CN112153957A - 微针贴剂促进毛发生长的用途 - Google Patents

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Abstract

描述了包含含有小分子毛发生长剂和天然产物(例如，囊泡，如源自干细胞的外泌体)的组合的聚合物网络的组合物。该聚合物网络可以，例如，包含经由分子间二硫键交联的角蛋白。可替换地，该聚合物网络可以包含角蛋白或其衍生物和另一种交联的亲水性聚合物。还描述了包含该组合物的微针、微针阵列和皮肤贴剂，以及使用该微针、微针阵列和/或皮肤贴剂治疗脱发和/或促进毛发生长的方法。

Description

微针贴剂促进毛发生长的用途
相关申请
本申请要求于2018年4月13日提交的美国临时专利申请序列号62/657,423的优先权和权益；将其公开内容通过引证整体结合于本文中。
技术领域
本公开的主题涉及用于递送天然产物(例如，胞外囊泡或干细胞)和小分子毛发生长剂的组合的组合物。该组合物可以包含角蛋白水凝胶或包含角蛋白或其衍生物和除角蛋白之外的交联亲水性聚合物的聚合物网络。本公开主题还涉及包含该组合物的微针、微针阵列和皮肤贴剂；制备该微针阵列的方法；和使用该微针、阵列或皮肤贴剂治疗脱发和/或促进毛发生长的方法。
缩写词
℃＝摄氏度
％＝百分比
μg＝微克
μl＝微升
μm＝微米(micrometer)或微米(micron)
μmol＝微摩尔
BSA＝牛血清白蛋白
cm＝厘米
DCM＝二氯甲烷
DiD＝1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基-吲哚二羰花青4-氯苯磺酸盐
Dil＝1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基-吲哚羰花青高氯酸盐
DLS＝动态光散射
EV＝胞外囊泡
FBS＝胎牛血清
FITC＝异硫氰酸荧光素
FTIR＝傅立叶变换红外光谱
g＝克
h＝小时
HA＝透明质酸
HFSC＝毛囊干细胞
HMN＝水凝胶微针贴剂
HPLC＝高效液相色谱
kDa＝千道尔顿
MBA＝N,N’-亚甲基双丙烯酰胺
mg＝毫克
m-HA＝丙烯酸酯改性的透明质酸
min＝分钟
mL＝毫升
mm＝毫米
MN＝微针
MTT＝溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑
NP＝纳米颗粒
MSC＝间充质干细胞
Mw＝重均分子量
MWCO＝分子量截值
N＝牛顿
nm＝纳米
PBS＝磷酸盐缓冲盐水
PEG＝聚(乙二醇)
PLGA＝聚(乳酸-共-乙醇酸)
PVA＝聚乙烯醇
RhB＝罗丹明B
s.c.＝皮下
SDS＝十二烷基硫酸钠
SEM＝扫描电子显微镜
s.d.＝标准偏差
TEM＝透射电子显微镜
UK5099＝2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸
UV＝紫外
wt％＝重量百分比
背景技术
超过50％的普通人群患有脱发或秃头症。脱发治疗的最常见策略包括药物治疗，例如，用米诺地尔局部治疗或口服非那雄胺。参见Chueh et al.(2013)ExpertOpin.Biol.Ther.,13(3),377-391；和Lolli et al.,(2017)Endocrine,57,9-17。然而，这些治疗方法通常只能提供短期改善。为了持续受益，使用这些药物的治疗会涉及它们的持续使用，这可能导致不良副作用。自体毛发移植可以作为可靠的替代方案。然而，其涉及创伤性外科手术，并受限于自体毛囊丰富的情况。参见Chueh et al.(2013)ExpertOpin.Biol.Ther.,13(3),377-391；和Lolli et al.,(2017)Endocrine,57,9-17。
因此，对于防止脱发和/或促进毛发生长的其他治疗选择仍存持续需求。具体地，存在对于有效促进局部毛发生长，提供治疗剂的持续递送和/或持续疗效并且无痛且副作用少的治疗的需要。
发明内容
该发明内容列出了本公开的主题的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变化和置换。该发明内容仅仅是众多和各种实施方式的举例说明。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这种实施方式通常可以具有或不具有所提到的特征；同样，这些特征可以应用于本公开的主题的其他实施方式，而无论是否在本发明内容中列出。为避免过多重复，本发明内容未列出或暗示这些功能的所有可能组合。
在一些实施方式中，本公开的主题提供一种组合物，包含：(a)包含角蛋白或其衍生物的亲水性聚合物网络；(b)选自包括囊泡、干细胞和囊泡衍生分子的组的天然产物，可选地其中囊泡是外泌体(exosome)，进一步可选地其中天然产物包括间充质干细胞(MSC)衍生的囊泡；和(c)小分子毛发生长剂。
在一些实施方式中，该亲水聚合物网络包含角蛋白水凝胶。在一些实施方式中，该角蛋白水凝胶经由分子间二硫键交联。在一些实施方式中，该角蛋白水凝胶是由包含约5重量％(wt％)至约20wt％的角蛋白和约0.1wt％至约1wt％的半胱氨酸，可选地约8wt％的角蛋白和/或约0.4wt％的半胱氨酸的水溶液制备的水凝胶。
在一些实施方式中，该亲水性聚合物网络包含：(i)交联的亲水性聚合物，其中所述交联的亲水性聚合物不是角蛋白，可选地其中交联的亲水性聚合物选自包括以下的组：甲基丙烯酸化的透明质酸(m-HA)或另一种葡糖胺聚糖或其共聚物或衍生物；聚乙烯醇(PVA)或其共聚物或衍生物；多糖；聚(氨基酸)，除角蛋白以外的蛋白质；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚(亚烷基二醇)或聚(氧化烯)；聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)，多羟基酸；它们的组合，和它们的共聚物；和(ii)角蛋白或其衍生物。
在一些实施方式中，该小分子毛发生长剂包含选自包括以下的组中的一种或多种：2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸(UK5099)、米诺地尔、非那雄胺、丙戊酸、脱氧可的松(cortexolone)17α,17α-雌二醇、腺苷、全反式视黄酸、氟罗地尔(fluridil)、RU-58841、软木肟酸(suberohydroxamic acid)(4-甲氧基羰基)苯基酯和酮康唑。在一些实施方式中，该小分子毛发生长剂包封于包含可生物降解聚合物的纳米颗粒中。在一些实施方式中，该可生物降解聚合物是聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。
在一些实施方式中，该组合物包含约0.01毫克(mg)至约2mg的外泌体，可选地是MSC衍生的外泌体。在一些实施方式中，该组合物包含约0.05微克(μg)至约1mg的小分子毛发生长剂。
在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种微针，包含一种组合物，该组合物包含：(a)含有角蛋白或其衍生物的亲水性聚合物网络；(b)选自包括囊泡、干细胞和囊泡衍生分子的组的天然产物，可选地其中囊泡是外泌体，进一步可选地其中天然产物包括间充质干细胞(MSC)衍生的囊泡；和(c)小分子毛发生长剂。
在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种包括多根微针的微针阵列，微针包含一种组合物，组合物包含：(a)含有角蛋白或其衍生物的亲水性聚合物网络；(b)选自包括囊泡、干细胞和囊泡衍生分子的组的天然产物，可选地其中囊泡是外泌体，进一步可选地其中天然产物包括间充质干细胞(MSC)衍生的囊泡；和(c)小分子毛发生长剂；可选地其中所述多根微针中的每个具有约400至约1000微米的长度，进一步可选地其中多根微针中的每个具有约600微米的长度和/或约300微米的基部直径。在一些实施方式中，本公开的主题提供一种包括微针阵列的皮肤贴剂，可选地其中贴剂包括保护性背衬层、可去除背衬层或包括与皮肤相容的粘合剂的背衬层。
在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种在对其有需要的受试者中治疗脱发和/或促进毛发生长的方法，其中该方法包括向受试者给予本文公开的微针阵列或本文公开的皮肤贴剂，其中给予包括使阵列或皮肤贴剂与受试者的皮肤表面接触，其中皮肤表面包含一个或多个毛囊。在一些实施方式中，接触包括每天使受试者的皮肤表面与阵列或贴剂接触，可选地，其中每天接触是每天约1至约24小时。在一些实施方式中，受试者是人。
