CN101285053A - 一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法，属于生物技术与组织工程领域。其特征是不添加血清、只添加细胞因子和滋养细胞，用海藻酸钙壳聚糖胶珠将滋养细胞包埋起来，结合微载体与旋转壁式生物反应器技术实现脐血造血干细胞与间充质干细胞的共同培养，并分离、收获这两种脐血来源的干细胞。本发明的效果和益处是微载体为脐血间充质干细胞提供了粘附表面，使间充质干细胞实现贴壁动态悬浮培养；旋转壁式生物反应器不仅为造血干细胞提供了悬浮生长环境，还有效降低了流体剪切力对造血干细胞造成的损伤；滋养细胞可以滋养胶珠外部的脐血干细胞，不仅起到部分替代血清的作用，还利于不同细胞之间的分离与收获。

Description

一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术与组织工程领域，特别涉及一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法。

背景技术

造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)可以广泛应用于基因治疗、肿瘤净化和骨髓移植等临床方面的应用，尤其是造血干细胞移植已成为癌症患者放化疗后造血功能重建的常规方法(Bellantuono，The International Journal ofBiochemistry&Cell Biology，2004，36(4)：607-620；Masson et al.，Stem Cells，2004，22(6)：897-907)。但细胞数量有限极大地限制了其在临床上的应用，解决此问题的有效方法是实施HSCs的体外大规模扩增。尽管造血干细胞移植能够显著地改善癌症患者放化疗之后的生命质量，但绝大多数患者不可避免地要承受短期内严重的嗜中性粒细胞减少症和血小板减少症的痛苦。因此有必要提出新的治疗方案来降低这些并发症的发生。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)已被证明在体外具有支持造血发生的功能(Jang et al.，Annals of Hematology，2006，85(4)：212-225；Majumdar etal.，Journal of Hematotherapy&Stem Cell Research，2000，9(6)：841-848；Laughlinet al.，New England Journal of Medicine，2001，344(24)：1815-1822)，同时在NOD/SCID小鼠体内实验中，也证明了同时移植HSCs和MSCs能够加速小鼠造血功能的恢复与重建(Bensidhoum et al.，Blood，2004，103(9)：3313-3319)。而对于临床上乳腺癌患者化疗后的造血干细胞移植，联合植入自体MSCs后，同样具有促进造血功能的恢复与重建，同时降低了伴随造血干细胞移植并发症的发病率(Koc et al.，Journal of Clinical Oncology，2000，18(2)：307-316)。另外，MSCs也可作为细胞治疗的种子细胞和基因治疗的载体细胞(Deans and Moseley，Experimental Hematology，2000，28(8)：875-884)。因此，能够在同一个培养体系内同时培养与收获HSCs和MSCs两种干细胞，具有重要的临床应用价值。

然而，HSCs和MSCs分别具有悬浮生长和贴壁生长的特性，体外共同培养这两种干细胞时，必须同时提供悬浮生长环境和赖以粘附生长的表面。微载体与适宜的生物反应器相结合是解决此问题的有效方法。玻璃包被的聚苯乙烯(Glass coated styrene copolymer，GCSC)微载体以其良好的表面贴附特性，在贴壁细胞动态培养方面倍受关注。而旋转壁式生物反应器(Rotating wall vesselbioreactor，RWVB)是近年来发展起来的，能够为细胞提供一个较为均匀的悬浮生长环境，适用于干细胞体外大规模培养与扩增。

Chen等(Chen et al.，Stem Cells，2006，24(9)：2052-2059)利用RWVB，在添加高剂量细胞因子组合的条件下实现了骨髓来源的HSCs和MSCs的共培养，虽然使HSCs与MSCs分别扩增了9倍和29倍，但高剂量的细胞因子组合显然比较昂贵。关于脐血来源的HSCs和MSCs的体外共同培养至今仍未见报道。因此，在不添加血清、只添加细胞因子和滋养层细胞支持的条件下，实现动态悬浮共培养脐带血来源的HSCs和MSCs，并分离、收获这两种干细胞，具有重要的临床价值和经济效益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1.分离人脐带血单个核细胞。脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次脐血采集量平均为50～100mL。脐血采集后，按体积比1∶1与PBS混合均匀，用密度为1.077g·mL^-1的Ficoll细胞分离液以2500rpm，25min离心后获得单个核细胞(Mononuclear cells，MNCs)，用IMDM基础培养基1000rpm，5min离心洗涤两次，调整细胞密度备用。

