CN1730099A - 免疫隔离化细胞药物,其制备方法和其在杀伤肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫隔离化细胞药物，其制备方法和其在杀伤和/或抑制肿瘤中的应用。用于治疗肿瘤的免疫隔离化细胞产品，其组成和用法是：1.可截割免疫活性物质的半透膜——免疫隔离膜包裹活细胞；2.该活细胞可分泌抑制肿瘤生长和/或杀死肿瘤细胞的因子；为两种以上活细胞共包裹；3.将该药物注入肿瘤组织或手术切除后的残余肿瘤组织内，用于杀死肿瘤细胞和/或抑制肿瘤组织的生长。一次性注入后，该细胞药物能在肿瘤组织内长时间地分泌抑瘤和/或杀瘤的因子，发挥治疗肿瘤的作用。

Description

免疫隔离化细胞药物，其制备方法和其在杀伤肿瘤中的应用

发明领域

本发明涉及新颖的免疫隔离化细胞药物，其制备方法和其在杀伤和/或抑制肿瘤中的应用。

背景技术

目前采用三大手段(手术切除、化疗、放疗)治疗恶性肿瘤的治愈率很低。手术只能切除肉眼所辨别的肿瘤组织；放疗或化疗仅能杀灭部分的肿瘤细胞，残存瘤细胞成为肿瘤复发和转移的根源；同时，放疗和化疗存在毒副作用大、全身使用的药物进入肿瘤区甚少及易产生耐药等缺点。恶性肿瘤的治疗仍是一世界性难题。

一些蛋白质因子可抑制肿瘤组织的生长，但临床难以应用。

研究已显示一些蛋白质等因子可杀死肿瘤细胞和/或抑制肿瘤组织生长，如：肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血管抑素(Angiostatin，AST)、内皮抑素(Endostatin，EST)等。

由于肿瘤组织的快速生长是与肿瘤血管的快速生长相关，阻断新血管的生成就可有效地抑制肿瘤的生长和转移。实验证明：在肿瘤局部注射大剂量的TNF，证明能直接杀死多种肿瘤细胞或抑制肿瘤增殖，无严重的毒副作用。将AST、EST等因子注射于肿瘤内部或连续静脉注射，可选择性地抑制肿瘤组织内毛细血管的生长，从而可减少肿瘤细胞的血液及营养物的供应，而对正常血管和细胞无抑制作用，具有明确的抑制动物实体瘤生长的作用，如肝癌、肺癌、脑胶质瘤等。该类因子的抗癌效果具有广谱性、低毒性及不易产生耐药性等优点。这些肿瘤抑制因子(TIF)和裸DNA半衰期短、易在体内降解，必须反复多次地大量的注射入肿瘤局部，临床使用困难，特别是对深部肿瘤。而全身使用TIF的毒副作用很大，如低血压等；同时，全身用药在肿瘤局部的药物浓度很低，治疗效果差；并且全身使用TIF的价格极昂贵。使得TIF难以在临床中应用于治疗肿瘤。

将分泌抑瘤和/或杀瘤因子的细胞植入瘤体内，具有较好的治疗肿瘤效果，但存在免疫反应和过度生长成瘤的难题。

虽然有研究将TNF或EST基因直接导入肿瘤动物体内或瘤细胞中，产生了一定的抑瘤效应。然而，这种基因治疗方法除了存在注射后易于引起炎症和免疫反应的问题，还存在着目的基因表达不稳定、转染效率低、病毒载体具有潜在地危险性等目前难以解决的问题。

国外有研究尝试将单一种类的EST或者AST基因转染入具有高增殖活性的载体细胞内，并将分泌EST或者AST的基因工程细胞植入模型动物的瘤体内，可观察到肿瘤区血管生成减少，产生了一定地抑制肿瘤生长的效果。但这种抑制肿瘤生长的效果并不理想，尚达不到杀死肿瘤细胞及治疗肿瘤的目的。分析其原因可能为：(1)由于异基因的载体细胞植入不可避免地会引起宿主体产生免疫排斥反应，导致载体细胞死亡；(2)高增殖活性的基因载体细胞会在宿主体内过度的生长，存在载体细胞产生新的肿瘤的危险；(3)植入的基因工程细胞仅能分泌单一种类的抑瘤或杀瘤因子，不足以杀死肿瘤细胞。