在一些实施方式中，本发明提供了一种制备微针阵列的方法，微针阵列包括多根微针，微针包含组合物，该组合物包含含有角蛋白或其衍生物的亲水性聚合物网络；选自由囊泡、干细胞和囊泡衍生分子组成的组的天然产物，可选地其中囊泡是外泌体，进一步可选地其中天然产物包括间充质干细胞(MSC)衍生的囊泡；和一种小分子毛发生长剂，其中方法包括：(a)提供包含一个或多个微腔的模具，可选地一个或多个微腔中的每个的形状近似圆锥形和/或其中微腔具有约400至约100微米的深度；(b)用第一水溶液填充模具的一个或多个微腔的至少一部分，第一水溶液包含：(i)角蛋白，(ii)选自囊泡、干细胞和囊泡衍生分子的天然产物，可选地其中囊泡是外泌体，进一步可选地其中天然产物包含间充质干细胞(MSC)衍生的外泌体；(iii)小分子毛发生长治疗剂；和(iv)半胱氨酸，可选地其中分子脱发治疗剂包埋于可生物降解聚合物纳米颗粒中，进一步可选地其中小分子毛发生长治疗剂是UK5099；(c)将模具置于空气或氧气中一时间段而形成角蛋白水凝胶；(d)将第二水溶液滴到模具上，其中所述第二水溶液包含亲水性聚合物；(e)将模具干燥另一时间段；和(f)从模具中取出微阵列。
在一些实施方式中，第一水溶液包含约5重量％(wt％)至约20wt％的角蛋白和约0.1wt％至约1.0wt％的半胱氨酸。在一些实施方式中，第二水溶液包含透明质酸。在一些实施方式中，步骤(b)和(c)重复一次或多次。
因此，本公开的主题的目的在于提供用于递送治疗脱发和/或促进毛发生长的药剂的组合的组合物和装置，以及制备和使用所述组合物和装置的方法。
上面已经陈述了本公开主题的目的，并且通过本公开主题会全部或部分实现本公开主题的目的，当结合如下文最佳描述的附图和实施例进行描述时，其他目的将变得显而易见。
附图说明
图1A是显示使用本公开的主题的示例性微针贴剂进行脱发治疗的系统的示意图。图左上角显示了含有角蛋白的发束，其可以用于形成微针的聚合物基质。如插图所示，角蛋白是毛发衍生的蛋白质，具有高含量的分子内二硫键。右上显示了微针皮肤贴剂的一部分的示意图，其中微针装有间充质干细胞(MSC)衍生的外泌体和包含2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚)-3-基)-2-丙酸(UK5099)，小分子毛囊干细胞活化剂的聚合物纳米颗粒。微针附着于包含透明质酸的基底层。右下显示该贴剂施用于皮肤，其中载药微针可以穿透包括毛囊干细胞(HFSC)的隆突(bluge)，并释放MSC衍生的外泌体和UK5099。如果需要，在贴剂施用于皮肤上之后可以除去透明质酸基底层，留下微针，其可以充当用于持续释放治疗剂的贮库。左下角是微针存在一段时间之后并且新的毛发正在存在HFSC处生长毛干的皮肤横截面示意图。由于生物降解，微针的尺寸已经缩小。
图1B是显示角蛋白水凝胶形成的示意图。在第一步(左)中，角蛋白中的分子内二硫键被半胱氨酸裂解而形成游离的硫醇，然后通过硫醇氧化形成分子间的二硫键(右)。
图2A是使用硅树脂模具制备用于递送毛发生长治疗剂的本公开的主题的示例性微针皮肤贴剂的方法的示意图。在左上方，包含半胱氨酸、外泌体和加载治疗剂的聚合物纳米颗粒的角蛋白溶液沉积于针腔中。模具保持于空气中(右上)，同时角蛋白水凝胶在微针腔中形成。然后，将透明质酸溶液添加到模具中(右下)，并使其干燥而形成微针贴剂的基底层(中下)。一旦干燥，将贴剂从模具拆下(左下)。
图2B是本公开的主题的示例性微针(MN)阵列的扫描电子显微镜(SEM)图像。图像左下方的比例尺代表200微米(μm)。MN包含交联的亲水性聚合物的聚合物网络、角蛋白、外泌体和加载小分子治疗剂的聚合物纳米颗粒。
图3A是显示在37摄氏度(℃)下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中染料标记的外泌体从本公开的主题的微针贴剂中随时间(0至60小时(h))的累积释放的图表。外泌体释放表示为最初存在于贴剂中的外泌体的百分比(％)。实心方块中显示了包含使用半胱氨酸破坏分子内二硫键(HMN)而制备的角蛋白水凝胶的贴剂的数据，实心圆显示了在不存在半胱氨酸(PMN)的情况下制备的贴剂的数据。
图3B是显示37摄氏度(℃)下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸(UK5099)从本公开主题的微针贴剂中随时间(0至60小时(h))累积释放的图表。UK5099释放表示为贴剂中最初存在的UK5099的百分比(％)。实心方块显示了包含使用半胱氨酸破坏分子内二硫键(HMN)而制备的角蛋白水凝胶的贴剂的数据，实心圆显示了在不存在半胱氨酸(PMN)的情况下制备的贴剂的数据。
图4是显示促进毛发生长的不同治疗的体外毒性(表示为细胞活力相对对照细胞活力的百分比(％))的图表。细胞用对照(磷酸盐缓冲盐水(PBS))温育，或浸入空白角蛋白氢微针阵列(空白HMN)、负载2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙烯酸(UK5099)的角蛋白水凝胶微针阵列(HMN-UK5099)、负载外泌体的角蛋白水凝胶微针阵列(HMN-外泌体)或载UK5099和负载囊泡的角蛋白水凝胶微针阵列(HMN-UK5099和外泌体)的溶液。为了进行比较，还显示了用纯UK5099(UK5099)或外泌体(外泌体)处理的细胞的数据。
图5A是在脱发的小鼠模型中经由水凝胶微针贴剂给予、局部小分子给予或皮下注射(s.c.)处理的脱发处理处理方案的示意图。
图5B是显示用负载外泌体和2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸(UK5099)的角蛋白水凝胶微针阵列(G2；正方形)、负载UK5099的角蛋白水凝胶微针阵列(G3，三角形)或负载外泌体的角蛋白水凝胶微针阵列(G4，圆圈)处理的小鼠中的毛发表型转化的时间分布的图表。为了进行比较，还显示了未经处理的小鼠(G1，菱形)的数据。毛发的生长阶段指示于左轴，而处理日期(对应于图5A中所示的时间表)示于底轴。
图5C是显示用负载外泌体和2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸(UK5099)的角蛋白水凝胶微针阵列(G2)、负载UK5099的角蛋白水凝胶微针阵列(G3)或负载外泌体的角蛋白水凝胶微针阵列(G4)处理的小鼠的毛发覆盖面积(平方厘米(cm2))的图表。为了比较，还显示了未经处理的小鼠(G1)的数据。***P＜0.001。
图5D是显示用负载外泌体和2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸(UK5099)的角蛋白水凝胶微针阵列(G2，正方形)、负载UK5099的角蛋白的水凝胶微针阵列(G3，三角形)或负载外泌体的角蛋白水凝胶微针阵列(G4，圆圈)处理的小鼠中的休止期(telogen)、休止期-生长期过渡和生长期中的毛发毛囊的定量(以百分比(％)表示)的图表。为了比较，还显示了未经处理的小鼠(G1，菱形)的数据。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图5E是显示用负载外泌体和2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸(UK5099)的角蛋白水凝胶微针阵列(G2)、负载UK5099的角蛋白水凝胶微针阵列(G3)或负载外泌体的角蛋白水凝胶微针阵列(G4)处理的小鼠的毛发密度(每平方厘米(cm2)的毛发数)的图表。为了比较，还显示了未经处理的小鼠(G1)的数据。***P＜0.001。
图5F是显示用负载外泌体和2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸(UK5099)的角蛋白水凝胶微针阵列(G2)、负载UK5099的角蛋白水凝胶微针阵列(G3)或负载外泌体的角蛋白水凝胶微针阵列(G4)处理的小鼠的毛发厚度(以微米(μm)计)的图表。为了比较，还显示了未经处理的小鼠(G1)的数据。***P＜0.001。
具体实施方式
现在将在下文中参考显示代表性实施方式的附图和实施例而更全面地描述本公开的主题。然而，本公开的主题可以以不同的形式实施，并且不应该解释为仅限于本文中阐释的实施方式。相反，提供这些实施方式而使本公开变得透彻而完整，并将向本领域技术人员充分传达各实施方式的范围。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与当前描述的主题所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全部内容结合于本文中。
在整个说明书和权利要求书中，给定的化学式或名称应该涵盖所有活性的旋光和立体异构体，以及存在此类异构体和混合物的外消旋混合物。
I.定义
尽管相信以下术语对于本领域普通技术人员很好理解，但提出以下定义有助于对本公开的主题的解释。
遵循长期的专利法惯例，当在包括权利要求书的本申请中使用时，术语“一个”、“一种”和“该”是指“一个或多个”。因此，例如，提及的“一种试剂”或“一种聚合物”包括多种这样的试剂或聚合物等。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示尺寸、反应条件等的数量的数字在任何情况下均应该理解为由术语“约”修饰。因此，除非相反指示，否则在本说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数是近似值，可以根据本公开的主题寻求获得的所需特性而变化。
