CN112315980A - 一种缓释msc来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法及应用 - Google Patents

一种缓释msc来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针，包括基板与固定于基板上的微针单元，所述的基板为具有掺入硝酸银的可溶性高分子聚合物，所述的微针单元为负载MSC来源外泌体的生物可降解材料。本发明通过采用蚀刻技术制备的PDMS模具，构建出微针单元负载MSC‑exo同时基板含有抗菌金属纳米颗粒的损伤修复微针，作用于皮肤后，MSC‑exo能够缓释释放发挥抗炎和免疫调节作用，加速血管新生、改善创面氧化炎症环境，同时基板中的抗菌金属纳米颗粒具有防治细菌感染的功效，加速皮肤慢性伤口愈合，使MSC‑exo及抗菌金属纳米颗粒可在原位达到治疗最小剂量，实现无痛、安全、自主给药。本发明制备工艺简单，不需大型仪器，药物携载量高，安全实用性强，易于推广。

Description

一种缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法及 应用
技术领域
本发明属于微针载药释放技术领域，具体涉及一种缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法及应用。
背景技术
糖尿病是一种高发病率的代谢性疾病，由血糖异常积累而导致神经病变和动脉损伤等病理过程，长期影响患者的健康和生活质量。高血糖引起的微血管功能障碍是糖尿病并发症的主要原因之一，导致伤口缺血进而延迟愈合。伤口愈合一般分为炎症、增殖和基质重构三个经典阶段，需要血管为参与愈合过程的细胞提供营养和氧气支持。因此，增强糖尿病患者伤口处的血管生成和重建是加速修复愈合的关键。此外，血液循环不良、营养不足和炎症反应通常会导致微生物，特别是金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的感染，进一步延缓损伤处的修复愈合。传统的生长因子治疗，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）可加快糖尿病创面血管化的速度。然而由于给药方式、剂量控制和治疗费用高昂等因素极大的限制它们的使用规模。因此，糖尿病创面治疗迫切需要抗菌联合促血管生成的新策略。
外泌体（exosomes，exo）是细胞分泌的一种纳米级小囊泡，大小为40～100 nm，包裹多种生物活性分子的脂质双分子层结构，如细胞因子、mRNA及lncRNA等小分子RNAs。它们可介导细胞之间的信号传导，参与免疫应答，介导炎症反应，血管新生，凋亡，衰老，废物处理等生理过程。不同细胞来源的外泌体所含有的RNAs和蛋白成分不尽相同，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。
间充质干细胞来源的外泌体（MSC-exo）作为一种重要的生物活性分子，具有类似于MSC的免疫调节、组织修复等多种功能。与MSC相比，外泌体具有诱发免疫排斥反应的风险低、稳定性高、易于存储等优势，近年来在伤口愈合中受到广泛关注，具有广阔的应用前景。有报道称，人脂肪干细胞（ADSCs）来源的外泌体能够调节成纤维细胞的功能，加速皮肤伤口的愈合。另一项研究证实了人脐带血间充质干细胞（hUCB-MSCs）来源的外泌体可有效促进血管生成促进创面愈合作用。然而，反复冻融外泌体会导致外泌体聚集、膜破裂或数量减少，此外其在体内能被快速清除、半衰期相对较短，游离外泌体的活性无法长久维持也将影响其治疗效果。因此，开发一种生物相容性载体以维持药物活性和持续释放对基于外泌体的创伤愈合治疗至关重要。
微针是透皮吸收给药的物理促渗方法之一，可以穿透皮肤角质层，在皮肤上创造微米尺度的通道，增强皮肤渗透性，使药物不经注射便可进入血液循环局部药物持续。此外微针提高药物的吸收率的同时不在皮肤表面留下伤口，实现药物缓释，可作为一种有效的药物/细胞传递支架材料在伤口愈合和组织器官功能的重建中得到广泛应用。生物可降解高分子材料具有较高的药物及细胞包埋率，可加载生物活性分子如细胞因子、抗氧化剂、干细胞等，通过溶解炎症、诱导血管生成来加速糖尿病创面愈合。微针与其他给药方式相比具有独特的优点，是一种无痛、安全、自主的给药方式。然而，同时兼具MSC外泌体缓释和抗菌功能的微针尚未开发。
因此，在本发明中，我们以掺入纳米抗菌颗粒的高分子聚合物为基板，负载MSC-exo的生物可降解材料为微针单元，设计发明了一种缓释释药的抗菌促修复的微针，可用于组织损伤修复。
