CN104758981A

CN104758981A - 一种促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜及其制备方法

Info

Publication number: CN104758981A
Application number: CN201510103992.5A
Authority: CN
Inventors: 龚逸鸿; 庄良婷; 李燕; 曹智楠; 李裕民; 蒋庆
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2015-03-10
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2015-07-08

Abstract

本发明公开了一种促成骨化的生物材料表面改性方法和一种促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜。具体是利用层层自组装技术及生长因子缓控释技术，以酪蛋白和肝素作为负电大分子层，胶原和生长因子作为正电大分子层，在生物材料表面构建层层静电自组装的生物多层膜，得到的多层膜为酪蛋白/肝素层和生长因子/胶原层的循环。本发明创造性地将四种具有优异物化性质的生物大分子交替沉积到同一基底材料上，不仅很好的保护了生长因子的生物活性，而且可以调控生长因子的负载量和缓释；并且具有良好的促生物矿化及成骨化能力，同时能够提高骨髓间充质干细胞的粘附、生长和增殖能力，可广泛应用于软骨、骨、血管、神经和心脏瓣膜等组织修复工程。

Description

一种促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程医用材料领域。更具体地，涉及一种促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜及其制备方法。

背景技术

高分子生物材料由于具有良好的物理机械性能和化学稳定性能而被广泛应用于人造器官、组织工程、外形整形，以及药物控释等领域。然而大多数人工合成的高分子材料如聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）和聚氨酯（PU）等，表面都是生物学惰性的，不具有生物活性和细胞组织相容性，缺乏细胞特异性识别位点，也缺乏高效的生物调节功能，因此与基体有更多相互作用的生物材料越来越受到研究重视。人工合成的高分子生物材料表面改性技术既可赋予材料表面良好的细胞相容性，又可以保留材料本体的性质如化学与降解性能、物理机械性能等不发生变化，因而被广泛采用。

在众多生物材料表面改性方法中，静电层层自组装法是一种简单而又高效的方法，具有很多优点：普遍性、层与层之间存在较强的相互作用、操作简单和对基底材料形状、尺寸没有严格要求；更重要的是该方法采用的是利用静电力而非化学键将生物大分子固定在材料表面，最大限度的维持了生物大分子的活性，这对于生物材料的性能来说至关重要。目前已有研究利用胶原-肝素层层自组装多层膜修饰钛表面，钛的细胞相容性得到较好改善。因此，利用该技术进一步探索研究出细胞相容性和综合性能更好的高分子生物材料，对于医学组织工程的应用具有重大的意义。

但是，静电层层自组装需要使用分别带有正负电荷的大分子中、强电解质才能实现多层膜的组装，对于生物材料来说，既满足静电层层自组装条件，同时具有良好的生物相容性的分子对相对较少，因此选择、寻找、开发新的静电层层自组装分子对成为该技术发展的关键之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有促成骨化的组织工程医用材料的不足，目的在于通过层层自组装法引入酪蛋白和生长因子到生物材料表面，使之具有生物相容性好、促成骨分化的生物材料界面，并提供一种行之有效的生长因子缓释方式；提供一种负载功能性蛋白质的、具有细胞相容性、促成骨分化、生长因子持续缓释作用的酪蛋白-生长因子复合多层膜，为骨修复与再生材料表面生物活性化和功能化提供了一种简单、行之有效的方法。

本发明的目的是提供一种促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜（即酪蛋白/生长因子复合多层膜）及其制备方法。

本发明另一目的是提供所述促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种可促生物矿化及成骨化的生物材料表面改性方法，是利用层层自组装技术及生长因子缓控释技术，以酪蛋白和肝素作为负电大分子层，胶原和生长因子（含肝素特异性结合位点，如aFGF、bFGF或BMP2、VEGF ）作为正电大分子层，在生物材料表面构建层层静电自组装的生物多层膜；所述生物材料为医用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己内酯或明胶。

