CN105582576A - 提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料、制备方法及用途 - Google Patents

提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料、制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料、制备方法及用途，该生物材料由氧化硫酸软骨素(CS)与I型胶原(Col？I)通过原位分子间交联构建的聚电解质多层膜，其中最外层成分为CS；CS、Col？I的组装浓度分别为0.5～2mg/mL；CS的氧化度为25％～50％；组装条件为：pH？4.0～5.0，离子强度为0.15mol/L？NaCl；温度为室温。本发明结合材料和细胞的优势，可广泛应用于促进组织损伤的血管再生和修复。血管新生有助于减少组织损伤和促进损伤骨组织的修复，因此具有血管新生能力的EPCs及EPC-EXs在骨损伤修复中具有广阔的临床运用前景。

Description

提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料、制备方法及用途，用于骨损伤的再生修复，属于医疗技术领域。
背景技术
外泌体(Exosomes,EXs)是细胞活化或凋亡时释放的一类具有生物学活性的小囊泡(直径为30-150nm)，其内载有功能性蛋白质、mRNAs及microRNAs(miRs)等物质，是实现细胞间相互交流和相互影响的重要介质。最新研究发现干细胞分泌EXs在组织损伤修复与再生过程中发挥着关键作用的重要成分。在适宜条件下，干细胞分泌的EXs通过携带某些与组织再生相关的miRs(如与干细胞抗氧化凋亡能力或与干细胞分化相关)及其下游“有益”的生物信息，可以促进骨骼肌再生、血管形成、神经再生、减少心肌损伤、保护急性肾小管损伤、减少肺损伤等。干细胞促进骨再生修复存在一些缺陷，例如干细胞治疗可能导致肿瘤形成，也可能使得非骨组织中出现骨化和钙化现象，利用干细胞EXs修复组织损伤不仅可获得与干细胞治疗类似的疗效，还可避免干细胞治疗带来的风险，为临床患者提供治疗新策略。因此与干细胞治疗相比，干细胞EXs的生物学治疗在临床应用上亦具有重要潜力和诸多优势。
受限于人体组织有限的再生修复能力，骨缺损的修复重建一直是骨科的一大难题。骨是一种高度血管化的组织，血管新生有助于减少组织损伤和促进损伤组织的修复，因此血管生成是骨再生修复过程中一个至关重要的基本环节。内皮祖细胞(EndothelialProgenitorCells,EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，具有促进体内血管生成和维持血液系统的稳态的能力。国内外许多研究证实,EPCs可以通过增强骨修复过程中的血管生成与骨形成能力来促进骨缺损修复。然而，目前关于EPCs所释放的EXs(EPC-EXs)对骨缺损修复的研究却鲜见报道，而且EPC-EXs对骨缺损修复的作用也值得深入研究。
EXs的生物学特性与干细胞所处微环境也密切相关，生物材料等刺激可改变细胞表型产生不同应答，从而分泌特异性EXs。在现代组织工程与再生医学中，通过模拟天然干细胞微环境仿生构建生物材料，调节干细胞与材料间相互作用，从而可以调控细胞行为与功能。那么，通过生物材料微环境调控干细胞EXs释放及其功能应当也是现实可行的。然而，目前在这一领域并没有更深入的研究。我们最新的研究发现，通过以I型胶原和糖胺多糖为基元仿生构建类细胞外基质聚电解质膜后发现，在不同聚电解质膜上EPCs呈现出不同的生长行为，更重要的是，EPC-EXs的量及其内含物成分也存在明显差异。提示通过生物材料模拟干细胞微环境，从而调控干细胞EXs生物学特性这一思路的可行性。
发明内容
本发明提供一种提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料、制备方法及用途，利用生物材料诱导EPCs分泌功能性EXs，通过层层自组装技术制备聚电解质多层膜，通过调节聚电解质膜分子组成、最外层成分以及交联强度，考察不同刺激因素对EPC-EXs释放及内容物成分(miR-126)的影响。
本发明的技术方案如下：