免疫隔离膜包裹细胞可防止移植免疫排斥反应

近年发展起来的免疫隔离技术是用能截割＞16万道尔顿分子的半透膜包裹细胞，植入宿主体内后，该膜在允许小分子的营养物和分泌物自由扩散的情况下，能截割＞16万道尔顿的免疫活性物质(免疫球蛋白、免疫活性细胞等)，从而发挥防止免疫排斥反应和维持膜内细胞生存的效应。目前的免疫隔离膜可由多种材料构成，并有多种形式，如中空纤维管、大包囊、微囊、灌流小室等。国内、外均有研究已证明采用免疫隔离膜包裹异基因细胞，植入体内后可有效地防止免疫排斥反应的发生，同时可维持囊内细胞的生存和分泌。实验显示出海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙构成的球型半透膜(APA微囊)具有较好的生物相容性，在小、大动物体内可较长时间(约4年)完好存在。在胰岛、肝细胞、甲状旁腺、肾上腺髓质嗜铬细胞和基因重组人生长激素分泌细胞移植治疗疾病模型动物的研究中，已证明具有保护异种移植物免受宿主免疫系统破坏的作用。但是，迄今为止，国内外尚未发现采用APA微囊包裹两种以上抑瘤和/或杀瘤因子分泌细胞植入瘤体内用于治疗肿瘤的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新的用于杀伤和/或抑制肿瘤的免疫隔离化细胞药物，其包括可分泌抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子的活细胞和免疫隔离膜的包裹，尤其是APA微囊化抑瘤和/或杀瘤细胞。

本发明另一目的是提供杀伤和/或抑制肿瘤的方法，其包括将免疫隔离化抑瘤和/或杀瘤因子分泌细胞直接植入肿瘤组织内或手术切除后残余的肿瘤组织内。

本发明进一步目的是提供用于杀伤和/或抑制肿瘤的免疫隔离化细胞药物的制备方法，其步骤如下：

(1)将抑瘤细胞和/或杀瘤细胞与一种浓度为10-20g/L的藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每升悬浮液中含0.01-1×10¹⁰个细胞；

(2)利用喷雾装置将步骤(1)获得的悬浮液以100-1000μm直径的微滴状态分散于一种浓度为80-120mmol/L的氯化钙或乳酸钙溶液中，放置5-20分钟，待沉淀完全后，除去上清液，获得含抑瘤和/或杀瘤细胞的藻酸钙微珠沉淀；

(3)将步骤(2)获得的沉淀物加入到一种浓度为0.1-1.0g/L的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；

(4)将步骤(3)获得的沉淀物加入到一种浓度为1.0-2.0g/L的藻酸钠溶液中，混合均匀，放置3-15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；

(5)将步骤(4)获得的沉淀物加入到一种浓度为10-100mmol/L的柠檬酸钠溶液中，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得APA微囊化抑和/或杀瘤细胞沉淀物；

(6)将步骤(5)获得的沉淀物加入到一种浓度为9g/L的氯化钠溶液清洗，最后将沉淀物转移入细胞培养液中培养并作为治疗肿瘤的APA微囊化抑瘤和/或杀瘤细胞(APA-TIF细胞微囊)药物保存。

本发明另一目的是提供可分泌抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子的活细胞和免疫隔离膜的包裹在制备用于杀伤和/或抑制肿瘤的免疫隔离化细胞药物中用途。

根据本发明，本发明所述抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子分泌细胞至少使用两种。

根据本发明，本发明所述肿瘤包括实体瘤或非实体瘤、良性或恶性肿瘤。

根据本发明，本发明中抑瘤细胞或杀瘤细胞可来自基因工程细胞或哺乳动物如人、猴、牛、羊、猪或鼠的分泌细胞，优选基因工程细胞。

根据本发明，本发明中抑瘤细胞或杀瘤细胞为可分泌抑瘤和/或杀瘤因子的基因工程细胞。

根据本发明，本发明的抑瘤细胞和/或杀瘤细胞是以免疫隔离化形式使用的，优选APA微囊化的抑瘤细胞和/或杀瘤细胞。

根据本发明，本发明的APA微囊(免疫隔离膜)可截割大于15万道尔顿分子、允许小于10万道尔顿分子通过，并符合体内植入要求的强度和生物相容度等性质。

根据本发明的APA-TIF细胞微囊药物，在其步骤(2)中优选是将步骤(1)获得的悬浮液以100-500μm直径的微滴状态分散。

在使用时，只要将本发明APA-TIF细胞微囊注入患者的肿瘤组织内或肿瘤切除后的腔内，即可在24小时内开始产生抑制或杀伤肿瘤细胞的作用，而且一次注射可以维持治疗作用6个月以上。

