KR20180015994A - 인간발모세포 및 지방줄기세포유래 엑소좀을 포함하는 발모유도 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모발재생과 연관되어 있는 인간발모세포 및 지방줄기세포로부터 엑소좀의 추출·혼합 및 탈모방지/발모촉진용 치료제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 세포가 증식하는 과정에서 분비되는 엑소좀으로 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생과 관련된 유전자, 단백질, 성장인자 등을 함유하고 있기 때문에 세포 활성화제나 성장인자 같은 다른 첨가물 없이도 모발재생을 유도할 수 있다. 또한, 항생제나 혈청, 배양액의 유해 인자들이 포함되지 않은 정제된 성분이기 때문에 배양액 치료제의 문제점을 극복할 수 있으며, 세포 유래 지질 전달체이기 때문에 세포 침투 및 유효인자 전달 효율이 매우 뛰어나다. 이에 따라, 본 발명은 발모세포 및 발모관련 세포들의 증식유도 및 모발 재생능 향상을 목적으로 하는 탈모 치료제 및 두피관리/모발재생 보조제 등으로 적용이 가능하다.

Description

인간발모세포 및 지방줄기세포유래 엑소좀을 포함하는 발모유도 조성물{Composition comprising exosomes derived from human adipose stem cell and human dermal papilla cell for promoting hair growth}

본 발명은 인간발모세포 및 지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 혼합 조성물을 이용하여 발모유도 및 탈모 치료제로의 활용에 관한 것이다.

탈모란 모발 주기에서 성장기, 퇴행기, 휴지기를 거쳐 모발이 두피로부터 빠지는 현상으로서, 일반적으로 대략 3-5년 동안 모발의 성장과 탈모가 주기적으로 발생하게 된다. 하지만 여러 요인들에 의해 성장/탈모의 균형이 깨지면서 하루에 탈모된 모발수가 100 여개 이상이 될 경우, "탈모증"이란 질환으로 판단하게 된다. 이러한 탈모증의 요인으로는 유전이거나 남성 호르몬의 변성과 같은 내적인 요인과 일상생활에서의 스트레스 및 두피에 쌓여가는 해로운 물질(과산화지질 등)에 의한 외부적인 요인들로 알려져 있고, 대부분은 남성 호르몬의 변성(테스토스테론에서 디하이드로테스토스테론으로 변성)이다.

일반적인 탈모증 치료방법에는 대표적인 탈모 치료약으로 알려진 프로페시아, 아보다트와 같은 약물 치료법과 타인의 모발을 이식받는 모발 이식법이 있다. 약물 치료에 많이 사용되는 프로페시아나 아보다트 등은 원래 전립선비대증의 치료약물로 알려져 있었으나, 발모 효과 또한 입증되어 시판된 약물로서 효능은 뛰어나지만 남성에게는 발기부전증, 여성에게는 불임 등의 부작용이 보고되고 있다. 이에 비해 모발 이식법은 본인 혹은 타인의 모발을 이식하는 방법이므로 가장 뛰어난 효과를 보이지만 근본적인 원인을 치료하는 것이 아니므로 일시적이고 또한 이식할 때 통증이 유발되는 문제점이 있다.

최근에 이를 개선하기 위해 탈모증에서 가장 근본적인 원인으로 알려진 남성호르몬의 변성을 줄기세포 배양액을 이용해 해결하고자 하는 연구들이 보고되고 있다. 줄기세포 배양액을 이용한 탈모치료법은 모발의 생성주기 중에 성장기(Anagen)에 영향을 주면서 기능이 저하된 휴지기의 발모세포들(진피유두세포, 케라틴세포, 멜라닌세포 등)을 자극함으로서 탈모증을 치료하는 방법이다. 이 때문에 기존의 약물치료에서 수반되는 부작용 및 모발이식에서 발생하는 통증이 없이 근본적인 원인 개선이 가능한 치료방법으로 각광받으며 많은 특허들이 보고되고 있다(미국 등록특허 제 14/218,926호, 미국 등록특허 제 14/384,044호, 국제 출원특허 제 PCT/KR2015/006919호, 국제 출원특허 제 PCT/KR2010/003551호, 국제 출원특허 제 PCT/KR2010/001730호). 하지만 배양액은 세포가 증식하기 위해 단백질, 아미노산, 호르몬 및 성장인자가 포함되어 있지만, 일반적으로 세포배양용 배지, 항생제, 그리고 혈청 등은 연구용으로서 모두가 검증되지 않은 위험성이 있기 때문에 인체에는 사용을 금지하고 있다. 또한 배양액에는 줄기세포가 분비하는 다양한 단백질, 싸이토카인, 성장인자 등이 함유되어 있는 반면, 세포가 성장하면서 분비한 노폐물이나 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 또한 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다.

