CN114917181B

CN114917181B - 一种可分离式微针贴片及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114917181B
Application number: CN202210526357.8A
Authority: CN
Inventors: 孔明; 石岩; 邱凯金; 於淼; 陈西广
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2022-05-16
Filing date: 2022-05-16
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2042-05-16
Also published as: CN114917181A

Abstract

本发明公开了一种可分离式微针贴片及其制备方法和应用。所述可分离式微针贴片由微针针体和背衬组成，所述微针针体包括外泌体、壳聚糖乳酸盐、针体聚合物，所述背衬是由背衬聚合物溶液制备而成的。所述可分离式微针贴片通过两步法制备，其步骤简单，在使用时，微针针体吸收的组织液会溶解背衬，不仅实现针体和背衬的分离，将针体滞留在皮肤内，确保微针贴片能有效穿透皮肤，还能实现外泌体的持续释放，提高治疗脱发的效果，避免了多次给药，具有实现临床应用的前景。

Description

一种可分离式微针贴片及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医用生物材料技术领域，特别涉及一种可分离式微针贴片及其制备方法和应用。

背景技术

脱发是指由各种原因引起的脱发现象。目前，世界平均脱发率已达到32.13％(20亿人)，脱发已成为继肥胖之后世界第二大疾病，脱发人群数量仍以极快的速度增长。脱发不仅仅导致头发功能的缺失，还带给人们严重的心理压力，比如自卑、焦虑、恐惧、轻生等心理问题，给人们的生活带来了极大的烦恼。目前，脱发的治疗主要是药物治疗或手术治疗。药物治疗主要依靠米诺地尔和非那雄胺，但具有明显的副作用，而毛囊移植存在成本高、供体不足和移植存活率的问题。因此，微创和无副作用的脱发治疗方式将受到公众的关注。

毛囊是一个复杂的“小器官”，要经历退化期、休止期和生长期的循环。由于处于生长期和衰退期的毛囊数量处于动态的平衡，因此可以维持正常的毛发数量。但是当毛囊受到各种刺激时，例如雄激素、药物、炎症等，会使得更多的头发进入毛发退化期，更少的头发进入毛发生长期，进而导致脱发。

微针作为一种给药方式，可以将药物递送至组织处，极大地提高了药物的给药率及药物作用效果，因此，将微针技术应用于脱发治疗中，能够提高脱发治疗的效果，且无痛、高效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含间充质干细胞外泌体和壳聚糖乳酸盐的可分离式微针贴片。

本发明的另一目的在于提供可分离式微针贴片的制备方法。

本发明的另一目的在于提供可分离式微针贴片在用于制备防治脱发的生发贴片中的应用，通过将外泌体和壳聚糖乳酸盐作为毛发再生的激活剂，为脱发治疗提供了一种无痛无副作用的治疗手段。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种可分离式微针贴片，包括微针针体和背衬；所述微针针体包括外泌体、壳聚糖乳酸盐、针体聚合物。

进一步的，所述外泌体的总蛋白含量为20μg/mL-800μg/mL。

进一步的，所述外泌体为脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞或脂肪来源间充质干细胞的外泌体。

进一步的，所述壳聚糖乳酸盐的浓度为0.2mg/mL～1.5mg/mL。

进一步的，所述壳聚糖乳酸盐由分子量为3W-30W的壳聚糖和L-乳酸制备而成的。

进一步的，所述针体聚合物为聚乙烯醇、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸－羟基乙酸共聚物、明胶甲基丙烯酸酐、丝素蛋白中的至少一种的混合物，其质量分数为10％～80％。

更进一步的，所述针体聚合物为聚乙烯醇混合物，包括醇解度为97.5mol％～99mol％的高醇解度聚乙烯醇和醇解度为92.0mol％～94.0mol％的低醇解度聚乙烯醇。

进一步的，所述高醇解度聚乙烯醇和低醇解度聚乙烯醇的质量比为1:1～3。

更进一步的，所述高醇解度聚乙烯醇和低醇解度聚乙烯醇的质量分数均分别为10％。

进一步的，所述背衬是由背衬聚合物溶液制备而成的，所述背衬聚合物溶液的质量分数为10％～60％。

进一步的，所述背衬聚合物溶液为淀粉、明胶、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物、葡聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、果糖、海藻酸钠、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、海藻糖、羟丙基-β-环糊精、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮溶液中的至少一种。

更进一步的，所述背衬是由透明质酸溶液制备得到的。

本发明还提供了所述的可分离式微针贴片的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将外泌体和壳聚糖乳酸盐加入到针体聚合物中，混合均匀，将得到的预混溶液注入微针模具中，离心使预混溶液充满整个微针模具的空腔，去除多余的预混溶液后，对微针模具进行第一次干燥；

