CN108452378A - 一种3d生物打印成型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3D生物打印成型方法，包括如下步骤：(1)3D生物打印：利用3D生物打印机将3D打印生物墨水按照建好的模型进行打印，打印支架在低温下储存，得到定型的凝胶材料；(2)交联：定型的凝胶材料进行水洗；然后加入交联剂，于低温条件下交联反应；最后再进行水洗，洗去残余交联剂；本方法采用低温处理及交联的方法打印目标结构，不仅能保证3D打印的快速进行，还可进一步在胶原蛋白分子内和分子之间引入共价键，保留大部分胶原蛋白结构，提高打印材料的力学强度和化学稳定性，控制其在体内的吸收速度，以便胶原类生物材料发挥作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及3D生物打印成型方法。
背景技术
3D打印技术用于临床医疗的案例已不再罕见，该技术与医疗的结合方式主要有以下几种：①术前诊断及手术预演模型；②植入物制备(骨骼、牙齿、软组织器官等)；③外用医疗耗材(颌面塑形支具等)。目前硬组织支架如骨、牙齿的打印技术目前已较为成熟，但软组织支架的打印仍有待进一步完善。
现有可供软组织打印的生物墨水多为高分子水凝胶，包括人工合成高分子材料及胶原等天然水凝胶，但围绕着这些材料开展的进一步研究结果显示；打印支架对细胞的分化促进作用较弱；接种于打印支架上的细胞在整个培养过程中都仅在原位生长，无法进一步与支架结合并降解支架。这些细胞与生物墨水、支架作用不良的问题，可能是由于现有制造技术(包括3D打印在内)的精度有限，无法重现ECM的拓扑结构所导致的，因为该结构对细胞的表型、功能具有至关重要的作用。
另外，为了提高材料的活性仿生水平，研究者大都把注意力聚焦在将一或多种活细胞或生子掺入材料这两种策略之上。然而，含细胞材料的制备难度大，稳定性差，推广困难。而长因子对软组织损伤愈合的作用在体内外的表现并不一致，呈现出复杂性以及对浓度、时空协同性的依赖,不同因子可能作用于不同的细胞生长周期,一种生长因子又可以影响其他因子的表达和活性。因此,这些方法最终的效果往往不令人满意。
最后，受传统软组织3D打印用墨水物理性能限制(很难快速的将其加工成预设计好的形状和结构)，现有的软组织3D打印技术一般采用边打印边交联、或者先交联后打印的方法，其主要缺陷包括：①需使用可光交联的材料，限制了可使用的材料，具有生物安全隐患，且由于光束散射的缘故，制备尺寸较小的材料时会发生较为严重的变形；②交联反应需要一定时间，使得材料在打印过程中结构不稳定，整体制备时间耗时过长。
综上所述，现有技术中的生物3D软组织打印技术尚不成熟，不能满足科研及临床需要。
发明内容
针对以上存在的问题，本发明提供了一种3D生物打印成型方法，针对天然高分子材料，尤其是软组织源性细胞外基质纳米纤维粉为主要原料的3D打印生物墨水，采用低温成型固定及先打印后交联的方法打印目标结构，不仅能保证3D打印的快速进行，还可进一步在胶原蛋白分子内和分子之间引入共价键，在保留大部分胶原蛋白结构的同时，提高打印材料的力学强度和化学稳定性，控制其在体内的吸收速度，以便胶原类生物材料发挥作用。
本发明通过如下技术方案实现：
一种3D生物打印成型方法，包括如下步骤：
(1)3D生物打印：利用3D生物打印机将3D打印生物墨水按照建好的数字模型打印出来。这里，主要利用墨水本身高温具有流动性而低温固化的特性，由10-50℃的墨水注射筒经针头打印到0-10℃的接收平台上。打印后，在0-10℃环境下储存5-120分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；
(2)交联：定型的凝胶材料进行水洗；然后加入交联剂，于0-10℃的条件下交联反应0.5-24h，将交联好的材料进行水洗，洗去残余交联剂即得。
所述3D打印生物墨水为以软组织源性细胞外基质纳米纤维粉为主要原料，所述软组织源性细胞外基质纳米纤维粉包括但不限于猪、牛或羊真皮组织源性细胞外基质纳米纤维微粉。
所述交联剂包括但不限于戊二醛、京尼平或碳酸二亚胺，所述交联剂的用量为3D打印生物墨水用量的0.1-0.5％。
为了提高软组织打印结构的生物活性，本发明还提供了含有胞外囊泡的3D生物打印墨水，将胞外囊泡应用于3D生物墨水中，可对细胞外基质成分、结构及生物活性进行更好的模拟，通过3D生物打印机构建出稳定结构的模型，经冷冻、水洗、交联步骤制备出能个性化定制的、具有良好生物活性、力学性能、体内降解速度可调节的组织，符合临床及基础研究的需要。
所述3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：
胞外囊泡混悬液10-30％；
生物大分子材料5-15％；
促溶剂0.1-1％；
余量水。
所述胞外囊泡混悬液是从异体/自体/异种来源的细胞、体液中提取得到的。所述胞外囊泡混悬液是通过但不限于差速离心法、蔗糖密度梯度离心法、抗体标记的磁珠分选、微孔过滤技术、试剂盒提取法、微流控技术中的任一中方法提取得到的。
