CN109718202B

CN109718202B - 一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束

Info

Publication number: CN109718202B
Application number: CN201811054658.5A
Authority: CN
Inventors: 杜子秀; 彭佳惠; 王红霞; 徐宇虹
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2038-09-11
Also published as: CN109718202A

Abstract

本发明属于药物输送技术领域，具体涉及一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束。本发明利用人体安全的两亲性生物可降解材料(如PCL‑PEG)与化学药物形成稳定的纳米结晶胶束以提高药物的生物利用度，降低胶束临界浓度，实现体内长效循环；能够高效靶向肿瘤细胞，通过受体介导的内吞作用进入细胞，通过自身降解释放出药物。从而实现抗体和化药联合靶向治疗某一抗体抗原高表达的恶性肿瘤。

Description

一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束

技术领域

本发明属于药物输送技术领域，具体涉及一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束。

背景技术

化学药物疗法已广泛运用于当今多种疾病，尤其对于严重威胁人类健康的癌症是一种不可或缺的有效手段。但是，大多数的化学药物在临床使用过程中，存在水溶性和稳定性较差、缺乏靶向性、分布选择性差等诸多问题，从而导致生物利用度降低、甚至引发严重的毒副作用。因此，寻找高效、低毒的给药系统成为相关领域的研究热点。目前，关于疏水性化药的肿瘤部位输送可大致分为以下类型：(1)通过药物载体输送，如脂质体、聚合物胶束、白蛋白纳米粒等；(2)微乳化和自微乳化技术，借助表面活性剂将药物分散在油相中从而改善药物溶出；(3)前体药物。

其中聚合物胶束一般是由两亲性嵌段高分子组成，当在水溶液中达到一定浓度时，通过分子间氢键、范德华力、静电相互作用自发形成内部疏水、表面亲水的聚合物胶束，球形最为常见，也存在棒状、囊状、片状、星状等；具有粒径小、载药量大的特点，可避免被网状内皮系统识别以延长体内循环时间，并通过EPR效应富集于肿瘤组织以更好的发挥药效。在众多高分子聚合物中，聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)因具有良好的生物相容性和生物可降解性被广泛应用于医药生物领域。聚己内酯段在熔融温度60℃以下易结晶、所含烷基支链少从而空间位阻小，更易与药物形成稳定的胶束内核；聚乙二醇化的胶束表面也使得肝、肾对药物的摄取减少，具备持续释药能力[Wen-jen Lin等人，聚乙二醇化胶束共聚物的表征和体内药代动力学和生物分布研究，生物医学材料研究期刊b类生物应用研究材料，20064,77(1):188-94]。此外较长的聚已内酯-聚乙二醇嵌段可以降低Rho家族的鸟苷三磷酸酶的表达，增加粘附因子从而抑制癌细胞的迁移过程[Yang Shen等人，两亲性PCL-PEG胶束对HepG2细胞迁移的影响，大分子生物学，20153；15(3):372-84]。

经过近十年来的发展，科学家们成功制备出一系列不同嵌段长度的PCL-PEG高分子聚合物材料以满足不同的递药需求，且逐渐转向了靶向给药系统，即对PEG末端进行修饰，使其直接与叶酸、靶向肽等小分子基团连接[Linhua Zhang等人，叶酸修饰的脂质-聚合物混合紫杉醇靶向纳米粒，国际纳米医学杂志，2015：10,2101-2114]，[Guangzhi Gu等人，MMP-2/9激活的低分子量鱼精蛋白修饰的PCL-PEG纳米颗粒靶向脑胶质瘤的研究，生物材料，2013，34，196-208]；或是将PEG末端羟基通过化学反应修饰改造为羧基、马来酰亚胺等可与大分子抗体蛋白相连接的化学基团[Jian Jin等人，PSMA连接的PCL-PEG聚合物胶束靶向前列腺癌细胞的研究，公共科学图书馆，9(11):e112200]，这些大分子抗体可特异性识别并结合肿瘤细胞表面的受体，使药物富集于肿瘤组织中再通过受体介导的内吞作用进入细胞以发挥药效。但是上述方法反应过程复杂，尤其是后者需要先对抗体进行改造，使其修饰有可与马来酰亚胺连接的巯基，成本较高，且经过大量体内研究发现，包括羧酸酯键、双硫键，甚至一贯被认为较稳定的酰胺键在体内的血液循环中[Schumacher D等人，现状：位点特异性抗体药物偶联物.临床免疫学杂志，2016，36，S100-S7.]不稳定，容易出现靶向基团与纳米颗粒分离而出现脱靶的现象。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，例如现有疏水性药物和抗体联合在体内输送技术中的不足，本发明的目的在于提供一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束。