(2)将背衬聚合物溶液注入步骤(1)中干燥后的微针模具中，再次离心使溶液充满剩余的针腔，第二次干燥至微针自动脱模，即得到可分离式微针贴片。

进一步的，所述第一次干燥的时间为1h～6h，温度为4℃～36℃，湿度为30％～60％；所述第二次干燥的时间为6h～36h，温度为4℃～36℃，湿度为30％～60％。

本发明还提供了所述的可分离式微针贴片在用于制备防治脱发的生发贴中的应用。

进一步的，所述可分离式微针贴片的使用方法为：将可分离式微针贴片按压至脱发皮肤上，固定保持10min～30min后，移除背衬，连续使用7天～15天。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

(1)本发明所述的可分离式微针贴片的针体中负载外泌体和壳聚糖乳酸盐，通过外泌体和L-乳酸的释放来调控毛囊周期，促进毛发生长；通过合理设置各组分含量，不仅可以确保微针贴片能有效穿透皮肤，还能实现外泌体的持续释放，从而提高治疗脱发的效果。

(2)本发明所述的可分离式微针贴片通过两步法制备，微针针体中含外泌体和壳聚糖乳酸盐，而贴片背衬中不含外泌体和壳聚糖乳酸盐，避免了外泌体和壳聚糖乳酸盐的浪费；使用时，微针针体吸收的组织液会溶解微针背衬部分，实现针体和背衬的分离，将针体滞留在皮肤内，给药过程短且药效持久，避免了多次给药，增加了病人的依从性。

(3)本发明所述的可分离式微针贴片能够实现外泌体和壳聚糖乳酸盐的经皮递送，在刺入皮肤后释放外泌体和L-乳酸，并能够实现外泌体的长时间缓释，使毛囊获得持续的激活作用。

(4)本发明利用可分离式微针贴片构建出一种非药物依赖性的治疗方式，以外泌体和L-乳酸作为毛发生长的激活剂用于治疗脱发，避免了药物带来的副作用，且减少了给药次数，具有实现临床应用的前景。

附图说明

图1为可分离式微针贴片的设计使用示意图。

图2为可分离式微针贴片的外泌体体外释放图。

图3为可分离式微针贴片中L-乳散的体外释放图。

图4为可分离式微针贴片的SEM图。

图5为可分离式微针贴片的激光共聚焦图。

图6为可分离式微针贴片的机械强度图。

图7为可分离式微针贴片的刺皮率检测图。

图8为可分离式微针贴片刺皮后皮肤的SEM图。

图9为可分离式微针贴片的体外分离性能检测图。

图10为可分离式微针贴片的体内分离性能检测图。

图11为可分离式微针组与皮下注射组外泌体的体内释放情况对比图。

图12为可分离式微针组与皮下注射组外泌体的体内释放率的结果对比图。

图13为各治疗组小鼠的毛发再生情况对比图。

图14为各治疗组小鼠的毛发再生覆盖率的结果对比图。

图15为各治疗组小鼠背部皮肤的H&E染色对比图。

图16为各治疗组小鼠背部皮肤的Ki67免疫荧光对比图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对发明实施例中的技术方案进行描述。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品。

实施例1：可分离式微针贴片的制备及其性能检测

1、可分离式微针贴片的制备

如图1所示，将10wt％高醇解度聚乙烯醇(HPVA)(醇解度：97.5-99mol％)、10wt％低醇解度聚乙烯醇(LPVA)(醇解度：92.0-94.0mol％)、1mg/mL壳聚糖乳酸盐、400μg/mL外泌体混合均匀，得到预混溶液。

用一次性注射器吸取过量的预混溶液滴加在硅胶微针模具(针长为400-1000μm)中，4000r/min离心4min使预预混溶液充分填充至模具的孔洞中，回收硅胶微针模具中多余的预混溶液，37℃下干燥2h；再用一次性注射器吸取过量的透明质酸溶液滴加在干燥后的硅胶微针模具中，4000r/min离心4min，37℃下干燥12h，并随后从硅胶微针模具中分离获得可分离式微针贴片。

2、外泌体和L-乳酸的体外释放研究

外泌体释放曲线通过BCA蛋白检测试剂盒进行测试。将含有外泌体的微针置于24孔的Transwell上室中，同时在下室中加入300μL PBS。然后在第0，1，6，12，24，36，48，60，72h时收集下室中80μL的PBS，并加入相同体积的新鲜PBS。使用BCA试剂盒检测待测样品，在562nm波长下读数，计算累计释放率并绘制释放曲线。