所述猪、牛或羊真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉，其主要成分为Ⅰ型,Ⅲ型以及Ⅴ型胶原。平均粒径低于30μm。细胞外基质纳米纤维微粉所制备的3D打印墨水具有明显的温敏性，在10℃以下不具有流动性，在10-25℃范围其粘度与弹性会有明显的转变过程，在室温或高温环境下具有高度的流动性。
所述水包括但不限于蒸馏水或超纯水。
所述促溶剂包括但不限于盐酸、磷酸、醋酸。
所述的3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
将猪、牛或羊真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉、促溶剂与水混合，搅拌至溶解完全，然后调节pH为6-7.45，加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到3D打印生物墨水。
胞外囊泡是细胞旁分泌产生的一种亚细胞成分，在细胞旁分泌中扮演重要角色。胞外囊泡内含有脂质、蛋白质(生长因子)、核酸(DNA、mRNA及microRNA、lncRNA、circRNA等noncodingRNA),可通过生物合成与内吞作用参与到精确而复杂的膜运输过程。在炎症免疫反应、细胞存活与凋亡、血管新生、血栓形成、自噬等生理状态维持及疾病进程中发挥重要作用。胞外囊泡可于体外长时间保存而不丧失活性(-80—4℃)，胞外囊泡内携带多种生物活性物质(蛋白及核酸),在细胞功能调控中占重要地位，获取过程较为简单，可大规模制备，低温保存仍能保留其生物学功能。将胞外囊泡作为生物活性元件加入生物墨水，可避免含细胞材料的“质量可控”问题，胞外囊泡“集团”化释放多种活性因子促进修复，效果优于只结合一到两种生长因子的传统材料，可实现材料生物性能仿生的目标。
生物墨水的重要成分是猪、牛或羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉，其主要成分为Ⅰ型及Ⅲ型胶原，保留了真皮内天然细胞外基质结构，成分及结构上本已具有仿生性，且这种仿生性无法通过将提纯的Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白混合，电纺、3D打印或其他制备手段实现。
复合了胞外囊泡的生物墨水，可在-80—4℃下长时间储存并保持原有成分、微结构及生物活性，仅凭简单的温度调控及交联既能成型，不含光敏物质，更为安全，更适用于在日用化工、科研、临床医学、转化医学中应用推广。
本发明的有益效果是：
本发明采用低温处理及交联的方法打印目标结构，不仅能保证3D打印的快速进行(因交联反应速度的问题，边打印边交联这种3D打印方案需时较长)，还可进一步在胶原蛋白分子内和分子之间引入共价键，在保留大部分胶原蛋白结构的同时，提高打印材料的力学强度和化学稳定性，控制其在体内的吸收速度，以便胶原类生物材料发挥作用。本发明提供的软组织3D打印生物墨水材料，内含胞外囊泡，可在-80—4℃下长时间储存并保持原有成分、微结构及生物活性。通过3D打印时仅凭简单的温度调控及交联既能成型，不含光敏物质，制备生物材料的速度快，更为安全可控。本技术可以实现生物材料个性化定制的目标，适于在日用化工、科研、临床医学、转化医学中应用推广。
具体实施方式
通过实施例的描述，对发明的具体实施方式作进一步详细的说明，目的是帮助本领域的技术人员对本发明的构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，并有助于其实施。
实施例1
一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：
胞外囊泡混悬液10％
猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉5％
盐酸1％
超纯水余量。
所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：
将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用碳酸氢钠调节pH为6.5,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。
3D打印成型方法，包括如下步骤：
(1)3D生物打印：利用3D生物打印机将复合墨水材料按照建好的数字模型，由15℃的墨水注射筒经针头打印到8℃的接收平台上，打印后，在0℃环境下储存5分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；
(2)交联：在定型的凝胶材料中加入0.1％(基于3D打印生物墨水的质量)的戊二醛，于4℃的条件下交联反应24h；最后进行水洗，洗去残余交联剂。