也就是说提供一种可以紧密包裹疏水性药物形成稳定均一的药物传递体系、表面为连有靶向抗体的体内长效循环并靶向特定细胞的药物传递体系；更具体来说，本发明是利用抗体和两亲性结晶性嵌段共聚物来构建一种抗体连接载药纳米颗粒的抗体－纳米颗粒复合物，虽然本示例利用抗her2单抗herceptin和聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG-CHO和PCL-PEG)载疏水性化学药物靶向特定细胞表面高效安全的纳米结晶胶束体系(Targetednanocrystalline micelles)，但其发明适合其他抗体和结晶性两亲性嵌段共聚物载疏水性化学药物的抗体－纳米颗粒复合物。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束，其包括用于载药的胶束载体和与所述胶束载体连接的靶向基团，所述胶束载体具有壳-核结构，所述胶束载体的制备材料包括PCL-PEG和PCL-PEG-CHO，疏水嵌段聚己内酯PCL与疏水性化学药物共同结晶形成所述壳-核结构的内核，亲水性嵌段聚乙二醇PEG形成所述壳-核结构的外壳，所述靶向基团通过自身表面的-NH₂与外壳表面PEG末端的-CHO形成碳氮单键进行连接。

一种实施方式中，示例性的以紫杉醇作为疏水性化学药物模型。但是并不限于此具体疏水性化学药物。例如可以是依帕司他等任何难溶性药物。

所述靶向基团可以是靶向抗体。所述靶向抗体可以是单克隆抗体的全抗也可以是抗体的某个具有靶向功能性的片段。

一种实施方式中，示例性的以赫赛汀作为所述靶向基团。但是并不限于此具体靶向基团。

所述PCL-PEG是由疏水性嵌段聚己内酯PCL与亲水性嵌段聚乙二醇PEG形成的两亲性嵌段共聚物。

一种实施方式中，PCL-PEG中PCL的分子量为2000Da；PEG的分子量为2000Da。

所述PCL-PEG-CHO是由疏水性嵌段聚己内酯PCL与亲水性嵌段聚乙二醇PEG形成的带有醛基的两亲性嵌段共聚物。

一种实施方式中，PCL-PEG-CHO中PCL的分子量为5000Da；PEG的分子量为2000Da。

一种实施方式中，所述靶向载药胶束中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为(10～1):1。

一种实施方式中，所述靶向载药胶束中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为(10～2):1。

一种实施方式中，所述靶向载药胶束中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为(2～1):1。

一种实施方式中，所述靶向载药胶束中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为10:1、2:1或1:1。

一种实施方式中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2～15％。

一种实施方式中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2～10％。

一种实施方式中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2～5％。

一种实施方式中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的5～15％。

一种实施方式中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的5～10％。

一种实施方式中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的10～15％。

一种实施方式中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2％、5％、10％或15％。

一种实施方式中，所述靶向基团通过自身表面的-NH₂与PEG末端的的-CHO先后通过Schiff和还原反应形成碳氮单键。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(3-20)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(3-15)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(3-12)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(3-5)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(5-20)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(5-15)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(5-12)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(12-20)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(12-15)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(15-20)：1。

一种实施方式中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为3:1、5:1、12:1、15:1或20:1。

一种实施方式中，还原反应中用到的还原剂为氰基硼氢化钠。

本发明的第二方面，提供前述适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束的制备方法，包括如下步骤：

(1)将所述PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG按照配比混合，然后按配比加入疏水性化学药物，共溶于有机溶剂中，加水形成有机溶剂和水的混合溶液或超声至形成均一的乳剂；

(2)去除溶液或乳剂中的有机溶剂，去除未包封的药物，得到载药胶束；

(3)将载药胶束与靶向基团共混，加入还原剂，还原反应，得到靶向载药胶束。

一种实施方式中，步骤(1)中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为(10～1):1。

一种实施方式中，步骤(1)中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为(10～2):1。

一种实施方式中，步骤(1)中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为(2～1):1。

一种实施方式中，步骤(1)中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为10:1、2:1或1:1。

一种实施方式中，步骤(1)中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2～15％。

一种实施方式中，步骤(1)中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2～10％。

一种实施方式中，步骤(1)中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2～5％。

一种实施方式中，步骤(1)中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的5～15％。

一种实施方式中，步骤(1)中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的5～10％。

一种实施方式中，步骤(1)中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的10～15％。

一种实施方式中，步骤(1)中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2％、5％、10％或15％。

