CN117159586A - 壳聚糖/peg-dspe负载的骨髓干细胞来源外泌体在治疗动脉再狭窄中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖/PEG‑DSPE负载的骨髓干细胞来源外泌体在治疗动脉再狭窄中的应用。本发明采用壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂(PEG‑DSPE)共聚物作为骨架，构建搭载外泌体的纳米载体，该纳米载体可根据壳聚糖和PEG‑DSPE的浓度、配比比例实现物理性能的可控化调节；该纳米载体负载骨髓干细胞来源外泌体进而合成壳聚糖/PEG‑DSPE负载的骨髓干细胞来源外泌体复合体，在小鼠内皮损伤模型中抑制靶血管再狭窄的动物实验结果中，相比于单纯外泌体，本发明的骨髓干细胞来源外泌体复合体可大大提高抑制靶血管再狭窄提高血管通畅率的效率，显示出良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖/PEG-DSPE负载的骨髓干细胞来源外泌体在治疗动脉再狭窄中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
外周血管病是动脉粥样硬化累及外周血管并导致相应组织缺血的一类疾病，常见于中老年人群。根据血管堵塞程度患者可出现不同程度的组织缺血症状，例如当动脉硬化累及下肢血管时，患者可表现为间歇性跛行、静息痛、组织溃疡乃至坏疽。目前临床采用的治疗外周血管疾病的方法主要为腔内介入治疗(如球囊扩张成形术和支架植入术)，然而介入手术后病变血管的再次狭窄是导致治疗失败的重要原因之一。
尽管对于再狭窄的具体机制仍未完全阐明，但目前学术观点认为主要由两个环节导致：1)靶血管动脉中膜平滑肌细胞(vascular smooth muscle，VSMC)增殖迁移、细胞外基质沉积引发的新生内膜增生：异常增殖的VSMC是再狭窄的主要细胞来源。因此，在该理论基础上研发了抑制细胞增生的雷帕霉素洗脱支架和雷帕霉素涂层球囊等新技术产品。随着这些产品的广泛上市应用，学者们发现早期(6月至12月)靶血管确实有较好的通畅率，但中远期(12月至36月)出现的迟发性再狭窄、支架内血栓事件甚至血管闭塞仍不可避免。2)再内皮化延迟：内皮损伤是动脉粥样硬化的起始环节，血管内皮损伤后将中膜暴露在血流环境中使其不断收到炎症刺激，如果再内皮化迟迟未出现，则血管壁的炎症刺激将持续存在，靶血管再狭窄的问题也将在中远期不断出现。目前的治疗手段无论是手术治疗还是药物治疗都无法较好的解决再狭窄的问题，远期心血管不良事件发生率以及中远期靶血管完全堵塞发生率仍然居高不下。究其原因主要可总结为以下几点：1)干预部位局限：手术采用的球囊扩张以及支架植入仅仅能处理肉眼可见的病灶，但动脉粥样硬化是一个持续性的、全身性的病变，手术治疗仅解决了眼前的血管阻塞问题，但并未阻止病灶的继续发展以及萌发在微血管内的病灶。2)干预目标局限：现如今采用的药物治疗手段作用功能都较为单一，例如雷帕霉素旨在通过抑制分泌性平滑肌细胞减少细胞外基质沉积，但未促进内皮细胞增殖实现再内皮化，例如负载有CD34阳性抗体的生物涂层支架，旨在捕获血流中的内皮祖细胞促进再内皮化，却没有降低支架本身对靶血管的刺激作用，导致炎症反应持续存在。因此寻找抑制靶血管再狭窄延长动脉通畅率的治疗新策略一直是外周血管领域研究的重点和热点。
外泌体是一种由细胞通过旁分泌形式分泌出的双层脂质结构的细胞外囊泡，其内包含了多种多样的生物因子，如核酸、蛋白质、微小RNA(microRNA，miRNA)等，外泌体不仅可以体现出其母细胞的天然功能还在细胞间的信息交流中扮演着重要的角色。近些年的基础研究发现，骨髓干细胞来源的外泌体具有十分丰富的促进血管组织修复的功能，它可以调节巨噬细胞由促进炎症的M1分型转化为抑制炎症反应的M2状态，可以抑制血管中膜平滑肌细胞增殖迁移，同时还具有显著的促进血管内皮细胞的功能。因此，骨髓干细胞来源外泌体被认为具有能同时抑制血管炎症反应，抑制分泌型平滑肌细胞功能和促进再内皮化进而达到抑制靶血管再狭窄的功能，是一种较理想的实现多角度抑制靶血管再狭窄，提高血管通畅率的治疗手段。
