脂肪组织来源外泌体的液态溶剂转移入预冷的一次性医用注射器中，置于冰上保存，即可；优化方案中外泌体最终浓度为1mg/ml。
5.根据权利要求4述的一种脂肪组织来源外泌体胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中脂肪组织提取液的浓度为2-5mg/ml。
6.根据权利要求4所述的一种脂肪组织来源外泌体胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中离心、过滤上清液为以2100-2200g,离心22-28min，再取上清液用0.20-0.25微米的滤器过滤；优化方案中上清液以2180g,离心25min，再取上清液用0.22微米的滤器过滤。
7.根据权利要求4所述的一种脂肪组织来源外泌体胶的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中进行先提纯后再加入外泌体提取试剂，提纯步骤为脂肪组织提取液用3KD分子量膜过滤后采用高速离心，即3-5℃以8000-12000g离心50-70min；优化方案中提纯步骤为脂肪组织提取液用3KD分子量膜过滤后采用高速离心，即4℃以10000g离心60min。
8.根据权利要求1所述的一种脂肪组织来源外泌体胶的应用，其特征在于：在体内促进脂肪再生中的应用。
9.根据权利要求1所述的一种脂肪组织来源外泌体胶的应用，其特征在于：在各种损伤造成的软组织缺损模型上的应用。
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