CN111419874A - 一种负载MSCs来源外泌体的口服微球的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载MSCs来源外泌体的口服微球的制备方法及应用。其制备方法包括以下步骤：(1)ALG/CST外核溶液的配制，(2)ALG/CNC内核溶液的配制，(3)分离间充质干细胞来源的外泌体，(4)制备负载MSCs外泌体的微球。本发明将疏水性的ALG/CST与亲水性的ALG/CNC结合起来，用ALG/CST包裹外泌体内核，克服ALG易酸解，CNC载药量低等缺点，有效保护外泌体免受胃酸和消化液的破坏作用，同时具有pH敏感性的小肠缓释释放的靶向性，使得MSCs可通过的口服方式安全运送到小肠部位，借由小肠吸收功能进行损伤修复、免疫调节及抗炎作用，实现RA及其他相关自身免疫性疾病的治疗。

Description

一种负载MSCs来源外泌体的口服微球的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种负载MSCs来源外泌体的口服微球的制备方法及应用。
背景技术
越来越多的研究证实，间充质干细胞来源的外泌体通过在细胞间传递信号分子，能够促进血管生成、减少炎症、修复受损的组织。与MSCs相比，外泌体具有更好的稳定，移植治疗后存活率高、无明显不良反应等优点。此外，外泌体中含有大量且种类繁多的蛋白细胞因子及生物活性分子，是MSCs发挥抗炎、抗纤维化及免疫调节功能的主要方式。因此，MSCs外泌体在防治系统性红斑狼疮及其并发症、类风湿性关节炎及糖尿病等免疫系统疾病具有一定的临床应用前景。
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一类以关节滑膜增生和软骨破坏为特征的慢性自身免疫性疾病，具有较高的致残率和致畸率，是目前临床面临的难题之一。越来越多的干细胞研究揭示其治疗效果的作用模式主要通过旁分泌产生。人脐带血MSC来源的外泌体(MSC-Exo)可以通过其自身的活性物质，介导细胞之间的信号交流，从而在RA模型小鼠治疗中发挥持续的治疗效果。然而，反复冻融外泌体会导致外泌体聚集、膜破裂或数量减少，影响其抗炎效应。且目前也没有明确详细的大规模制造过程，因此鲜有临床研究。
在自身免疫性疾病的研究中，外泌体通常由静脉给药，这种给药方式，不但操作不便，还会带来一系列安全问题，此外由于机体自身单核-吞噬系统对部分外泌体进行清除，而有效注射剂量增大也伴随着毒性增加，临床应用受到一定限制。近年来，国内外有众多学者致力于外泌体制剂的开发，给药方式涉及静脉、皮下注射、经皮、皮下埋植，以及腹腔移植等。但这些方式很大程度上不能同时实现智能响应、快速释放、长效循环和安全准确等方面的诉求。口服给药的方式具有使用方便、快速高效，安全性高等优点。药物可经口服后被胃肠道吸收入血液循环,达到局部和全身治疗的目的。因此，设计并构建一种口服外泌体系统的能够根据体内免疫系统紊乱情况，智能释放的长效给药系统，是推进临床间充质干细胞外泌体治疗自身免疫性疾病的迫切需要。
发明内容
为了解决MSCs外泌体治疗自身免疫性疾病效率低、输注剂量大、治疗效果不稳定等缺点，本发明提供了一种负载MSCs来源外泌体的口服微球的制备及其在RA治疗中的应用。负载MSCs来源外泌体的口服微球由pH敏感的ALG/CST外核和包裹外泌体的ALG/CNC内核组成。本发明将免疫调节作用与药物缓释系统相结合，运用微胶囊微流控电喷技术，获得相对于静脉注射更为长久可控且经济的疗效。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种负载MSCs来源外泌体的口服微球，其制备方法包括以下步骤：
(1)ALG/CST外核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和壳聚糖CST，各加入到双蒸水中分散，分别制备海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；
(2)ALG/CNC内核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和羟甲基纤维素钠CNC-Na，各加入到双蒸水中分散，分别制备海藻酸钠溶液和羟甲基纤维素钠溶液，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；
(3)分离间充质干细胞来源的外泌体：
选取处于对数生长期的MSCs用于外泌体的提取，采用MSC完全培养基培养，当细胞生长至70～80％融合度时，将MSC完全培养基更换为含5％无外泌体血清的培养基，继续培养36～72小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取外泌体；
(4)制备负载MSCs外泌体的微球：
将MSCs来源的外泌体按一定密度均匀混合于ALG/CNC内核溶液，将混合了外泌体的ALG/CNC内核溶液和ALG/CST外核溶液分别置于同轴电喷装置的相应注射器中，通过同轴电喷技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹外泌体的微凝胶液滴，通过电压、流速、接收距离及内外轴直径大小进行调控内外核大小及壁厚。
步骤(1)中ALG/CST外核溶液的浓度质量分数为1％ALG/1％CST。
步骤(2)中，ALG/CNC内核溶液的浓度质量分数为1％ALG/2％CNC。
步骤(3)中，超速离心的条件为：50,000～65,000rpm，4℃，1～2小时；外泌体的浓度为100μg/ml。
