CN116725939A - 一种可溶性玻尿酸载药微针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可溶性玻尿酸载药微针及其制备方法。所述微针包括针尖部分和圆形基底部分，所述针尖部分采用5‑25w范围内的小分子量玻尿酸为基质制备得到；所述圆形基底部分采用25‑150w范围内的大分子量玻尿酸与5‑25w范围内的小分子量玻尿酸的混合物为基质制备得到；其中，所述大分子量玻尿酸与小分子量玻尿酸的质量比为3:20‑3:100。所述可溶性玻尿酸载药微针负载有促进皮肤愈合与再生的生长因子。通过本方法的微针制备技术，可以充分发挥不同分子量的玻尿酸不同的功能，同时可以将目标生长因子集中分布在微针的微尖部位，可有效提高局部药物浓度，提高治疗效果，节约生产成本，具有精度高、治疗效果好、批次稳定、易制备成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于医疗美容和医药领域，具体涉及一种可溶性玻尿酸载药微针及其制备方法。
背景技术
皮肤是人体最外层的保护屏障，其主要作用就是防止外界刺激物质、紫外线、细菌和水分等有害因素对身体造成伤害。这一屏障保护作用主要由皮肤表层的角质层和皮脂膜两部分所实现的。首先，皮肤表层的角质层是由多层死亡的角质细胞组成，这些细胞通过不断地剥落和更新来形成一个坚实的屏障层。这个屏障层可以有效阻挡外界的刺激物质，而且还能够调节水分的流失，保持皮肤的水润度，避免干燥、粗糙等问题的发生。此外，角质层中含有大量天然保湿因子，能够吸附并保存空气中的水分，保持皮肤的湿润状态。其次，皮脂膜是由皮脂腺分泌的油脂和汗腺分泌的汗液混合而成，它能够形成一层润滑的保护膜，帮助皮肤抵御外界刺激，减少水分的流失。皮脂膜还含有一些天然抗菌物质和酸性物质，可以有效地杀灭细菌、真菌等病原体，防止感染的发生。皮肤在阻止外界刺激的同时也阻碍了针对皮肤的药物渗透进入内部发挥作用的过程，因此需要一种在微创甚至无创情况下将药物送到表皮层以下的药物递送方式。
微针透皮给药系统是一种新型的药物传输技术，通过微细的针头将药物直接输送到皮肤深层，从而实现更有效的治疗效果。微针的高度在几百微米不等。因而这些微针可以穿透皮肤表层的角质层，打破皮肤的屏障，而且不会触及神经和毛细血管，在不引起痛觉和皮下出血的同时将药物更快速、更充分地递送到皮下组织中。相较于传统的透皮给药方式，微针透皮给药有以下几个优势：首先，微针透皮给药可以提高药物的渗透率和吸收率。微针能够穿透皮肤的角质层，大大缩短了药物穿透皮肤的时间，并且可以使药物更均匀地分布在皮下组织中，从而提高药物的吸收效率。其次，部分药物在口服或注射后容易对身体其他部位产生副作用，而微针透皮给药可以直接输送药物到需要治疗的局部皮肤，从而减少了药物在体内产生副作用的风险。第三，微针透皮给药可以提高药物的稳定性。一些药物在外界环境下容易发生分解、失活或者氧化等反应，而在进入体内后也容易被消化系统等代谢分解，而将药物负载于微针并针对特定部位给药可以保护其免受这些因素的影响，从而提高了药物的稳定性。最后，微针透皮给药操作简单、安全、无痛苦。相较于注射和口服，微针透皮给药不需要专业人员操作，且针头极其细，不会对皮肤造成明显的伤害，患者的使用体验更加良好。
玻尿酸(又称透明质酸)是一种天然存在于人体组织尤其是皮肤中的多糖分子，在体内发挥保湿、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。其最大的优点在于其极强的保湿能力，可以在皮肤表面形成一层保护膜，防止水分流失，从而使皮肤更加湿润、柔软和光滑。另外，玻尿酸还具有促进细胞再生和修复的作用，增加皮肤的弹性和紧致度。因此，玻尿酸也被广泛应用于医学美容领域，作为填充物来注入到面部皮肤中，可以有效地改善皱纹、法令纹、唇部轮廓等问题，使人脸部线条更加清晰自然，达到年轻化的效果。总的来说，玻尿酸具有保湿、促进细胞再生和修复、医学美容等多种优点，成为了当今最受欢迎的保湿补水、改善肌肤问题和整形美容材料之一。