进一步讲，在本发明中所述的TI F细胞是指在载体细胞中转染了分泌抑制和/或杀伤肿瘤因子基因的工程细胞，它可分泌抑制和/或杀伤肿瘤的因子(包括肿瘤坏死因子、肿瘤血管生长抑制因子等)物质。

TIF细胞的获得可用本领域已知的基因转染方法进行。例如，可以使用腺病毒等将目的基因转染入载体细胞，使其可持续地分泌TIF。将TIF细胞在体外培养系统中培养增殖。

载体细胞可为各种具有增殖活性的细胞，优选人胚胎细胞系。

在本发明的APA-TIF细胞微囊药物的制备中，步骤(1)所获得的悬浮液中每升含有0.01-1×10¹⁰个细胞，也可以根据载体细胞的生长特性来掌握。例如，高增殖活性的载体细胞可降低细胞密度，而低增殖活性的载体细胞可升高细胞密度。余此类推。

在步骤(2)中形成藻酸钙微珠呈密网格状，其中含有许多TIF细胞。步骤(3)的作用是为了在藻酸钙微珠表面形成能截割大分子的半透膜。步骤(4)的作用是为了步骤(3)产物表面形成生物相容的膜，获得含TIF细胞的APA微球。在步骤(5)中，柠檬酸钠的钠离子将藻酸钙微珠中的钙离子置换之后，便使APA微球中芯液化，形成了中芯为稀网格状孔隙的APA微囊，其中含有许多TIF细胞。

对藻酸钙微珠的形成方法没有特殊限定，只要是能将含有TIF细胞的藻酸钠悬浮液以足够微小的液滴分散于钙溶液中既可。该藻酸钠悬浮液微滴的直径通常应在100-1000μm的范围内，优选在180-500μm的范围内。如果微滴直径在1000μm以上，则最后获得的微囊过大，在注射入人或动物的机体时容易引起破裂，因此不好。通常使用的液滴分散方法有针头注射法、喷雾法等，优选是静电微囊发生器之喷雾法。

上面对本发明的技术方案进行了较详细的解释，本领域的技术人员在阅读了上文及下文所附的实施例之后将能很容易地理解本发明。

与本领域的现有同类技术相比，本发明具有如下的积极效果：

通过动物实验证实，使用本发明的APA-TIF细胞微囊可以持续地分泌抑制和/或杀伤肿瘤的因子(TIF)，作用于患者的肿瘤组织细胞。植入的TIF细胞发挥“微型生物泵”的持续、小量分泌效应，在一段较长的时间内，通过其分泌的TIF，达到抑制和/或杀伤肿瘤组织细胞的作用，从而达到治疗肿瘤的目的。

与现有技术相比，本发明具有下列特点：

1、静脉等方法全身使用TIF，肿瘤组织内药物浓度低，治疗效果差；同时，药物对全身的毒副作用大。而本发明将TIF细胞植入肿瘤组织内，其分泌的肿瘤抑制和/或杀伤因子主要浓集并作用于肿瘤组织局部，治疗效果好、对全身的毒副作用小；

2、直接使用TIF蛋白因子，必须反复多次地长时间地注射于肿瘤组织内，才能达到治疗肿瘤的目的。本发明采用分泌肿瘤抑制和/或杀伤因子的基因工程细胞系(TIF细胞)植入肿瘤组织，通过其持续分泌TIF的微型生物泵作用，发挥抑制肿瘤组织生长的效应。它可解决临床难以实施向肿瘤组织内反复注射TIF蛋白因子的问题；

3、本发明采用同时植入多种分泌肿瘤抑制和/或杀伤因子的基因工程细胞的方法，所分泌的多种TIF，可通过杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤血管组织生长等多种机制，更好地发挥治疗肿瘤的作用；

4、本发明以APA微囊包裹TIF细胞，一方面可防止免疫反应发生，另一方面可限制高增殖活性载体细胞的过度生长。大量实验已证实，本发明的APA微囊具有很好的免疫保护作用；

5、按本发明制作的APA微囊体积小(直径100-500um)，因而至少具有4个优点，即(1)利于营养物和代谢物的扩散，使囊内细胞易于较长期的存活；(2)微囊的机械强度高；(3)仅需以简单的注射方法即可将微囊注入肿瘤组织内，不需特殊的手术操作植入；(4)微囊对肿瘤周围组织的损伤压迫作用小；