L-乳酸的体外释放通过酸碱滴定法检测。将微针置于去离子水中，并在5、15、30和60分钟时收集上清液。加入氢氧化钠滴定溶液(1mol/L)，煮沸5分钟后加入2滴酚酞指示剂溶液，用硫酸滴定溶液(1mol/L)热滴定，使溶液的粉红色褪色，用空白试验校正结果，记录硫酸滴定溶液的消耗量体积，计算L-乳酸的释放量。实验结果如图2-3所示。

如图2所示，微针所采用的HPVA:LPVA＝1:1组可以持续释放72h左右，释放率为76％。如图3所示，L-乳酸在壳聚糖乳酸盐接触到模拟体液后30min内从壳聚糖乳酸盐中释放出来。

3、微针形态的表征

将上述制备的可分离式微针贴片，置于扫描电子显微镜中观察。同时，预混溶液中的外泌体使用亲脂性染料DiI标记，制备的可分离式微针通过共聚焦激光显微镜Z轴扫描观察。实验结果如图4-5所示。

如图4所示，微针针体呈金字塔形，底部边长为300μm，高度600μm，形状完整且均匀。如图5所示，微针的针尖与基底层次分明，且亲脂性染料DiI标记的外泌体集中在微针针体上。

4、微针刺皮能力检测

微针的机械强度是通过万能试验机模具的不锈钢板压缩来测量的。将微针贴片裁切成10×10的阵列置于万能试验机上，当微针尖端接触到不锈钢板产生之间的2mm，测压元件容量为100N；顶部不锈钢板向微针移动的速度为0.2mm/min^-1。

采用C57BL/6小鼠背部的新鲜皮肤来研究可分离式微针的刺皮能力。将C57BL/6小鼠麻醉后使用颈椎脱臼法处死，用剃毛器脱去其背部毛发后脱毛膏进一步清理背部皮肤。取下小鼠背部皮肤并固定于操作台上，擦拭皮肤表面的生理盐水以保持皮肤表面干燥。将微针裁切成10×10阵列，垂直刺入新鲜皮肤中，使用约15N的力按压1min。取下微针，用0.2％台盼蓝染色液染色20min，期间保持染色液充足，防止干燥。染色结束后，用生理盐水及75％乙醇将染液清洗干净，观察被染成蓝色的针孔数。同时，将另一块微针刺皮后的新鲜皮肤置于戊二醛溶液中固定，经超临界干燥后于扫描电子显微镜下观察。实验结果如图6-8所示。

如图6所示，每个微针针体能承受0.4N的力。如图7所示，微针刺皮后的皮肤上，大部分微针针尖处均被成功染成蓝色，数据分析显示微针刺皮率可达94.5％。如图8所示，微针在皮肤表面留下排列规则的孔洞，且孔洞间距与微针各个针尖间距一致。

5、微针分离性能研究

微针针体分离及稳定性观察通过将微针置于模拟体液中，随即在显微镜下观察记录第0、1、2、3、5min和第1、2、3、5、7天微针的形态。微针针尖在皮肤中的滞留观察通过用10×10微针贴片垂直刺入皮肤或模拟皮肤中，用约15N的力按压10min，移除微针基底，将微针刺皮后的皮肤和模拟皮肤置于立体显微镜下观察。实验结果如图9-10所示。

如图9所示，微针在接触到模拟体液后1min，透明质酸基底迅速溶解导致针尖基底分离；2min时，透明质酸基底已经完全溶解，PVA针尖分布在模拟体液中。随着时间的延长，PVA针尖出现溶胀，并且7天后仍然能维持微针结构。如图10所示，微针在刺入皮肤移除背衬后，可以在皮肤中观察到排列规则的微针针尖。

6、体内外泌体释放实验

C57BL/6小鼠麻醉后，使用剃毛器和脱毛膏脱去小鼠背毛。使用针尖负载DiI标记外泌体的微针，将微针裁切成20×20为阵列。将两片可分离式微针应用于小鼠背部皮肤，15min后移去背衬。背部皮下注射(S.C.)等量DiI标记的外泌体作为对照。在给药后立即以及第1、3、5、7天将小鼠放置于小动物活体成像仪上拍照观察。实验结果如图11-12所示。

如图11所示，皮下注射组中，DiI标记的EXO的荧光信号可以在3天内检测到，而5天无法检测到荧光信号。微针组中持续到第7天依然能在C57BL/6小鼠皮内检测到DiI标记的EXO的荧光信号。如图12所示，相比于皮下注射组，微针组能显著延长外泌体的释放时间至7天。