一种实施方式中，步骤(1)中，所述有机溶剂选自四氢呋喃或氯仿。

一种实施方式中，步骤(1)中，所述水为去离子水。

一种实施方式中，步骤(1)中，有机溶剂与水的体积比为1:(10-20)。例如，实施例中，有机溶剂与水的体积比为1:10。

一种实施方式中，步骤(2)中，采用真空旋蒸蒸发除去有机溶剂。

一种实施方式中，步骤(2)中，采用微孔膜过滤除去未包封的药物。例如可以采用0.45um微孔膜过滤除去未包封的药物。

一种实施方式中，步骤(2)中，去除未包封的药物后采用透析的方式进一步去除残留的有机溶剂。例如，于PBS溶液中透析，将溶剂置换成磷酸盐缓冲溶液。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述还原剂为氰基硼氢化钠。

一种实施方式中，步骤(3)中，在10℃、300rpm条件下反应24h。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(3-20)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(3-15)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(3-12)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(3-5)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(5-20)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(5-15)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(5-12)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(12-20)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(12-15)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(15-20)：1。

一种实施方式中，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为3:1、5:1、12:1、15:1或20:1。

一种实施方式中，步骤(3)中，还原反应中用到的还原剂为氰基硼氢化钠。

本发明的第三方面，提供前述靶向载药胶束用于制备体内输送疏水性药物传递体系的用途。

进一步地，提供前述靶向载药胶束用于制备肿瘤药物传递体系的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明在现有技术的基础上，创造性地利用不可降解的的碳氮单键将胶束载体与靶向基团稳定连接起来构建一类可以紧密包裹疏水性化学药物并通过靶向基团靶向和治疗的药用载体。

具体地，

(1)本发明利用了聚己内酯易结晶的性质可以将疏水性化学药物紧密包裹在内；

(2)本发明胶束载体的PEG表面可实现载体在体内的长循环功能；

(3)本发明胶束载体上所连有的靶向基团可特异性靶向特定细胞表面，并通过受体介导的内吞作用进入细胞，增加药物的摄取。

由上所述，本发明是利用了聚己内酯的易结晶性能将疏水性化学药物紧密包裹在内，保证了药物在到达靶细胞前的稳定性；亲水性的PEG外壳以及两亲性高分子嵌段共聚物所形成的胶束粒径在170nm左右，均有助于胶束避免被系统网状内皮系统所识别，具有长循环功能；另外本发明的靶向功能是通过胶束与抗体之间的碳氮单键所实现，此种连接方法不仅反应过程简单，成本较低，而且有效突破了常用连接键在血液中不稳定的弊端，可以更有效的将药物富集于特定细胞表面，再通过受体介导的内吞作用进入细胞发挥药效。

附图说明

图1：为本发明实施例1中的非靶向载药胶束或靶向载药胶束的构建示意图。

图2：为本发明实施例2中胶束与抗体连接的反应示意图。

图3A：为本发明实施例3中空白胶束的粒径图。

图3B：为本发明实施例3中非靶向载药胶束的粒径图。

图3C：为本发明实施例3中靶向载药胶束的粒径图。

图3D：为靶向载药胶束于血清中三天内的粒径和多分散系数的变化。

图4A：为本发明实施例3中空白胶束的透射电镜图。

图4B：为本发明实施例3中非靶向载药胶束的透射电镜图。

图4C：为本发明实施例3中靶向载药胶束的透射电镜图。

图5：为本发明实施例3中的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图，其中a条带为Marker，b条带为对照抗体，c条带为-CHO:-NH2摩尔比＝3:1组，d条带为-CHO:-NH2摩尔比＝5:1组，d条带为-CHO:-NH2摩尔比＝12:1组，e条带为-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组，f条带为-CHO:-NH2摩尔比＝20:1组。

图6：为本发明实施例3中非靶向载药胶束和靶向载药胶束的圆二性色谱图，其中，herceptin代表抗体赫赛汀，targeted-micelles代表实施例2获得的靶向载药胶束组(-CHO:-NH2摩尔比＝15:1)，blank-micelles代表实施例1中获得的空白胶束。

图7A：为本发明实施例4中的制剂不同组分及市售紫杉醇注射剂对SK-BR-3人乳腺癌细胞的毒性作用的毒性实验结果，其中，blank-micelles代表实施例1获得的空白胶束；targeted-blank-micelles代表靶向非载药胶束(-CHO:-NH2摩尔比＝15:1，与实施例2中的靶向载药胶束相比不含有紫杉醇)；non-targeted-micelles代表实施例1中获得的非靶向载药胶束；targeted-micelles代表实施例2中获得的靶向载药胶束；her+NaCNBH3代表与实施例2中靶向载药胶束相同量的赫塞汀抗体与还原剂NaCNBH3的混合物；TAX-liposome代表市售紫杉醇脂质体注射剂(泰素)。