2.脐血单个核细胞与玻璃包被的聚苯乙烯微载体在六孔板内静止孵育24小时：将干燥的玻璃包被的聚苯乙烯微载体置于硅化处理的玻璃瓶中，按每克微载体置于50～100mL的不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS缓冲盐溶液中室温下浸泡3小时，用新鲜的不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS缓冲盐溶液冲洗两次，115℃下高压灭菌15分钟，铺满六孔板每孔底面，接种入新鲜分离得到的密度为1×10⁷cells·mL^-1的脐血单个核细胞，静止孵育24小时；

3.提供滋养细胞。取人脂肪组织，以质量百分比浓度分别为0.25％的胰蛋白酶和0.1％的I型胶原酶联合消化，吸出下层含单个核细胞的悬液，加入含体积百分比浓度为10％胎牛血清的培养基终止消化，剩余脂肪组织重复消化2～3次，将收集到的细胞沉淀加入含体积百分比浓度为10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，移入培养瓶中，37℃、5％CO2、20％O2、饱和湿度条件下孵育，每2～3天换液。待细胞在培养瓶底面积达80％融合时，加入质量百分比浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例进行常规传代培养，获得脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)。

4.海藻酸钙壳聚糖胶珠包埋滋养细胞。将质量百分比浓度为1.0％的海藻酸钠溶液与密度为6×105cells·mL-1的脂肪干细胞悬液以2∶1体积比混合后，经5#针头逐滴滴加至质量百分比浓度为3.0％氯化钙溶液中，反应8分钟，制得直径为1.0～1.5毫米的包埋有脂肪干细胞的海藻酸钙胶珠，PBS缓冲盐溶液冲洗两次后，再与质量百分比浓度为1.0％壳聚糖交联反应8分钟，将交联反应后的包埋有脂肪干细胞的海藻酸钙壳聚糖胶珠用PBS缓冲盐溶液冲洗两次后备用。

5.准备旋转壁式生物反应器。采用专利号为ZL 2003 1 0105054.6旋转式细胞培养系统来共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞。实验之前，将旋转壁式生物反应器各个部件清洗干净后，浸泡在体积百分比浓度为75％的酒精溶液中过夜，再用超纯水冲洗干净。将装配好的旋转式细胞培养系统、连接好的管路、充氧器分别包裹并于121℃下高压灭菌30分钟，烘干备用。

6.旋转壁式生物反应器内共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞。将脐血单个核细胞与GCSC微载体在六孔板内静止孵育24小时，待脐血间充质干细胞粘附到GCSC微载体上后，将脐血单个核细胞悬液与包埋脂肪干细胞的海藻酸钙壳聚糖胶珠混合，加入IMDM培养基，调整脐血单个核细胞密度至5×10⁵cells·mL^-1，微载体浓度为5mg·mL^-1，脐血单个核细胞与脂肪干细胞细胞数比例为5∶1，加入细胞因子组合SCF 15ng·mL^-1，FL 5ng·mL^-1，TPO 6ng·mL^-1，IL-315ng·mL^-1，G-CSF 1ng·mL^-1，GM-CSF 5ng·mL^-1，接种至旋转壁式生物反应器中，37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度条件下共培养12天。

7.分离海藻酸钙壳聚糖胶珠与脐血干细胞，收获并分离脐血造血干细胞与间充质干细胞。采用20目不锈钢筛网截留包埋脂肪干细胞的海藻酸钙壳聚糖胶珠，收集滤过液——脐血造血干细胞与粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微载体上的间充质干细胞混合悬液，采用自由沉降法分离并收获悬浮的脐血造血干细胞与粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微载体上的间充质干细胞。