该技术使用超分子静电力而非化学键的方式，将生物蛋白及生长因子有效地引入生物材料表面，可最大限度地保证生物蛋白及生长因子的活性不受破坏，多层膜中的酪蛋白具有良好的促进生物矿化特性，胶原可有效地提高材料表面细胞亲和力，肝素特异性结合生长因子，可以很好地保护生长因子的活性，从而获得适宜于成骨再生的材料界面。该技术操作简单，可重复性好，可通过改变组装条件有效地调节生物蛋白、生长因子的负载量，可用于植入性骨科材料（如降解骨钉、骨填充材料）表面及骨组织工程材料表面修饰，具有良好的应用前景。

本发明还提供了一种促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜，是利用层层自组装技术及生长因子缓控释技术，以酪蛋白和肝素作为负电大分子层，胶原和生长因子作为正电大分子层，在生物材料表面构建层层静电自组装的生物多层膜得到；制备得到的复合多层膜为酪蛋白/肝素层和生长因子/胶原层的循环。

利用层层自组装技术构建促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜，能有效和持续地释放生长因子，并具有良好的细胞相容性和促矿化性能。其中生物材料包括但不限于常用于骨科修复中经常采用的医用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己内酯、明胶等，材料表面包含氨基或可通过简单表面化学改性后带有氨基的生物材料均适用于本发明。其中生长因子包括但不限于aFGF、bFGF、BMP2或VEGF等，含有肝素特异性结合位点、可与肝素形成特异性生物结合的生长因子均适用于本发明。

具体地，上述促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜的制备方法包括如下步骤：

S1.将基片表面进行氨基化处理；

S2.将表面氨基化的基片置于肝素/酪蛋白混合溶液中，浸泡5～30min，使得肝素和酪蛋白吸附到基片表面；然后移至pH值为5～12的HEPES溶液中漂洗3～5次；所述肝素/酪蛋白混合溶液中肝素的浓度为0.01～10mg/mL，酪蛋白的浓度为0.1～10mg/mL；

S3.将S2得到的完成组装聚阴电解质的基片置于生长因子/胶原混合溶液中，浸泡5～30min，使得生长因子和胶原吸附到膜表面，然后移至pH值为5～12的HEPES溶液中漂洗3～5次；所述生长因子/胶原混合溶液中生长因子的浓度为0.1～10mg/mL，胶原的浓度为0.1～10mg/mL；

S4.步骤S3完成后，多次循环重复步骤S2和S3（即将S3处理后的基片按照步骤S2和S3交替浸入酪蛋白/肝素溶液和生长因子胶原溶液中），即得到促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜。

该制备方法将天然具有矿化能力的酪蛋白引入到材料表面，并使之稳定和保持良好的生物活性；肝素和生长因子特异性的结合，从而保护生长因子的生物活性，而且可以通过改变肝素的浓度，调控肝素的负载量，从而调控生长因子的负载量，得到结构及释放速率可控的生长因子复合多层膜。

其中，步骤S1所述氨基化处理是指将基片浸泡在体积比1：9的己二胺异丙醇溶液中，37℃胺解1h，再用纯水清洗干净。

优选地，步骤S1所述基片是医用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己内酯或明胶。

优选地，步骤S2所述肝素/酪蛋白溶液中肝素的浓度为0.04、0.4或4mg/mL；酪蛋白的浓度为0.2mg/mL。

优选地，步骤S3所述生长因子/胶原溶液中生长因子的浓度为0.2mg/mL；胶原的浓度为1mg/mL。

优选地，所述aFGF/胶原溶液用乙酸调节其pH至4.8。

优选地，步骤S2或S3所述HEPES溶液的配方为：2.383g Hepes和 8.770g NaCl 溶于1000mL纯水，加NaOH 调PH 7.0。

另外，步骤S3所述生长因子是细胞粘附因子、细胞生长因子或细胞分化因子，可根据不同应用需求而负载相应的生长因子，具有灵活性。

优选地，步骤S3所述生长因子为酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、bFGF、BMP2或VEGF。更优选地，所述生长因子为酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）。

上述促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜在作为组织工程医用材料方面的应用也应在本发明的保护范围之内。优选地，是作为组织工程中骨缺损修复材料的应用。

本发明涉及医用材料的表面改性，功能性的蛋白质负载，生长因子缓释，具体涉及利用层层自组装技术构建促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜的方法。选取酪蛋白和肝素作为负电大分子层，胶原和生长因子为正电大分子层，很好地满足了骨修复和再生中对于生物矿化和组织再生的特定要求。

