CN113633606A

CN113633606A - 一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法及应用

Info

Publication number: CN113633606A
Application number: CN202110934880.XA
Authority: CN
Inventors: 史冬泉; 刘岸龙; 万密密
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2021-08-16
Filing date: 2021-08-16
Publication date: 2021-11-12

Abstract

本发明提供一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法，首先从跟腱中提取出肌腱干细胞外泌体，再通过2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱原位聚合包裹外泌体后接枝L‑精氨酸，即可得到纳米马达驱动的外泌体；将其与甲基丙烯酸酰化明胶和聚乙烯醇混合后共同加入微针模板中，最终制得载有纳米马达驱动外泌体微针，并将其应用于制备治疗末端病药物中。载有纳米马达驱动外泌体微针以反应产生的一氧化氮气体作为外泌体的驱动力，结合纳米马达向pH值降低的损伤部位趋附的性质，将微针内滞留在表皮层中的外泌体递送至受损的肌腱部位，结合一氧化氮气体的抗炎作用，有效地提高了末端病的治疗效果。

Description

一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法及应用。

背景技术

末端病(Enthesiopathy)是常见的运动系统疾病之一，如冈上肌肌腱炎、网球肘、跟腱病等都属于此范畴。常规的治疗手段包括口服抗炎药物、局部膏药、休息、理疗存在胃肠副作用明显、药物渗透不足、依从性差等弊端，根据其机制需从损伤修复、抑制炎症和更好的药物递送方式等方面来制定治疗方案。

外泌体(Exosomes,EXO)有明显的抗炎、促进损伤修复的作用，但是通过局部注射EXO 治疗末端病会引起疼痛、造成二次损伤且需反复多次注射。而微针是一种无痛、可控的透皮给药方式，通过微针递送EXO适用于末端病的治疗，但是EXO会大量滞留在表皮层和浅部真皮层，无法达到肌腱损伤的部位。

纳米马达是一种能够将各种能量转化为动能的分子或纳米级装置，尤其以化学型纳米马达在生物医学领域应用广泛。它是通过在特定环境下的化学反应产生气体使目标获得驱动力，其设计一般根据体内的一些生理或病理环境。考虑到反应Mg+2H₂O→Mg(OH)₂+H₂↑、 CaCO₃+2H⁺→Ca²⁺+CO₂↑会产生固体废物Mg(OH)₂或非生理性CO₂等副产物，且NO是末端病环境下机体代偿性产生的抗炎物质，因此在制备治疗末端病的纳米马达时，可采用NO气体作为纳米马达的驱动力。

末端病微环境中存在大量的活性氧(ROS)和一氧化氮合酶(NOS)，因此通过反应L-arginine+ROS/NOS→NO↑+L-citrulline可以产生一氧化氮(NO)气体，并将NO气体作为驱动力，但是L-arginine不能与EXO直接结合。MPC(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine，中文名为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)是一种人工合成的胆碱类似物，该分子单体可以通过较温和的原位聚合作用包裹纳米级物质，且同时具有向pH较低的炎症和损伤部位趋附的性质。因此，我们以MPC为单体，BAC(N,N′-bis(acryloyl)cystamine，中文名为N,N′-双丙烯酰胱胺)和GDMA(Glycerol dimethacrylate，中文名为二甲基丙烯酸甘油酯)为交联剂，通过静电作用富集到EXO周围，形成聚合物PMPC(polyMPC)包裹外泌体，在将L-精氨酸“镶嵌”至二者形成的分子网络中，制备以纳米马达(命名为MPC/BAC/L-arginine，即MBA) 包裹的外泌体EXO/MBA，最后，通过微针装载EXO/MBA用于末端病的治疗。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提供一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案，其特征在于，包括以下步骤：

S1、肌腱干细胞外泌体(EXO)的提取：

取跟腱并剪碎，加入I型胶原酶，在37℃的条件下充分消化跟腱，得到消化液，经过滤、离心，加入完全培养基，反复吹打、混合均匀后，得到悬浮液；将悬浮液倒入干细胞培养基中培养肌腱干细胞后，收集培养基中的液体，经过离心纯化悬浮液，最终得到肌腱干细胞外泌体(EXO)；最后将肌腱干细胞外泌体(EXO)分散重悬于磷酸盐缓冲液中；