发明内容
本发明的目的是针对传统MSCs-exo原位治疗输注剂量大、治疗效果不稳定等缺点，提供一种缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法及应用。
本发明采用以下技术方案：
一种缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法，包括以下步骤：
S1、配制生物可降解聚合物溶液：称取一定量的生物可降解聚合物，加入到双蒸水中分散，充分溶解，形成生物可降解聚合物溶液；
S2、分离间充质干细胞来源的外泌体：取充质干细胞培养液，收集细胞培养上清，采用离心法提取MSC来源外泌体；
S3、制备负载MSC来源外泌体的微针单元：在S1中制备的生物可降解聚合物溶液中加入1%（v/v）光引发剂（2-羟基-2-甲基苯丙酮），将S2中提取的MSC来源外泌体按一定密度均匀混合于上述加入光引发剂的生物可降解聚合物溶液中，形成混悬液；将所述混悬液加入到微针模板中，紫外光固化1~3 min后制得负载MSC来源外泌体的微针单元；
S4、制备抗菌微针基板：配制含金属纳米颗粒的高分子聚合物溶液，灌注到S3制备的微针模板表面，充分装填后干燥，形成抗菌微针基板，抗菌微针基板的厚度为0.2~1mm；最终将负载MSC来源外泌体的微针单元和抗菌微针基板从微针模板中剥离，获得固态的目标产物缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针。
进一步的，S4中，抗菌微针基板的干燥在湿度为20~40%、温度为15~25℃的条件下进行，所述干燥主要目的是让微针基板内的水分挥发，乳液在微针模具内固化成型，所述抗菌微针基板干燥时间为30~60 min。
进一步的，S1中，所述生物可降解聚合物溶液为20~50%透明质酸钠溶液或15~40%甲基丙烯酸酯明胶（GelMA）溶液。
进一步的，S2具体为：选取处于对数生长期的MSC用于外泌体的分离提取，采用MSC完全培养基进行培养，当细胞生长至80~85%融合度时，将MSC完全培养基更换为无血清的培养基，继续培养36~72小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取MSC来源外泌体。
进一步的，所述MSC为人脐带间充质干细胞第2~4代。
进一步的，超速离心的条件为：50,000~65,000 rpm，4°C，1~2小时。
进一步的，S3中，所述MSC来源外泌体在生物可降解聚合物溶液中密度为10~50μg/ml。
进一步的，S4中，所述高分子聚合物选自丝素蛋白（SF）、硫酸软骨素、羧甲基纤维素钠、透明质酸钠、聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA）、甲基丙烯酸酯明胶（GelMA）、海藻糖、羧甲基纤维素、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、半乳糖、糊精、麦芽糖、聚乳酸（PLA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇（PVA）、聚二甲基硅氧烷（PDMS）中的一种或多种。
进一步的，S4中，所述金属纳米颗粒为金、银、铜纳米颗粒中的一种，粒径为5~100nm；金属纳米颗粒在高分子聚合物溶液中的浓度为1~10 mM。
进一步的，S3中，利用施加压力或抽真空的方法使混悬液加入到微针模具微孔中；其中，施加压力为0.2~0.8 MPa，抽真空达到的真空度为0.02~0.1Mpa。
进一步的，所述微针单元的形状为金字塔形、圆锥形、子弹形、箭头形或剑形；所述微针底部直径为50~250 µm，高度为200~1000 µm；相邻微针的间距为300~950µm。
本发明还提供一种缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针，包括抗菌微针基板及固定于抗菌微针基板上的负载MSC来源外泌体的微针单元。
以上所述的缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针可应用在组织损伤疾病修复治疗领域中。
本发明的有益效果：
（1）本发明以生物可降解材料结合PDMS模具制备微针，制备工艺简单，不需大型仪器，药物携载量高，易于推广；
（2）本发明设计了一种掺入金属纳米颗粒的抗菌微针基板，易在皮肤表面形成抗菌层，施用时可长时间给药和药物缓释，安全实用性强；