이에 본 발명자들은 이러한 줄기세포 배양액의 단점을 보완하기 위하여, 세포유래 엑소좀을 추출하여 이를 이용하기 위한 기술이 개발하였고, 구체적으로 인간발모세포 및 지방줄기세포로부터 분비된 엑소좀의 추출 및 발모촉진 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

미국 등록특허 제 14/218,926호 미국 등록특허 제 14/384,044호 국제 출원특허 제 PCT/KR2015/006919호 국제 출원특허 제 PCT/KR2010/003551호 국제 출원특허 제 PCT/KR2010/001730호

본 발명의 목적은 인간발모세포 및 지방줄기세포로부터 발모 유도·촉진 효능을 지닌 엑소좀을 추출하고 이들의 혼합물을 포함하는 탈모 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 인간발모세포 및 지방줄기세포로부터 발모 유도·촉진 효능을 지닌 엑소좀을 추출하고 이들의 혼합물을 포함하는 탈모 치료제 조성물을 제공한다.

상기 치료제 조성물은 인간발모세포와 인간지방줄기세포에서 추출된 엑소좀을 특징으로 한다. 각각의 엑소좀은 발모 효과가 극대화될 수 있도록 일정한 비율로 혼합하여 사용한다. 무혈청, 무항생제 배지에서 추출된 인간발모세포와 줄기세포 엑소좀은 모발 주위의 다양한 발모관련 세포들의 성장촉진 및 모발 재생에 유효한 성장인자를 함유하고 있어 탈모에 의한 손실된 모발재생에 효과적으로 응용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "인간발모세포"란 인간의 모발조직으로부터 유래된 진피유두세포(human dermal papilla cells)를 의미한다. 이로부터 모발 재생시 분비되는 다양한 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다. 성장기(anagen)에서 발모세포에 의해서 모발 재생시 분비되는 다양한 물질로는 fibroblast growth factor 7(FGF7), fibroblast growth factor 10(FGF10), transforming growth factor beta(TGF-β) 등이 있다. 각각은 발모 세포로부터 분비되어 주변에 존재하는 다양한 세포들에게 전달된 다음 새로운 모발 조직이 성장할 수 있도록 유도하는 자극제 역할을 담당하고 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "인간지방줄기세포"란 인간의 지방조직으로부터 유래된 줄기세포(human adipose-derived stem cells)를 의미한다. 이로부터 지방줄기세포에 의한 모발재생에 관련된 다양한 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다. 지방줄기세포에서 모발 재생시 분비되는 대표적인 물질로는 bone morphogenetic protein(BMP)가 있는데, 이는 발모세포가 휴지기(talogen)에서 성장기(anagen)로 전환되도록 유도시키는 역할을 가지고 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "엑소좀(exosome)"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 면역학적으로 중요한 단백질인 주조직적합체와 열충격 단백질을 포함하여 강력한 항종양 면역 반응을 유도하며, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 모발재생에 관련된 다양한 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 이용하여 탈모 치료제의 조성물로 활용할 수 있다.

상기 엑소좀은

1) 인간발모세포는 기능 유지를 위해 3차원 스페로이드로 배양한 다음 무혈청 및 무항생제 배지에서 하루 동안 배양하는 단계;

2) 인간지방줄기세포를 각 배양 배지에 배양한 다음 무혈청 및 무항생제 배지에서 하루 동안 배양하는 단계;

3) 세포 배양 상층액을 회수하는 단계;