S2、纳米马达中间体(EXO/PMPC)的制备：

将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)加入磷酸盐缓冲液(PBS)中，混合至均一溶液，向均一溶液中加入过量的N,N’-双丙烯酰胱胺(BAC)和二甲基丙烯酸甘油酯(GDMA) 的混合物作为交联剂，确保2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)能够充分交联，随后向上述混合溶液中加入过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMTD)，在4℃条件下静置1h，静置过程中2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)可以发生原位聚合反应，得到可以包裹外泌体(EXO)的聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(PMPC)，结束后振荡并重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中，得到纳米马达中间体(EXO/PMPC)的溶液；

S3、纳米马达驱动的外泌体(EXO/MBA)的制备：

将步骤S1中的外泌体(EXO)的溶液加入步骤S2制得的纳米马达中间体(EXO/PMPC)溶液中，混合均匀后，在室温下放置1h，使聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(PMPC)充分包裹外泌体(EXO)；随后向其中加入L-精氨酸，静置2h后，L-精氨酸结合至聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(PMPC)的表面，最终得到纳米马达驱动的外泌体(命名为 EXO/MPC/BAC/L-arginine，即EXO/MBA)；

S4、载有EXO/MBA的微针制备：

将步骤S3制得的EXO/MBA与甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)和聚乙烯醇(PVA)共同加入磷酸盐缓冲液(PBS)中得到混合液；然后将混合液加入微针模板中填满模板内部，去除微针模板内的气泡，刮去多余的混合液，使混合液填满微针的针部和体部，紫外固化；混合液固化后再加入透明质酸(HA)溶液，去除微针模板内的气泡，使透明质酸(HA)溶液填满微针的底部，并在室温下干燥固化；脱模后即得到载有EXO/MBA的微针。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

进一步地，所述步骤S1中，I型胶原酶的浓度为1～5mg/ml，消化跟腱的时间为2～6h；肌腱干细胞外泌体(EXO)在磷酸盐缓冲液(PBS)中的浓度为100～1000μg/mL。

进一步地，所述步骤S2中，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)在磷酸盐缓冲液(PBS) 中的浓度为0.1～2g/ml，N，N’-双丙烯酰胱胺(BAC)和二甲基丙烯酸甘油酯(GDMA)的浓度比为1：1～1：4，N,N’-双丙烯酰胱胺(BAC)在混合溶液中的浓度为50～100mmol/L；过硫酸铵在磷酸盐缓冲液中的浓度为6～60mg/ml，四甲基乙二胺在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.012～0.12g/ml。

进一步地，所述步骤S3中，外泌体溶液和纳米马达中间体溶液的体积比为1：1，L-精氨酸的浓度为1～4mg/ml。

进一步地，所述步骤S4中，纳米马达驱动的外泌体(EXO/MBA)、甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)和聚乙烯醇(PVA)在磷酸盐缓冲液中的浓度分别为0.1～0.5mg/ml、0.05～0.3g/ml 和0.1～0.2g/ml；透明质酸溶液的质量百分浓度为1～4％。

进一步地，所述步骤S4中制得的载有纳米马达驱动的外泌体微针由针头、体部和底部三部分构成，针头为四棱锥结构，体部为圆柱形结构，圆柱的上下底面内切于四棱锥的底面，底部为长方体。

进一步地，所述针头四棱锥的高度为500～700μm，四棱锥底边长度为200～300μm，圆柱的直径为200～300μm，圆柱高度为200～300μm，相邻两个四棱锥顶部间距为600～1000μm，底部长方体的厚度为0.5～1mm。

进一步地，所述针头和体部通过纳米马达驱动的外泌体(EXO/MBA)与甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)和聚乙烯醇(PVA)共同加入磷酸盐缓冲液中得到的混合液紫外固化而成，紫外固化时间为15～60s；微针底部材料通过透明质酸(HA)溶液固化而成。

进一步地，本发明提供上述方法制备的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针。

进一步地，本发明还提供一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针在制备治疗末端病药物中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)采用外泌体(EXO)治疗末端病相比单一效应的治疗药物，具备抗炎、促增值、诱导分化和抑制细胞外基质降解等作用，结合一氧化氮气体的抗炎作用，提高了末端病的治疗效果；