（3）本发明制备的缓释MSC-exo微针可用于经皮给药，相对直接原位注射的血药浓度平稳，外泌体活性保持时间长久，减少给药次数，可实现无痛、安全、自主给药，同时微针单元中的MSC-exo长时间发挥抗炎和免疫调节作用，加速血管新生、改善创面氧化炎症环境，促进愈合速率。
附图说明
图1为本发明缓释MSC-exo抗菌修复微针的制备流程示意图；其中，图i为向模板中装填负载MSC-exo的聚合物前体溶液，图ii为紫外固化后得到的微针阵列单元；图iii为向固化后微针阵列铺上掺有硝酸银的高分子聚合物基板，固化后得到抗菌修复微针贴片；
图2为本发明缓释MSC-exo的抗菌损伤修复微针模板示意图（A）及主模板局部实物图（B）；
图3 为本发明实施例中抗菌微针基板SF-PVA-AgNPs对大肠杆菌和金黄色葡糖球菌的抗菌性能的影响；
图4为本发明缓释MSC-exo的抗菌损伤修复微针对STZ诱导糖尿病大鼠全层皮肤切除伤口14天的疗效考核；
图5为本发明缓释MSC-exo的抗菌损伤修复微针对STZ诱导糖尿病大鼠全层皮肤切除伤口第14天的H&E染色图片（A）及上皮愈合率统计结果（B）；
附图中的标号为：
1、MSC-exo；2、PDMS微针模板；3、紫外仪；4、载药微针单元；5、高分子聚合物；6、掺入纳米金属的微针基板。
具体实施方式：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
缓释MSC-exo的抗菌修复微针的制备，步骤如下：
（1）甲基丙烯酸酯明胶（GelMA）水溶液的配制：
称取GelMA，加入到双蒸水中分散，制备30%的GelMA溶液，充分溶解；
（2）分离间充质干细胞来源的外泌体：
选取处于对数生长期的MSC用于外泌体的分离提取，采用MSC完全培养基进行培养，当细胞生长至80%融合度时，将MSC完全培养基更换为无血清外泌体的培养基，继续培养48小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取外泌体，超速离心的条件为：50,000 rpm，4°C，60 min；
（3）制备负载MSC外泌体的微针单元：
将第4代MSC来源的外泌体按50μg/ml均匀混合于含1%（v/v）光引发剂（2-羟基-2-甲基苯丙酮）的GelMA溶液，形成混悬液，将所述混悬液加入到微针模具中，施加压力为0.5 MPa，抽真空达到的真空度为0.1MPa，紫外光固化1min后制得负载MSC外泌体的微针单元；
（4）制备抗菌微针基板：
配制含10 mM AgNO3的20%（w/v）丝素蛋白与10%（w/v）PVA混合悬液，灌注到步骤（3）制备的微针模板表面，充分装填后日光照射1小时，室温干燥，过夜；从微针模板中小心剥离固化的负载MSC外泌体的微针和抗菌微针基板，最终得到针长1000 mm，底部直径为50 mm，针尖距离为700 mm，数量阵列20×20 mm，微针贴片尺寸16.3×16.3mm，凹槽深度1 mm的缓释MSC来源外泌体的抗菌修复微针。
实施例2
缓释MSC-exo的抗菌修复微针的制备，步骤如下：
（1）甲基丙烯酸酯透明质酸水溶液的配制：
称取一定量的甲基丙烯酸酯透明质酸，加入到双蒸水中分散，制备40%的水溶液，充分溶解；
（2）分离间充质干细胞来源的外泌体：
选取处于对数生长期的MSC用于外泌体的分离提取，采用MSC完全培养基进行培养，当细胞生长至80%融合度时，将MSC完全培养基更换为无血清外泌体的培养基，继续培养48小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取外泌体，超速离心的条件为：60,000 rpm，4°C，120 min；
（3）制备负载MSC外泌体的微针单元：
将第3代MSC来源的外泌体按50μg/ml均匀混合于含1%（v/v）光引发剂（2-羟基-2-甲基苯丙酮）的GelMA溶液，将所述混悬液加入到微针模具中，施加压力0.5 MPa或抽真空达到的真空度为0.1MPa，紫外光固化3 min后制得负载MSC外泌体的微针单元。
（4）制备抗菌微针基板：
配制含10 mM AgNO3的30%（w/v）丝素蛋白与20%（w/v）PVA混合悬液，灌注到步骤（3）中微针模板表面，充分装填后日光照射1小时，室温干燥，过夜，从模板中小心剥离固化的负载MSC外泌体的微针和抗菌微针基板，最终得到针长800 mm，底部直径为60 mm，针尖距离为500 mm，数量阵列20×20 mm，微针贴片尺寸16.3×16.3mm，凹槽深度1.5 mm的缓释MSC来源外泌体的抗菌修复微针。
实施例3