4) 회수한 세포 배양 상층액을 원심분리하는 단계; 및

5) 엑소좀을 분리 및 정제하는 단계

상기 엑소좀은 인간발모세포와 인간지방줄기세포의 배양 과정 중 얻은 배양액을 이용한다는 점에서는 종래 기술들과 유사하지만, 배양액을 그대로 사용하지 않고 배양액 내에 존재하는 나노베지클 형태의 엑소좀을 추출 및 정제하여 탈모 치료제로 사용한다는 점에서 차별성이 있다. 이 경우, 엑소좀에 담지된 재생 관련 단백질 및 다양한 성장인자들만을 유효하게 사용할 수 있으므로 항생제 및 혈청을 포함한 배지 성분에 의해 야기되는 문제들을 해결할 수 있다. 또한 인간발모세포와 인간지방줄기세포 유래 엑소좀을 혼합하여 발모 유도·촉진 효과를 극대화 시킬 수 있는 조성물을 제공한다는 점에서 기존 선행기술과 차별성이 있다.

상기 엑소좀은 줄기세포의 유전정보, 단백질, 성장인자가 담지되었을 뿐 아니라 엑소좀 자체가 캐리어 역할까지 할 수 있다. 약 50-150 nm 크기의 지질로 이루어진 엑소좀은 세포 유래 물질이기 때문에 생체적합하며, 세포의 흡수율 또한 매우 좋다.

최종적으로 본 발명에 따른 엑소좀 조성물은 발모 촉진, 탈모 치료제 및 모발관리용 보조제 혹은 첨가물로 이용할 수 있다. 상기 엑소좀에는 발모와 관련된 세포들의 증식, 분화 및 모발재생을 유도하는 단백질과 성장인자들이 함유되어 있기 때문에 탈모된 부위나 기능이 저하된 세포를 활성화하여 모발재생을 촉진시킬 수 있다. 상기 모발재생에 유효한 엑소좀은 주사, 스프레이, 크림, 패치 등의 다양한 형태로 적용이 가능하다.

본 발명에 따른 엑소좀은 발모세포와 줄기세포의 증식 과정에서 분비되는 엑소좀으로 모발의 성장과 관련된 유전자, 단백질, 성장인자 등을 함유하고 있기 때문에 세포 활성화제나 성장인자 같은 다른 첨가물 없이도 모발재생을 유도할 수 있다. 또한, 항생제나 혈청, 배양액의 유해 인자들이 포함되지 않은 정제된 성분이기 때문에 배양액 치료제의 문제점을 극복할 수 있으며, 세포 유래 지질 전달체이기 때문에 세포 침투 및 유효인자 전달 효율이 매우 뛰어나다. 이에 따라, 본 발명에서 제시하는 엑소좀 조성물은 발모관련 세포들의 증식과 분화를 촉진시켜 최종적으로는 모발의 재생을 목적으로 하는 탈모 치료제 및 두피관리/모발재생 보조제(샴푸, 로션 등) 등으로 적용이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인간발모세포로부터 발모촉진 효능을 지닌 엑소좀 추출

인간발모세포유래 엑소좀은 인간발모세포를 배양하는 과정에서 추출하였다.

구체적으로, 인간발모세포(업체: Promocell, Cat#: C-12071)를 발모세포 전용 배양배지(업체: Promocell, Cat#: C-26502)에 골형태형성단백질(BMP)를 첨가하여 배양하였다. 그 다음, 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청, 무항생제, 무페놀레드인 배지(업체: Gibco, Cat#: 31053028)로 교체하여 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포배양 상층액은 일차적으로 2,000 xg, 4 ℃에서 5분간 원심분리하는 단계 및 이차적으로 10,000 xg, 4 ℃에서 30분간 원심분리하는 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거해주었다. 이후, 회수한 상층액을 100,000 xg, 4 ℃에서 70분간 원심분리하는 단계를 총 3차례 반복하여 가라앉은 엑소좀을 분리 및 정제하였다. 상층액을 회수한 이후 다시 일반 배양배지를 인간발모세포에 첨가하여 배양하였고, 이러한 과정은 계대 10까지 반복하였다. 이렇게 계대 10까지 증식시키는 과정에서 추출한 엑소좀을 탈모 치료제 조성물로 이용하였다.

실시예 2: 인간발모세포 3차원 스페로이드로부터 발모촉진 효능을 지닌 엑소좀 추출

인간발모세포는 그 기능을 유지하기 위해 3차원 스페로이드로 배양할 수 있으며 이 과정에서 엑소좀을 추출할 수 있다.