(2)对于本发明的微针阵列结构，针头底部长度大于圆柱半径，构成“倒钩”型设计，使微针在治疗末端病时，微针载EXO/MBA部分(即针头和体部)附着在皮肤内部更加牢固，避免了普通微针因关节活动而易于脱落的风险；

(3)微针的针部和体部采用聚乙烯醇(PVA)和甲基丙烯酸酰化明胶(GelMA)，针部和体部的降解时间满足末端病的常规治疗疗程(＞14d)，微针的底部材料采用透明质酸，微针底部在吸收皮肤表面水分后能够与针头和体部分离，使针头和体部留在体内；

(4)纳米马达通过反应产生一氧化氮气体作为外泌体(EXO)的驱动力，结合MPC向pH降低的损伤部位趋附的性质，将滞留在表皮层中的外泌体(EXO)递送至受损的肌腱部位，具有更好的治疗效果。

附图说明

图1是实施例1提取的肌腱干细胞鉴定结果图。

图2是差速离心法提取并纯化肌腱干细胞外泌体的过程示意图。

图3是实施例1纯化后的肌腱干细胞外泌体(EXO)的结构表征图。图3.a～图3.c是纯化后的EXO在不同放大倍数下的透射电镜图；图3.d是WB蛋白电泳结果图(蛋白标记物CD9、CD63和TSG101的表达)；图3.e～图3.f是关于EXO的浓度、颗粒大小和粒径浓度分布的NTA分析图。

图4是实施例1制备过程中的材料表征结果。图4.a是EXO/MBA的合成过程(EXO、PMPC、EXO/PMPC和EXO/MBA)的透射电镜图，图4.b是步骤2中EXO、PMPC和EXO/PMPC 的激光共聚焦显微镜图，图4.c是Zeta电位分析、近红外光谱以及NO释放实验结果图。

图5是载有EXO/MBA的微针的制备工艺示意图。

图6是载有EXO/MBA的微针的结构示意图。

图7是实施例1制备的载有EXO/MBA的微针的扫描电镜图。

图8是实施例2治疗大鼠跟腱病的过程示意图。图8.a是局部注射I型胶原酶建立大鼠跟腱病模型，图8.b是跟腱病大鼠模型验证及跟腱提取过程。

图9是对比例1和实施例1治疗大鼠跟腱病的结果图。图9.a是跟腱不同状态(两组对照组、对比例1和实施例1)下的不同染色图(Col1和Col3免疫组化染色、天狼星红、马松、HE染色图和大体观)；图9.b是图9.a中不同状态下的跟腱的Col3免疫组化呈阳性的面积图；图9.c是图9.a中不同状态下的跟腱的Col1免疫组化呈阳性的面积图；图9.d是图9.a中不同状态下的跟腱患跟腱病的炎症面积图。

图10是不同比例GelMA和PVA的机械强度及降解时间对比图。图10.a是对比例2-9的机械强度对比图；图10.b是对比例2、5、6、8和9的降解时间对比图。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例提供一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体(EXO/MBA)微针的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1、肌腱干细胞外泌体(EXO)的提取。

选取6-8周的SD大鼠，适应环境后在无菌条件下过量注射质量体积浓度为10％的水合氯醛致死，采用体积浓度为75％的酒精溶液清洗并切开SD大鼠的跟腱表面皮肤，剥离筋膜和肌肉，取出SD大鼠的跟腱，PBS溶液冲洗后放置于纱布上，在超净台中将跟腱转移至大皿中并剪碎；配置足量的3mg/mL的I型胶原酶溶液，选择0.22μm孔径的滤膜对I型胶原酶溶液除菌后加入大皿中，37℃消化4h；用孔径为70μm的细胞滤网过滤上述消化液，去除残余跟腱组织后离心，并倒出上层清液，离心参数为1500rpm×5min；将离心后的消化液加入足量的完全培养基，反复吹打、混匀底部沉淀，获得肌腱干细胞的悬浮液，并将其均匀铺至装有干细胞培养基的培养瓶中。通过特异性蛋白检测和多系分化鉴定其干性，结果如图1所示，所提取的肌腱干细胞的CD90和CD44呈阳性，CD45和CD34呈阴性，说明本实施例提取的肌腱干细胞具有分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞和跟腱细胞的能力。每3天更换一次培养瓶中的悬浮液，干细胞生长至瓶底约80％后收集培养瓶中的液体并传代，收集培养瓶中的干细胞培养基(1～3代)，并采用差速离心法提取并纯化肌腱干细胞，具体过程如图2所示，具体为2000g×15min，弃去沉淀，10000g×30min，弃去沉淀，100000g×80min，弃去上清，收集沉淀；在PBS溶液中重悬分散沉淀，100000g×80min，弃去上清，收集沉淀，最终得到纯化的肌腱干细胞外泌体(EXO)。采用20μmol/L的细胞膜绿色荧光探针(DiO)标记EXO并分散重悬于0.5ml PBS溶液中。