酪蛋白是牛奶的主要组成成分，由乳腺上皮细胞合成的，是乳中特有的一组含有大量磷和钙的蛋白，磷以磷酸酯键的形式与丝氨酸（Ser）的羟基结合。除磷和钙外，酪蛋白含有少量的己糖、氨基糖和唾液酸等残基。酪蛋白不是单一组分的蛋白质，而是由一类在结构和性质上相近的蛋白质组成的，包括αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白。它们都是链状的两亲性蛋白质，主要特征是有高含量的磷酸丝氨酸残基和相当多的脯氨酸。其中β-酪蛋白具有许多独特的结构，一级结构含有5个磷酸丝氨酸，结合位点集中在N端，主要肽链的第14~21位，丰富的磷酸丝氨酸结构能够形成一个高度的磷酸化区，使得酪蛋白很容易吸附钙离子而凝聚成沉淀，形成类似骨组织的磷灰石，因此，酪蛋白在骨组织工程中具有巨大的应用潜力，但目前还未被重视和较少使用。

生长因子（Growth factor）是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质，存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。生长因子是一类多肽类物质，在组织的形成中扮演着重要的角色，对细胞的粘附、增殖、迁移、分化、基因表达起调控作用，并且不同组织器官细胞所需要的生长因子不同。生长因子在一般的环境中活性半衰期短，因此，在组织支架中如何负载生长因子、并维持生长因子的活性和有效活性剂量，以及在体内的释放和剂量调控，是当前组织工程支架要解决的问题。传统的负载生长因子方法主要有物理吸附法、化学固定法和凝胶包埋。这些负载方式不能有效地保持生长因子的活性或无法得到长时间的释放效果。

本发明利用层层自组装技术改善生物材料表面的生物相容性，提供一种行之有效的生长因子缓释方式，把酸性成纤维细胞生长因子（如酸性成纤维细胞生长因子aFGF）和酪蛋白负载到生物材料表面，酪蛋白对钙离子有良好的吸引和接收能力，使其在材料表面沉淀和聚集，形成类似骨组织的磷灰石，从而构建了生物相容性好、促成骨化的生物材料界面。静电吸附的物理作用既不会破坏生物大分子的结构，而且作为聚阴离子的肝素和aFGF有很高的特异性结合能力，能够有效提高aFGF的生物活性和稳定性，并通过改变肝素的组装浓度，从而调节酸性成纤维细胞生长因子的负载量，控制生长因子有效和持续地释放。并且创造性地引入了天然具有促生物矿化的生物大分子酪蛋白，从而构建具有促成骨化特性的生物活性复合多层膜。为组织工程支架材料表面生物活性化和功能化提供了一种简单、行之有效的方法。

以常用的生物可降解聚酯材料为基底材料，不同的聚阴和聚阳解质交替组装到聚酯基体表面，构成了促成骨化的酪蛋白/生长因子复合多层膜，其中，每个循环中，第一层物质为酪蛋白和肝素，第二层为生长因子和胶原。创造性地将四种具有优异物化性质的生物大分子交替沉积到同一基底材料上，并根据肝素特异性结合生长因子这一特性，从而通过改变肝素的浓度，调节生长因子的负载量。特别地，引入了天然具有生物矿化能力的生物大分子酪蛋白，对钙离子有很强的吸附力，从而钙离子在材料表面沉淀、凝聚成团，形成类似骨组织的磷灰石，为构建促成骨化复合膜提供了依据。

本发明实施例中采用的技术及表征手段包括复合多层膜构建、甲苯胺蓝法测定肝素含量、FITC标记酪蛋白和罗丹明标记aFGF的荧光追踪、模拟体液体外矿化以及细胞相容性评价。为了监控和验证技术的有效性，以及复合多层膜的作用，本发明主要采用以下方法进行检测：

（1）甲苯胺蓝法测定层层自组装过程中，负载在生物材料上的肝素量不断增加，从而证明组装的成功发生。肝素可与甲苯胺蓝分子相结合，而发生颜色变化，甲苯胺蓝由蓝色转变成紫色，通过测定与甲苯胺蓝结合后复合多层膜的吸光值，以及肝素浓度和吸光值对应关系的标准曲线，即可得到复合多层膜中肝素的含量；分析不同组装层数，肝素负载量的变化情况。