本发明的效果和益处是：

(1)能够使脐血造血干细胞和间充质干细胞在动态悬浮条件下进行共培养，并发挥滋养细胞对干细胞的滋养、支持作用。

(2)微载体为脐血间充质干细胞提供了粘附表面，使脐血间充质干细胞在动态环境中实现贴壁悬浮培养。

(3)旋转壁式生物反应器显著降低了细胞生长环境的剪切力，使细胞始终处于动态悬浮生长环境，有利于造血干细胞的扩增。

(4)利用本发明一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法，对海藻酸钙壳聚糖胶珠包埋人脂肪干细胞滋养下的人脐血造血干细胞与间充质干细胞进行了动态悬浮共培养。结果表明，这两种脐血干细胞在此培养体系中均生长良好，12天后造血干细胞和间充质干细胞的扩增倍数分别可达5倍以及14倍。

附图说明

图1是本发明所述的一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法流程图。

图2是本发明所述的一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法海藻酸钙壳聚糖胶珠(直径为1.0～1.5毫米)包埋滋养细胞的显微照片。

图3是本发明所述的一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法脐血单个核细胞在接种至旋转壁式生物反应器之前与微载体在六孔板内孵育时的显微照片(100×)。

图4是本发明所述的一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法体外扩增过程中UCB-MSCs粘附在GCSC微载体表面上的光镜与扫描电镜观察结果(A：六孔板内光镜照片，200×；B：RWVB内光镜照片，200×；C：六孔板内扫描电镜照片；D：RWVB内扫描电镜照片)。

具体实施方式

以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。

实施例1：

本实施例为静态条件下共同培养UCB-HSCs与UCB-MSCs。

将新鲜分离得到的UCB-MNCs以5×10⁵cells·mL^-1的密度接种到提前铺满GCSC微载体的六孔板中，与包埋ADSCs的海藻酸钙壳聚糖胶珠混合均匀，ADSCs的接种密度为1×10⁵cells·mL^-1，补充IMDM培养基使培养体系为4mL，37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度条件下共培养9天。其中微载体的浓度为5mg·mL^-1，细胞因子组合与用量为SCF 15ng·mL^-1，FL 5ng·mL^-1，TPO 6ng·mL^-1，IL-315ng·mL^-1，G-CSF 1ng·mL^-1，GM-CSF 5ng·mL^-1。每隔24小时计数NCs，分别在第72小时、216小时从培养体系中取2mL的含有GCSC微载体的细胞悬液，经含0.02％EDTA的质量百分比浓度为0.125％的胰蛋白酶消化后，流式细胞仪分别分析检测CD34⁺CD45⁺CD105^-细胞即HSCs和CD34^-CD45^-CD105⁺细胞即MSCs的含量。

实验结果：采用稀释换液法，UCB-MNCs在不添加血清，只添加细胞因子和滋养层细胞支持的条件下，体外静态培养9天，UCB-HSCs和UCB-MSCs分别扩增了2.6倍和8.5倍。

此实施例说明，UCB-MSCs在GCSC微载体上能够良好地粘附生长；由于六孔板仅能提供二维静态培养环境，该体系不能自动调节细胞周围由于养料、氧及代谢废物产生的浓度梯度，致使UCB-HSCs的扩增倍数较低。提示在动态培养条件下，UCB-HSCs与UCB-MSCs可能会增殖更多。

实施例2：

本实施例为动态悬浮条件下共同培养UCB-HSCs与UCB-MSCs。

将新鲜分离得到的UCB-MNCs以1×10⁷cells·mL^-1的密度接种到提前铺满GCSC微载体的六孔板内静止孵育24小时，待UCB-MSCs充分粘附到微载体上后，与包埋ADSCs的海藻酸钙壳聚糖胶珠混合，补充IMDM培养基以使动态悬浮培养时UCB-MNCs和ADSCs的细胞密度可分别为5×10⁵cells·mL^-1和1×10⁵cells·mL^-1，微载体浓度为5mg·mL^-1，细胞因子组合与用量与实施例1相同。将此混合液接种至RWVB内，反应器的培养室转速保持在6rpm，37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度条件下共培养12天。每隔24小时计数NCs，分别在第72小时、216小时从培养体系中取4mL的含有GCSC微载体的细胞悬液，消化，分析检测HSCs和MSCs的含量，方法同实施例1。