如本文所用，术语“约”在指代尺寸(即，直径)、重量、浓度或百分比的值或量时，旨在涵盖指定的量的±20％或±10％，在另一个实施例中为±5％，在另一个实施例中为±1％，而在又一实施例中为±0.1％的变化，因为这样的变化适合于实施所公开的方法。
如本文所用，术语“和/或”当在实体列表的上下文中使用时，是指实体单独或组合存在。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”各自包括A、B、C和D，而且还包括A、B、C和D中的任何之一和所有组合和子组合。
属于“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包括性的或开放式的，并不排除其他未叙述的要素或方法步骤。“包含”是在权利要求语言中使用的技术术语，这意味着所宣称的要素是必不可少的，但可以添加其他要素，并仍然构成权利要求范围内的结构。
如本文中所用，短语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当在权利要求书的正文中出现短语“由...组成”时，而不是紧跟在前导词之后时，它仅限制该条款中列出的要素；总体上，其他要素也不排除于权利要求范围外。
如本文中所用，短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤，以及并不实质影响所要求保护的主题的基本和新颖特征的那些。
关于术语“包含”，“由……组成”和“基本上由……组成”，在本文中使用这三个术语中之一时，本公开和要求保护的主题可以包括其他两个术语中的任意之一的使用。
术语“纳米尺寸”、“纳米材料”、“纳米尺寸聚合物”、“纳米颗粒”及其其他语法变化形式是指具有至少一个尺寸(例如，长度，宽度，直径等)小于约1000nm的区域的结构。在一些实施方式中，该尺寸更小(例如，小于约500nm，小于约250nm，小于约200nm，小于约150nm，小于约125nm，小于约100nm，小于约80nm，小于约70nm，小于约60nm，小于约50nm，小于约40nm，小于约30nm或甚至小于约20nm)。在一些实施方式中，该尺寸小于约10nm。
在一些实施方式中，纳米颗粒是近似球形的。当纳米颗粒近似球形时，特征尺寸可以对应于球的直径。除了球形之外，纳米颗粒或其他纳米尺寸材料可以是碟状、长方形、多面体形、棒状、立方形或不规则形状。纳米尺寸材料还可以包含球形、长方形、多面体形、棒状、碟状、立方体形或不规则形状的颗粒或不同形状的颗粒组合的簇体。
术语“直径”是本领域公认的，并且在本文中用于指代物理直径或流体力学直径。基本为球形的颗粒的直径可以是指物理或流体力学直径。如本文所用，非球形颗粒的直径可以是指颗粒表面上两点之间的最大线性距离。当提及多个颗粒时，颗粒的直径通常是指颗粒的平均直径。颗粒直径可以使用本领域中包括，但不限于，动态光散射的多种技术进行测量。在一些实施方式中，术语“直径”也可以用于指代物理对象如微针的圆形横截面的直径。
如本文所用，术语“微针”是指具有至少一个尺寸小于约1000微米(μm)的区域(例如，长度，基部直径等)的针状结构。在一些实施方式中，术语“微针”是指具有约1微米至约1,000微米(例如，约1、5、10、25、50、75、100、200、300、400、500，600、700、800、900或约1,000微米)的尺寸的结构。微针可以具有圆锥形或金字塔形的形状，或可以是大致棒状形状，但包括包含圆锥形或金字塔形的结构的一个末端/尖端。
如本文所用，“大分子”是指具有高相对分子质量的分子，其结构包含源自低相对分子质量的分子，例如，单体和/或低聚物的单元的多次重复。
“低聚物”是指具有中等相对分子质量的分子，其结构包含少量(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)衍生自低相对分子质量的分子的重复单元。
如本文所用，“单体”是指可以进行聚合，从而向大分子的基本结构贡献结构单元，即原子或原子团的分子。
术语“聚合物”和“聚合物的”是指具有重复组成单元的化学结构(即，给定的化学亚结构或“单体单元”的多个拷贝)。如本文所用，聚合物可以指具有多于10个重复单元的组和/或其中重复单元不是亚甲基的组。聚合物可以由可聚合单体形成。可聚合单体是包含一个或多个可以与其他分子反应而成键的反应性部分(例如，甲硅烷氧基醚，羟基，胺，乙烯型基团(即，碳-碳双键)，卤化物(即，Cl，Br，F和I)，羧酸，酯，活化的酯，等)。通常，每个可聚合单体分子可以键合至两个或多个其他分子。在某些情况下，可聚合单体仅与一个其他分子键合，形成聚合物材料的末端。一些聚合物包含可生物降解的连接键，如酯或酰胺，使得它们可以在生物学条件下(例如，在体内存在的特定pH下或在酶的存在下)随时间而降解。
“共聚物”是指衍生自一种以上单体的聚合物。每种单体提供不同种类的单体单元。
多分散度(PDI)是指聚合物样品的比率(Mw/Mn)。Mw是指质均摩尔质量(也通常称为重均分子量)。Mn是指数均摩尔质量(也通常称为数均分子量)。
如本文所用，“生物相容的”通常是指通常对受体(例如，动物，如人或其他哺乳动物)无毒并且不会对受体引起任何明显不利影响的物质及其任何代谢产物或其降解产物。
如本文所用，“可生物降解的”通常是指在生理条件下降解或侵蚀成能够被受试者代谢、消除或排泄的较小单位或化学物质的材料。在一些实施方式中，降解时间是聚合物组成和形态的函数。合适的降解时间为数天至数周。例如，在一些实施方式中，聚合物可以在7天至24周，可选地7天至12周，可选地7天至6周，或进一步可选地7天至3周的时间内降解。
术语“亲水性的”可以是指溶解或优先溶解于水和/或水溶液中的基团。
术语“疏水性的”是指并不明显溶于水和/或水溶液和/或优先溶于脂肪和/或非水性溶液的基团。
如本文所用，术语“交联试剂”或“交联剂”是指包括至少两个可以是相同或不同的反应性官能团(或可以解封或去保护而提供反应性官能团的基团)的化合物。在一些实施方式中，两个反应性官能团可以具有不同的化学反应性(例如，两个反应性官能团与其他分子上的不同类型的官能团具有反应活性(例如，形成键，如共价键)，或两个反应性官能团之一倾向于与另一个分子上的特定官能团比其他反应性官能团反应更快)。因此，交联剂可以用于连接(例如，共价键合)两个其他实体(例如，分子，聚合物，蛋白质，核酸，囊泡，脂质体，纳米颗粒，微米颗粒等)或连接同一实体(例如，聚合物)上的两个基团而形成交联的组合物。
如本文所用，术语“交联的聚合物”是指包含在各个聚合物链上的位点之间和/或各个聚合物链之间形成的至少一个且通常多于一个的另外的键的聚合物。在一些实施方式中，这些位点经由当交联剂结合至聚合物链上的两个不同位点或两个不同聚合物链上的位点时而形成的连接基团而彼此成键。在一些实施方式中，这些位点经由一个聚合物链上的基团和不同聚合物链上的基团之间的成键而彼此键连。
如本文所用，术语“包埋”是指一个实体(例如，小分子治疗剂)陷入另一实体(例如，聚合物网络，纳米颗粒，微米颗粒，微针等)中。通常，“包埋”是指一个实体在另一实体中，例如，在聚合物网络或聚合物纳米颗粒内的孔或腔中的非共价物理包封。
如本文所用，术语“小分子”是指分子量小于约900道尔顿(例如，小于约900道尔顿，小于约850道尔顿，小于约800道尔顿，小于约750道尔顿，小于约700道尔顿，小于约650道尔顿或小于约600道尔顿)。通常，本公开的主题的小分子包括合成的小分子。
如本文所用，术语“天然产物”是指细胞、囊泡、分子(例如，肽，蛋白质，脂质，核酸等)，或源自生物、组织、细胞或流体(例如，血浆，细胞培养基等)的分子混合物。在一些实施方式中，天然产物包含外泌体、干细胞或外泌体衍生分子。在一些实施方式中，天然产物包含外泌体、含外泌体干细胞培养基或外泌体衍生分子(例如，外泌体衍生的脂质、蛋白质、肽或核酸)。
II.一般考虑
哺乳动物的毛发可能会经历周期性的休止(静止期)、再生(生长期)和消退(退化期)循环，这取决于毛囊干细胞(HFSC)保持该循环的能力。参见Hsu et al.(2011)Cell,144,92-105。HFSC通常出现在生长期，但它们可以被来自毛囊内部微环境或毛囊外部宏观环境的信号激活，从而进入新的毛发生长周期的生长期。参见Moore and Lemischka(2006)Science,311,1880-1885；和Hsu et al.(2014)Nature Medicine,20,847-857。通常，毛发的长度取决于HFSC来源的祖细胞停留于生长期的持续时间。在某些情况下，HFSC无法被激活，从而导致毛发循环动力学发生变化：毛发休止期持续时间增加，而毛发生长期逐渐减少，结果是毛发变短，最终出现秃顶。参见Chueh et al.(2013)Expert Opin.Biol.Ther.,13(3),377-391。