图7B：为本发明实施例4中的制剂不同组分及市售紫杉醇注射剂对MDA-MB-231人乳腺癌细胞的毒性作用的毒性实验结果，其中，blank-micelles代表实施例1获得的空白胶束；targeted-blank-micelles代表靶向非载药胶束(与实施例2中的靶向载药胶束相比不含有紫杉醇)；non-targeted-micelles代表实施例1获得的非靶向载药胶束；targeted-micelles代表实施例2获得的靶向载药胶束；her+NaCNBH3代表与实施例2获得的靶向载药胶束相同量的赫塞汀抗体与还原剂NaCNBH3的混合物；TAX-liposome 代表市售紫杉醇脂质体注射剂(泰素)。

图8：为本发明实例5中的SK-BR-3细胞对靶向载药胶束和非靶向载药胶束结合的流式检测图，其中，targeted-micelles代表实施例2获得的靶向载药胶束，non-targeted-micelles代表实施例1获得的非靶向载药胶束。

图9A：为本发明实施例6中，-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组靶向载药胶束(实施例2获得的靶向载药胶束)和非靶向载药胶束(实施例1获得)给药后，在不同时间点于小鼠的心组织中的紫杉醇浓度图。

图9B：为本发明实施例6中，-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组靶向载药胶束(实施例2获得的靶向载药胶束)和非靶向载药胶束(实施例1获得)给药后，在不同时间点于小鼠的肝组织中的紫杉醇浓度图。

图9C：为本发明实施例6中，-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组靶向载药胶束(实施例2获得的靶向载药胶束)和非靶向载药胶束(实施例1获得)给药后，在不同时间点于小鼠的脾组织中的紫杉醇浓度图。

图9D：为本发明实施例6中，-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组靶向载药胶束(实施例2获得的靶向载药胶束)和非靶向载药胶束(实施例1获得)给药后，在不同时间点于小鼠的肺组织中的紫杉醇浓度图。

图9E：为本发明实施例6中，-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组靶向载药胶束(实施例2获得的靶向载药胶束)和非靶向载药胶束(实施例1获得)给药后，在不同时间点于小鼠的肾组织中的紫杉醇浓度图。

图9F：为本发明实施例6中，-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组靶向载药胶束(实施例2获得的靶向载药胶束)和非靶向载药胶束(实施例1获得)给药后，在不同时间点于小鼠的肿瘤组织中的紫杉醇浓度图。

图10A：为本发明实施例7荷瘤小鼠尾静脉注射后，30天内各组裸鼠的肿瘤大小变换结果，其中，NaCl代表氯化钠组；Ab代表抗体组；blank-micelles代表空白胶束(实施例1获得)组；targeted-micelles代表-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组靶向载药胶束(实施例2获得的靶向载药胶束)组；non-targeted-micelles代表非靶向载药胶束(实施例1获得)组；TAX-injection代表市售紫杉醇注射剂(泰素)组。

图10B：为本发明实施例7荷瘤小鼠尾静脉注射后，30天内各组裸鼠的体重变化结果，其中，NaCl代表氯化钠组；Ab代表抗体组；blank-micelles代表空白胶束(实施例1获得)组；targeted-micelles代表-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组靶向载药胶束(实施例2获得的靶向载药胶束)组；non-targeted-micelles代表非靶向载药胶束(实施例1获得)组；TAX-injection代表市售紫杉醇注射剂(泰素)组。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规技术。

下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下列实施例中均以紫杉醇为模型药物进行具体阐述。

下列实施例中，

1.实验试剂和细胞/动物来源：

PCL-PEG-CHO、PCL-PEG和PCL-PEG-FITC均购自上海拓旸生物科技有限公司；紫杉醇(taxol)，购自上海泰坦科技股份有限公司；临床上使用的赫赛汀(曲妥珠单抗，herceptin)来源于Genetech公司(South San Francisco,CA,USA)；三氯甲烷(分析纯)，乙腈(色谱纯)，购自上海国药集团试剂有限公司；氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)购自萨恩化学技术(上海)有限公司；磷钨酸购自上海麦克林生化科技有限公司；RPMI-1640和DMEM高糖培养基、0.25％胰酶购自BI公司；青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗)，胎牛血清(FetalBovine Serum，FBS)购自美国Gibco公司；Fluoroshield Mounting Medium With DAPI、免疫荧光细胞固定液、抗荧光淬灭封片液、WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE 试剂盒)、考马斯亮蓝染色液、Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司；胰蛋白酶1:250购自上海翊圣生物科技有限公司。