生长因子是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长等功能的多效应多肽类物质。其作用机制主要包括促进细胞增殖和分化、促进胶原蛋白和弹性纤维合成、促进血管生成等。此外，生长因子还可以增强皮肤的免疫力和抵抗力，促进伤口愈合和组织修复。虽然生长因子在治疗中具有很大潜力，但其应用仍面临一些挑战，首先是其半衰期短，容易被分解，稳定性差；其次，由于生长因子的分子量较大，难以通过涂抹的给药方式穿透角质层进入皮肤内部发挥作用。因此，需要探寻适宜的给药方式递送生长因子以更好地发挥其在皮肤护理和美容领域的作用。
发明内容
本发明拟解决其他聚合物材料本身或交联剂多次使用后可能会导致的在机体沉积等生物相容性差问题(KhaterAhmedSaeedAL-Japairaia,SyedMahmood,SamahHamedAlmurisi,etal.Currenttrendsinpolymermicroneedlefortransdermaldrugdelivery[J].Internationaljournalofpharmaceutics,2020,587:119673.)，通过使用玻尿酸材料来避免生物体本身的免疫排斥反应。
本发明的目的是提供一种可溶性玻尿酸载药微针及其制备方法，所述微针用于皮下快速给药。
本发明所提供的可溶性玻尿酸载药微针为圆锥形，包括针尖部分和圆形基底部分，其高度为200-900μm，基底部分直径为100-500μm；
所述针尖部分采用5-25w范围内的小分子量玻尿酸为基质制备得到；所述圆形基底部分采用25-150w(具体可为40-100w)范围内的大分子量玻尿酸与5-25w范围内的小分子量玻尿酸的混合物为基质制备得到；其中，所述大分子量玻尿酸与小分子量玻尿酸的质量比可为3:20-3:100(具体可为3:40)；
所述可溶性玻尿酸载药微针负载有促进皮肤愈合与再生的生长因子，包括但不限于bFGF、EGF、VEGF、HGF、PLGF等中的一种或多种因子的组合；
优选地，所述可溶性玻尿酸载药微针的针尖部分负载生长因子，基底部分负载或不负载生长因子。
本发明所提供的可溶性玻尿酸载药微针，通过包括如下步骤的方法制备得到：
1)配制含生长因子的小分子量玻尿酸溶液；
2)将制备好的溶液加入微针贴片模具中，真空负压除泡使溶液完全填充至模具的针尖部分；
3)配制小分子量玻尿酸与大分子量玻尿酸的混合溶液；
4)将配制好的混合溶液加入步骤2)中针尖部分已经填充的微针贴片模具，真空负压除泡使混合溶液填充基底部分；
5)干燥，脱模，得到可溶性玻尿酸载药微针贴片。
上述方法步骤1)中，所述生长因子包括但不限于bFGF、EGF、VEGF、HGF、PLGF等中的一种或多种因子的组合；
所述含生长因子的小分子量玻尿酸溶液中溶质包括生长因子、5-25w范围内的小分子量玻尿酸；溶剂为无菌去离子水、PBS缓冲液或无菌去离子水与PBS缓冲液的混合液，所述混合液中无菌去离子水与PBS缓冲液的体积比为1:1-1:10，具体可为1:5；
所述含生长因子的小分子量玻尿酸溶液中，生长因子的浓度为0-900μg/mL，端点0不可取，具体可为50μg/mL，小分子量玻尿酸的浓度可为0-200mg/mL，端点0不可取，具体可为50mg/mL；
步骤3)中，所述混合溶液中，大分子量玻尿酸与小分子量玻尿酸的质量比可为3:20-3:100(具体可为3:40)；
所述混合溶液中，大分子量玻尿酸的浓度可为0-20mg/mL，具体可为3mg/mL；
所述混合溶液还可含有生长因子，所述混合溶液中的生长因子的浓度为0-600μg/mL，端点0不可取，具体可为40μg/mL；