尽管骨髓干细胞来源外泌体在抑制靶血管再狭窄拥有巨大的治疗潜力，但基于外泌体的治疗方法仍然受到了诸多限制无法成功在临床转化。总结基础研究的经验教训，限制其发挥治疗效果和临床转化的原因可归于以下几点：1)贴附血管能力弱：外泌体为直径仅50-100nm的脂质小囊泡，且表面不具备靶向肽段，因此静脉注射后，在血液循环中仅有不到百分之一的外泌体能成功到达病变部位。大多数外泌体在血流中逸散，在到达靶血管前已降解或已沉积在肝脏脾脏等脏器中。2)细胞吞噬效率低：外泌体发挥其生物效能依赖于目标细胞对其成功摄取，然而由于外泌体质量低，表面电荷作用弱以及缺乏特异性识别的受体等特点导致外泌体成功被目标细胞吞噬的含量极低。3)结构稳定性弱：外泌体为亚细胞结构，仅依靠膜结构维持基本形态，不仅解离速度较快还容易在注射时以及血流环境中受到流体剪切应力的损伤。为了弥补损耗，在动物实验水平，骨髓干细胞来源外泌体要想达到成功抑制靶血管再狭窄的目的需要前期培养大量骨髓干细胞并提取其外泌体，无疑需要消耗巨大的经济花费。因此，如何提高骨髓干细胞来源外泌体治疗靶血管再狭窄的效率成为当前需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是：针对治疗动脉再狭窄的药物和方法和局限性，本发明提供一种壳聚糖/PEG-DSPE负载的骨髓干细胞来源外泌体在治疗动脉再狭窄中的应用，本发明采用壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂(PEG-DSPE)共聚物作为骨架，构建搭载外泌体的纳米载体，该纳米载体可根据壳聚糖和PEG-DSPE的浓度、配比比例实现物理性能的可控化调节；该纳米载体可装载骨髓干细胞来源外泌体进而合成壳聚糖/PEG-DSPE负载的骨髓干细胞来源外泌体复合体(简称为复合体)，相比于单纯外泌体，复合体可大大提高抑制靶血管再狭窄提高血管通畅率的效率。
为了实现上述目的，本发明提供一种壳聚糖/PEG-DSPE负载的骨髓干细胞来源外泌体复合体在制备治疗动脉再狭窄药物中的应用，所述复合体包括纳米载体和骨髓干细胞来源外泌体，所述纳米载体时以壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂共聚物作为骨架构建的纳米载体，所述骨髓干细胞来源外泌体体负载于所述纳米载体中。
优选地，所述复合体的制备方法包括以下步骤：
步骤1：分别配制壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂共聚物PEG-DSPE的PBS-醋酸溶液，得到壳聚糖溶液和PEG-DSPE溶液；
步骤2：从骨髓干细胞中提取外泌体，并加入戊二醛固定液重悬外泌体，得到外泌体悬液；
步骤3：将步骤1配制的壳聚糖溶液和PEG-DSPE溶液按比例置于同一容器中得到纳米载体前驱液，然后采用双通路的闪速纳米沉淀法制备复合体，其中，所述纳米载体前驱液和外泌体悬液从两个不同的通道分别注入后在涡旋作用下混合形成复合体。
优选地，所述步骤1中的PBS-醋酸溶液为含有1％醋酸的PBS溶液。
优选地，所述步骤3的纳米载体前驱液中壳聚糖的浓度为0.1～1mg/ml，PEG-DSPE的浓度为0.1～0.5mg/ml，所述外泌体悬液中外泌体的浓度为0.05～0.2mg/ml；所述纳米载体前驱液和外泌体悬液按照体积比1:1的比例从两个不同的通道分别注入后在涡旋作用下混合形成复合体。
本发明还提供了一种壳聚糖/PEG-DSPE负载的骨髓干细胞来源外泌体复合体，所述复合体包括纳米载体和骨髓干细胞来源外泌体，所述纳米载体时以壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂共聚物作为骨架构建的纳米载体，所述骨髓干细胞来源外泌体体负载于所述纳米载体中，所述复合体采用双通路的闪速纳米沉淀法制备而成。
优选地，所述复合体的制备方法包括以下步骤：
步骤1：分别配制壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂共聚物PEG-DSPE的PBS-醋酸溶液，得到壳聚糖溶液和PEG-DSPE溶液；
步骤2：从骨髓干细胞中提取外泌体，并加入戊二醛固定液重悬外泌体，得到外泌体悬液；
步骤3：将步骤1配制的壳聚糖溶液和PEG-DSPE溶液按比例置于同一容器中得到纳米载体前驱液，然后采用双通路的闪速纳米沉淀法制备复合体，其中，所述纳米载体前驱液和外泌体悬液从两个不同的通道分别注入后在涡旋作用下混合形成复合体。