步骤(4)中，将MSC来源的外泌体按一定密度均匀混合于ALG/CNC内核溶液，所述的一定密度为10-200μg/ml。
步骤(4)中，通过同轴电喷技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，反应参数设定及条件为：电压为4～8kV，流速为30～50μl/min，接收距离为8～10cm；内相毛细管直径为80～150μm；中间相玻璃毛细管直径为：300～500μm。
优选的，步骤(4)中，同轴电喷技术反应参数设定及条件为：电压为5kV,流速为30μl/min,接收距离为8～10cm”；内相毛细管直径为100μm；中间相玻璃毛细管直径为：300μm；方管直径为1mm；外相收集管直径为：850μm。
步骤(4)中，氯化钙溶液的浓度范围是1％～2％w/w。
所述MSCs选自人脐带间充质干细胞第2～4代。
所制备的负载MSCs外泌体的微球外壳尺寸为241±8.1μm，内核尺寸大小为126±3.8μm。
本发明通过电喷雾方法，制备了一种负载MSC-Exo的口服核壳ALG/CST-ALG/CNC微球。这种微球以负载MSC-Exo的ALG/CNC为核心，以ALG/CST包裹，清洗干净后口服灌胃给入CIA(collagen induced arthritis,CIA)模型小鼠，可根据关节炎症程度控制外泌体的释放速度，发挥抗炎免疫调节功能。纳米级的MSC-Exo具有趋化性和特有的EPR效应，因而具有明确的损伤炎症组织靶向能力。本发明将疏水性的ALG/CST与亲水性的ALG/CNC结合起来，用ALG/CST包裹外泌体内核，克服了ALG易酸解，CNC载药量低等缺点，优点得以扩大，可以有效保护外泌体免受胃酸和消化液的破坏作用，同时具有pH敏感性的小肠缓释释放的靶向性，使得MSCs可通过的口服方式安全运送到小肠部位，借由小肠吸收功能进行损伤修复、免疫调节及抗炎作用，从而实现RA及其他相关自身免疫性疾病的治疗。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明以共轴电喷微流控为技术基础，结合生物医学材料性质，构建出负载MSCs外泌体的口服微球，在外核抗酸层的保护下，有效减缓外泌体在消化液的冲击下失活，实现MSCs来源的外泌体口服递送到小肠部位，缓释释放后治疗自身免疫性疾病的作用。
(2)该核壳载药微球的制备工艺流程比较易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，实用性强，方法简单，操作方便。
(3)本发明提供了一种MSCs外泌体口服给药途径及其在类风湿性关节炎模型小鼠治疗中的应用，突破了外泌体类治疗剂通过口服在消化道被消化液和胃酸破坏的问题，同时确保了MSCs来源的外泌体在小肠肠道内长时间存活、缓释释放稳定发挥其生物功能，使外泌体在体内可达到治疗最小剂量。
附图说明
图1一种负载MSCs外泌体的口服微球，其结构为双层核壳结构，从外到内依次是外核肠溶层1、内核水溶性载体2和药层3。药层是由F2～4代间充质干细胞来源的外泌体组成。
图2为间充质干细胞来源的外泌体(MSC-Exosomes)的TEM的结果。
图3为间充质干细胞来源的外泌体(MSC-Exosomes)的DLS的颗粒直径分布结果。
图4为负载PKH26标记的间充质干细胞来源外泌体(MSC-Exosomes)微球的体外消化液缓释释放测试结果。
图5为负载间充质干细胞来源外泌体(MSC-Exosomes)微球的对CIA模型小鼠的疗效结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种负载MSCs来源外泌体的口服微球，其制备方法包括以下步骤：
(1)ALG/CST外核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和壳聚糖CST，各加入到双蒸水中分散，制备海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液，分别充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；ALG/CST外核溶液的浓度为1％ALG/1％CST。
(2)ALG/CNC内核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和羟甲基纤维素钠CNC-Na，各加入到双蒸水中分散，分别充分溶解，制备海藻酸钠溶液和羟甲基纤维素钠溶液；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；ALG/CNC内核溶液的浓度为1％ALG/2％CNC。
(3)分离间充质干细胞来源的外泌体：
选取处于对数生长期的人脐带间充质干细胞第3代MSCs用于外泌体的提取，当细胞生长至70-80％融合度时，将MSC完全培养基更换为含5％无外泌体血清的培养基，继续培养48小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取外泌体；超速离心的条件为：50,000rpm，4℃，1小时；外泌体的浓度为100μg/ml。
(4)制备负载MSCs外泌体的微球：
将MSC来源的外泌体按80μg/ml均匀混合于ALG/CNC内核溶液，将混合了外泌体的ALG/CNC内核溶液和ALG/CST外核溶液分别置于同轴电喷装置的相应注射器中，通过同轴电喷技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹外泌体的微凝胶液滴，通过电压、流速、接收距离及内外轴直径大小进行调控内外核大小及壁厚，具体参数如下：电压为5kV,流速为30μl/min,接收距离为8～10cm；内相毛细管直径为100μm；中间相玻璃毛细管直径为300μm。