实施例2
一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：
胞外囊泡混悬液20％；
牛真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉15％；
磷酸0.1％；
超纯水余量。
所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：
将牛真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、磷酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用磷酸钠调节pH为6,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。
3D打印成型方法，包括如下步骤：
按实施例1的3D打印成型方法进行3D打印，然后水洗、0.5％(按3D打印生物墨水用量)戊二醛交联以定型。
实施例3
一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：
胞外囊泡混悬液10％；
猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉8％；
盐酸1％；
蒸馏水余量。
所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：
将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与蒸馏水混合，搅拌至溶解完全，用氢氧化钠调节pH为7.45,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。
3D打印成型方法，包括如下步骤：
(1)3D生物打印：利用3D生物打印机将复合墨水材料按照建好的数字模型，由20℃的墨水注射筒经针头打印到4℃的接收平台上，打印后，在4℃环境下储存20分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；
(2)交联：在定型的凝胶材料中加入京尼平(3D打印生物墨水的0.5％)，于1℃的条件下交联反应24h；最后进行水洗，洗去残余交联剂。
实施例4
一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：
胞外囊泡混悬液25％；
猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉10％；
盐酸1％；
超纯水余量。
所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：
将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用碳酸氢钠调节pH为7.3,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。
3D打印成型方法，包括如下步骤：
(1)3D生物打印：利用3D生物打印机将复合墨水材料按照建好的数字模型，由45℃的墨水注射筒经针头打印到0℃的接收平台上，打印后，在8℃环境下储存120分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；
(2)交联：在定型的凝胶材料中加入碳酸二亚胺(3D打印生物墨水的0.1％)，于10℃的条件下交联反应0.5h；最后进行水洗，洗去残余交联剂。
对比例1
一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：
胞外囊泡混悬液30％；
猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉10％；
盐酸1％；
超纯水余量。
所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：
将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用碳酸氢钠调节pH为6.5,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。
3D打印成型方法，包括如下步骤：
按实施例1的3D打印成型方法进行3D打印，然后水洗。未经交联与定型，直接用于细胞培养与动物实验。
对比例2
一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：
猪皮细胞外基质纳米纤维微粉9％
盐酸1％
超纯水余量。
将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌混合均匀，用碳酸氢钠溶液调节pH为6.5,进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。