如图3所示，纯化后的EXO呈球状；同时，WB蛋白电泳结果显示EXO的蛋白标记(CD9、CD63和TSG101)正常表达，证明按照以上所述方法可以成功提取EXO；纯化后的EXO浓度(颗粒数)为3.8×10⁹/mL，平均粒径为126.1nm，峰值占比为96.2％。

步骤2、纳米马达中间体(EXO/PMPC)的制备。

将0.17g的MPC加入0.5mL PBS溶液中，超声下充分溶解、混匀，然后加入BAC和GDMA的混合物作为交联剂得到混合溶液，二者浓度比为1：2，N,N’-双丙烯酰胱胺在混合溶液中的浓度为100mmol/L；接着在上述混合溶液中加入6mgAPS和0.012gTEMED，通过原位聚合作用形成可以包裹EXO的聚合物PMPC；聚合过程在4℃下进行，静置反应1h后将得到的混合物振荡重悬于0.5mLPBS溶液中，得到纳米马达的中间体(EXO/PMPC)溶液，在前述的中间体溶液中加入Cy5.5红色荧光染色标记出溶液中的PMPC。

步骤3、纳米马达驱动的外泌体(EXO/MBA)的制备。

取步骤1中EXO溶液0.5mL并加入到步骤2制得的纳米马达中间体溶液中，轻微振荡混匀，室温放置1h，使PMPC充分包裹EXO；然后加入1mg的L-精氨酸，反应2h后，L- 精氨酸结合至PMPC表面，获得纳米马达驱动的外泌体EXO/MPC/BAC/L-arginine，即 EXO/MBA。

如图4所示，EXO的粒径在经过MPC/BAC/L-arginine的修饰后略有增加，激光共聚焦的显微图中显示，几乎所有的EXO和PMPC存在共定位现象；同时，Zeta电位分析结果显示EXO由于细胞膜的存在呈现负电性，包裹了PMPC后负电性下降，而修饰了L-精氨酸后由于羧基暴露于表面，负电性又增强；近红外结果显示EXO/MPC/BAC/L-arginine携带L-精氨酸特有的羧基、MPC特有的O-P-O-和EXO特有的氨基，表明成功合成了EXO/MBA；此外，NO释放实验结果表明，EXO/MBA在跟腱病的炎性环境中释放出NO气体，证明EXO 可在NO气体的驱动下增加渗透深度。综合以上分析说明，通过透射电镜、激光共聚焦显微镜、Zeta电位分析、近红外光谱(NIRS)和NO释放实验均证明按照以上步骤可以成功合成出EXO/MBA。

步骤4、载有EXO/MBA的微针制备。

如图5所示为载有EXO/MBA的微针制备工艺，将300μg的EXO/MBA和0.15g PVA、0.075g GelMA溶于1mLPBS溶液中(PVA和GelMA的质量百分浓度分别为15％和7.5％)，其中GelMA的氨基取代度为90％，PVA的分子量为89000-98000，水化度为99％；加热充分溶解得到混合溶液；然后将400μl上述混合溶液加入微针模具中，离心(离心参数为 2000g×3min)使针体部全部充满液体，抽真空去除气泡，刮去多余液体，紫外照射固化30s；将300μl的4％HA溶液加入模具底部，离心(离心参数为2000g×3min)后抽真空去除气泡，室温过夜，干燥固化；微针模具采用硅胶材质，通过牵拉可将微针阵列与模具分离，获得载有EXO/MBA的微针。