（2）通过测定RD-aFGF的荧光强度的变化，判断生长因子负载情况。用罗丹明标记的生长因子（RD-aFGF）替代未标记的aFGF进行层层自组装，通过测定复合多层膜的荧光强度随组装层数的增加，从而判断生长因子的成功组装和负载。

（3）通过测定FITC-casein的荧光强度的变化，从而监测酪蛋白的成功负载和复合多层膜中酪蛋白（casein）的含量，以及组装发生的过程。用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的酪蛋白（FITC-casein）替代未标记的酪蛋白进行层层自组装，通过测定复合多层膜的荧光强度，从而监控自组装的发生，检测组装过程中，酪蛋白含量的变化。

（4）扫描电子显微镜观察膜材料体外矿化后的表面形貌。体外矿化实验：把负载了酪蛋白/生长因子的复合多层膜浸泡在模拟体液中，并置于37℃、0.5% CO₂的培养箱中孵育，隔天换液，7天和14天后，取样清洗干燥后，扫描电镜下观察复合膜的体外矿化特征。

（5）荧光素二乙酸酯（FDA）染色检测骨髓间充质干细胞在生长因子复合多层膜上的粘附以及生长情况；四唑盐(MTT)比色法测定骨髓间充质干细胞在生长因子复合多层膜上的活性以及增殖情况。把P4代的人骨髓间充质干细胞在接种于灭菌后的膜材料上，经一定时间的培养后，进行活细胞染色和细胞活性检测。

（6）细胞骨架染色检测人源成骨细胞在生长因子复合多层膜上的粘附以及铺展情况。在灭菌后的复合多层膜上接种人源成骨细胞，培养5天、7天分别取样，进行细胞骨架染色和荧光定量PCR检测，荧光定量PCR测定人源成骨细胞在生长因子复合多层膜上分化情况。

本发明具有以下有益效果：

本发明利用层层自组装技术把酪蛋白和生长因子负载到生物材料表面，创造性地将四种具有优异物化性质的生物大分子交替沉积到同一基底材料上，构建了促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜，通过肝素和生长因子特异性的结合，从而很好保护生长因子的生物活性，并且可以通过改变肝素的浓度，控制复合多层膜中肝素的含量，从而调控生长因子的负载量，而且生长因子可从聚电解质复合多层膜中有效、持续地释放。

另外，引入了天然具有生物矿化能力的生物大分子酪蛋白，对钙离子有很强的吸附力，从而钙离子在材料表面沉淀、凝聚成团，形成类似骨组织的磷灰石，为构建促成骨化复合膜提供了依据。负载到材料表面的酪蛋白具有良好的促生物矿化能力，从而得到具有促成骨化的生物活性膜。生物活性膜很好地提高骨髓间充质干细胞的粘附、生长、增殖能力；并且体外矿化实验表明，钙离子能有效地在该复合膜表面沉淀、聚集，并形成类似骨组织的磷灰石，为促干细胞成骨化提供了可能性，可用于组织工程中骨缺损修复。

同时，本发明制备促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜的方法操作简单，可重复性好，能很好保护生长因子的生物活性，且具有促成骨化的潜能，可广泛应用于软骨、骨、血管、神经和心脏瓣膜等组织工程。

附图说明

图1为本发明制备促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜过程中肝素含量的变化情况。

图2为本发明制备促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜过程中的生长因子含量的变化情况。

图3为本发明制备促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜过程中酪蛋白含量的变化情况。

图4为本发明促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜在体外矿化的能力表征。

图5为本发明促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜上骨髓间充质干细胞的粘附和生长情况。

图6为本发明促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜上骨髓间充质干细胞的增殖能力。

图7 为本发明促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜上人源成骨细胞粘附、铺展情况。

图8为本发明促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜上人源成骨细胞的成骨分化特异基因OPN的表达情况。

图9为本发明促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜上人源成骨细胞的成骨分化特异基因OC的表达情况。

图10为本发明促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜上人源成骨细胞的成骨分化特异基因ALP的表达情况。

图11为本发明促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜上人源成骨细胞的成骨分化特异基因COLI的表达情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 层层自组装法构建促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜

1、制备

S1.利用己二胺处理，将基片表面进行氨基化处理；

S2.将表面氨基化的基片置于用HEPES配制的肝素/酪蛋白溶液（负电大分子组装溶液）中，浸泡15min，使PU表面吸附上一层带负电的酪蛋白和肝素；然后移至pH值为7的HEPES溶液中漂洗3次；

所述肝素/酪蛋白溶液中酪蛋白的浓度为0.2 mg/mL和肝素的浓度为4 mg/mL；

S3.将S2得到的完成组装聚阴电解质的基片置于aFGF/胶原溶液（正电大分子组装溶液）中，浸泡15min，以吸附单分子层胶原和aFGF；然后移至pH值为7的HEPES溶液中漂洗3次；

所述aFGF/胶原溶液用乙酸调节其pH至4.8，所述aFGF/胶原溶液中胶原的浓度为1.0 mg/mL，aFGF的浓度为0.2 mg/mL；

S4.步骤S3完成后，多次循环重复步骤S2和S3，即得到促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜（根据循环次数不同，可得到不同组装层数的复合多层膜）。

其中，步骤S2或S3所述HEPES溶液的配方为：2.383g Hepes和 8.770g NaCl 溶于1000mL纯水，加NaOH 调PH 7.0。

实施例2 通过组装层数调控肝素在复合多层膜中的含量

按照实施例1的方法制备复合多层膜，利用甲苯胺蓝法测定肝素在层层自组装过程中的含量。

1、测定复合多层膜上负载肝素的含量

（1）根据实施1进行组装，每组装上一层肝素后，把复合多层膜浸泡在500μL的甲苯胺蓝缓冲液中，摇床混合30min；所述甲苯胺蓝缓冲液的配方为：称取0.2g NaCl，100uL36%浓盐酸和5mg 甲苯胺蓝溶于1000mL去离子水。

（2）加入1mL的正己烷，摇床混合均匀20min；

（3）移走有机相，取下层水相，加入96孔板，在631nm波长下用紫外分光光度计检测吸收值。

（4）取1mg肝素溶于10mL水中，配成0.1mg/mL的母液，用母液配备0、1、2.5、5、10和25μg/mL等不同梯度的肝素标准液。对肝素标准液进行相同步骤，得到不同梯度浓度肝素溶液对应的吸收值，绘制吸收值与肝素浓度对应关系的标准曲线。