实验结果：采用稀释换液法，UCB-MNCs在不添加血清，只添加细胞因子和滋养层细胞支持的条件下，在RWVB内动态悬浮培养12天，HSCs和MSCs分别扩增了5.2倍和13.9倍，显著优于六孔板中的培养结果。

此实施例说明，不添加血清、只添加细胞因子及滋养层细胞，采用微载体与生物反应器相结合的技术，可以实现动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞和间充质干细胞，使这两种干细胞获得较高的扩增倍数。海藻酸钙壳聚糖胶珠的人脂肪干细胞有效地滋养、支持了UCB-HSCs与UCB-MSCs的体外扩增从而，并部分替代了动物血清的作用，更加靠近临床，更加具有医学价值。

实施例3：

本实施例为扩增后的UCB-HSCs的集落形成CFU-Cs培养。

CFU-Cs集落主要包括CFU-Mix’s、CFU-GMs和BFU-Es。分别在第0小时、72小时和216小时将RWVB中的悬浮细胞，进行CFU-Cs集落培养。将扩增后的UCB-HSCs以2×10⁵cells·mL^-1的密度接种于甲基纤维素培养基中，每个35mm培养皿接种1mL，每个样本平行3皿。37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度的培养箱中培养10～12天，倒置显微镜下计数50个细胞以上的集落个数。其中培养基为含0.9％甲基纤维素的IMDM，添加30％FBS、1％BSA、50U·mL^-1青霉素、50mg·mL^-1链霉素、1×10^-4M 2-巯基乙醇、2mM左旋古氨酰铵、50ng·mL^-1重组SCF、10ng·mL^-1重组人IL-3、10ng·mL^-1重组人GM-CSF及3U·mL^-1重组人EPO。

实验结果：RWVB内动态悬浮条件下培养的UCB-HSCs能够形成CFU-Cs集落(参见图5)。

此实施例说明，动态悬浮条件下培养的造血干细胞，仍具有形成CFU-Cs集落的能力，良好地保持了UCB-HSCs的干细胞特性。

实施例4：

本实施例为扩增后的UCB-MSCs多向诱导分化分析。

在RWVB内动态悬浮培养结束时，将粘附在GCSC微载体上的细胞用含0.02％EDTA的质量百分比浓度为0.125％的胰蛋白酶消化下来，调整细胞密度至5×10⁴cells·mL^-1，接种到24孔板中，每孔加入1ML常规培养基，三天后全量吸出培养基，分别添加成骨、软骨、脂肪诱导剂进行诱导分化培养4周，每3天全量换液一次。分别在1周进行成骨细胞ALP染色、4周进行成骨细胞矿化结节von Kossa染色、软骨细胞甲苯胺蓝染色和脂肪细胞油红染色。

其中成骨诱导剂的成份为：IMDM培养基中添加10％FBS、0.1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠、50μM维生素C；脂肪诱导剂的成份为：IMDM培养基中添加10％FBS、0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μM地塞米松、0.2μM吲哚美辛和10μM胰岛素；软骨诱导剂的成份为：IMDM培养基中添加0.1μM地塞米松、50μg·mL^-1维生素C、100μg·mL^-1丙酮酸钠、10ng·mL^-1转化生长因子(TFG-β₃)、500ng·mL^-1骨形成蛋白(BMP-6)及50mg·mL^-1ITS+。

实验结果：动态悬浮条件下粘附在GCSC微载体上培养的UCB-MSCs经成骨诱导一周时，约90％的细胞表达碱性磷酸酶，诱导两周时，约80％的细胞能够矿化结节；软骨诱导三周时，约90％的细胞间外基质被甲苯胺蓝染成蓝紫色；脂肪诱导两周时，约80％的细胞胞内有红色的脂滴形成。多向诱导分化结果说明，动态悬浮条件下粘附在GCSC微载体上培养的大部分细胞具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的能力，并且所分化成的成骨细胞具有较好的矿化结节能力。