从图6-图7中可以看出，微针包括针头、体部和底部三部分，其中针头为四棱锥结构，针头高度600μm，四棱锥底部正方形边长为250μm；体部为圆柱形结构，体部圆柱直径和高度均为250μm，圆柱顶部的圆形内切于四棱锥底部的正方形；底部为长方体，长方体的厚度为0.5mm；微针模板为20×20的阵列，长宽均为1.8cm，模板内相邻两微针的针头中心距为 800μm。

实施例2

将实施例1制得的载有EXO/MBA的微针应用于建立治疗跟腱病的大鼠模型中，如图8 所示。

选取24-48周的SD大鼠用于本实验，将完好跟腱和患有跟腱病的跟腱作为对照组实验，配置足量5mg/ml I型胶原酶溶液，采用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，在大鼠的双足跟腱的单侧局部注射2周，每隔1天注射1次，单侧剂量为60μl，获得大鼠的跟腱病模型；采用体积浓度为75％的酒精溶液消毒大鼠跟腱部的皮肤，并将实施例1中制备的载有EXO/MBA的微针贴于大鼠患处，适当按压后以胶布捆缚，1h后取下微针底部；2周后处死大鼠取出跟腱，通过组织学观察跟腱的炎性增生面积、胶原结构排列，通过形态学观察I型胶原和III型胶原的表达，通过分子生物学检测跟腱中相关蛋白和mRNA的表达，评估实施例1制备的载有 EXO/MBA的微针与对照组实验对跟腱病的治疗效果。

对比例1

本对比例和实施例2的区别仅在于将实施例1中步骤1提取出的EXO溶液(将300μg的EXO配制成60μl的注射液)注射于大鼠患处，一次性注射完毕。评估对比例1对跟腱病的治疗效果。

如图10所示，与对照组的两组实验相比，EXO/MBA增加了跟腱病模型中Col1的表达，降低了Col3的表达，同时与对比例1相比，EXO/MBA的天狼星红染色和Masson染色表明跟腱的纤维结构得到了改善，且HE染色表明炎性组织增生减少，相比对比例1的治疗效果更好，这些都证明了载有EXO/MBA的微针促进了跟腱病的治疗。

对比例2

将PVA溶解于PBS溶液中(PVA的质量百分浓度为20％)，并将溶液加入实施例1中所述的微针模具中，离心(离心参数为2000g×3min)使针头和体部全部充满液体，抽真空去除气泡，刮去多余液体，紫外照射固化30s；随后将300μl的4％HA溶液加入模具底部，离心 (离心参数为2000g×3min)后抽真空去除气泡，室温过夜，干燥固化，通过牵拉将微针与模具分离。

对比例3

本对比例与对比例2的区别仅在于PVA的质量百分浓度为15％。

对比例4

本对比例与对比例2的区别仅在于PVA的质量百分浓度为10％。

对比例5

本对比例与对比例2的区别仅在于将PVA和GelMA共同溶解于PBS溶液中(PVA的质量百分浓度为15％，GelMA的质量百分浓度为7.5％)。

对比例6

本对比例与对比例5的区别仅在于PVA的质量百分浓度为10％，GelMA的质量百分浓度为15％。

对比例7

本对比例与对比例2的区别仅在于只将GelMA溶解于PBS溶液中(GelMA的质量百分浓度为10％)。

对比例8

本对比例与对比例7的区别仅在于GelMA的质量百分浓度为20％。

对比例9

本对比例与对比例7的区别仅在于GelMA的质量百分浓度为30％。

通过采用分析不同比例的PVA和GelMA的机械强度及降解时间来选择步骤3中PVA和 GelMA在PBS溶液中的浓度。实验结果如图10所示，从图10.3a中看出30％的GelMA(对比例9)最容易断裂，15％的PVA和7.5％的GelMA混合物(即对比例5)的机械强度最大， 10％的PVA(对比例4)和20％的GelMA(对比例8)机械强度最低。从图10.b中可以看出 20％的PVA(对比例2)降解速度(2天)最快，15％的PVA和7.5％的GelMA混合物(即对比例5)在第16天刚好完全降解，而30％的GelMA(对比例9)的降解时间大于16天，20％的PVA(对比例2)的降解时间小于1天，都不适合末端病的疗程时长(14d)。