（5）根据肝素标准曲线计算复合多层膜上负载肝素的含量，并分析肝素负载量与组装浓度以及组装层数之间的关系。

3、结果如附图1所示，结果表明多层膜中肝素含量随组装层数增加而增加。

实施例3 通过调节组装层数来调控生长因子在多层膜中的含量

按照实施例1的方法制备复合多层膜，利用罗丹明标记酸性成纤维细胞生长因子后的荧光追踪测定酪蛋白/生长因子复合多层膜的成功构建。

1、用罗丹明（RD）标记酸性成纤维细胞生长因子（aFGF），得到罗丹明标记的酸性成纤维细胞生长因子（RD-aFGF）。

2、RD-aFGF替代未标记的aFGF，根据实施例1进行组装，每组装上一层aFGF后，用酶标仪检测其荧光强度。

3、重复步骤2，酪蛋白/生长因子复合多层膜构建完成，并分析荧光强度与组装层数之间的关系。结果如附图2所示，结果表明多层膜中生长因子含量随组装层数增加而增加。

实施例4 通过调节组装层数来调控酪蛋白在多层膜中的含量

按照实施例1的方法制备复合多层膜，利用FITC-casein荧光追踪测定酪蛋白/生长因子复合多层膜的成功构建。

1、用异硫氰酸荧光素（FITC）标记酪蛋白（casein），得到异硫氰酸荧光素标记的酪蛋白（FITC-casein）。

2、用FITC-casein替代未标记的casein，根据实施例1进行组装，每组装上一层casein后，用酶标仪检测其荧光强度。

3、重复步骤2，直到酪蛋白/生长因子复合多层膜构建完成，并分析荧光强度与组装层数之间的关系。结果如附图3所示，结果表明多层膜中酪蛋白含量随组装层数增加而增加。

实施例5 通过改变肝素组装浓度调控肝素和生长因子在复合多层膜中的含量

1、按照实施例1的方法，不同之处在于分别改变实施例1中肝素溶液浓度为0.4 mg/mL和0.04 mg/mL，可获得不同肝素含量的复合多层膜。

2、按照实施例2和3的测定方法，测定复合多层膜中肝素、生长因子的含量。

3、结果表明复合多层膜中肝素和生长因子的含量可由组装材料溶液浓度（肝素溶液浓度）进行有效的调控。

实施例6 酪蛋白/生长因子复合多层膜的体外矿化

1、配制模拟矿化液（模拟体内矿化条件），各离子浓度如下：Na⁺ 142.0 mM，K⁺ 5.0mM，Mg²⁺ 1.5mM，Ca²⁺2.5mM，Cl^- 103.0mM，HCO₃ ^- 4.2mM，HPO₄ ^2- 1.0mM，SO₄ ^2- 0.5mM。

2、把实施例1制备的酪蛋白/生长因子复合多层膜及对照组未改性的PU膜浸泡在模拟矿化液中，隔天换液；矿化后样品用去离子水轻缓冲洗后冷冻干燥。

3、将矿化样品固定于样品台上，喷金处理，置于热场发射扫描电镜下观察。

观察到7天矿化后，酪蛋白/生长因子复合多层膜表面上散落分布的羟基磷灰石；14天矿化后，羟基磷灰石沉积增加并连成了一片（如附图4所示）。表明了本发明方法制备的酪蛋白/生长因子复合多层膜具有很好的促成骨化作用。

实施例7 酪蛋白/生长因子复合多层膜的细胞相容性评价

1、将实施例1制备的复合多层膜灭菌后置于24孔板内，并把P4代骨髓间充质干细胞按2000细胞/cm²（cell/cm²）密度接种于酪蛋白/生长因子复合多层膜上，采用基础培养基（α-MEM，10% FBS，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素，0.25μg/mL二性霉素B）于37℃的5%的CO₂培养箱中培养，隔2天换液。

2、FDA染色：去掉培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗三次，加入200μL的FDA溶液，培养箱中放置10min，锡箔纸避光。取出，吸去染色液，用PBS清洗三次，加入PBS后置于荧光显微镜下观察。激发波长484nm，发射波长520nm。结果如附图5所示，本发明制备的酪蛋白-生长因子复合多层膜上骨髓间充质干细胞的粘附和生长情况非常好。

所述FDA溶液的配方为：配置5mg/mL的母液，即称5mg FDA加入1mL丙酮溶解，摇匀，避光4℃保存；使用时用PBS将FDA母液稀释1000倍，得到5μg/mL FDA溶液。

3、MTT细胞活性检测：干细胞在复合膜培养1天、3天、7天及14天后取样检测，吸掉培养基，用PBS清洗两遍，随后每孔加入MTT/PBS溶液150μL，37℃避光孵育4h，小心吸弃孔内培养上清液，用PBS清洗两遍后每孔加入150μL 二甲基亚砜（DMSO），反复吹打使结晶物溶解。将此溶液分别对应加入酶标板中，在酶标仪上设定波长为570nm处测试其光吸收值。

所述MTT/PBS溶液的配方：称取25mg MTT(3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，噻唑蓝，sigma公司)，放入小烧杯中，加入5mL PBS使之溶解，配成的溶液浓度为5mg/mL。

结果如附图6所示，本发明制备的酪蛋白-生长因子复合多层膜上骨髓间充质干细胞具有很好的增殖能力，细胞活性改善效果明显。

实施例8 人源成骨细胞在酪蛋白/生长因子复合多层膜上的粘附和生长

1、把人源成骨细胞（购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）接种在灭菌后的生长因子复合多层膜上，用全培养基（DMEM/F12，0.3 mg/mL G418，10% FBS）于37℃、5%的CO₂培养箱中培养，隔天换液。第五天取样，小心吸掉培养，用PBS清洗几遍，用4%多聚甲醇在室温环境下固定30min。

2、用1×wash buffer洗两次，用1%triton x-100浸泡5min，以穿透细胞膜，加上1% BSA室温封闭1h。用vinculin一抗（vinculin为粘着斑蛋白）室温孵育1h后，用1×wash buffer洗三遍。