Her2高表达的SK-BR-3人乳腺癌细胞和三阴性MDA-MB-231人乳腺癌细胞购自中国科学院上海细胞所。

BALB/c裸鼠，四周龄，购自于斯莱克公司。

2、实验仪器：

旋转蒸发仪：上海鲁伊工贸有限公司；水浴超声仪：昆山超声仪器厂；激光散射粒度分析仪：英国马尔文仪器公司；生物型透射电镜：FEI公司；荧光共聚焦显微镜：德国徕卡；酶标仪；流式仪：美国BD公司；CO₂恒温培养箱：美国ThermoFisher科技有限公司；Centrifuge 5418R离心机：Eppendorf公司；超净工作台、4℃冰箱：海尔公司；BS 210S电子天平：Sartorius公司；高效液相色谱仪(HPLC)、色谱柱ZORBAX SB-C18(5um,4.6×150mm)：安捷伦科技有限公司。

实施例1非靶向纳晶胶束(亦即，非靶向载药胶束)的制备方法

载药量为紫杉醇的质量占高分子载体材料质量的百分比。

本实施例中所使用的PCL-PEG-CHO中PCL的分子量为5000Da；PEG的分子量为2000Da。本实施例中所使用的PCL-PEG中PCL的分子量为2000Da；PEG的分子量为2000Da。

具体地，非靶向载药胶束的制备方法，包括如下步骤：

将所述PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG按照质量比2:1混合，然后加入PCL-PEG-CHO与PCL-PEG总质量5％的紫杉醇，共溶于1ml氯仿中震荡至完全溶解并混合均匀；随后加入10ml的去离子水以100％功率水浴超声至形成白色均匀的乳剂。于圆底烧瓶中15-35℃、真空条件下旋转蒸发除去氯仿即得到泛乳光的胶束溶液，随后于25-66℃水浴中超声10min，有助于进一步形成均一胶束体系。经0.45um微孔膜过滤除去未包封的药物(紫杉醇)后，于PBS溶液中透析2h将溶剂置换成磷酸盐缓冲溶液后即可用于进行后续实验。

合成构建示意图详见图1。

此外，空白胶束的制备方法，包括如下步骤：

将所述PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG按照质量比2:1混合，共溶于1ml氯仿中震荡至完全溶解并混合均匀；随后加入10ml的去离子水以100％功率水浴超声至形成白色均匀的乳剂。于圆底烧瓶中15-35℃、真空条件下旋转蒸发除去氯仿即得到泛乳光的胶束溶液，随后于25-66℃水浴中超声10min，有助于进一步形成均一胶束体系。于PBS溶液中透析2h将溶剂置换成磷酸盐缓冲溶液后即可用于进行后续实验。

实施例2、靶向纳晶胶束(亦即，靶向载药胶束)的制备方法

靶向载药胶束采用NaCNBH₃还原法制备。即在磷酸盐缓冲盐溶液中，在实施例1中所获得的非靶向载药胶束表面的醛基与赫赛汀表面的伯氨基(摩尔比-CHO/-NH2＝15:1)通过schiff反应形成C＝N键，随后在NaCNBH₃作用下形成稳定的C-N键，反应在2-10℃、350rpm条件下进行24h，所得靶向载药胶束4℃储存备用。

具体反应示意图详见图2。

实施例3、纳晶胶束(包括空白胶束、非靶向载药胶束、靶向载药胶束)的性能测定

一、粒径的测定

在常温下使用激光散射粒度分析仪分别测定实施例1获得的空白胶束、实施例1获得的非靶向载药胶束和实施例2获得的靶向载药胶束的粒径和多分散系数。

实施例1获得的空白胶束的粒径、多分散系数(PDI)见图3A。实施例1获得的非靶向载药胶束的粒径、多分散系数(PDI)见图3B。实施例2获得的靶向载药胶束的粒径、多分散系数(PDI)见图3C。

从图3A、图3B及图3C，可见载药后胶束粒径从130nm左右增加到165nm左右，连有抗体后粒径略微增加。进一步以粒径和多分散系数为指标检测靶向载药胶束在血清中三天内的稳定性以模仿体内环境，具体地，将胶束溶液与血清按体积1:1混合均匀，置于37℃恒温箱中。分别于0、30min、1h、2h、4h、5h、30h、2d、3d测定混合溶剂的粒径与PDI，结果见图3D，可见三天后粒径为240nm左右，虽有增大但是反映了载体仍旧能够维持胶束形态，说明本载体稳定性良好。