实施例3

步骤1、肌腱干细胞外泌体(EXO)的提取。

选取6-8周的SD大鼠，适应环境后在无菌条件下过量注射质量体积浓度为10％的水合氯醛致死，采用体积浓度为75％的酒精溶液清洗并切开SD大鼠的跟腱表面皮肤，剥离筋膜和肌肉，取出SD大鼠的跟腱，PBS溶液冲洗后放置于纱布上，在超净台中将跟腱转移至大皿中并剪碎；配置足量的5mg/mL的I型胶原酶溶液，选择0.22μm孔径的滤膜对I型胶原酶溶液除菌后加入大皿中，37℃消化2h；用孔径为70μm的细胞滤网过滤上述消化液，去除残余跟腱组织后离心，并倒出上层清液，离心参数为1500rpm×5min；将离心后的消化液加入足量的完全培养基，反复吹打、混匀底部沉淀，获得肌腱干细胞的悬浮液，并将其均匀铺至装有干细胞培养基的培养瓶中。每3天更换一次培养瓶中的悬浮液，干细胞生长至瓶底约80％后收集培养瓶中的液体并传代，收集培养瓶中的干细胞培养基(1～3代)，并采用差速离心法提取并纯化肌腱干细胞，具体为2000g×15min，弃去沉淀，10000g×30min，弃去沉淀， 100000g×80min，弃去上清，收集沉淀；在PBS溶液中重悬分散沉淀，100000g×80min，弃去上清，收集沉淀，最终得到纯化的肌腱干细胞外泌体(EXO)。采用20μmol/L的细胞膜绿色荧光探针(DiO)标记EXO并分散重悬于0.5ml PBS溶液中。

步骤2、纳米马达中间体(EXO/PMPC)的制备。

将0.1g的MPC加入0.1mL PBS溶液中，超声下充分溶解、混匀，然后加入BAC和GDMA的混合物作为交联剂，二者浓度比为1：4，N，N’-双丙烯酰胱胺在混合溶液中的浓度为50mmol/L；接着在上述混合溶液中加入8mgAPS和0.012gTEMED，通过原位聚合作用形成可以包裹EXO的聚合物PMPC；聚合过程在4℃下进行，静置反应1h后将得到的混合物振荡重悬于0.5mLPBS溶液中，得到纳米马达的中间体(EXO/PMPC)溶液，在前述的中间体溶液中加入Cy5.5红色荧光染色标记出溶液中的PMPC。

步骤3、纳米马达驱动的外泌体(EXO/MBA)的制备。

取步骤1中EXO溶液0.5mL并加入到步骤2制得的纳米马达中间体溶液中，轻微振荡混匀，室温放置1h，使PMPC充分包裹EXO；然后加入2mg的L-精氨酸，反应2h后，L- 精氨酸结合至PMPC表面，获得纳米马达驱动的外泌体，并命名为EXO/MPC/BAC/L-arginine，即EXO/MBA。

步骤4、载有EXO/MBA的微针制备。

将500μg的EXO/MBA和0.15g PVA、0.075g GelMA溶于1mLPBS溶液中(PVA和GelMA的质量百分浓度分别为15％和7.5％)，其中GelMA的氨基取代度为90％，PVA的分子量为89000-98000，水化度为99％；加热充分溶解得到混合溶液；然后将400μl上述混合溶液加入微针模具中，离心(离心参数为2000g×3min)使针体部全部充满液体，抽真空去除气泡，刮去多余液体，紫外照射固化30s；将300μl的1％HA溶液加入并填满模具底部，离心(离心参数为2000g×3min)后抽真空去除气泡，室温过夜，干燥固化；微针模具采用硅胶材质，通过牵拉可将微针阵列与模具分离，获得载有EXO/MBA的微针。