提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料，其特征在于：该生物材料由氧化硫酸软骨素(CS)与I型胶原(ColI)通过原位分子间交联构建的聚电解质多层膜，其中最外层成分为CS；CS、ColI的组装浓度分别为0.5～2mg/mL；CS的氧化度为25％～50％；组装条件为：pH4.0～5.0，离子强度为0.15mol/LNaCl；温度为室温。
所述提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：一、以玻璃或培养板为组装基底，室温条件下首先组装基底浸入pH7.4、浓度为5mg/mL聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，使组装基底在表面组装一层带正电的PEI基础层；二、将PEI修饰后的玻璃片或培养板浸入浓度为0.5～2mg/mL的CS溶液中10～15min，用洗脱液洗2～4次洗脱多余的CS，再浸入浓度为0.5～2mg/mL的ColI溶液中15～20min，用洗脱液洗2～4次洗脱多余的ColI溶液；重复步骤二，使CS与ColI在基底层上交替吸附，最终得到最外层为CS的聚电解质多层膜。
所述的洗脱液为pH4.0～5.0、浓度0.15mol/L的氯化钠溶液。
每次洗脱液的洗脱时间为3～5分钟。
利用上述的提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料用于制备治疗骨缺损修复的药物。
本发明利用生物材料诱导EPCs分泌功能性EXs，通过层层自组装技术制备聚电解质多层膜，通过调节聚电解质膜分子组成、最外层成分以及交联强度，考察不同刺激因素对EPC-EXs释放及内容物成分(miR-126)的影响。
本发明结合材料和细胞的优势，可广泛应用于促进组织损伤的血管再生和修复。血管新生有助于减少组织损伤和促进损伤骨组织的修复，因此具有血管新生能力的EPCs及EPC-EXs在骨损伤修复中具有广阔的临床运用前景。本研究具有操作简单，效果显著，结果稳定等优点，不仅提升了EPCs自身的功能，同时促进了EPC-EXs的释放和有益miR-126的含量，可提高EPC-EXs的功能性作用。本项目可为骨科相关疾病治疗提供一种新的技术手段。
附图说明
图1为不同聚电解质膜材料对EPC-EXs释放的影响。
图2为不同聚电解质膜材料对EPC-EXs中miR-126含量的影响。
具体实施方式
实施例一：提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料，其特征在于：该生物材料由氧化硫酸软骨素(CS)与I型胶原(ColI)通过原位分子间交联构建的聚电解质多层膜，其中最外层成分为CS；CS与ColI的组装浓度分别为0.5mg/mL；CS的氧化度为25％；组装条件为：pH4.0，离子强度为0.15mol/LNaCl,温度为室温。
所述提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：一、以培养板为组装基底，室温条件下首先组装基底浸入pH7.4、浓度为5mg/mL聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，使组装基底在表面组装一层带正电的PEI基础层；二、将PEI修饰后的培养板浸入浓度为0.5mg/mL的CS溶液中15min，用洗脱液洗3次洗脱多余的CS，再浸入浓度为0.5mg/mL的ColI溶液中20min，用洗脱液洗3次洗脱多余的ColI溶液；重复步骤二，使CS与ColI在基底层上交替吸附，最终得到最外层为CS的聚电解质多层膜。所述的洗脱液为pH4、浓度0.15mol/L的氯化钠溶液。每次洗脱液的洗脱时间为5分钟。
实施例二：
提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料，其特征在于：该生物材料由氧化硫酸软骨素(CS)或氧化透明质酸(HA)与I型胶原(ColI)通过原位分子间交联构建的聚电解质多层膜，其中最外层成分为CS；CS与ColI的组装浓度分别为2mg/mL；CS的氧化度为50％；组装条件为：pH5.0，离子强度为0.15mol/LNaCl,温度为室温。