此实施例说明，在RWVB内动态悬浮条件下粘附在GCSC微载体上所扩增的细胞为UCB-MSCs，扩增的MSCs仍具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的能力。

尽管本发明是以人脂肪干细胞滋养人脐带血来源的造血干细胞和间充质干细胞、选用玻璃包被的聚苯乙烯微载体提供粘附表面为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，其它种类的滋养细胞、被滋养细胞、微载体粘附表面以及实施例的其他变形，对于本领域技术人员都是可以预料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。

Claims (1)

1.一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法，其特征在于以下步骤：

(1)分离人脐血单个核细胞：脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，脐血采集量平均为50～100mL，密度梯度离心分离得到单个核细胞，用IMDM基础培养基1000rpm，5min离心洗涤，调整细胞密度备用；

(2)脐血单个核细胞与玻璃包被的聚苯乙烯微载体在六孔板内静止孵育24小时：玻璃包被的聚苯乙烯微载体经不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS缓冲盐溶液处理后，115℃下高压灭菌15分钟，铺满六孔板每孔底面，接种入新鲜分离得到的密度为1×10⁷cells·mL^-1的脐血单个核细胞，静止孵育24小时；

(3)提供滋养细胞：滋养细胞为人脂肪组织来源的脂肪干细胞，以5×10⁴cells·mL^-1的密度接种于含体积百分比浓度为10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，当细胞在培养瓶底面积达80％融合时，加入质量百分比浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例进行常规传代培养；

(4)海藻酸钙壳聚糖胶珠包埋滋养细胞：将质量百分比浓度为1.0％的海藻酸钠溶液与密度为6×10⁵cells·mL^-1的脂肪干细胞悬液以2∶1体积比混合后，经5^#针头逐滴滴加至质量百分比浓度为3.0％氯化钙溶液中，反应8分钟，制得直径为1.0～1.5毫米的包埋有脂肪干细胞的海藻酸钙胶珠，PBS缓冲盐溶液冲洗后，再与质量百分比浓度为1.0％壳聚糖交联反应8分钟，将交联反应后的包埋有脂肪干细胞的海藻酸钙壳聚糖胶珠用PBS缓冲盐溶液冲洗后备用；

(5)准备旋转壁式生物反应器：将旋转壁式生物反应器各个部件清洗干净后，浸泡在体积百分比浓度为75％的酒精溶液中过夜，再用超纯水冲洗干净；将装配好的旋转式细胞培养系统、连接好的管路、充氧器分别包裹并于121℃下高压灭菌30分钟，烘干备用；

(6)旋转壁式生物反应器内共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞：将脐血单个核细胞与玻璃包被的聚苯乙烯微载体在六孔板内静止孵育24小时后，与包埋脂肪干细胞的海藻酸钙壳聚糖胶珠混合，加入IMDM培养基，调整脐血单个核细胞密度至5×10⁵cells.mL^-1，微载体浓度为5mg.mL^-1，脐血单个核细胞与脂肪干细胞的细胞数比例为5∶1，加入细胞因子组合SCF 15ng·mL^-1，FL 5ng.mL^-1，TPO 6ng.mL^-1，IL-315ng.mL^-1，G-CSF 1ng.mL^-1，GM-CSF 5ng.mL^-1，接种至旋转壁式生物反应器中，37℃、5％CO₂、20％O₂、饱和湿度条件下共同培养12天；

(7)分离海藻酸钙壳聚糖胶珠与脐血干细胞，收获并分离脐血造血干细胞与间充质干细胞：采用20目不锈钢筛网截留包埋脂肪干细胞的海藻酸钙壳聚糖胶珠，收集滤过液——脐血造血干细胞与粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微载体上的间充质干细胞混合悬液，采用自由沉降法分离并收获悬浮的脐血造血干细胞与粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微载体上的间充质干细胞。

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