外泌体是一种胞外囊泡，具有直径为10-100纳米(nm)的纳米球膜型结构，并被许多细胞和组织分泌。外泌体包含各种蛋白质、脂质和核酸，对于细胞间通讯是重要的。参见Luan et al.(2017)Acta Pharmacologica Sinica,38,754-763。研究表明，外泌体与许多生物学过程和某些常见疾病有关。参见Zhang et al.(2015)Stem Cells,33,2158-2168；and Jiang et al.(2017)ACS Nano,11,7736-7746。
此外，外泌体是囊泡的一个实例，并且具体是胞外囊泡的一个实例。“囊泡”是指包含脂质膜并且能够与其他细胞和其他脂质膜融合的任何球形或半球形分子。该膜可以包含有助于细胞融合的蛋白质和胆固醇。因此，如本文所用，本公开的主题包含囊泡，如但不限于外泌体(直径约10nm至约100nm)，微囊泡(直径约100nm至约300nm)和凋亡体(直径约300nm至约500nm)。
在一些实施方式中，本公开的主题涉及一种组合物，该组合物包含用于治疗脱发和/或促进毛发生长的天然产物与合成小分子治疗剂如本领域已知用于治疗脱发和/或促进毛发生长的治疗剂的组合。在一些实施方式中，天然产物是囊泡，如外泌体(例如，干细胞来源的外泌体)或其他胞外囊泡；囊泡衍生的分子，如外泌体衍生的蛋白质或核酸；干细胞；或含外泌体的干细胞培养基。例如，天然产物可以是源自干细胞或干细胞条件培养基的外泌体。在一些实施方式中，外泌体是从间充质干细胞(MSC)或MSC条件培养基分离的外泌体。MSC可以源自皮肤、骨髓、牙龈或其他组织。外泌体(或其他囊泡)也可以源自组织细胞如，但不限于，人脂肪组织。在一些实施方式中，囊泡被以下物质取代：来自一种或多种组织的干细胞或源自囊泡(例如，外泌体)的一种或多种分子如，但不限于，蛋白质，如在细胞骨架中发现的胞质蛋白、胞内膜融合和/或转运蛋白、信号转导蛋白、代谢酶或四次跨膜蛋白(tetraspanin)；核酸，例如，源自外泌体的信使RNA(mRNA)和/或微RNA，如可以对HFSC激活具有活性的核酸。
在一些实施方式中，组合包含源自MSC的外泌体和UK5099或另一种小分子治疗剂(例如，分子量低于约500的合成分子)。在一些实施方式中，小分子治疗剂(例如，UK5099)可以包封于可生物降解的聚合物纳米颗粒(例如，PLGA纳米颗粒)中。纳米颗粒的使用可以使小分子试剂与亲水性组合物更相容。
在一些实施方式中，小分子治疗剂可以是激活HFSC的试剂。在一些实施方式中，小分子治疗剂是通过增加HFSC中乳酸的产量而改变糖分解代谢并促进毛发生长的试剂。在一些实施方式中，小分子治疗剂是UK5099(即，2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸)或其治疗活性衍生物或药用盐。在一些实施方式中，UK5099可以被具有脱发的潜在治疗作用的另一种分子替代，包括但不限于，丙戊酸，脱氧可的松、17α,17α-雌二醇，腺苷，全反式维甲酸，氟罗地尔，RU-58841(又称为PSK-3841或HMR-3841)，软木肟酸、(4-甲氧基羰基)苯基酯，酮康唑或其他可以调节HFSC信令通路的小分子如，但不限于，Wnt/β-链蛋白(catenin)，骨形态发生蛋白(BMP)，Notch等，以调节毛发周期。
在一些实施方式中，该组合物还包含一种或多种可以形成包含外泌体和小分子试剂的交联网络的聚合物材料(例如，天然或合成聚合物材料，或其组合)。在一些实施方式中，该组合物适合用于制备微针阵列，该微针阵列可以制备成皮肤贴剂形式而用作方便且无痛的透皮装置，用于将治疗剂组合持续递送至毛囊。
在一些实施方式中，MN阵列可以用于治疗哺乳动物受试者，例如，人类受试者的脱发和/或促进毛发生长。因此，MN阵列可以用于治疗患有脱发、毛发稀疏和/或秃顶的受试者。在一些实施方式中，脱发、毛发稀疏和/或秃顶是男性或女性型秃头的结果。因此，在一些实施方式中，脱发、毛发稀疏和/或秃顶是遗传因素、年龄和/或激素所致。在一些实施方式中，脱发、毛发稀疏和/或秃顶可能是压力、身体创伤、慢性疾病(例如，自身免疫性疾病，如脱发症)、使用某些药物(例如，某些抗抑郁药，细胞毒性化疗药物等)、食入毒物或饮食营养(例如，铁失衡，锌、L-赖氨酸、维生素B6或B12缺乏或维生素A过多)所致。在一些实施方式中，脱发、毛发稀疏和/或秃顶可能是脱发症所致，例如但不限于，青少年脱发症，早发脱发症，老年脱发症，斑秃症，雄性脱发症，机械性脱发症，产后脱发症和症状性脱发症。
术语“治疗脱发”和“促进毛发生长”包括引起发束损失或断裂速率的降低和/或秃顶增长速率的降低或发迹线后退速率的降低。另外或可代地，这些术语可能涉及促进秃顶处的毛发生长、发根鞘厚度改善、毛发锚定改善、毛发强度增加、毛发生长速率和/或长度增加、可见发束数量增加和/或毛发体积增加。
在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种组合物，其包含：(a)亲水性聚合物网络；(b)选自由囊泡(例如外泌体)、干细胞和囊泡衍生分子组成的组的天然产物；和(c)小分子毛发生长剂。在一些实施方式中，亲水性聚合物网络包含角蛋白或其衍生物。在一些实施方式中，天然产物包含外泌体。在一些实施方式中，天然产物包含源自质干细胞(MSC)的外泌体。在一些实施方式中，小分子毛发生长剂包埋于包含可生物降解的聚合物的纳米颗粒中。
在一些实施方式中，亲水聚合物网络包含角蛋白水凝胶。角蛋白水凝胶可以由包含至多约20wt％角蛋白的水溶液制备。在一些实施方式中，角蛋白水凝胶由包含约15wt％至约20wt％的角蛋白的水溶液制备。在一些实施方式中，亲水性聚合物网络包含角蛋白水凝胶或由其组成，角蛋白水凝胶在角蛋白分子之间包含分子间二硫键。在一些实施方式中，包含分子间二硫键的角蛋白水凝胶由包含约5wt％至约20wt％的角蛋白(例如，约5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或约20wt％的角蛋白)的水溶液制备。在一些实施方式中，角蛋白水凝胶由包含约7wt％至约9wt％的角蛋白的溶液制备。在一些实施方式中，水凝胶由包含约8wt％角蛋白的溶液制备。在一些实施方式中，角蛋白水凝胶由还包含半胱氨酸的角蛋白水溶液制备。在一些实施方式中，角蛋白水凝胶由包含至少约0.1wt％的半胱氨酸至至多达约1wt％的半胱氨酸的溶液制备。在一些实施方式中，该溶液包含约0.25wt％至约0.75wt％的半胱氨酸(例如，约0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70或约0.75wt％的半胱氨酸)。在一些实施方式中，该溶液包含约0.4wt％的半胱氨酸。
在一些实施方式中，该亲水性聚合物网络包含(i)除角蛋白之外的聚合物的交联的水性聚合物网络和(ii)角蛋白或其衍生物。因此，在一些实施方式中，该聚合物网络包含除角蛋白以外的聚合物的交联聚合物网络，聚合物包含包埋在中的角蛋白或其衍生物。该交联的亲水性聚合物网络的非角蛋白亲水性聚合物可以是天然聚合物或合成聚合物。在一些实施方式中，可交联亲水性聚合物选自包括但不限于以下的组：透明质酸(HA)或其衍生物或共聚物；聚乙烯醇(PVA)或其共聚物或衍生物；多糖，可选的纤维素或其衍生物，壳聚糖或糊精；聚氨基酸，如聚-L-丝氨酸或聚-L-赖氨酸；除角蛋白外的蛋白质，例如明胶，胶原蛋白，弹性蛋白，丝素蛋白，蜘蛛丝蛋白等；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚(亚烷基二醇)或聚(氧化烯)，可选地聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)或聚(氧化乙烯)(PEO)；聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)；多羟基酸，如聚乳酸或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PGLA)；以及其组合和共聚物。在一些实施方式中，亲水性聚合物是可生物降解的。在一些实施方式中，该亲水性聚合物是甲基丙烯酰化HA(m-HA)。
角蛋白可以从天然来源提取，包括人或其他动物皮肤或皮肤附属物，如人毛发，羊毛或羽毛。在一些实施方式中，角蛋白是人工合成的，如通过肽合成或通过基因工程化的微生物或细胞合成。从天然来源提取时，角蛋白可以通过任何合适的方法，如通过化学方法(例如，还原，氧化和/或水解)或特别是通过物理方法提取。在一些实施方式中，组合物包含角蛋白的衍生物，如衍生自角蛋白的多肽或其他片段，化学修饰的角蛋白，或化学改性多肽或衍生自角蛋白的其他片段。
当亲水性聚合物网络包含除角蛋白以外的交联亲水性聚合物时，可以根据需要调节亲水性聚合物与角蛋白或角蛋白衍生物的质量比。在一些实施方式中，聚合物(例如，m-HA)与角蛋白的比率可以为约9/1至约1/9。在一些实施方式中，组合物包含约2/1的m-HA/角蛋白比率。