缓释MSC-exo的抗菌修复微针的制备，步骤如下：
（1）甲基丙烯酸酯明胶（GelMA）水溶液的配制：
称取GelMA，加入到双蒸水中分散，制备35%的GelMA溶液，充分溶解；
（2）分离间充质干细胞来源的外泌体：
选取处于对数生长期的MSC用于外泌体的分离提取，采用MSC完全培养基进行培养，当细胞生长至80%融合度时，将MSC完全培养基更换为无血清外泌体的培养基，继续培养48小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取外泌体，超速离心的条件为：65,000 rpm，4°C，60 min；
（3）制备负载MSC外泌体的微针单元：
将第4代MSC来源的外泌体按100μg/ml均匀混合于含1%（v/v）光引发剂（2-羟基-2-甲基苯丙酮）的GelMA溶液，将所述混悬液加入到微针模具中，施加压力为0.4 MPa；抽真空达到的真空度为0.1Mpa，紫外光固化3 min后制得微针单元；
（4）制备抗菌微针基板：
配制含5 mM AgNO3的20%（w/v）丝素蛋白与10%（w/v）PVA混合悬液，灌注到步骤（3）微针模板表面，充分装填后日光照射30 min，室温干燥，过夜，从模板中小心剥离固化的负载MSC外泌体的微针和抗菌微针基板，最终得到针长1000 mm，底部直径为60 mm，针尖距离为800mm，数量阵列20×20 mm，微针贴片尺寸16.3×16.3mm，凹槽深度1 mm的缓释MSC来源外泌体的抗菌修复微针。
试验例1 微针基板SF-PVA-AgNPs体外抗菌活性测定
为了验证本发明所制备的抗菌微针基板的抗菌活性，进行体外抗菌活性测定。
分组：分5组，分别是SF-PVA-AgNPs组、SF-AgNPs组、AgNO3组、SF组和PVA组。
使用大肠杆菌（革兰氏阴性，ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性，ATCC29213）的两种细菌菌株，其浓度约为1.0×107 CFU/mL。使用琼脂扩散试验研究了Ag+的抗菌活性。在9 mL的固体LB培养基中分别接种1 mL的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌悬浮液，并均匀地涂板于琼脂平板上，中心打孔（约5 mm×5 mm），将实施例1所制备的干燥后的抗菌基板（约4 mm×4 mm）放在琼脂板中心的孔洞中。在黑暗中于37 °C孵育24小时。将各组基板拍照观察细菌生长的抑制区，以监测释放的Ag+的抗菌作用。通过软件统计面积计算细菌存活率。结果见图3，由抑菌率可以看出，基板SF-PVA-AgNPs表现出对两种细菌均有强烈的杀菌效果，且高于单独的硝酸银的抑菌率。结合体内实验表明，可以较长时间的维持一定的浓度，不会因为浓度高而产生毒性，因此可以有效的减少给药次数。
试验例2 缓释MSC-exo的抗菌损伤修复微针对大鼠糖尿病全层皮肤切除难愈合模型的治疗作用
按照文献报道方法（现有技术）建立大鼠皮肤创伤愈合，即取SD大鼠，随机分为四组，异氟烷麻醉，在背部打孔，防止感染，基于创伤模型给药。
分组如下：
Tegaderm对照组：治疗时给入生理盐水；
MSC-exo组：治疗时给入等量的MSC-exo作为对照；
GelMA@SF-AgMN组：治疗时给入未携载MSC-exo的抗菌微针作为对照；
GelMA@SF-AgMN&MSC-exo组：治疗时给入携载MSC-exo的抗菌微针作为治疗组；
微针给药后，红霉素软膏涂抹伤口，一次性无菌敷料贴包扎，单笼饲养，观察大鼠造模前后的体重，皮毛，运动及进食的变化。通过创面愈合率、创面愈合时间和组织病理学分析作为直接而有效的创面愈合评价指标。通过对大鼠定时拍照记录伤口愈合的图片，第14天的创面愈合图片见图4。病理图片及上皮修复率见图5，结果表明缓释MSC-exo的抗菌损伤修复微针能够促进慢性的伤口愈合，减少愈合过程中感染的风险。
本发明制备的缓释MSC-exo微针可用于经皮给药，相对直接原位注射的血药浓度平稳，外泌体活性保持时间长久，减少给药次数，可实现无痛、安全、自主给药，同时微针单元中的MSC-exo长时间发挥抗炎和免疫调节作用，加速血管新生、改善创面氧化炎症环境，促进愈合速率，制备工艺简单，不需大型仪器，药物携载量高，安全实用性强，易于推广。
本发明通过对STZ诱导的动物糖尿病全层皮肤切除创伤模型进行例证。此处的动物包括但是不限于：小鼠，大鼠，驯养动物包括但是不限于猫，狗，以及其它一些动物包括但是不限于牛，羊，猪，马，灵长类动物包括但是不限于猴子和人。大鼠糖尿病全皮层切除模型的体内检测是被广泛认可和接受的体内药物活性检测的模型，同时也可以为其它生物提供参考。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配制生物可降解聚合物溶液：