微针包括针头、体部和底部三部分，其中针头为四棱锥结构，针头高度700μm，四棱锥底部正方形边长为300μm；体部为圆柱形结构，体部圆柱直径和高度均为300μm，圆柱顶部的圆形内切于四棱锥底部的正方形；底部为长方体，长方体的厚度为1mm；微针模板为20×20 的阵列，长宽均为1.8cm，模板内相邻两微针的针头中心距为800μm。

实施例4

步骤1、肌腱干细胞外泌体(EXO)的提取。

选取6-8周的SD大鼠，适应环境后在无菌条件下过量注射质量体积浓度为10％的水合氯醛致死，采用体积浓度为75％的酒精溶液清洗并切开SD大鼠的跟腱表面皮肤，剥离筋膜和肌肉，取出SD大鼠的跟腱，PBS溶液冲洗后放置于纱布上，在超净台中将跟腱转移至大皿中并剪碎；配置足量的1mg/mL的I型胶原酶溶液，选择0.22μm孔径的滤膜对I型胶原酶溶液除菌后加入大皿中，37℃消化6h；用孔径为70μm的细胞滤网过滤上述消化液，去除残余跟腱组织后离心，并倒出上层清液，离心参数为1500rpm×5min；将离心后的消化液加入足量的完全培养基，反复吹打、混匀底部沉淀，获得肌腱干细胞的悬浮液，并将其均匀铺至装有干细胞培养基的培养瓶中。每3天更换一次培养瓶中的悬浮液，干细胞生长至瓶底约80％后收集培养瓶中的液体并传代，收集培养瓶中的干细胞培养基(1～3代)，并采用差速离心法提取并纯化肌腱干细胞，具体为2000g×15min，弃去沉淀，10000g×30min，弃去沉淀， 100000g×80min，弃去上清，收集沉淀；在PBS溶液中重悬分散沉淀，100000g×80min，弃去上清，收集沉淀，最终得到纯化的肌腱干细胞外泌体(EXO)。采用20μmol/L的细胞膜绿色荧光探针(DiO)标记EXO并分散重悬于0.5ml PBS溶液中。

步骤2、纳米马达中间体(EXO/PMPC)的制备。

将0.2g的MPC加入0.1mL PBS溶液中，超声下充分溶解、混匀，然后加入BAC和GDMA的混合物作为交联剂，二者浓度比为1：1，N，N’-双丙烯酰胱胺在混合溶液中的浓度为100mmol/L；接着在上述混合溶液中加入12mgAPS和0.012gTEMED，通过原位聚合作用形成可以包裹EXO的聚合物PMPC；聚合过程在4℃下进行，静置反应1h后将得到的混合物振荡重悬于0.5mLPBS溶液中，得到纳米马达的中间体(EXO/PMPC)溶液，在前述的中间体溶液中加入Cy5.5红色荧光染色标记出溶液中的PMPC。

步骤3、纳米马达驱动的外泌体(EXO/MBA)的制备。

取步骤1中EXO溶液0.5mL并加入到步骤2制得的纳米马达中间体溶液中，轻微振荡混匀，室温放置1h，使PMPC充分包裹EXO；然后加入1.5mg的L-精氨酸，反应2h后，L- 精氨酸结合至PMPC表面，获得纳米马达驱动的外泌体，并命名为EXO/MPC/BAC/L-arginine，即EXO/MBA。

步骤4、载有EXO/MBA的微针制备。

将500μg的EXO/MBA和0.1g PVA、0.15g GelMA溶于1mLPBS溶液中(PVA和GelMA 的质量百分浓度分别为10％和15％)，其中GelMA的氨基取代度为90％，PVA的分子量为89000-98000，水化度为99％；加热充分溶解得到混合溶液；然后将400μl上述混合溶液加入微针模具中，离心(离心参数为2000g×3min)使针体部全部充满液体，抽真空去除气泡，刮去多余液体，紫外照射固化30s；将300μl的3％HA溶液加入并填满模具底部，离心(离心参数为2000g×3min)后抽真空去除气泡，室温过夜，干燥固化；微针模具采用硅胶材质，通过牵拉可将微针阵列与模具分离，获得载有EXO/MBA的微针。