二、包封率及载药量的测定

为考察实施例2获得的靶向载药胶束的包封率和实际载药量，建立了以下液相条件进行探究：色谱柱：ZORBAX SB-C18(5um,4.6×150mm)，流动相：乙腈：水(50:50，V/V)，柱温：30℃，流速1ml/min，检测波长：227nm。具体过程为，精密称取靶向载药胶束的冻干粉末适量，用乙腈涡旋充分溶解后，经0.22um微孔膜过滤后取10ul进样分析，代入标准曲线计算实际TAX含量，代入以下公式经计算得所制载紫杉醇胶束的实际载药为5.69％，包封率为81.3％。

包封率(％)＝纯化后胶束中紫杉醇质量/紫杉醇投药质量*100

载药量(％)＝胶束中紫杉醇质量/载药胶束总质量*100

三、透射电镜(TEM)

采用透射电镜对前期制备的实施例1获得的空白胶束、实施例1获得的非靶向载药胶束和实施例2获得的靶向载药胶束进行形态学观察。具体方法为使用去离子水作为分散介质稀释上述胶束至0.5～1mg/ml(载体浓度)，然后取10ul稀释后的胶束滴加到铺有碳膜的铜网上，1min后用滤纸将多余的脂质体溶液吸干，再取10ul磷钨酸滴加到铜网，复染铜网上的胶束，1min后，用滤纸吸干，放置过夜后使用生物型透射电镜仪进行观察，测定结果见图4A(实施例1获得的空白胶束)、图4B(实施例1获得的非靶向载药胶束)、图4C(实施例2获得的靶向载药胶束)，可见三种制剂均以棒状胶束形态呈现，分布均匀。

四、抗体连接的确证与连接率的测定

聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证是否成功制备靶向载药胶束。按照实施例2中的方法制备靶向载药胶束，不同之处在于，所述-CHO与所述-NH₂的摩尔比例分别为3:1、5:1、12:1、20:1，获得不同处方的靶向载药胶束。将实施例2获得的靶向载药胶束以及本实施例中制备获得的不同处方的靶向载药胶束，分别与巯基乙醇(v/v＝5)混合后于95℃条件下加热5min促使蛋白变性，配制10％的电泳用胶后上样，电泳先在80v条件下进行15min，随后在120v电压下继续30min，经考马斯亮蓝染色液染色30min后去离子水脱色即可。由于分子量越大，条带位置越上，因此我们从条带的向上偏移可以初步判定，各靶向载药胶束大约有50％的抗体与胶束发生了连接反应，且能够保持抗体的结构完整性，详见图5，其中a条带为Marker，b条带为对照抗体，c条带为-CHO:-NH2摩尔比＝3:1组，d条带为-CHO:-NH2摩尔比＝5:1组，d条带为-CHO:-NH2摩尔比＝12:1组，e条带为-CHO:-NH2摩尔比＝15:1组，f条带为-CHO:-NH2摩尔比＝20:1组。

对于抗体连接率的定量分析，我们首先采用高速离心法分离靶向载药胶束与游离抗体，离心条件为13000rpm、1h。采用Bradford法测定上清液中的游离抗体浓度。即取10ul不同浓度的蛋白标准液(0～1.5mg/ml)以及10ul上清液加于96孔板中，各孔再加入300ulG250染色液，随后用酶标仪测定595nm下各孔的吸光度。连接率为抗体总投药量减去上清液中的游离抗体与总量的比值。经测定，-CHO:-NH2摩尔比为15:1的反应进行24h后抗体连接率为52.6％。以此处方进行后续的实验。

为进一步确证抗体与胶束的成功连接，我们利用圆二色谱法鉴定靶向载药胶束与非靶向载药胶束的区别。在圆二色谱中也显示，当抗体与胶束连接后，蛋白的圆二色性会随之发生改变，进一步确证了抗体与胶束的连接，详见图6。