구체적으로, 인간발모세포(업체: Promocell, Cat#: C-12071)를 발모세포 전용 배양배지(업체: Promocell, Cat#: C-26502)에 골형태형성단백질(BMP)를 첨가하여 3차원으로 배양하였다. 3차원 스페로이드형으로 배양하기 위해서 1 x 10⁴ cells 이상의 세포를 3일 동안 "Hanging Drop" 방식을 도입하여 세포들이 서로 뭉치게 하였다. 3차원 스페로이드로 형성된 세포군집들을 새로운 배양디쉬에 모으고 일정한 유속을 주면서 세포를 배양하였다. 그 다음, 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청, 무항생제, 무페놀레드인 배지(업체: Gibco, Cat#: 31053028)로 교체하여 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포배양 상층액은 일차적으로 2,000 xg, 4 ℃에서 5분간 원심분리하는 단계 및 이차적으로 10,000 xg, 4 ℃에서 30분간 원심분리하는 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거해주었다. 이후, 회수한 상층액을 100,000 xg, 4 ℃에서 70분간 원심분리하는 단계를 총 3차례 반복하여 가라앉은 엑소좀을 분리 및 정제하였다. 상층액을 회수한 이후 다시 일반 배양배지를 인간발모세포에 첨가하여 배양하였고, 이러한 과정에서 추출한 엑소좀을 탈모 치료제 조성물로 이용하였다.

실시예 3: 인간지방줄기세포로부터 발모촉진 효능을 지닌 엑소좀 추출

인간지방줄기세포유래 엑소좀은 인간지방줄기세포를 배양하는 과정에서 추출하였다.

구체적으로, 인간지방줄기세포를 일반 배양배지(업체: Gibco, Cat#: 11995065)에서 배양하였다. 그 다음, 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청, 무항생제, 무페놀레드인 배지(업체: Gibco, Cat#: 31053028)로 교체하여 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포배양 상층액은 일차적으로 2,000 xg, 4 ℃에서 5분간 원심분리하는 단계 및 이차적으로 10,000 xg, 4 ℃에서 30분간 원심분리하는 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거해주었다. 이후, 회수한 상층액을 100,000 xg, 4 ℃에서 70분간 원심분리하는 단계를 총 3차례 반복하여 가라앉은 엑소좀을 분리 및 정제하였다. 상층액을 회수한 이후 다시 일반 배양배지를 인간지방줄기세포에 첨가하여 배양하였고, 이러한 과정은 계대 7까지 반복하였다. 이렇게 계대 7까지 증식시키는 과정에서 추출한 엑소좀을 탈모 치료제 조성물로 이용하였다.

실시예 4: 인간발모세포와 인간지방줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 혼합물 제조

상기 실시예 1 내지 실시예 3으로부터 회수한 엑소좀들은 발모촉진 효과를 위해 다음 조합비율에 따라 다양한 엑소좀 혼합물을 제조할 수 있다(표 1).

상기 표1의 혼합 조건에 따라 최소 10가지 이상의 엑소좀 혼합물을 제조할 수 있고, 구체적인 범위는 다음과 같다. 하나의 엑소좀 혼합물에는 0 내지 100% 비율의 발모세포유래 엑소좀과 0 내지 100% 비율의 줄기세포유래 엑소좀으로 구성이 가능하다. 또한 발모세포유래 엑소좀의 경우에는 실시예 1과 실시예 2처럼 2차원 배양을 통한 엑소좀과 3차원 배양을 통한 엑소좀을 단일 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

실시예 5: 엑소좀 혼합물의 발모세포 증식유도 평가

상기 실시예 4로부터 제조된 엑소좀 혼합물은 인간발모세포에 대한 증식유도능 평가를 실시하였고, 이를 통해 추출한 엑소좀이 발모세포의 기능적인 측면에 관여를 하는지 평가하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1 내지 실시예 4에서 추출한 엑소좀을 농도별(1, 5, 10, 20, 50, 70, 100 ug/mL)로 준비하여 50,000 cells/mL의 인간발모세포를 48-well plate에서 3일간 배양하면서 세포 증식률을 평가하였다. 세포 증식률은 WST-1 reagent(업체: Takara, Cat#: Premix WST-1)와 ELISA reader 장비를 통해 측정하였고, WST-1 시약(formazan)이 살아있는 세포와 만나면 세포내 탈수소효소에 의해 시약의 색소가 변환되면서 발색강도가 비례적으로 증가하는 원리를 이용하여 세포증식률을 수치화하였다. 비교군은 인간발모세포용 세포배양배지를 사용하여 비교군에 대비하여 증식한 세포수를 정량하였다.