在一些实施方式中，小分子毛发生长剂包括UK5099和/或本领域已知的另一种用于治疗脱发、毛发稀疏和或秃顶的试剂，例如米诺地尔或非那雄胺。在一些实施方式中，小分子毛发生长剂包括改变干细胞，例如毛囊干细胞中的糖分解代谢的试剂。在一些实施方式中，试剂包含UK5099或由UK5099组成。
如上所述，在一些实施方式中，小分子毛发生长剂可以以纳米颗粒形式提供，即包埋于纳米颗粒中，例如但不限于聚合物纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒包含可生物降解聚合物，如聚酯或聚酰胺。在一些实施方式中，可生物降解聚合物选自包括但不限于以下的组：HA，聚丙交酯，聚乙交酯，壳聚糖，聚羟基丁酸酯及它们的组合或共聚物。在一些实施方式中，可生物降解聚合物是聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)。
囊泡(例如，外泌体)或其他天然产物的量和/或小分子治疗剂(例如，UK5099)的量可以根据例如由该组合物制备的微针阵列贴剂的大小而变化。例如，对于包含15×15针阵列的微针贴剂，其中每个阵列具有约300μm的基部直径和约600μm的高度，囊泡(例如，外泌体)的添加量可以为约0.01毫克(mg)至约2mg。小分子毛发生长剂(例如，UK5099)的量可以为约0.05微克(μg)至约1毫克(例如，约0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000μg)。当制备更大贴剂时，可以提高这些量。
通过改变聚合物组成、聚合物的交联水平和/或活性剂负载于交联聚合物网络中的水平，可以调节本公开的组合物中活性成分(即，天然产物和小分子毛发生长剂)的释放速率。
在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种包含本文公开的组合物的微针。在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种包括多个这种微针的微针阵列。例如，在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种包括多个微针的微针阵列，微针包含一种或多种交联亲水性聚合物、角蛋白、囊泡如外泌体(例如，源自MSC的外泌体)和小分子毛发生长剂(例如，UK5099)。在一些实施方式中，微针阵列可以包括多个微针，其中所述多个微针中的每个具有约20至约1000微米(例如，约20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或约1000微米)的长度。在一些实施方式中，多个微针中的每个具有约400微米至约1000微米的长度。在一些实施方式中，多个微针中的每个具有至少约500、550、600、650、700、750或800微米的长度。在一些实施方式中，多个微针中的每个具有约600微米的长度。
在一些实施方式中，每个微针可以具有近似圆锥形或金字塔形的形状。在一些实施方式中，每个微针的基部的直径可以为约10至约600微米(例如，约20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或约600微米)。在一些实施方式中，每根微针基部的直径可以为约200至约400微米(例如，200、225、250、275、300、325、350、375或400微米)。在一些实施方式中，每根微针基部的直径可以为约300微米。
在一些实施方式中，微针的尖端可以小于约100微米，小于约75微米，小于约50微米，小于约40微米，小于约30微米或小于约20微米。在一些实施方式中，每根微针的尖端可以为约10微米。
微针阵列可以包括多根微针，其中微针的基部以任何合适的二维图案布置。微针可以排布为规则的阵列(例如，正方形，矩形，圆形，椭圆形或其他形状的图案)，其中各个微针之间的距离保持相同或以重复的方式变化，或呈不规则阵列(例如，其中各个微针之间的距离以无法识别的重复方式变化)。
阵列还可以包括附连至阵列的基部的其他层(即，在阵列与微针尖端相对的侧上)。例如，在一些实施方式中，阵列可以还包括保护性背衬层以保护其他阵列组件免受湿气或其他外部污染物以及机械伤害，如免受刮擦。在一些实施方式中，保护性背衬层包括耐水性或防水性塑料膜。在一些实施方式中，阵列可以包括粘合剂背衬层(例如，使阵列可以附着于另一种材料或受治疗的受试者)或着色层(例如，着色为与人皮肤或毛发颜色匹配的颜色而使阵列可以与包含阵列的贴剂治疗的受试者的皮肤或毛发颜色更好融合)。在一些实施方式中，该阵列可以包括可移除背衬层。
在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种皮肤贴剂，其包括本公开的主题的微针阵列。在一些实施方式中，皮肤贴剂可以包括一层或多层背衬层(例如，以保护微针阵列免受湿气或其他污染物或物理损伤(例如，刮擦))。因此，在一些实施方式中，耐水性或防水性塑料可以附着于阵列的基底层。在一些实施方式中，微针阵列可以包括从阵列向外延伸的层(例如，与阵列的基部共面)，该层包括用于辅助阵列向皮肤附着的皮肤相容性粘合剂。在一些实施方式中，贴剂可以还包括装饰性或着色的背衬层(例如使得贴剂在贴附至用贴剂治疗的受试者的皮肤表面时较不明显)。在一些实施方式中，贴剂包括可移除衬里层(例如使得阵列在微针嵌入皮肤后较不明显)。
在一些实施方式中，本公开的主题提供一种使用本公开的主题的微针阵列和/或皮肤贴剂在对其需要的受试者中治疗脱发和/或促进毛发生长的方法。在一些实施方式中，该方法包括使受试者的一部分皮肤表面(例如，包含一个或多个毛囊的一部分皮肤表面和/或期望毛发生长的部位)与本公开的主题的微针阵列或皮肤贴剂接触。
在一些实施方式中，阵列可以接触该部位以持续递送囊泡(例如，外泌体)和小分子毛发生长剂的组合约15分钟至一天或多天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天)。在一些实施方式中，皮肤贴剂可以每天佩戴15分钟至一个或多个小时(例如，1、2、3、4、5、6、7或8小时)范围内的时间段，直到观察到期望的新毛发生长水平。
在一些实施方式中，尽管应当理解的是本文的方法对于所有哺乳动物都是有效的，但根据本公开的主题治疗的受试者是人类受试者。
更具体地，本文提供了对哺乳动物的治疗，如人类，以及由于濒危而具有重要意义(如西伯利亚虎)、具有经济重要性(由人在农场饲养以供食用或其他用途(例如，羊毛生产)的动物)和/或对人类具有社会重要性(作为宠物或动物园饲养的动物)的那些哺乳动物，例如人类以外的食肉动物(例如，猫和狗)、猪(猪，肉猪和野猪)、反刍动物(如牛，肉牛，绵羊，长颈鹿，鹿，山羊，野牛和骆驼)和马。因此，本文描述的方法的实施方式包括家畜和宠物的治疗。
在一些实施方式中，本公开的主题提供了一种制备微针阵列的方法，微针阵列包括多个微针，微针包含毛发生长剂(例如，外泌体和小分子)的组合。在一些实施方式中，方法包括提供包含一个或多个微针(MN)形微腔的模具。微腔的形状可以是近似圆锥形的。在一些实施方式中，微腔具有约400至约1000微米的深度。在一些实施方式中，模具包括硅树脂。
在一些实施方式中，可以通过“一步”或“两步”法制备MN贴剂。在“一步”法的一些实施方式中，包含非角蛋白亲水性聚合物、可选的角蛋白或其衍生物、囊泡(例如，外泌体，如源自MSC的外泌体)或相关的天然产物，如干细胞或囊泡衍生的蛋白质或核酸、小分子生长剂(例如，包含小分子生长剂的纳米颗粒)、合适的交联剂和可选的用于交联反应的光引发剂的溶液(例如，稀释的水溶液)可以沉积于包括MN形腔的模具中。然后模具可以(例如，在室温下在真空干燥器中在真空下)干燥。如果需要，可以将额外量的溶液添加到模具中和/或可以将模具离心以更完全地填充微腔。在将填充的模具干燥后，可以将阵列从模具中取出，并根据所使用的交联剂，将其暴露于紫外辐射而使阵列发生交联。
在一些实施方式中，在“两步”法中，可以通过将包含非角蛋白亲水性聚合物、可选的角蛋白或其衍生物、囊泡(例如外泌体，例如源自MSC的外泌体)或相关的天然产物，例如干细胞或囊泡衍生的蛋白质或核酸、小分子生长剂(例如，包含小分子生长剂的纳米颗粒，例如，UK5099)、合适的交联剂和可选的光引发剂的第一溶液(例如，稀释的水溶液)滴入包含MN形腔的模具中来制备微针。然后可以将模具(例如，在真空下)维持一段时间以更充分地将溶液沉积和/或冷凝于这些腔中。在一些实施方式中，模具可以进行离心而辅助溶液沉积于微腔中。滴入、维持和/或离心步骤可以按需重复，以更完全填充MN腔。
然后，可以将第二溶液滴于模具上。在一些实施方式中，第二溶液包含可交联的生物相容性聚合物如，但不限于，丙烯酸酯改性的透明质酸(m-HA)，角蛋白，合适的交联剂(例如，N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)(MBA)和光引发剂(例如，Irgacure 2959)。然后，可以将模具(例如，在真空干燥器中)干燥并从模具中取出。可以将UV辐射施加于模具使基底层交联。