上述方法步骤5)还可进一步包括在微针基底覆盖带有粘性的材料，所述带有粘性的材料具体可为3M胶。
所得微针贴片长40-150mm，宽10-100mm，单个微针底径为50-1000μm，高度为100-1000μm，针尖间距为100-5000μm，单片微针数约为500-10000针，形状类似月牙。
本发明采用的分子量在5w-150w的玻尿酸是一种生物来源材料，基底采用大分子量玻尿酸可以在皮肤表面起到保湿效果，针尖部分采用小分子量玻尿酸能够溶解渗透到真皮层，通过微针进入真皮层后递送生长因子实现促进细胞增殖和迁移的作用。
本发明利用不同分子量玻尿酸在皮肤组织中具有不同的功能这一特点，优化得到不同大、小分子量玻尿酸的最佳配比，其中小分子量的玻尿酸位于针尖部分，具有更强的渗透性、溶解性，渗入真皮递送负载的生长因子，扩张毛细血管，增强血液循环，促进皮肤营养吸收；大分子量的玻尿酸位于基底部分，在皮肤表面形成保湿透气膜，保持皮肤的光滑湿润。将玻尿酸溶于不同比例的无菌去离子水或无菌PBS缓冲液中制成了不同基质的可溶性玻尿酸微针，通过调整用量制成了不同种类的玻尿酸微针，它可以将一种或多种生长因子封装在微针内，并通过穿刺皮肤后微针快速溶解来实现定点释放，具有良好的生物相容性和可降解性。使用可溶性载药微针可以有效地改善药物靶向性和有效性问题，提高治疗效果和安全性。与传统的局部外用或注射治疗相比，这种方法具有更高的局部药物浓度和更长的持续时间，可以最大限度地发挥药物的作用。通过本微针制备技术，可以将目标生长因子集中分布在微针的微尖部位，可有效提高局部药物浓度，提高治疗效果，节约生产成本，具有精度高、治疗效果好、批次稳定、易制备成本低等优点。
附图说明
图1为本发明的微针用于透皮给药的示意图。
图2为本发明实施例1制作的月牙形水溶玻尿酸微针贴片的具体形态照片。
图3为本发明实施例2制作的微针使用光学显微镜拍摄的微针阵列侧视图。
图4为本发明实施例2制作的微针使用扫描电子显微镜(SEM)拍摄的微针阵列图像。
图5为本发明实施例2制作的微针使用扫描电子显微镜(SEM)拍摄的单个微针图像。
图6为本发明实施例3中三种微针针尖能承受的机械力-位移关系变化曲线。
图7为本发明实施例4中微针贴片的bFGF释放浓度随时间的变化曲线。
图8为本发明实施例5中应用微针后皮肤台盼蓝染色照片。
图9为本发明实施例5中应用微针贴片后形成微孔的小鼠皮肤冷冻切片图像。
图10为本发明实施例6中应用微针贴片后不同时间的小鼠皮肤愈合情况照片。
图11为本发明实施例7中微针贴片应用于小鼠皮肤后不同时间点的针尖溶解的光学显微镜图像(a:10min,b:15min,c:20min)。
图12为本发明实施例8中应用罗丹明B微针后的小鼠皮肤冷冻切片图像。(a:明场图像，b:荧光图像蓝色:DAPI红色:RhB)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、水溶玻尿酸微针的制备。
首先完全清洗模具，用超声波清洗仪清洗3h，中途更换无菌去离子水，完成后将模具进行烘干。准确取50mg分子量为15w-25w玻尿酸和1mL无菌去离子水，两者混合加入烧杯中，磁力搅拌至其完全溶解，离心去除其中的气泡得到50mg/mL小分子水溶玻尿酸溶液。取400μL制备好的溶液加入模具中，真空负压除泡使溶液完全填充模具空腔，每次关闭阀门真空负压增泡约15s后打开排气孔，重复3次后利用移液枪除去较大气泡。重复循环直至溶液完全进入针尖，同时取15mg分子量为40w-100w的玻尿酸和1mL无菌去离子水，按上述溶液制备方式制得15mg/mL大分子水溶玻尿酸溶液，将其按照1:4的体积比(指大分子量水溶玻尿酸溶液的体积为1份，小分子水溶玻尿酸溶液的体积为4份)与小分子量水溶玻尿酸溶液充分混合后取1.2mL加入模具，使溶液充分填充基底，完成后将模具放入恒温干燥箱干燥后脱模，在微针基底覆盖3M胶等带有粘性的材料即可完成微针的制作，所得月牙形微针贴片长46.61mm，宽18.09mm，单个微针底径为280μm，高度为650μm，针尖间距为800μm，单片微针数约为1000针，形状类似月牙。