实施例4、制剂的不同组分及市售紫杉醇脂质体对SK-BR-3和MDA-MB-231细胞的毒性作用

MDA-MB-231细胞为三阴性乳腺癌细胞，细胞表面不表达Her2受体，采用DMEM培养基加10％FBS和1％双抗培养；SK-BR-3为Her-2受体高表达细胞，采用1640培养基加10％FBS加1％双抗培养。不同处方的毒性实验采用WST试剂盒检测。基本过程是，将细胞用胰酶消化后计数，按照1万个细胞每孔加入96孔板中，于5％CO₂条件下继续培养24h。随后用pH7.4的PBS清洗细胞三遍后，加入不同组分的制剂继续培养4h后吸出培养液，再用pH7.4的PBS清洗细胞三遍，重新加入200ul新鲜的培养液继续培养三天，其中紫杉醇浓度为50ng/ml。孵育完成后，每孔加入20ul的WST试剂，于37℃条件下孵育40min后测定在450nm波长下的吸光度。数据经处理后详细见图7A和图7B。由于SK-BR-3细胞表面高表达Her2受体，靶向载药胶束所连有的赫赛汀可与其特异性结合，并通过受体介导的细胞内吞增加细胞对纳晶胶束的摄取，从而导致细胞毒性增强，统计学分析靶向载药胶束的毒性和非靶向载药胶束的毒性具有显著性差异。而在不表达Her2受体的三阴性细胞MDA-MB-231细胞上未出现此差异。另外，结果显示实验剂量下的载体材料与赫赛汀抗体均无明显毒性作用。

实施例5、SK-BR-3细胞对靶向载药胶束和非靶向载药胶束结合的流式检测

事先采用PCL-PEG-FITC荧光材料代替未标记荧光的PCL-PEG的材料，按照实施例1和实施例2中的方法，制备一批非靶向载药胶束和靶向载药胶束。

胰酶消化细胞后计数，按照每孔15万细胞加入12孔板中，每组两个复孔。于5％CO2条件下继续培养24h。待细胞贴壁后用pH7.4的PBS清洗细胞三遍，按照荧光材料8ng和10ng的剂量加入每个复孔中，于4℃条件下继续孵育一小时。孵育完成后用PBS清洗细胞一遍，胰酶消化各组细胞于1.5ml EP管中，在4℃、1000rpm条件下离心10min，弃去上清后用200ulPBS重悬细胞，此过程重复三次。最后一次用0.5ml PBS重悬细胞于流式管中，进行检测。检测结果详见图8。可见细胞对靶向载药胶束的结合率均高于非靶向载药胶束，说明所连靶向基团发挥了增加药物富集于特定细胞表面的功能。

实施例6、靶向载药胶束和载药胶束于小鼠体内的组织分布检测

(1)种瘤：

配置好浓度为5×10^6个/ml的SK-BR-3细胞悬液，于靠近裸鼠腋下的皮下注射，每只200ul。待两周后处死裸鼠，取出母瘤，分割成直径约1mm的小肿瘤块，采用种瘤针给实验小鼠皮下种瘤，共分为靶向载药胶束和非靶向载药胶束两大组，每组按不同给药时间分为1、3、6、12、24h五个小组，每组3只，共30只。种瘤两周后开始实验。

(2)组织分布实验：

按紫杉醇剂量0.1mg/只尾静脉注射给药后，分别于各个时间点取出裸鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，用生理盐水冲洗干净组织表面残留的血液。分别精密称取一定质量的组织加入0.5ml生理盐水，匀浆5min(注意全程保持低温)。于4℃、13.2k rpm条件下高速离心10min后，分别取100ul上清液加入400ul乙腈涡旋1min，100％功率超声5min以让组织液中的蛋白充分的沉淀待除去。随后再于4℃、13.2k rpm条件下高速离心10min，取上清液过0.22um微孔膜后采用LC-MS进行检测。结果详见图9A、图9B、图9C、图9D、图9E、图9F。根据分析，靶向载药胶束组在1、3、6、12时间点肿瘤部位的紫杉醇浓度分别为非靶向载药胶束的1.87、1.39、2.13、1.38倍(1h和6h时有显著性差异)，显示了本载体在传递药物于特定组织中的优势。

实施例7、裸鼠体内的药效学实验

将母瘤分割成直径约1mm的小肿瘤块，采用种瘤针给实验小鼠皮下种瘤，一周后将裸鼠均分为以下六组：氯化钠组、抗体组、空白胶束组、靶向载药胶束组、非靶向载药胶束组和市售紫杉醇注射剂组，每组六只，确保每组的肿瘤大小平均值接近。按紫杉醇剂量0.15mg/只尾静脉注射，每三天给药一次，并测量各组肿瘤的大小及体重。结果详见图10A和图10B，其中靶向载药胶束组相较于其他组显示出明显的肿瘤抑制作用。可见，实施例2中获得的靶向载药胶束对于肿瘤的抑制作用是市售紫杉醇注射剂的2-3倍。