在一些实施方式中，如图2A中所示，通过以下方法可以制备包含含有角蛋白水凝胶的微针的MN阵列贴剂，该方法包括：(a)提供包含一个或多个微腔的模具，可选地其中一个或多个微腔中的每个的形状近似圆锥形和/或其中微腔具有约400至约100微米的深度；(b)用包含以下的第一水溶液填充模具一个或多个微腔的至少一部分：(i)角蛋白，(ii)天然产物，如选自囊泡(例如，外泌体)、干细胞和囊泡衍生的分子(例如，外泌体衍生分子)的天然产物；(iii)小分子毛发生长治疗剂，和(iv)半胱氨酸；(c)在微腔中形成角蛋白水凝胶一段时间(例如，将填充的模具置于空气或氧气中一段时间(例如，约30分钟至约3小时，可选地约1小时))以形成角蛋白水凝胶)；(d)将第二水溶液滴于模具上(即，角蛋白水凝胶的顶部)，其中第二水溶液包含亲水性聚合物；(e)将模具干燥另外一段时间；和(f)从模具中取出微阵列。在一些实施方式中，天然产物是外泌体。在一些实施方式中，天然产物是源自MSC的外泌体。在一些实施方式中，小分子脱发治疗剂包埋于可生物降解的聚合物纳米颗粒(例如，PGLA)中。在一些实施方式中，小分子毛发生长治疗剂是UK5099。
在一些实施方式中，第一水溶液包含约5wt％至约12wt％的角蛋白和约0.1wt％的半胱氨酸至约1.0wt％的半胱氨酸。在一些实施方式中，第一水溶液包含约7wt％至约9wt％的角蛋白。在一些实施方式中，第一水溶液包含约8wt％的角蛋白。在一些实施方式中，角蛋白是人发的提取物。在一些实施方式中，第一水溶液包含约0.25wt％至约0.75wt％的半胱氨酸。在一些实施方式中，第一水溶液包含约0.4wt％的半胱氨酸。
在一些实施方式中，步骤(b)和(c)重复一次或多次(例如，以更完全填充微针腔)。在一些实施方式中，在步骤(c)之前将包含角蛋白和半胱氨酸(但没有天然产物(例如，外泌体)或小分子毛发生长治疗剂)的另外的水溶液(即，第三水溶液)添加到微腔中以完全填充微腔。在一些实施方式中，在步骤(c)之前从模具中除去过量的第一水溶液(和/或包含角蛋白和半胱氨酸的过量的其他的/第三水溶液)，以将均匀/水平的水凝胶表面提供于微针基部。在一些实施方式中，第二水溶液包含透明质酸。
实施例
包括以下实施例，以进一步举例说明本公开的主题的各实施方式。然而，根据本公开，本领域普通技术人员应当理解的是，在所公开的具体实施方式中可以作出许多改变，并且在不脱离本公开的主题的精神和范围的情况下仍可以获得相同或相似的结果。
实施例1
负载UK5099的颗粒和微针阵列的制备
负载UK5099的PLGA纳米颗粒的制备：负载UK5099的PLGA纳米颗粒经由乳液/溶剂蒸发法制备。简而言之，将5mg PLGA和0.2mg 2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸(UK5099)，可商购的小分子毛囊干细胞活化剂溶解于0.4mL二氯甲烷(DCM)中，然后加入1mL的3％聚乙烯醇(PVA)溶液。超声处理后，在搅拌下将混合物分散于4mL 0.3％PVA溶液中，并在旋转蒸发仪中除去DCM。通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)分析表征所得的纳米颗粒的形貌和尺寸。通过高效液相色谱(HPLC)对UK5099进行定量分析。
从MSC中分离和纯化鼠类外泌体：MSC源自小鼠骨髓，并在Dulbecco改良Eagle培养基，补充10％的胞外囊泡(EV)耗尽的胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的营养混合物F-12(DMEM-F12；ThermoFisher Scientific,Waltham,Massachusetts,United States ofAmerica)中在37℃下以5％CO2温育。根据先前公开的方案，从MSC中分离出源自MSC的外泌体。参见Rajendran et al.(2017)Scientific Reports,7,15560。为了定量分析，外泌体用1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基-吲哚羰花菁高氯酸盐(Dil)分子探针标记。
源自人MSC的外泌体的制备和表征：使用HyClone AdvanceSTEM间充质干细胞扩增试剂盒(GE Healthcare Life Sciences,Chicago,Illinois,United States of America)培养人骨髓间充质干细胞(MSC)。当MSC生长到70％汇合时，将细胞在补充有10％EV耗尽的胎牛血清的间充质干细胞基础培养基中在37℃下以5％CO2温育两天。根据方案，使用INVITROGENTM总外泌体分离试剂(Life Technologies Corporation,Carlsbad,California,United States of America)从细胞培养基中分离出源自MSC的外泌体。通过透射电子显微镜观察纯化的外泌体。根据制造商的定量分析和荧光成像方案，使用亲脂示踪剂Dil荧光染料(ThermoFisher Scientific,Waltham,Massachusetts,United Statesof America)制备Dil标记的外泌体。
从人发中提取角蛋白：从当地发廊收集未染色的人发，用水充分洗涤，然后通过索氏提取法用丙酮脱脂。角蛋白的化学还原性提取根据先前的工作(参见Yang et al.,Mater.Sci.Eng.C 2018,83,1-8)经过一些修改而进行。简而言之，将脱脂的毛发在80℃下浸入含有8摩尔/升(mol/L)尿素、0.5mol/L Na2S2O5和0.2mol/L十二烷基硫酸钠(SDS)的反应溶液中10小时。然后，将混合物过滤而除去未反应的毛发，并使用纤维素膜(MWCO＝4500Da)将滤液对去离子水透析48h。最后，将透析液冻干成粉末用于进一步使用。再生角蛋白的游离硫羟基和总硫羟基的含量根据文献通过Ellman试验测定。参见Chan and Wasserman,Cereal Chem.1993,70,22-26。
包含非角蛋白聚合物网络/角蛋白微针的微针(MN)贴剂的制备：MN贴剂的制备使用均匀的有机硅模具进行，其中每个针的圆形基部直径为300μm，高度800μm，使用的方法与先前公开的程序类似。参见Zhang et al.,(2017)ACS Nano,11,9223-9230。
对于“两步法”：首先将含有200μg DiD标记的外泌体、3.4μg的负载UK5099的PLGA纳米颗粒、N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)(MBA，1-20％w/w的m-HA)和光引发剂(irgacure2959，1-5％w/w的m-HA)的1mL的m-HA/角蛋白溶液(w/v：1-3％，m-HA/角蛋白质量比＝2/1)沉积于模具表面上，然后在真空下处理6小时。然后，将3mL HA溶液(m/v：4％)加入到制备的微模具储器中，并在真空干燥器中在室温下在真空中使其干燥。
对于“一步”法：将含有100μg-2mg外泌体、2μg-1mg负载UK5099的PLGA纳米颗粒、N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)(MBA，1-20％w/w的m-HA)和光引发剂(irgacure 2959，1-5％w/w的m-HA)的4mL的m-HA/角蛋白溶液(w/v：2-4％，m-HA/角蛋白质量比＝2/1)沉积于模具表面上，并在真空干燥器中在室温下在真空中使其干燥。
完全干燥后，将MN贴剂从有机硅模具上取下。通过扫描电子显微镜(SEM)表征MN的形态。
负载外泌体和/或UK5099的角蛋白水凝胶MN(HMN)贴剂的制备：使用有机硅微模具制作“HMN”贴剂，其中每个针腔圆形基部直径为300μm，高度600μm。这些针腔以15×15的阵列排列，尖端间距为600μm。为了制备HMN贴剂，首先将50μL的8wt％角蛋白溶液(含有0.4wt％半胱氨酸，200μg外泌体和3.4μg负载UK5099的PLGA NP)(约0.17μg UK5099)沉积于针腔中并保持于真空下30分钟。然后，沉积另外50μL的含0.4wt％半胱氨酸的8wt％角蛋白溶液以填充针腔，然后通过塑料刮刀除去过量的角蛋白溶液。将有机硅微模具在空气之下保持1小时以形成角蛋白水凝胶。随后，将1mL透明质酸(HA)溶液(4wt％的H2O溶液，Mw＝3000kDa)加载至微模具上，并使其在室温下干燥。完全干燥后，将HMN贴剂从硅胶模具上取下用于进一步使用。为了制备“PMN”贴剂，在角蛋白溶液中未添加半胱氨酸。
讨论：首先研究了稳定的角蛋白水凝胶结构的制作。使用至少15％角蛋白的角蛋白浓度进行角蛋白的胶凝；然而，由于溶液的高粘度和长胶凝时间(>10小时)，蛋白质浓度增加到高于20％会导致困难的制造过程。据测定，角蛋白中的二硫键的量为约426μmol/g蛋白质。基于这一发现，采用二硫化物重排策略以较低的蛋白质浓度制备了基于角蛋白的水凝胶。
