JP2012512846A - 脂肪幹細胞を含んでなる組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書の理解を容易にするために、本発明の文脈におけるいくつかの用語や語句の意味が以下に説明される。さらなる定義は必要に応じて明細書に沿って盛り込まれる。
本発明者らは、ASCを架橋ポリマー性マトリックスにカプセル化すると、通常の保管方法と比較して細胞の貯蔵寿命が驚異的に増加する(3倍程度)ことを観察した。従って、一つの態様によれば、本発明は、最大寸法が約1μm−約1000μmでありかつ脂肪由来幹細胞および1種類以上の接着剤を含んでなる三次元構造体を提供する。本発明の構造体は、以下では「マイクロカプセル化したASC」とも表す。
Chemistry, 2005, 73:287−295)。
本発明は、微粒子の製造方法、または脂肪幹細胞の微粒子を得る方法を提供し、該方法は、
(i) 脂肪幹細胞の懸濁液と架橋可能なポリマーの溶液とを混合し、
(ii) 工程(i)で得た混合物を断片化し、
(iii) 工程(ii)で形成した断片を、架橋可能なポリマーの架橋ポリマー性網状構造への転換を促進するのに適切な条件下に置き、
(iv) 工程(iii)で得た粒子を回収する工程を含んでなる。
(i) 脂肪サンプルから細胞懸濁液を調製し、
(ii) 前記細胞懸濁液から細胞を回収し、
(iii) 細胞が固体表面に接着し、増殖することを許容する条件下で、適切な細胞培地中固体表面上で前記細胞をインキュベートし、
(iv) インキュベーション後、非接着細胞を除くために上記固体表面を洗浄し、
(v) 前記培地で少なくとも2回継代された後、上記固体表面に接着したままの細胞を選別し、そして
(vi) 選別された細胞集団が目的の表現型を提示するか確認する。
本発明による三次元構造体またはマイクロカプセル化したASC、またはそこから解離したASCを用いて、疾患状態に関連した1種類以上の症状を予防し、治療しまたは改善することができる。 これらのものとしては、創傷治癒、組織損傷、アレルギー反応、免疫疾患、自己免疫疾患、免疫介在疾患、炎症性疾患、慢性炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。前記の使用は、本発明のもう一つの態様を構成する。
別の態様によれば、本発明は、ASC療法による患者の治療で使用するキットを提供する。一つの態様によれば、前記キットは、i)本発明によるマイクロカプセル化したASC、およびii)前記のマイクロカプセル化したASCから、ASCを解離するための薬剤を含んでなる。前記薬剤は、好ましくはEDTAおよび/またはクエン酸ナトリウム二水和物である。
ASCの調製
脂肪組織を脂肪吸引によって得た。平滑末端を有するカニューレを、小臍周切開(直径0.5cm未満)により皮下に導入した。腹壁下に位置した脂肪組織区画に沿ってカニューレを移動させることによって吸引を行い、脂肪組織の機械的崩壊を促進した。血液の損失を最小限に抑えるため、塩水およびエピネフリン溶液を血管収縮薬として注射した。80〜100mlの脂肪吸引細胞を、この手法を用いてそれぞれの患者から得た。
フロー・フォーカシング
1%(w/v)アルギン酸塩溶液から約50−250μmの均一粒径の微粒子を得る目的で、最適圧力および流速条件を決定するための実験を行った。実験は、Protanal LF 10/60 (FMC)、Protanal LF 10/60S LS (FMC)およびFLUKAアルギン酸塩を用いて、いずれも15(w/v)で行った。溶液の粘度および表面張力は表1に示されるとおりであった。
アルギン酸塩微粒子でのASCのマイクロカプセル化
ASC細胞を培養皿から取り出して、遠心分離し、5%ヒト血清アルブミン(HSA)を含むDMEM−Hepesに再懸濁し、最終的濃度を20%(v/v)とした。次に、細胞懸濁液1.15%(w/v)ポリマー性アルギン酸塩分散液(PRONOVA
UP LVG)に再懸濁し、混合物をフロー・フォーカシング装置に加えた。生成する微粒子を、次に3%(w/v)塩化カルシウム溶液中で15分間攪拌した。試料中の細胞の濃度は、5x106個/mlであった。