图1为微针用于透皮给药的示意图。
图2在自然光下展现了所制得的水溶玻尿酸微针贴片的形态。
实施例2、玻尿酸微针的制备
取50mg小分子玻尿酸和15mg大分子玻尿酸，分别溶于1mLPBS缓冲液，磁力搅拌至其完全溶解，离心以除去溶液中的气泡，而后重复实施例1中的后续操作。
图3为所制得的微针贴片光学显微镜侧视图。
图4和图5为所制得的微针贴片SEM图像，可以证明所得微针为圆锥形，高度在650μm，底部直径在280μm。
实施例3、微针机械性能测试
参照实施例1中的制备方法，将50mg分子量为15w-25w玻尿酸用1mLPBS与水体积比5:1的混合溶液溶解，其他操作不变，按照实施例1中的方法制成微针3。使用质地分析仪对实施例1、实施例2制得的微针及微针3所能承受的机械应力进行测试，将微针贴片水平置于平台上，针尖向上，探头以0.1mm/s速度对微针进行垂直压缩，同时记录压缩力。
图6为每根微针所能承受的机械力和位移关系曲线，微针透皮所能承受的机械力应大于0.045N，本发明所得微针在压缩位移达到600μm时应力大于0.38N，表明所得微针能够成功穿透皮肤。
实施例4、微针贴片药物释放能力测试
利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)来进行体外模拟药物释放实验。将1mg bFGF溶于1mL无菌去离子水中，取300μL加入5.7mL无菌去离子水中，充分混合后加入300mg小分子玻尿酸，配制成浓度为50μg/mLbFGF，50mg/mL小分子玻尿酸溶液。再利用磁力搅拌机使其充分溶解后利用移液枪将带药溶液注入模具。在真空负压除泡时注意控制溶液体积防止溢出后定量不准。烘干脱模后即完成物理包埋bFGF微针的制作。微针制备完成后将微针放入30mL无菌去离子水中，放置在150r/min，37℃的恒温摇床下进行释放。释放过程中间于1min，2.5min，5min，7.5min，10min，15min，20min，30min，40min，50min，60min时间点分别取样。将样品分别稀释后使用Elisa试剂盒按照说明书方法检测样品中的bFGF浓度，设置四组对照组。利用酶标仪测量样品吸光度。根据测量数据和标准样曲线得出bFGF释放浓度。
图7为微针贴片以装载bFGF为例体外模拟药物的释放浓度-时间曲线，可以看出该微针具有快速释放能力。
实施例5、皮肤穿刺能力测试
小鼠麻醉后利用脱毛膏除去背部毛发，使用生理盐水将皮肤表面擦拭干净，擦干后将实施例1制备的微针贴片贴附在皮肤上，按压5min后取下，涂抹台盼蓝溶液将皮肤染色5min，使用颈椎脱位处死小鼠，立即将皮肤取下放入4％多聚甲醛固定液中固定30min，取出后放入OCT包埋剂中冷冻过夜，使用冷冻切片机将组织切成7μm厚度的冷冻切片进行观察。
图8为台盼蓝染色后的皮肤照片，蓝点代表微针穿刺位置。
图9为小鼠皮肤冷冻切片的光学显微镜照片，可以看到微针能够成功穿透皮肤表皮层。
实施例6、小鼠皮肤愈合实验
小鼠麻醉后利用脱毛膏除去背部毛发，使用生理盐水将皮肤表面擦拭干净后将实施例1制备的微针贴片贴附在皮肤上，按压3min后取下，观察小鼠背部皮肤微孔愈合速度及后续表现。
根据图10可以看到在在按压结束取下微针后小鼠背部皮肤留下了明显的穿刺痕迹。在之后的20min内穿刺痕迹逐渐减轻，20min后已无肉眼可见痕迹。后续小鼠皮肤表现正常，无不良反应。
实施例7、通过将微针应用于小鼠皮肤在测定其在体内的实际溶解情况
小鼠麻醉后利用脱毛膏除去背部毛发，使用生理盐水将皮肤表面擦拭干净，将实施例1制备的微针贴片紧贴在皮肤上，分别在10min、15min、20min取下，使用光学显微镜观察微针针尖溶解情况。