根据该策略，半胱氨酸用作生物相容性试剂以切割角蛋白中的分子内二硫键。该策略由于硫羟基氧化反应代替非费时的物理相互作用，可以在较短的胶凝时间内完成角蛋白胶凝。参见Singh et al.,Thiol-Disulfide Interchange,John Wiley&Sons,Inc.,Chichester,United Kingdom,1993,6433-658。更具体地，根据二硫键重排策略，角蛋白中固有的分子内二硫键首先被还原剂裂解而产生游离硫羟基基团，其可以通过氧化重新交联以形成分子间二硫键。参见图1B。藉此，通过引入约0.4wt％半胱氨酸(半胱氨酸/二硫键摩尔比约1/1)，在小于1小时内形成了具有约8wt％的蛋白质浓度的稳定角蛋白水凝胶。此外，如通过比较角蛋白粉末和本发明的水凝胶的FTIR光谱观察的，该策略保持了天然角蛋白结构，因为其没有额外的化学改性或外部交联剂。
探索了简单的两步法制备可拆卸水凝胶微针贴剂(称为HMN)。简而言之，首先形成基于角蛋白水凝胶的微针，并且随后由基于水溶性透明质酸(HA)的贴剂基底覆盖。参见图2A。将得到的微针以15×15阵列排布于9×9mm贴剂上。从由若丹明B标记的角蛋白和FITC标记的HA制备的代表性HMN贴剂的荧光图像中可以识别出组合结构。SEM图像证实，每个微针都是圆锥形的，其基部直径为300μm，高度为600μm，并具有完整且均匀的形态。参见图2B。为了比较，还进行了不添加半胱氨酸的传统胶凝方法制备微针(称为PMN)。与HMN贴剂相反，在PMN贴剂中，在微针区域观察到HA与角蛋白的相互融合，以及破裂和不均匀的形态。HMN和PMN贴剂之间的结构差异也影响了微针的机械强度。HMN贴剂显示出每针2.9N的破坏力(failure force)，与PMN贴剂显示出的每针1.7N的破坏力相比高得多，确保了用于插入皮肤的足够刚度。
实施例2
体外研究
微针中外泌体和UK5099的载量：微针中负载物的载量定义为整个HMN贴剂中与贴剂基底的负载物装载之差。MN贴剂制备中添加的负载物总量被视为整个MN贴剂中的负载物载量。为了检测贴剂基底中的载量，首先将负载Dil标记的外泌体和负载UK5099的PLGA NP的HMN贴剂插入小鼠皮肤4h，然后去除贴剂基底。然后，将贴剂基底浸入PBS溶液中。通过荧光和HPLC分别分析溶液中的外泌体或UK 5099的量。
体外释放研究：通过将针尖浸入下37℃的PBS溶液中测定Dil标记的外泌体或UK5099从MN、HMN或PMN贴剂的体外释放分布曲线。在预定时间点，收集PBS溶液，并加入相同体积的新鲜PBS溶液。从贴剂释放的Dil标记的外泌体或UK5099的浓度分别通过荧光和HPLC测定。通过将微针中的Dil标记的外泌体或UK5099的负载量设为100％，在每个时间点记录Dil标记的外泌体或UK5099的释放百分比。
MTT试验：将人皮肤成纤细胞用作溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑(MTT)试验的模型细胞。生长至70％汇合后，将细胞在37℃下以5％CO2在样品溶液中温育48小时，包括PBS，空HMN针尖在PBS中的浸透溶液，负载UK5099的HMN在PBS中的浸透溶液，负载外泌体的HMN在PBS中的浸透溶液，和纯UK5099或在HMN中的具有相同剂量的外泌体。通过将其浸入PBS中50小时而获得HMN系统的浸透溶液。
统计分析：数据表示为平均值±s.d.。使用学生t检验和ANOVA(Prism5 GraphPad)进行统计。
讨论：胞外囊泡、外泌体和小分子UK5099用作HFSC激活剂。外泌体从人骨髓MSC的培养基中分离，显示出平均直径约95nm。为了实现持续释放效果，制备了负载UK5099的PLGA纳米颗粒(NP)，显示出平均直径约105nm。从包含Dil标记的外泌体和负载UK5099的PLGA NP的代表性HMN贴剂的荧光图像和数字照片中，可以观察到包封的负载物均匀地分布于微针内部。在微针中，外泌体和UK5099的负载量分别测定为195μg和0.16μg，分别占整个HMN贴剂负载量的97％和93％。图3A显示了HMN贴剂的外泌体体外释放曲线，其中PMN贴剂作为比较。通过HMN贴剂实现了外泌体的持续缓慢释放。在小分子药物的释放曲线中发现了类似的现象。参见图3B。还观察到包埋的Dil标记的外泌体和UK5099从使用m-HA和角蛋白混合物制备的MN贴剂中逐渐释放。这些贴剂的释放曲线与HMN贴剂的释放曲线相似。
为了评价外泌体和负载UK5099的HMN系统的生物相容性，评价了微针在PBS中的浸透溶液对人真皮成纤细胞的细胞毒性。对比研究了源自空微针、负载UK5099的微针、负载囊泡的微针以及纯囊泡和UK5099的浸透溶液。通过比较空HMN和PBS对照之间以及负载UK5099或外泌体的HMN贴剂与相应的纯负载物之间的细胞活力，证明了角蛋白可以促进细胞增殖。参见图4。
实施例3
体内研究
动物研究：C57BL/6J小鼠用于这项工作，并购自Jackson Laboratory(BarHarbor,Maine,United States of America)。为了进行体内治疗研究，在出生后第50天将小鼠剃毛，并在剃毛后的第1天和第5天用负载外泌体和/或UK5099的HMN贴剂处理。在最初的5秒钟中将贴剂用力按压以穿透表皮，并随后再轻轻按压1分钟使贴剂吸收液体。插入皮肤后4小时，将贴剂基底去除。UK5099(溶剂配方：乙醇/水/丙二醇＝5/3/2)的局部给予和外泌体的皮下注射每两天进行一次，其剂量与相应HMN贴剂的剂量相同。未经任何处理的剃毛小鼠作为对照。临床药剂米诺地尔通过局部给予以3％的浓度使用。通过实时观察小鼠中的毛发再生而获得毛发表型转化的时间曲线。对毛囊的休止期、休止期-生长期过渡和生长期的判断根据先前文献中描述的方法进行。参见Oh et al.,J.Investig.Dermatol.2016,136(1),34-44。通过将胶带粘附于发涂层上，然后剥离而评价粘于胶带上的毛发量，进行胶带分析测试的毛发拉力试验。
统计分析：数据表示为平均值±s.d.。使用学生-t检验和ANOVA(Prism5GraphPad)进行统计。星号表示两组之间的显著差异(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
蛋白质印迹：将小鼠皮肤研磨并用蛋白酶和磷酸酶抑制剂分解。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离等量的蛋白质，并随后转移到PROTRANTM硝化纤维素膜(GE HealthcareLife Sciences,Chicago,Illinois,United States of America)上。将膜用3％脱脂奶粉封闭1小时，并在4℃分别用靶向β-链蛋白、PCNA、K15、CD34和ALP的一级抗体培养过夜。小鼠β-肌动蛋白抗体用作对照。所有抗体均购自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,Texas,United States of America)，并在1.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液中以1:500稀释。将膜洗涤3次并与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG二级抗体(1:2000；Seracare Life SciencesInc.，Milford,Massachusetts,United States of America)在室温下培养1小时。
组织学和免疫染色：对于组织病理学，将收获的皮肤固定于10％福尔马林中并石蜡包埋，切片并用苏木精和曙红染色。组织病理学图像在EVOS FL荧光显微镜(ThermoFisher Scientific,Waltham,Massachusetts,United States of America)上获得。为了进行免疫染色，将收获的皮肤包埋于OCT中，冷冻并冷冻切片(15μm)。所有用于染色的切片在4％多聚甲醛中固定10分钟，在PBST(PBS+0.3％Triton)中透化，并再在FBS中封闭10分钟。然后，将切片用靶向CD3的一级抗体(小鼠，1:100；eBiosciences Inc.,Affymetrix,Santa Clara,California,United States of America)和CD68(小鼠，1:100；BioLegend,San Diego,California,United States of America)。培养后，将这些切片用PBST冲洗，并用1:200稀释的若丹明缀合的IgG二级抗体在室温下培养90min，并用DAPI复染5min。使用EVOS FL荧光显微镜(ThermoFisher Scientific,Waltham,Massachusetts,United States of America)对荧光信号进行可视化。