所制备的负载MSCs外泌体的微球外壳尺寸为241±8.1μm，内核尺寸大小为126±3.8μm。
实施例2
一种负载MSCs来源外泌体的口服微球，其制备方法包括以下步骤：
(1)ALG/CST外核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和壳聚糖CST，各加入到双蒸水中分散，制备海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液，分别充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；ALG/CST外核溶液的浓度为1％ALG/1％CST。
(2)ALG/CNC内核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和羟甲基纤维素钠CNC-Na，各加入到双蒸水中分散，分别充分溶解，制备海藻酸钠溶液和羟甲基纤维素钠溶液；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；ALG/CNC内核溶液的浓度为1％ALG/2％CNC。
(3)分离间充质干细胞来源的外泌体：
选取处于对数生长期的人脐带间充质干细胞第3代MSCs用于外泌体的提取，当细胞生长至70-80％融合度时，将MSC完全培养基更换为含5％无外泌体血清的培养基，继续培养48小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取外泌体；超速离心的条件为：65,000rpm，4℃，1小时；外泌体的浓度为100μg/ml。
(4)制备负载MSCs外泌体的微球：
将MSC来源的外泌体按100μg/ml均匀混合于ALG/CNC内核溶液，将混合了外泌体的ALG/CNC内核溶液和ALG/CST外核溶液分别置于同轴电喷装置的相应注射器中，通过同轴电喷技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹外泌体的微凝胶液滴，通过电压、流速、接收距离及内外轴直径大小进行调控内外核大小及壁厚，具体参数如下：电压为6kV,流速为50μl/min,接收距离为10cm；内相毛细管直径为120μm；中间相玻璃毛细管直径为400μm。
所制备的负载MSCs外泌体的微球外壳尺寸为301±9.2μm，内核尺寸大小为186±7.3μm。
实施例3
一种负载MSCs来源外泌体的口服微球，其制备方法包括以下步骤：
(1)ALG/CST外核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和壳聚糖CST，各加入到双蒸水中分散，制备海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液，分别充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；ALG/CST外核溶液的浓度为1％ALG/1％CST。
(2)ALG/CNC内核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和羟甲基纤维素钠CNC-Na，各加入到双蒸水中分散，分别充分溶解，制备海藻酸钠溶液和羟甲基纤维素钠溶液；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；ALG/CNC内核溶液的浓度为1％ALG/2％CNC。
(3)分离间充质干细胞来源的外泌体：
选取处于对数生长期的人脐带间充质干细胞第2代MSCs用于外泌体的提取，当细胞生长至70-80％融合度时，将MSC完全培养基更换为含5％无外泌体血清的培养基，继续培养72小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取外泌体；超速离心的条件为：50,000rpm，4℃，2小时；外泌体的浓度为100μg/ml。
(4)制备负载MSCs外泌体的微球：
将MSC来源的外泌体按50μg/ml均匀混合于ALG/CNC内核溶液，将混合了外泌体的ALG/CNC内核溶液和ALG/CST外核溶液分别置于同轴电喷装置的相应注射器中，通过同轴电喷技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹外泌体的微凝胶液滴，通过电压、流速、接收距离及内外轴直径大小进行调控内外核大小及壁厚，具体参数如下：电压为8kV,流速为40μl/min,接收距离为8cm”；内相毛细管直径为80μm；中间相玻璃毛细管直径为200μm。
所制备的负载MSCs外泌体的微球外壳尺寸为183±6.5μm，内核尺寸大小为98±7.0μm。
实施例4
体外药物释放：
将微球置于模拟体外胃和小肠人工液，检测PKH26标记的外泌体在胃肠消化液释放情况，该口服微球的消化道递送及缓释性能是导致CIA关节肿胀等疾病症状明显降低的基础。
将三份等量的负载PKH26标记的外泌体微球，分别均匀分布于1ml的PBS，人工胃液和人工小肠液中，70rpm 37℃摇床，分别在0，1h和2h进行荧光拍照，分析口服外泌体微球在体外消化液中的缓释功能。