优选地，所述步骤3的纳米载体前驱液中壳聚糖的浓度为0.1～1mg/ml，PEG-DSPE的浓度为0.1～0.5mg/ml，所述外泌体悬液中外泌体的浓度为0.05～0.2mg/ml。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)为外泌体提供机械结构保护：本发明采用壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂(PEG-DSPE)共聚物作为骨架，构建搭载外泌体的纳米载体，该纳米载体可为外泌体创造空间骨架结构，并使外泌体附着于其上，使外泌体更加“聚合”而非散乱分布；因此保护外泌体在血液中以及注射给药时免于流体剪切力损伤；其中壳聚糖为纳米载体最主要的骨架结构，壳聚糖为纳米载体提供了一个多糖大分子骨架，为纳米载体最基础的结构；PEG-DSPE具有囊泡稳定性的作用，可为外泌体提供长循环保护，稳定囊泡膜的结构稳定性；
(2)粒径可调节：在液体环境中的外泌体呈现出散乱的分布状态，为相互独立不聚合的单个囊泡，粒径仅为50-100nm；进入血液循环中立刻分散，且极其不利于贴壁；壳聚糖/PEG-DEPS为其提供了聚合场所，并且可通过调节壳聚糖/PEG-DSPE的比例进一步调节复合体粒径大小，提高贴壁效率；
(3)电势可调节：靶血管中的目标细胞(VSMC、内皮细胞以及巨噬细胞)仅能通过胞吞作用吞噬外泌体，通过调节复合体表面电势能在胞吞基础上提供电荷吸附作用，提高目标细胞对外泌体的吞噬效率；外泌体zeta电位为带负电荷，壳聚糖zeta电位为带正电荷，PEG-DSPE zeta电位带轻微正电荷，三者通过不同比例配比，可呈现出负电、电中性、正电等不同属性。
附图说明
图1为本发明实施例1中采用双通路的闪速纳米沉淀法制备复合体的示意图；
图2为本发明实施例1中提取的骨髓干细胞来源外泌体(A)和制备的复合体(B)的透射电镜扫描图；
图3为各组小鼠颈动脉内皮损伤后28天血管HE染色结果。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
壳聚糖/PEG-DSPE搭载骨髓干细胞来源外泌体制备复合体，制备流程如图1所示：
1、壳聚糖/PEG-DSPE骨架的制备：
1)壳聚糖母液制备：将商品化购买的壳聚糖溶解于含有1wt％醋酸的PBS溶液配制成10mg/ml的母液；
2)PEG-DSPE母液制备：将商品化购买的PEG-DSPE溶解于含有1％醋酸的PBS溶液配制成1mg/ml的母液
2、骨髓干细胞来源外泌体的提取：
1)小鼠骨髓干细胞培养：将商品化购买的小鼠骨髓干细胞(BMSCs)在含10％胎牛血清和1％抗生素的α-MEM培养基(可商品化购买)中培养，温度37℃，CO2浓度5％。每2-3天更换一次培养基，当细胞在培养板中扩增至90％时，收获细胞传代。
2)外泌体的分离：采用外泌体捕获和定量试剂盒(Overall exosome capture andquantification assay kit；货号：ab287851；厂家：Abcam)分离提取外泌体，按照试剂盒说明书操作进行，收集在细胞培养以及传代过程中得到的上清液，在2000rpm离心30分钟，收集离心后的上清液。在4℃条件下加入外泌体分离试剂，涡旋过夜。1000rpm离心1小时，除去离心后的上清液并加入2.5％戊二醛固定液重悬外泌体。
3)外泌体的鉴定：采用透射电镜观察鉴定所得外泌体形态，制备提取成功的外泌体应为直径50-100nm的囊泡，如图2A所示。
3、外泌体装载：
外泌体装载采用双通路的闪速纳米沉淀法(Flash nanoprecipitation，FNP)制备，本实施例中采用的FNP设备为500A-Y2X。
1)管道连接：将壳聚糖与PEG-DSPE按照特定比例(可自行根据实验需求配比)置于10ml气密性良好的玻璃注射器中，将外泌体悬液置于10ml气密性良好的玻璃注射器中，将上述两个注射器分别通过1.6mm ID的特氟龙管连接至FNP设备。
2)溶液混合：在FNP装置中，壳聚糖/PEG-DSPE与外泌体可在涡旋作用下混合形成复合体。
在本实施例中按照不同壳聚糖/PEG-DSPE的配比，搭载0.1mg/ml外泌体，通过摸排总结了以下有关配比与粒径大小和zeta电位的关系：
表1：不同壳聚糖/PEG-DSPE配比(外泌体均为0.1mg/ml)zeta电位的关系
| 壳聚糖浓度/PEG-DSPE浓度之比 | Zeta电位(mV) |
| 0：0(仅外泌体) | -7.2 |
| 0：10(仅外泌体+PEG-DSPE) | -5.6 |
| 10：0(仅外泌体+壳聚糖) | +2.6 |
| 5：5(壳聚糖/PEG-DSPE相同浓度) | +5.8 |
表2：固定外泌体浓度(0.1mg/ml)和壳聚糖浓度(0.5mg/ml)调整PEG-DSPE浓度实现zeta电位的微调
| PEG-DSPE浓度(mg/ml) | Zeta电位(mV) |