讨论：HMN贴剂可以轻松插入小鼠皮肤。插入后5分钟去除HMN贴剂后，在皮肤上可以观察到微孔阵列，深度约200μm。同时，插入后4小时，贴剂基底可以与微针分离，从而使微针留于皮肤中。参见图1A。按照这种方式，HMN系统可以在治疗期间在皮肤上获得不可见的外观。此外，HMN系统可以在渗透到皮肤中并去除贴剂基底的7-10天内在体内生物降解，这已通过生物荧光成像证实。由于HMN贴剂中的微针的水凝胶结构与PMN贴剂中的水凝胶结构相比，HMN系统的降解持续时间大大延长。
负载外泌体的HMN贴剂处理的小鼠的生物荧光图像证实了外泌体在体内持续缓慢释放的时间超过10天。相比之下，分别通过PMN贴剂和皮下注射给予的外泌体则持续约7天和4天。
通过H&E染色，以及在HMN系统穿透后第5天和第9天通过单核炎性细胞的免疫荧光染色，对处理的皮肤进行组织学评价，并以未处理的小鼠皮肤作为对照。通过H&E染色在处理的皮肤区域发现可忽略的炎症细胞。在处理的皮肤中未检测到淋巴细胞浸润(CD3)并检测到可忽略的巨噬细胞浸润(CD68)，表明HMN系统具有良好的生物相容性。
图5A示出了通过HMN贴剂给予、局部给予或皮下注射给予在7周龄的剃毛的C57BL/6J小鼠模型中的脱发疗法治疗方案。所有三种治疗均使用相同剂量的外泌体或UK5099。形成鲜明对比的是，无论外泌体还是UK5099，通过HMN给予进行的治疗仅通过两轮给予即可在治疗区域内快速开始毛发再生长，而常规的局部药物，包括UK5099和临床使用的米诺地尔，或皮下注射外泌体则会产生较差的治疗效果，甚至由7次治疗也能从毛发覆盖的区域反映出来。参见图5C。未经任何处理或空HMN处理的小鼠中均未发现明显的毛发再生。还证实通过施用多个HMN贴剂可以获得扩大的毛发再生长区域，这证实了HMN系统是用于促进毛发再生长的有效透皮递送装置。此外，联合治疗允许HFSC在短短6天内就进入生长期，这由色素沉积和毛发再生长显示。相比之下，UK5099或外泌体的单药治疗分别在治疗约8天和11天后显示出相同的效果。参见图5B。HMN系统促进毛发再生通过毛囊的组织形态计量学分析进一步证实。与局部或皮下注射给予相比，HMN系统使毛囊明显进入毛发生长期，这通过以较高密度延伸到脂肪层的细长形态揭示。参见See Oh et al.,J.Investig.Dermatol.2016,136(1),34-44；和
Figure BDA0002787042210000291
et al.,J.Investig.Dermatol.,2001,117(1),3-15。在不同的治疗方法中，载有外泌体和UK 5099的HMN系统实现了最有效的毛发周期活化促进作用，这通过对毛发周期的定量分析得以证明。参见图5D。此外，与野生型小鼠相比，通过任何HMN系统处理的小鼠均获得了更高的毛发密度和毛发厚度。参见图5E和5F。脱毛试验表明，与野生型小鼠的毛发相似，由HMN系统再生的毛发不易被胶带剥离。蛋白印迹表明，经HMN系统治疗处理的小鼠在治疗后10天与毛发周期激活相关的蛋白表达，包括β-链蛋白，K15，CD34，ALP和PCNA，都大大增加，这与它们加速进入新的毛发周期一致。
应该理解的是，在不脱离本公开主题的范围的情况下，可以改变本公开主题的各种细节。此外，前面的描述仅出于举例说明的目的，而非出于限制的目的。

Claims (20)

1.一种组合物，包含：
(a)含有角蛋白或其衍生物的亲水性聚合物网络；
(b)选自由囊泡、干细胞和源自囊泡的分子组成的组的天然产物，可选地其中所述囊泡是外泌体，进一步可选地其中所述天然产物包括源自间充质干细胞(MSC)的囊泡；和
(c)小分子毛发生长剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述亲水性聚合物网络包含角蛋白水凝胶。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述角蛋白水凝胶经由分子间二硫键交联。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述角蛋白水凝胶是由包含约5重量％(wt％)至约20wt％的角蛋白和约0.1wt％至约1wt％的半胱氨酸，可选地约8wt％的角蛋白和/或约0.4wt％的半胱氨酸的水溶液制备的水凝胶。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述亲水性聚合物网络包含：
(i)交联的亲水性聚合物，其中所述交联的亲水性聚合物不是角蛋白，可选地其中所述交联的亲水性聚合物选自由以下组成的组：甲基丙烯酸化的透明质酸(m-HA)或另一种葡糖胺聚糖或其共聚物或衍生物；聚乙烯醇(PVA)或其共聚物或衍生物；多糖；聚(氨基酸)，除角蛋白以外的蛋白质；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚(亚烷基二醇)或聚(氧化烯)；聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)，多羟基酸；它们的组合，及它们的共聚物；和(ii)角蛋白或其衍生物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述小分子毛发生长剂包括选自由以下组成的组的一种或多种：2-氰基-3-(1-苯基-1H-吲哚-3-基)-2-丙酸(UK5099)、米诺地尔、非那雄胺、丙戊酸、脱氧可的松、17α,17α-雌二醇、腺苷、全反式视黄酸、氟罗地尔、RU-58841、软木肟酸、(4-甲氧基羰基)苯基酯和酮康唑。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，所述小分子毛发生长剂包封在包含可生物降解的聚合物的纳米颗粒中。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述可生物降解的聚合物是聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约0.01毫克(mg)至约2mg的外泌体，可选地源自MSC的外泌体。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含约0.05微克(μg)至约1mg的所述小分子毛发生长剂。
11.一种微针，包含权利要求1-10中任一项所述组合物。
12.一种微针阵列，包括多个权利要求11所述的微针，可选地其中多个所述微针中的每个具有约400至约1000微米的长度，进一步可选地其中多个所述微针中的每个具有约600微米的长度和/或约300微米的基部直径。
13.一种皮肤贴剂，包括权利要求12所述的微针阵列，可选地其中所述贴剂包括保护性背衬层、可去除背衬层或包含与皮肤相容的粘合剂的背衬层。
14.一种在对其有需要的受试者中治疗脱发和/或促进毛发生长的方法，其中，所述方法包括向所述受试者给予权利要求12所述的微针阵列或权利要求13所述的皮肤贴剂，其中所述给予包括使所述阵列或所述皮肤贴剂与所述受试者的皮肤表面接触，其中所述皮肤表面包含一个或多个毛囊。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述接触包括每天使所述受试者的所述皮肤表面与所述阵列或所述贴剂接触，可选地其中每天接触是每天约1至约24小时。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中，所述受试者是人类。
17.一种制备权利要求12所述的微针阵列的方法，其中所述方法包括：
(a)提供包括一个或多个微腔的模具，可选地其中所述一个或多个微腔中的每个的形状为近似圆锥形和/或其中所述微腔具有约400至约100微米的深度；
(b)用包含以下的第一水溶液填充所述模具的所述一个或多个微腔的至少一部分：(i)角蛋白，(ii)选自由囊泡、干细胞和源自囊泡的分子组成的组的天然产物，可选地其中所述囊泡是外泌体，进一步可选地其中所述天然产物包含源自间充质干细胞(MSC)的外泌体；(iii)小分子毛发生长治疗剂，和(iv)半胱氨酸，可选地其中分子脱发治疗剂包埋于可生物降解的聚合物纳米颗粒中，进一步可选地其中所述小分子毛发生长治疗剂是UK5099；
(c)将所述模具置于空气或氧气下一时间段以形成角蛋白水凝胶；
(d)将第二水溶液滴至所述模具上，其中所述第二水溶液包含亲水性聚合物；
(e)将所述模具干燥另外的时间段；和
(f)从所述模具中取出微阵列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一水溶液包含约5重量％(wt％)至约20wt％的角蛋白和约0.1wt％至约1.0wt％的半胱氨酸。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中，所述第二水溶液包含透明质酸。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的方法，其中步骤(b)和(c)重复一次或多次。
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