图4结果显示，外泌体微球在ph1.2人工胃液中1h情况下核壳结构完好，且外泌体并无扩散；而微球在ph6.8人工小肠液以后，核壳结构立即崩裂，2h后大部分外泌体已经从内核载体中扩散到消化液中。因此，本发明中核壳微球可以很好的提高外泌体在胃液存活，抵抗消化液破坏，实现小肠中缓释释放的情况。
实施例5
口服MSCs外泌体微球的制备方法在CIA诱导的类风湿性关节炎模型的治疗应用：
本实施例采取口服MSCs外泌体微球灌胃给药方式给予合适的剂量。该胶囊的有效量是能导致CIA关节肿胀等疾病症状明显降低的量。
a.在第0、21天对每只DBA/1小鼠尾根部皮下注射0.1mL的乳化剂(用2mg/mL的牛二型胶原与2mg/mL的弗氏完全佐剂等体积混合，冰上研磨至油包水状态)
b.治疗组分别在免疫的第18天和26天对每只小鼠通过灌胃给药的方式预先制备好的100μg口服MSCs外泌体微球。
c.记录小鼠关节炎发病时间，计算并绘制发病率图；第二次免疫后每三天对各组小鼠的足趾情况进行监测，记录每只小鼠的关节炎分数。
d.于首次免疫后第42天，处死各组小鼠，对小鼠腿足观察拍照后，部分关节固定包埋用于H&E染色等病理学分析。
设立正常对照组，CIA模型组给予灌胃等体积的PBS，治疗组在造模第18和26天灌胃微球。CIA模型小鼠经口服MSCs外泌体微球后，通过观察可以发现：于首次免疫42天后观察各组小鼠足趾关节的肿胀程度，治疗组小鼠足趾关节肿胀程度明显低于CIA对照组小鼠(图5)。由此可见口服MSCs外泌体微球的治疗可以减轻CIA小鼠的疾病程度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
(1)ALG/CST外核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和壳聚糖CST，各加入到双蒸水中分散，分别制备海藻酸钠溶液和壳聚糖溶液，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；
(2)ALG/CNC内核溶液的配制：
分别称取海藻酸钠ALG和羟甲基纤维素钠CNC-Na，各加入到双蒸水中分散，分别制备海藻酸钠溶液和羟甲基纤维素钠溶液，充分溶解；冷却至室温后将二者按照一定比例混合，充分搅拌直至均匀；
(3)分离间充质干细胞来源的外泌体：
选取处于对数生长期的MSCs用于外泌体的提取，采用MSC完全培养基培养，当细胞生长至70～80％融合度时，将MSC完全培养基更换为含5％无外泌体血清的培养基，继续培养36～72小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取外泌体；
(4)制备负载MSCs外泌体的微球：
将MSCs来源的外泌体按一定密度均匀混合于ALG/CNC内核溶液，将混合了外泌体的ALG/CNC内核溶液和ALG/CST外核溶液分别置于同轴电喷装置的相应注射器中，通过同轴电喷技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，获得包裹外泌体的微凝胶液滴，通过电压、流速、接收距离及内外轴直径大小进行调控内外核大小及壁厚。
2.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：步骤(1)中，ALG/CST外核溶液的浓度质量分数为1％ALG/1％CST。
3.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：步骤(2)中，ALG/CNC内核溶液的浓度质量分数为1％ALG/2％CNC。
4.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：步骤(3)中，超速离心的条件为：50,000～65,000rpm，4℃，1～2小时；外泌体的浓度为100μg/ml。
5.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：步骤(4)中，将MSC来源的外泌体按一定密度均匀混合于ALG/CNC内核溶液，所述的一定密度为10-200μg/ml。
6.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：步骤(4)中，通过同轴电喷技术，在高电压的作用下将混合溶液喷射到氯化钙溶液中，反应参数设定及条件为：电压为4～8kV，流速为30～50μl/min，接收距离为8～10cm；内相毛细管直径为80～150μm；中间相玻璃毛细管直径为：300～500μm。
7.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：步骤(4)中，同轴电喷技术反应参数设定及条件为：电压为5kV,流速为30μl/min,接收距离为8～10cm”；内相毛细管直径为100μm；中间相玻璃毛细管直径为：300μm；方管直径为1mm；外相收集管直径为：850μm。
8.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：步骤(4)中，氯化钙溶液的浓度范围是1％～2％w/w。
9.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：所述MSCs选自人脐带间充质干细胞第2～4代。
10.根据权利要求1所述的负载MSCs来源外泌体的口服微球，其特征在于：所制备的负载MSCs外泌体的微球外壳尺寸为241±8.1μm，内核尺寸大小为126±3.8μm。
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