キトサンコーティングした微粒子でのASCのマイクロカプセル化
実施例3で調製した細胞を、次に300rpmでの遠心分離し、PBSで洗浄した。粒子を0.5%(w/v)キトサン溶液中で2分間攪拌しながらインキュベーションした。
微粒子からASCの放出
カルシウムの存在下でアルギン酸塩でカプセル化した微粒子を、2%(w/v)クエン酸塩溶液で数秒間処理した。この処理は、0.1%(w/v)アルギン酸塩(0.8%(w/v)最終的濃度)を用いて得た粒子並びに1.15%(w/v)(0.9%(w/v)最終的濃度)を用いて得た粒子で有効であった。
キトサン−アルギン酸塩またはアルギン酸塩中のマイクロカプセル化細胞の安定性
実施例2と同様にして得られたアルギン酸塩中でマイクロカプセル化した細胞または実施例3と同様にして得られたアルギン酸塩中でカプセル化して様々な濃度のキトサン(0.1%(w/v)または0.2%(w/v))でコーティングした細胞を、空気雰囲気中様々な粒子濃度(30%(v/v)または10%(v/v))で22 ℃に最長26日間保持した。
Claims (16)
- 最大寸法が約1μmと約1000μmの間にあり、脂肪由来幹細胞および一またはそれ以上の接着剤を含んでなる、三次元構造体。
- 前記接着剤が第一の架橋ポリマー性網状構造である、請求項1に記載の三次元構造体。
- 前記第一の架橋ポリマー性網状構造がアルギン酸塩である、請求項2に記載の三次元構造体。
- 前記脂肪由来幹細胞が、前記の一またはそれ以上の接着剤に埋設されてなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の三次元構造体。
- 第二の架橋ポリマー性網状構造をさらに含んでなり、前記第二の架橋ポリマー性網状構造が第一の架橋網状構造をカプセル化しているものである、請求項2〜4のいずれか一項に記載の三次元構造体。
- 前記第二の架橋ポリマー性網状構造がキトサンである、請求項5に記載の三次元構造体。
- 脂肪幹細胞の微粒子を得る方法であって、
(i) 脂肪幹細胞の懸濁液と架橋可能なポリマーの溶液とを混合し、
(ii) 工程(i)で得た混合物を断片化し、
(iii) 工程(ii)で形成した断片を、架橋可能なポリマーの架橋ポリマー性網状構造への転換を促進するのに適切な条件下に置き、
(iv) 工程(iii)で得た粒子を回収する工程を含んでなる、方法。 - 前記架橋可能なポリマーがアルギン酸塩である、請求項7に記載の方法。
- 工程(iv)で得た微粒子を、第二の架橋可能なポリマーの存在下で、前記ポリマーの架橋に適切な条件下に置く工程を更に含んでなる、請求項7または8に記載の方法。
- 前記第二の架橋可能なポリマーがキトサンである、請求項9に記載の方法。
- 前記第一のポリマー性網状構造および場合によって前記第二のポリマー性網状構造から、架橋剤を除去し、脂肪幹細胞を放出するのに適切な条件下に、前記微粒子を置くことを更に含んでなる、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法によって得られた、微粒子。
- 薬学担体を更に含んでなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の三次元構造体または請求項12に記載の微粒子。
- 医薬として用いられる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の三次元構造体、請求項12に記載の微粒子、または前記から解離した脂肪幹細胞。
- 治療を必要とする患者に、請求項1〜6のいずれか一項に記載の三次元構造体、請求項12に記載の微粒子、またはそれらから解離した脂肪幹細胞を投与することを含んでなる、炎症性疾患または自己免疫疾患の治療方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の三次元構造体、または請求項12に記載の微粒子、および所望ならばCO2または空気雰囲気中で構造体または微粒子から幹細胞を解離する手段を含んでなる、キット。
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