实施例8

本发明还参照实施例2制备了其他处方的靶向载药胶束，并考察了其粒径、包封率、载药量、透射电镜形态、抗体连接的确证与连接率、对SK-BR-3和MDA-MB-231细胞的毒性作用、流式检测、于小鼠体内的组织分布检测、裸鼠体内的药效学实验，具体如下：

处方1、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为10:1，其他均相同。

(1)采用与实施例3相同的方法测定粒径，可见载药后胶束粒径从130nm左右增加到165nm左右，连有抗体后粒径略微增加。进一步以粒径和多分散系数为指标检测靶向载药胶束在血清中三天内的稳定性以模仿体内环境，见三天后粒径为240nm左右，虽有增大但是反映了载体仍旧能够维持胶束形态，说明本处方的靶向载药胶束稳定性良好。

(2)采用与实施例3相同的方法测定本处方的靶向载药胶束包封率及载药量，实际载药约为6％左右，包封率为80％左右。

(3)采用与实施例3相同的方法进行透射电镜观察，发现本处方的靶向载药胶束以棒状胶束形态呈现，分布均匀。

(4)采用与实施例3相同的方法进行抗体连接的确证与连接率的测定，发现本处方靶向载药胶束大约有50％的抗体与胶束发生了连接反应，且能够保持抗体的结构完整性。

(5)采用与实施例4相同的方法考察本处方靶向载药胶束对SK-BR-3和MDA-MB-231细胞的毒性作用，结果显示本处方载药胶束均无明显毒性作用。

(6)采用与实施例5相同的方法进行本处方靶向载药胶束的流式检测，发现所连靶向基团发挥了增加药物富集于特定细胞表面的功能。

(7)采用与实施例6相同的方法进行本处方靶向载药胶束于小鼠体内的组织分布检测，发现，本处方靶向载药胶束与非靶向载药胶束相比，在肿瘤部位的紫杉醇浓度有显著性差异。

(8)采用与实施例7相同的方法进行本处方靶向载药胶束于裸鼠体内的药效学实验，发现，本处方靶向载药胶束对于肿瘤的抑制作用是市售紫杉醇注射剂的2-3倍。

处方2、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为1:1，其他均相同。

处方3、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为3:1，其他均相同。

处方4、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为5:1，其他均相同。

处方5、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为12:1，其他均相同。

处方6、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为20:1，其他均相同。

处方7、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2％，其他均相同。

处方8、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的10％，其他均相同。

处方9、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的15％，其他均相同。

处方10、与实施例2中靶向载药胶束不同之处在于：有机溶剂使用四氢呋喃、四氢呋喃与水的体积比为1:20，其他均相同。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种适用于载疏水性化学药物的靶向载药胶束，其包括用于载药的胶束载体和与所述胶束载体连接的靶向基团，所述胶束载体具有壳-核结构，所述胶束载体的制备材料包括PCL-PEG和PCL-PEG-CHO，疏水嵌段聚己内酯PCL与疏水性化学药物共同结晶形成所述壳-核结构的内核，亲水性嵌段聚乙二醇PEG形成所述壳-核结构的外壳，所述靶向基团通过自身表面的-NH₂与外壳表面PEG末端的-CHO形成碳氮单键进行连接。

2.根据权利要求1所述的靶向载药胶束，其特征在于，所述靶向载药胶束中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为(10～1):1。

3.根据权利要求1所述的靶向载药胶束，其特征在于，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2～15％。

4.根据权利要求1所述的靶向载药胶束，其特征在于，所述靶向基团通过自身表面的-NH₂与PEG末端的的-CHO先后通过Schiff和还原反应形成碳氮单键。

5.如权利要求1-4之任一项所述靶向载药胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG的质量比为(10～1):1。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述疏水性化学药物的质量为PCL-PEG-CHO与所述PCL-PEG总质量的2～15％。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂选自四氢呋喃或氯仿。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，有机溶剂与水的体积比为1:(10-20)。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，还包括如下特征中的任一项或多项：(1)步骤(2)中，采用真空旋蒸蒸发除去有机溶剂；(2)步骤(2)中，采用微孔膜过滤除去未包封的药物；(3)步骤(2)中，去除未包封的药物后采用透析的方式进一步去除残留的有机溶剂。

11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述还原剂为氰基硼氢化钠。

12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述-CHO与所述-NH2的摩尔比为(5-20)：1。

13.如权利要求1-4之任一项所述靶向载药胶束用于制备体内输送疏水性药物传递体系的用途。

14.如权利要求1-4之任一项所述靶向载药胶束用于制备肿瘤药物传递体系的用途。