실시예 6: 추출한 엑소좀의 발모세포 모발재생능 향상 평가

상기 실시예 1 내지 실시예 4에서 추출한 각 엑소좀으로 인간발모세포의 모발재생효능과 관련된 특정 유전자 발현을 촉진시키는지 분석하였고, 이를 통해 추출한 엑소좀이 발모세포의 기능적인 측면에 관여를 하는지 평가하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 추출한 인간발모세포유래 엑소좀을 농도별(1, 5, 10, 20, 50, 70, 100 ug/mL)로 준비하고 3차원 스페로이드형으로 준비된 인간발모세포에 함께 배양하여 모발재생과 관련된 특정 유전자(ALP, α-SMA, NCAM)발현정도를 확인하였다. 유전자 발현정도는 RT-PCR과 immunofluorescent staining을 통해 평가하였다. 상기 실시예 2 내지 실시예 4에서 추출한 각 엑소좀 또한 상기 동일한 방법으로 특정 유전자 발현정도를 확인하였다.

실시예 7: 동물모델을 통한 추출한 엑소좀의 모발재생능 평가

상기 실시예 1 내지 실시예 4에서 추출한 각 엑소좀으로 동물모델에 적용시 실제 모발재생이 촉진되는지 분석하였고, 이를 통해 추출한 엑소좀이 동물모델을 통해 모발재생 측면에 직접적인 영향을 주는지 평가하였다.

구체적으로, 동물모델은 7~9 주령 누드마우스(BALB/cAJcl-nu)를 사용하여 총 8주동안 각 추출한 엑소좀에 의한 모발재생 효과를 확인하였다. 8 주후, 엑소좀에 의한 모발재생 효과를 확인하기 위해, 엑소좀을 처리한 조직을 샘플링하여 hematoxylin and eosin(H&E) staining과 immunofluorescent staining을 통해 재생된 모발을 확인하였다.

Claims (6)

1. 인간발모세포와 인간지방줄기세포에서 추출된 엑소좀 혼합물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 및 발모촉진용 치료제 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 엑소좀은
   1) 인간발모세포는 기능 유지를 위해 3차원 스페로이드로 배양한 다음 무혈청 및 무항생제 배지에서 하루 동안 배양하는 단계;
   2) 인간지방줄기세포를 각 배양 배지에 배양한 다음 무혈청 및 무항생제 배지에서 하루 동안 배양하는 단계;
   3) 회수한 배양 상층액에서 엑소좀을 분리 및 정제하는 단계를 통하여 제조된 엑소좀을 단일 조성물 혹은 2종의 혼합물로 구성된 탈모 방지 및 발모촉진용 치료제 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 인간발모세포에 대한 특화된 배양조건은 2차원 세포배양 조건과 3차원 세포배양 조건을 포함한 인간발모세포유래 엑소좀 생산조건.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 특화된 2차원 세포 배양조건은 1 × 10⁶ cells/mL 이하의 인간발모세포를 세포배양디쉬에서 골형태형성단백질(BMP)을 처리하면서 3일동안 배양하는 조건.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 특화된 3차원 세포 배양조건은 3차원 스페로이드형 세포군집 하나당 1 × 10⁴ cells/mL 이상의 인간발모세포 농도로 구성하여 다수의 3차원 스페로이드형 세포군집에 골형태형성단백질(BMP)을 처리하여 3일동안 배양하는 조건.
   
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 엑소좀 혼합물은 발모세포유래 엑소좀과 지방줄기세포유래 엑소좀으로 구성된 것을 말하며, 구체적으로는 발모세포유래 엑소좀 0 내지 100%, 지방줄기세포유래 엑소좀 0 내지 100% 내의 비율로 혼합하여 제조된 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모촉진용 치료제 조성물.