3D打印成型方法，包括如下步骤：
按上述实施例1的3D打印成型方法进行3D打印，然后将水洗、交联以定型。
性能测试
经该实施例1-4及对比例1、2所得3D水凝胶支架在38℃温度下，对弹性模量，损耗模量,断裂伸长率进行测试，并对动物实验过程完整性的保持性能进行的测试。具体性能参见表1。
表1 3D水凝胶支架的性能
从以上数据可以看出，所有样品均具有固体属性(弹性模量远大于损耗模量)，具有一定的力学强度、结构稳定性以及耐拉伸性能。不过，各实施例因化学成分或配方量不同，其性能有一定差异；若应用于生物医学，必然产生不同的效果。其中，实施例2与4具有最高的弹性模量与损耗模量，表明其强度最高，但实施例2有瑕疵，太硬，手感差，其应用效果并不好。实施例3使用了相对较高的猪皮细胞外基质纳米纤维微粉(15％)，而实施例3使用了较低浓度的猪皮细胞外基质纳米纤维微粉，以及胞外囊泡，其力学性能并不突出，不过其耐拉伸性能却最佳，表明调整材料的组成有助于获取延展性或柔韧性好的材料。对比例1在3D打印过程未进行交联和定型，其结构稳定性较差，材料发粘，表面粗糙且易脆。对比例2仅在组分上缺少胞外囊泡，但采用本发明的打印方法仍具有稳定的结构，因此，本打印方法适用于天然高分子材料，尤其是软组织源性细胞外基质纳米纤维粉为主要原料的3D打印生物墨水。
内皮细胞成管实验
将实施例1的生物墨水和对比例2的生物墨水分别铺于24孔板底部，低温冷冻定型后，PBS缓冲溶液浸洗，以2.5×104每孔的密度接种人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后加入EGM-2培养液，37℃培养箱内培养12小时后在光镜下检测内皮细胞成管情况，具体结果见表2。
从表2可以看出，实施例1的生物墨水-HUVEC共培养的成管数目大于对比例2的生物墨水-HUVEC共培养，且平均血管长度高于对比例2的生物墨水-HUVEC共培养的，*p＜0.05。考虑实施例1中所含的胞外囊泡发挥了促血管化效用，提示实施例1的生物活性优于不含胞外囊泡的对比例2生物墨水。
表2内皮细胞成管实验结果对比
Claims (9)
1.一种3D生物打印成型方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)3D生物打印：利用3D打印机将3D打印生物墨水按照建好的数字模型，由10-50℃的墨水注射筒经针头打印到0-10℃的接收平台上；打印后，在0-10℃环境下储存5-120分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；
(2)交联：定型的凝胶材料进行水洗；然后加入交联剂，于0-10℃的条件下交联反应0.5-48h；最后再进行水洗，洗去残余交联剂；
所述3D打印生物墨水为以软组织源性细胞外基质纳米纤维粉为主要原料。
2.如权利要求1所述的3D生物打印成型方法，所述软组织源性细胞外基质纳米纤维粉包括猪、牛或羊真皮组织源性细胞外基质纳米纤维微粉。
3.如权利要求1所述的3D生物打印成型方法，所述交联剂包括戊二醛、京尼平或碳酸二亚胺。
4.如权利要求1所述的3D生物打印成型方法，所述交联剂的用量为3D打印生物墨水用量的0.1-0.5％。
5.如权利要求1所述的3D生物打印成型方法，所述3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：
胞外囊泡混悬液10-30％；
猪、牛或羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉5-15％；
促溶剂0.1-1％；
余量水。
6.如权利要求5所述的3D生物打印成型方法，所述胞外囊泡混悬液是从异体/自体/异种来源的细胞、体液中提取得到的胞外囊泡悬浮于PBS缓冲液中制得。
7.如权利要求3所述的3D打印生物墨水，所述猪、牛或羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉的平均粒径低于30μm。
8.如权利要求1所述的3D打印生物墨水，所述水包括蒸馏水、超纯水，所述促溶剂包括盐酸、磷酸或醋酸。
9.如权利要求5所述的3D生物打印成型方法，所述3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
将猪、牛或羊真皮组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、促溶剂与水混合，搅拌至溶解完全搅拌，然后调节pH为6-7.45，加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到3D打印生物墨水。
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