微针包括针头、体部和底部三部分，其中针头为四棱锥结构，针头高度500μm，四棱锥底部正方形边长为200μm；体部为圆柱形结构，体部圆柱直径和高度均为200μm，圆柱顶部的圆形内切于四棱锥底部的正方形；底部为长方体，长方体的厚度为0.5mm；微针模板为20×20 的阵列，长宽均为1.8cm，模板内相邻两微针的针头中心距为600μm。

需要注意的是，发明中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、肌腱干细胞外泌体的提取：

取跟腱并剪碎，加入I型胶原酶，在37℃的条件下充分消化跟腱，得到消化液，经过滤、离心，加入完全培养基，反复吹打、混合均匀后，得到悬浮液；将悬浮液倒入干细胞培养基中培养肌腱干细胞后，收集培养基中的液体，经过离心纯化收集到的液体，得到肌腱干细胞外泌体，并将肌腱干细胞外泌体分散重悬于磷酸盐缓冲液中；

S2、纳米马达中间体的制备：

将2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱加入磷酸盐缓冲液中，混合至均一溶液，向均一溶液中加入N,N’-双丙烯酰胱胺和二甲基丙烯酸甘油酯的混合物作为交联剂，随后向上述混合溶液中加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，在4℃条件下静置1h，结束后振荡并重悬于磷酸盐缓冲液中，得到纳米马达中间体溶液；

S3、纳米马达驱动的外泌体的制备：

将步骤S1中的外泌体溶液加入步骤S2制得的纳米马达中间体溶液中，混合均匀后，在室温下放置1h；随后向其中加入L-精氨酸，反应2h后制得纳米马达驱动的外泌体；

S4、载有纳米马达驱动的外泌体微针制备：

将步骤S3制得的纳米马达驱动的外泌体与甲基丙烯酸酰化明胶和聚乙烯醇共同加入磷酸盐缓冲液中得到混合液；然后将混合液加入微针模板中填满模板内部，去除微针模板内的气泡，刮去多余的混合液，紫外固化15～60s；混合液固化后再加入透明质酸溶液，去除微针模板内的气泡，并在室温下干燥固化；脱模后即得到载有纳米马达驱动的外泌体微针。

2.根据权利要求1所述的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中I型胶原酶的浓度为1～5mg/ml，消化跟腱的时间为2～6h；肌腱干细胞外泌体重悬在磷酸盐缓冲液中的浓度为100～1000μg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1～2g/ml，N,N’-双丙烯酰胱胺和二甲基丙烯酸甘油酯的浓度比为1：1～1：4；混合溶液中N,N’-双丙烯酰胱胺的浓度为50～100mmol/L；过硫酸铵在磷酸盐缓冲液中的浓度为6～60mg/ml，四甲基乙二胺在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.012～0.12g/ml。

4.根据权利要求1所述的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，外泌体溶液和纳米马达中间体溶液的体积比为1：1，L-精氨酸的浓度为1～4mg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，纳米马达驱动的外泌体、甲基丙烯酸酰化明胶和聚乙烯醇在磷酸盐缓冲液中的浓度分别为0.1～0.5mg/ml、0.05～0.3g/ml和0.1～0.2g/ml；透明质酸溶液的质量百分浓度为1～4％。

6.根据权利要求1所述的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中制得的载有纳米马达驱动的外泌体微针由针头、体部和底部三部分构成，针头为四棱锥结构，体部为圆柱形结构，圆柱的上下底面内切于四棱锥的底面，底部为长方体。

7.根据权利要求6所述的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法，其特征在于，所述针头四棱锥的高度为500～700μm，四棱锥底边长度为200～300μm，圆柱的直径为200～300μm，圆柱高度为200～300μm，相邻两个四棱锥顶部间距为600～1000μm，底部长方体的厚度为0.5～1mm。

8.根据权利要求6所述的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针的制备方法，其特征在于，所述针头和体部的材料为纳米马达驱动的外泌体与甲基丙烯酸酰化明胶和聚乙烯醇共同加入磷酸盐缓冲液中的混合液紫外固化而成，紫外固化时间为15～60s；底部材料通过透明质酸溶液固化而成。

9.如权利要求1-8所述任意一种制备方法得到的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针。

10.根据权利要求9所述的一种专用于治疗末端病的载有纳米马达驱动外泌体微针在制备治疗末端病药物中的应用。