综上，可分离式微针贴片具有足够的机械强度，能够刺破皮肤并实现针尖与基底的分离，同时针尖滞留在皮肤内释放负载的外泌体及壳聚糖乳酸盐中的L-乳酸。

实施例2：可分离式微针贴片用于脱发治疗的功效评价

本实施例中使用C57BL/6小鼠，在活体治疗实验中，小鼠在出生后第7周剃毛，并使用脱毛膏进一步脱去背部毛发，制备脱发小鼠模型。将实施例1制备的可分离式微针贴片，将其按压在脱发小鼠模型的背部皮肤上，并固定保持10min后移除背衬(微针组)；皮下注射含外泌体和壳聚糖乳酸盐的浓缩液作为皮下注射对照组；涂抹传统脱发治疗药物米诺地尔作为阳性对照组；未接受任何处理的脱发模型小鼠作为模型组，治疗后，记录小鼠毛发再生状态，并检测毛发覆盖率、H&E染色及Ki67免疫荧光分析。实验结果如图13-16所示。

如图13所示，在治疗后第7天，微针组治疗后毛发明显再生，而模型组及药物治疗组再生不明显。15天后微针治疗组毛发已经完全再生，而其他组均未完全再生。如图14所示，微针组毛发再生覆盖率明显高于其他治疗组，展现出最好的促进毛发再生的效果。如图15所示，治疗后第七天模型组中未见再生的毛囊结构，而各治疗组中均有不同程度的毛囊再生，其中微针组毛囊再生最明显，毛囊直径最大，并进一步导致微针组的皮肤最厚。如图16所示，治疗后第7天，各治疗组均有毛囊中存在Ki67⁺细胞，并且微针组中处于生长期的毛囊数量以及毛囊中Ki67阳性细胞数量均最多。

由此说明，本发明制备的可分离式微针贴片在用于治疗脱发上具有很好的效果，因此，可以制备成生发帖使用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种可分离式微针贴片，其特征在于，所述可分离式微针贴片由微针针体和背衬组成；所述微针针体由外泌体、壳聚糖乳酸盐、针体聚合物组成；

所述壳聚糖乳酸盐的浓度为0.2 mg/mL~1.5 mg/mL；所述针体聚合物为聚乙烯醇混合物，由醇解度为97.5 mol%~99 mol%的高醇解度聚乙烯醇和醇解度为92.0mol%～94.0mol%的低醇解度聚乙烯醇的组成，其质量分数为10%~80%；

所述壳聚糖乳酸盐由分子量为3W-30W的壳聚糖和L-乳酸制备而成；

所述外泌体的总蛋白含量为20 μg/mL-800 μg/mL；

所述外泌体为脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞或脂肪来源间充质干细胞的外泌体；

所述高醇解度聚乙烯醇和低醇解度聚乙烯醇的质量比为1:1。

2.根据权利要求1所述的可分离式微针贴片，其特征在于，所述背衬是由背衬聚合物溶液制备而成的，所述背衬聚合物溶液的质量分数为10%~60%。

3.根据权利要求2所述的可分离式微针贴片，其特征在于，所述背衬聚合物溶液为淀粉、明胶、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素、甲基乙烯基醚-马来酸酐共聚物、葡聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、果糖、海藻酸钠、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、海藻糖、羟丙基-β-环糊精、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮溶液中的至少一种。

4.权利要求1-3任一项所述的可分离式微针贴片的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）将外泌体和壳聚糖乳酸盐加入到针体聚合物中，混合均匀，将得到的预混溶液注入微针模具中，离心使预混溶液充满整个微针模具的空腔，去除多余的预混溶液后，对微针模具进行第一次干燥；

（2）将背衬聚合物溶液注入步骤（1）中干燥后的微针模具中，再次离心使

溶液充满剩余的针腔，第二次干燥至微针自动脱模，即得到可分离式微针贴片。

5.根据权利要求4所述的可分离式微针贴片的制备方法，其特征在于，所述第一次干燥的时间为1h~6h，温度为4℃~36℃，湿度为30%~60%；所述第二次干燥的时间为6h~36h，温度为4℃~36℃，湿度为30%~60%。

6.权利要求1-3任一项所述的可分离式微针贴片在用于制备防治脱发的生发贴中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述可分离式微针贴片的使用方法为：将可分离式微针贴片按压至脱发皮肤上，固定保持10min~30min后，移除背衬，连续使用7天~15天。