所述提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：一、以培养板为组装基底，室温条件下首先组装基底浸入pH7.4、浓度为5mg/mL聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，使组装基底在表面组装一层带正电的PEI基础层；二、将PEI修饰后的培养板浸入浓度为2mg/mL的CS溶液中10min，用洗脱液洗2次洗脱多余的CS，再浸入浓度为2mg/mL的ColI溶液中15min，用洗脱液洗2次洗脱多余的ColI溶液；重复步骤二，使CS与ColI在基底层上交替吸附，最终得到最外层为CS的聚电解质多层膜。所述的洗脱液为pH5、浓度0.15mol/L的氯化钠溶液。每次洗脱液的洗脱时间为3分钟。
实施例三：
提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料，其特征在于：该生物材料由氧化硫酸软骨素(CS)与I型胶原(ColI)通过原位分子间交联构建的聚电解质多层膜，其中最外层成分为CS；CS与ColI的组装浓度分别为1.0mg/mL；CS的氧化度为40％；组装条件为：pH4.5，离子强度为0.15mol/LNaCl,温度为室温。
所述提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：一、以培养板为组装基底，室温条件下首先组装基底浸入pH7.4、浓度为5mg/mL聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，使组装基底在表面组装一层带正电的PEI基础层；二、将PEI修饰后的培养板浸入浓度为1.0mg/mL的CS溶液中12min，用洗脱液洗4次洗脱多余的CS，再浸入浓度为1.0mg/mL的ColI溶液中18min，用洗脱液洗4次洗脱多余的ColI溶液；重复步骤二，使CS与ColI在基底层上交替吸附，最终得到最外层为CS的聚电解质多层膜。所述的洗脱液为pH4.5、浓度0.15mol/L的氯化钠溶液。每次洗脱液的洗脱时间为4分钟。
聚电解质多层膜组装条件的确定包括以下步骤：
1)分别以氧化糖胺多糖(GAG)(氧化硫酸软骨[CS]、氧化透明质酸[HA]或氧化肝素[HEP])为聚阴离子，I型胶原(ColI)为聚阳离子，分别调节组装条件(聚电解质浓度、pH条件、温度、离子强度)，利用石英晶体微天平(QCM)考察聚电解质膜的组装行为；采用椭谱仪检测膜厚度；利用接触角(WCA)、SurPASS电位分析仪、原子力显微镜(AFM)等手段研究和表征聚电解质膜的理化特性及整体微观形貌，根据结果分析确定最佳聚电解质膜组装条件。
对上述三个实施例的聚电解质膜分子交联强度的确定按以下步骤进行：
1)根据上一步研究结果，选择适宜组装条件，通过调节糖胺多糖(CS，HA，HEP)的氧化度，调控高分子间交联度，构建具有不同硬度的聚电解质多层膜；利用QCM考察聚电解质膜的组装行为与粘弹性；利用纳米压痕仪、紫外分光光度计和椭谱仪分别检测膜硬度、交联强度和厚度；采用WCA、SurPASS电位分析仪、AFM等手段研究和表征聚电解质膜的理化特性及整体微观形貌；
2)EPCs接种至各聚电解质膜表面后，特定时间点收集EPC-EXs，采用流式、TEM、NTA等对EPC-EXs的表型、形貌、粒径和浓度等进行研究和鉴定；利用基因芯片技术分析各培养条件下EPC-EXs中与骨组织修复以及miR-126的表达情况。通过数据分析，确定最佳GAG氧化度即聚电解质膜分子交联强度。
对上述三个实施例的聚电解质膜分子组成及其最外层成分的确定包括以下步骤：
1)根据上一步研究结果，选择具有最佳氧化度的GAG(CS、HA或HEP)为聚阴离子，ColI为聚阳离子，构建最外层成分分别为CS、HA、HEP或ColI的聚电解质多层膜；
2)EPCs接种至各聚电解质膜表面后，特定时间点收集EPC-EXs，采用流式、透射电镜(TEM)、纳米颗粒分析系统(NanoparticleTrackingAnalysis,NTA)等对EPC-EXs的表型、形貌、粒径和浓度等进行研究和鉴定；利用基因芯片技术分析各培养条件下EPC-EXs中与骨组织修复以及miR-126的表达情况。通过数据分析，确定最佳聚电解质膜分子组成及其最外层成分。
用实施例一的生物材料作以下实验
EPC-EXs与骨组织工程支架材料复合修复骨质疏松模型大鼠骨缺损包括以下步骤：
1)选用商业化骨组织工程支架材料为原料，以氧化硫酸软骨素、EPC-EXs和ColI为组装单元，通过层层自组装技术将EPC-EXs负载至支架材料上，其中通过荧光素酶对EPC-EXs进行标记，将该复合材料植入大鼠骨缺损部位，通过小动物成像系统实时监测骨缺损修复情况以及EPC-EXs在体内的动态过程；