称取一定量的生物可降解聚合物，加入到双蒸水中分散，充分溶解，形成生物可降解聚合物溶液；
S2、分离MSC干细胞来源的外泌体：
取充质干细胞培养液，收集细胞培养上清，采用离心法提取MSC来源外泌体；
S3、制备负载MSC来源外泌体的微针单元：
在S1中制备的生物可降解聚合物溶液中加入光引发剂，将S2中提取的MSC来源外泌体按一定密度均匀混合于上述加入光引发剂的生物可降解聚合物溶液中，形成混悬液；将所述混悬液加入到微针模板中，紫外光固化后制得负载MSC来源外泌体的微针单元；
S4、制备抗菌微针基板：
配制含金属纳米颗粒的高分子聚合物溶液，灌注到S3制备的微针模板表面，充分装填后干燥，形成抗菌微针基板，最终将负载MSC来源外泌体的微针单元和抗菌微针基板从微针模板中剥离，获得固态的目标产物缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针。
2.根据权利要求1所述的缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法，其特征在于，S1中，所述生物可降解聚合物溶液为20~50%透明质酸钠溶液或15~40%甲基丙烯酸酯明胶溶液。
3.根据权利要求1所述的缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法，其特征在于，S2具体为：选取处于对数生长期的MSC用于外泌体的分离提取，采用MSC完全培养基进行培养，当细胞生长至80~85%融合度时，将MSC完全培养基更换为无血清的培养基，继续培养36~72小时；收集细胞培养上清，采用超速离心法提取MSC来源外泌体；所述MSC为人脐带间充质干细胞第2~4代；超速离心的条件为：50,000~65,000 rpm，4°C，1~2小时。
4.根据权利要求1所述的缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法，其特征在于，S3中，所述MSC来源外泌体在生物可降解聚合物溶液中密度为10~50μg/ml。
5.根据权利要求1所述的缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法，其特征在于，S4中，所述高分子聚合物选自丝素蛋白、硫酸软骨素、羧甲基纤维素钠、透明质酸钠、聚乙二醇双丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯明胶、海藻糖、羧甲基纤维素、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、半乳糖、糊精、麦芽糖、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚二甲基硅氧烷中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法，其特征在于，S4中，所述金属纳米颗粒为金、银、铜纳米颗粒中的一种，粒径为5~100 nm；金属纳米颗粒在高分子聚合物溶液中的浓度为1~10 mM。
7.根据权利要求1所述的缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法，其特征在于，S3中，利用施加压力或抽真空的方法使混悬液加入到微针模具微孔中；其中，施加压力为0.2~0.8 MPa，抽真空达到的真空度为0.02~0.1Mpa。
8.根据权利要求1所述的缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针的制备方法，其特征在于，所述微针单元的形状为金字塔形、圆锥形、子弹形、箭头形或剑形；微针底部直径为50~250 µm，高度为200~1000 µm；相邻微针的间距为300~950µm。
9.一种缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针，其特征在于，包括抗菌微针基板及固定于抗菌微针基板上的负载MSC来源外泌体的微针单元。
10.权利要求1~9任意一项所述的缓释MSC来源外泌体的抗菌损伤修复微针在组织损伤疾病修复治疗中的应用。
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