3、用vinculin二抗和鬼笔环肽的混合液，室温孵育45min，用1×wash buffer洗三遍。

4、加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室温孵育3min，1×wash buffer洗三遍。

5、取样拍照，结果如附图7所示，结果表明，结果显示，复合多层膜上的成骨细胞连接成片，紧紧贴在材料的表面，形成单层的细胞面，细胞与细胞联系密切，单个细胞铺展面较大，细胞中央的突起的细胞核清晰可见。这说明本发明的酪蛋白/生长因子复合多层膜能有效促进成骨细胞的粘附及铺展。

实施例9 应用人源成骨细胞评价生长因子复合多层膜的促成骨分化能力

1、将成骨细胞接种在实施例1制备的复合多层膜上，放置在39.5℃、5%的CO₂培养箱中培养，诱导成骨细胞分化，并用组织培养专用的聚苯乙烯（TCPS）和未改性PU膜上的细胞作为阴性对照，于7天提取总RNA并反转录。

2、取用上述反转录得到的cDNA样品进行相对定量荧光PCR检测，分析TCPS、未改性PU膜和本发明制备复合多层膜上成骨细胞的成骨分化特异基因OPN、OC、ALP和COLI的表达情况，从而评价生长因子复合多层膜促成骨分化的能力。

3、结果：各处理组的成骨细胞的成骨分化特异基因OPN、OC、ALP和COLI的表达情况分别如附图8～11所示。

结果显示，本发明的酪蛋白/生长因子复合多层膜上成骨细胞的ALP、OPN、COLI以及OC基因表达非常高，这说明成骨组织的胞外基质已经逐步分泌形成、成熟以及矿化。同时，各基因的表达高于TPCS上的细胞对应基因的表达，且远高于未改性PU膜上的细胞，这说明本发明的酪蛋白/生长因子复合多层膜具有良好的促成骨分化能力。

Claims

1.一种促成骨化的生物材料表面改性方法，其特征在于，利用层层自组装技术及生长因子缓控释技术，以酪蛋白和肝素作为负电大分子层，胶原和生长因子作为正电大分子层，在生物材料表面构建层层静电自组装的生物多层膜；

所述生物材料为医用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己内酯或明胶。

2.一种促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜，其特征在于，是利用层层自组装技术及生长因子缓控释技术，以酪蛋白和肝素作为负电大分子层，胶原和生长因子作为正电大分子层，在生物材料表面构建层层静电自组装的生物多层膜得到；制备得到的复合多层膜为酪蛋白/肝素层和生长因子/胶原层的循环；

3.权利要求2所述促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

S1.将基片表面进行氨基化处理；

S2.将表面氨基化的基片置于肝素/酪蛋白混合溶液中，浸泡5～30min；然后移至pH值为5～12的HEPES溶液中漂洗3～5次；所述肝素/酪蛋白混合溶液中肝素的浓度为0.01～10mg/mL，酪蛋白的浓度为0.1～10mg/mL；

S3.将S2得到的完成组装聚阴电解质的基片置于生长因子/胶原混合溶液中，浸泡5～30min，然后移至pH值为5～12的HEPES溶液中漂洗3～5次；所述生长因子/胶原混合溶液中生长因子的浓度为0.1～10mg/mL，胶原的浓度为0.1～10mg/mL；

S4.步骤S3完成后，多次循环重复步骤S2和S3，即得到促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述氨基化处理是指将基片浸泡在体积比1：9的己二胺异丙醇溶液中，37℃胺解1h，再用纯水清洗干净。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述基片是医用聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸/乙醇酸、聚己内酯或明胶。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S2所述肝素/酪蛋白溶液中肝素的浓度为0.04、0.4或4mg/mL；酪蛋白的浓度为0.2 mg/mL。

7.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述生长因子/胶原溶液中生长因子的浓度为0.2 mg/mL；胶原的浓度为1 mg/mL；所述生长因子/胶原溶液调节其pH至4.8。

8.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述生长因子是细胞粘附因子、细胞生长因子或细胞分化因子。

9.权利要求3所述促成骨化的生长因子可控缓释体系复合多层膜在作为组织工程医用材料方面的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，是作为组织工程中骨缺损修复材料的应用。