| 0.1 | +3.9 |
| 0.2 | +4.7 |
| 0.3 | +5.1 |
| 0.4 | +5.2 |
表3：固定外泌体浓度(0.1mg/ml)和PEG-DSPE浓度(0.2mg/ml)调整壳聚糖浓度实现zeta电位的大幅度调控
| 壳聚糖浓度(mg/ml) | Zeta电位(mV) |
| 0.1 | -0.2 |
| 0.5 | +5.5 |
| 1.0 | +5.9 |
表4：固定外泌体浓度(0.1mg/ml)和壳聚糖浓度(0.5mg/ml)调整PEG-DSPE浓度实现粒子直径大小的调控
| PEG-DSPE浓度(mg/ml) | 粒径大小(nm) |
| 0.1 | 324 |
| 0.2 | 359 |
| 0.3 | 430 |
本实施例中以外泌体0.1mg/ml，壳聚糖0.5mg/ml和PEG-DSPE 0.2mg/ml合成的复合体(记为样品A)扫描电镜结果如图2B所示。
实施例2
将实施例1制备的壳聚糖/PEG-DSPE骨髓干细胞来源外泌体复合体(样品A)在小鼠内皮损伤模型中抑制靶血管再狭窄的动物实验结果，本实施例中采用导丝对小鼠颈动脉进行内皮损伤，并在术后第0天、3天、7天分别进行尾静脉注射生理盐水(对照组)、骨髓干细胞来源外泌体(单纯外泌体组)和壳聚糖/PEG-DSPE外泌体复合体组(复合体组)。并在第28天取材，将颈动脉损伤段做HE染色，观察内膜增生效果。结果发现：对照组管腔明显狭窄，内膜增生严重。单纯外泌体对管腔狭窄有一定抑制效果，复合体组抑制效果更佳显著，如图3所示。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种壳聚糖/PEG-DSPE负载的骨髓干细胞来源外泌体复合体在制备治疗动脉再狭窄药物中的应用，其特征在于，所述复合体包括纳米载体和骨髓干细胞来源外泌体，所述纳米载体时以壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂共聚物作为骨架构建的纳米载体，所述骨髓干细胞来源外泌体体负载于所述纳米载体中。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述复合体的制备方法包括以下步骤：
步骤1：分别配制壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂共聚物PEG-DSPE的PBS-醋酸溶液，得到壳聚糖溶液和PEG-DSPE溶液；
步骤2：从骨髓干细胞中提取外泌体，并加入戊二醛固定液重悬外泌体，得到外泌体悬液；
步骤3：将步骤1配制的壳聚糖溶液和PEG-DSPE溶液按比例置于同一容器中得到纳米载体前驱液，然后采用双通路的闪速纳米沉淀法制备复合体，其中，所述纳米载体前驱液和外泌体悬液从两个不同的通道分别注入后在涡旋作用下混合形成复合体。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤1中的PBS-醋酸溶液为含有1wt％醋酸的PBS溶液。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤3的纳米载体前驱液中壳聚糖的浓度为0.1～1mg/ml，PEG-DSPE的浓度为0.1～0.5mg/ml，所述外泌体悬液中外泌体的浓度为0.05～0.2mg/ml。
5.一种壳聚糖/PEG-DSPE负载的骨髓干细胞来源外泌体复合体，其特征在于，所述复合体包括纳米载体和骨髓干细胞来源外泌体，所述纳米载体时以壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂共聚物作为骨架构建的纳米载体，所述骨髓干细胞来源外泌体体负载于所述纳米载体中，所述复合体采用双通路的闪速纳米沉淀法制备而成。
6.如权利要求5所述的骨髓干细胞来源外泌体复合体，其特征在于，所述复合体的制备方法包括以下步骤：
步骤1：分别配制壳聚糖和马来酰亚胺聚乙二醇磷脂共聚物PEG-DSPE的PBS-醋酸溶液，得到壳聚糖溶液和PEG-DSPE溶液；
步骤2：从骨髓干细胞中提取外泌体，并加入戊二醛固定液重悬外泌体，得到外泌体悬液；
步骤3：将步骤1配制的壳聚糖溶液和PEG-DSPE溶液按比例置于同一容器中得到纳米载体前驱液，然后采用双通路的闪速纳米沉淀法制备复合体，其中，所述纳米载体前驱液和外泌体悬液从两个不同的通道分别注入后在涡旋作用下混合形成复合体。
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