2)植入后不同时间点，处死实验动物，通过病理组织学观察、Micro-CT、骨密度仪、电子万能力学实验系统等对骨形态学、离体BMD、骨生物力学等进行分析。明确该生物复合材料对骨质疏松骨缺损的修复效果。
EPC-EXs与微载体复合修复骨质疏松模型大鼠骨折包括以下步骤：
1)将EPC-EXs均匀分散至海藻酸钠溶液中，通过将混合液缓慢注射至富含钙离子溶液中，形成包埋EPC-EXs的微球。其中通过荧光素酶对EPC-EXs进行标记，将包载EPC-EXs的微球注入大鼠骨折部位，通过小动物成像系统实时监测骨折愈合情况以及EPC-EXs在体内的动态过程；
2)植入后不同时间点，处死实验动物，通过病理组织学观察、Micro-CT、骨密度仪、电子万能力学实验系统等对骨形态学、离体BMD、骨生物力学等进行分析。明确EPC-EXs微载体对骨质疏松骨折愈合的修复效果。
以下是本项目具体的实施案例和已取得的技术结果。
取C57/B1老鼠(8-10周)的股骨和胫骨，用含培养基冲出骨髓，利用密度梯度离心将骨髓单个核细胞(bonemarrowmononuclearcells，MNCs)分离出来。将MNCs接种在纤维连接蛋白包被的培养板中，培养3天后，收集贴壁细胞即为EPCs。PEI为基底层，进而以CS或HA为聚阴离子，ColI为聚阳离子，在基底层上进行层层自组装得到具有不同分子组成与最外层成分的聚电解质多层膜。EPCs用PBS清洗一次后接种于不同聚电解质膜上，培养48小时。将EPC培养液收集,利用分度离心获得EPC-EXs沉淀。得到EPC-EXs沉淀后加入600μl过滤处理的PBS做NTA分析。
图1的结果显示，四种聚电解质膜均可提高EPC-EXs的释放，其中以最外层为CS的聚电解质膜效果为最好。
从不同聚电解质膜涂层培养皿中收集和提取EPC-EXs的方法同前；将EPC-EXs的总miRNA用mirVanamiRNeasyMinikit(QIAGEN)提取出来；采用miScriptreversetranscriptionkit(QIAGEN)将总miRNA逆转录成cDNA，选取U6基因为内参基因，作为实时荧光定量结果数据的矫正基因，然后采用PCR扩增检测miR-126表达。
图2的结果显示，四种聚电解质膜均可提高EPC-EXs中miR-126的含量，其中以最外层为CS的聚电解质膜效果为最好。

Claims (5)

1.提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料，其特征在于：该生物材料由氧化硫酸软骨素(CS)与I型胶原(ColI)通过原位分子间交联构建的聚电解质多层膜，其中最外层成分为CS；CS、ColI的组装浓度分别为0.5～2mg/mL；CS的氧化度为25％～50％；组装条件为：pH4.0～5.0，离子强度为0.15mol/LNaCl；温度为室温。
2.权利要求1所述提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：一、以玻璃片或培养板为组装基底，室温条件下首先组装基底浸入pH7.4、浓度为5mg/mL聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，使组装基底在表面组装一层带正电的PEI基础层；二、将PEI修饰后的玻璃片或培养板浸入浓度为0.5～2mg/mL的CS溶液中10～15min，用洗脱液洗2～4次洗脱多余的CS，再浸入浓度为0.5～2mg/mL的ColI溶液中15～20min，用洗脱液洗2～4次洗脱多余的ColI溶液；重复步骤二，使CS与ColI在基底层上交替吸附，最终得到最外层为CS的聚电解质多层膜。
3.权利要求2所述提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料的制备方法，其特征在于：所述的洗脱液为pH4.0～5.0、浓度0.15mol/L的氯化钠溶液。
4.权利要求3所述提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料的制备方法，其特征在于：每次洗脱液的洗脱时间为3～5分钟。
5.利用权利要求1所述的提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料用于制备治疗骨缺损修复的药物。
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