图11为微针在不同时间点的针尖溶解情况，可以看出在20min时针尖已经完全溶解。
实施例8、皮肤药物释放能力测试
为了评估微针应用于皮肤之后的药物释放及扩散能力，使用罗丹明B配制成1mg/mLRhB，50mg/mL15w-25w小分子水溶玻尿酸溶液，替代实施例1中的50mg/mL小分子水溶玻尿酸溶液，采用实施例1的方法制得的微针贴附在脱毛小鼠背部皮肤并按压20min，而后按照实施例6的方法制备冷冻切片并使用DAPI进行染色，封片后使用荧光显微镜分别观察切片明场及荧光图像。
图12体现了微针经皮释放药物的能力，由明场图像可以看出针尖刺入皮下，而后通过荧光图像可以证明针尖溶解释放药物，并能扩散到周围皮肤。
大分子量的玻尿酸溶液在20mg/ml及以上非常粘稠难以制作，而浓度过低会导致水含量高，在烘干的时候要中途反复添加溶液，使得过程更加复杂，所以选用15mg/ml的浓度同时与小分子量玻尿酸溶液(50mg/mL)的混合，在要保证烘干一次成型和大分子量玻尿酸覆盖的前提下大分子量：小分子量溶液的体积比在1：2-1：10之间。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (8)
1.一种可溶性玻尿酸载药微针，所述可溶性玻尿酸载药微针为圆锥形，包括针尖部分和圆形基底部分，其高度为200-900μm，基底部分直径为100-500μm；
其特征在于：所述针尖部分采用5-25w范围内的小分子量玻尿酸为基质制备得到；
所述圆形基底部分采用25-150w范围内的大分子量玻尿酸与5-25w范围内的小分子量玻尿酸的混合物为基质制备得到；
其中，所述大分子量玻尿酸与小分子量玻尿酸的质量比为3:20-3:100。
2.根据权利要求1所述的可溶性玻尿酸载药微针，其特征在于：所述可溶性玻尿酸载药微针负载有促进皮肤愈合与再生的生长因子，
所述生长因子为bFGF、EGF、VEGF、HGF、PLGF中的一种或多种的组合。
3.根据权利要求2所述的可溶性玻尿酸载药微针，其特征在于：所述可溶性玻尿酸载药微针的针尖部分负载生长因子，基底部分负载或不负载生长因子。
4.制备权利要求1-3中任一项所述的可溶性玻尿酸载药微针的方法，包括如下步骤：
1)配制含生长因子的小分子量玻尿酸溶液；
2)将制备好的溶液加入微针贴片模具中，真空负压除泡使溶液完全填充至模具的针尖部分；
3)配制小分子量玻尿酸与大分子量玻尿酸的混合溶液；
4)将配制好的混合溶液加入步骤2)中针尖部分已经填充的微针贴片模具，真空负压除泡使混合溶液填充基底部分；
5)干燥，脱模，得到可溶性玻尿酸载药微针贴片。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述含生长因子的小分子量玻尿酸溶液中溶质包括生长因子、5-25w范围内的小分子量玻尿酸；
溶剂为无菌去离子水、PBS缓冲液或无菌去离子水与PBS缓冲液的混合液，所述混合液中无菌去离子水与PBS缓冲液的体积比为1:1-1:10。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述含生长因子的小分子量玻尿酸溶液中，生长因子的浓度为0-900μg/mL，小分子量玻尿酸的浓度为0-200mg/mL。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述混合溶液中，大分子量玻尿酸与小分子量玻尿酸的质量比为3:20-3:100；
大分子量玻尿酸的浓度为0-20mg/mL。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述混合溶液还可含有生长因子，所述混合溶液中的生长因子的浓度为0-600μg/mL。
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