6、按本发明制作的APA微囊强度高、囊球形度高、表面光洁度高，因而其组织相容性好，更适合于体内植入的要求，不易在宿主体内破裂，不易被宿主的炎性细胞包裹而堵塞微囊膜孔；

7、与其它材料的免疫隔离膜相比，APA微囊具有良好的生物相容性；

8、APA-TIF细胞微囊在宿主肿瘤组织内可持续地(6个月以上)分泌肿瘤抑制和/或杀伤因子，产生持续的抑制和/或杀伤肿瘤组织细胞的治疗作用。为解决肿瘤复发等难题提供新的方法；

9、与采用人体自然杀伤细胞或因子相比，TIF基因工程细胞可大批量获得；

10、可采用低温技术保存APA-TIF细胞微囊，便于长距离运输和批量供应。

具体实施方式

下面举出实施例和实验例来进一步解释本发明，但本发明不受这些具体例的限定。

实施例1：rEST/293基因工程细胞系的建立

1、将人血管内皮抑素(rEST)表达载体转染入人胚胎肾293细胞，以获得稳定分泌人血管内皮抑素的工程细胞(rEST/293)

2、用台盘兰染色法检测rEST/293细胞的存活率；

3、用RT-PCR扩增法从mRNA水平检测转染细胞内皮抑素的表达；

4、从蛋白水平检测转染细胞内皮抑素的表达：用SDS-PAGD检测rEST的特异性；用Western Blot法证实rEST/293细胞表达分泌型蛋白中含有重组rEST，并具有抗原活性；

5、用ELISA法检测细胞分泌的rEST量。

6、转染细胞表达产物内皮抑素的体外生物学活性鉴定：通过血管内皮细胞抑制实验、鸡胚绒毛膜尿囊膜实验，证实rEST/293细胞可抑制血管内皮细胞再生。

实施例2：TNF/293基因工程细胞系的建立

1、将肿瘤坏死因子α(TNFα)表达载体转染入人胚胎肾293细胞，以获得稳定分泌人血管内皮抑素的工程细胞(TNFα/293)；

2、用台盘兰染色法检测TNFα/293细胞的存活率；

3、用RT-PCR扩增法从mRNA水平检测转染细胞TNFα的表达；

4、用Western Blot法从蛋白水平检测转染细胞TNFα的表达；

5、用ELISA法检测细胞分泌的TNFα量。

6、用MTT比色法测定TNFα对肿瘤细胞的杀伤活性。

应予说明，实施例1、2的方法属于常规技术，它对本发明不起任何限定作用。

实施例3：APA-TIF细胞微囊药物的制备

1、使用按实施例1、2的方法获得的TIF细胞(rEST/293细胞、TNFα/293细胞混合物)沉淀物，用生理盐水洗涤。

2、向其中加入1ml浓度为15g/L的海藻酸钠溶液，其制成悬浮液。

3、用静电微囊发生器(electrostatic droplet generator)将悬浮液喷入到100ml浓度为100mmol/L的氯化钙溶液中，获得一种直径在100-500μm范围内的含细胞的藻酸钙珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。

4、将海藻酸钙珠加入到50ml浓度为0.5g/L的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液。

5、将步骤4获得的沉淀物加入到60ml浓度为1.5g/L的藻酸钠溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液。

6、将步骤5获得的沉淀物加入到60ml浓度为55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得APA-TIF细胞微囊沉淀物。

7、用浓度为9g/L的氯化钠溶液洗涤沉淀物，然后将此沉淀物转移入DMEM培养液中培养，作为注射用APA-TIF细胞微囊药物待用。

实验例1：APA-TIF细胞微囊对C6脑胶质瘤大鼠的治疗作用

实验材料与方法：

1、在裸鼠上建立C6脑胶质瘤鼠模型；

2、将APA-rEST-TNFα/293细胞微囊植入C6脑胶质瘤模型鼠的瘤体内；

3、21天后将小鼠处死，行组织病理学检查。与对照组C6脑胶质瘤模型鼠比较，APA-rEST-TNFα/293细胞微囊植入组C6脑胶质瘤体内新生血管数量明显减少、死亡细胞数量明显增多。

组别                             血管分数                凋亡指数(％)

APA-rEST-TNFα/293细胞微囊组     6.33±5.20*             11.2±0.5*

空囊对照组                       38.21±5.91             3.8±2.5

实验例2：APA-TIF细胞微囊对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用

鸡胚尿囊膜血管生成实验显示：APA-rEST-TNFα/293微囊培养上清液可明显减少新生血管的数量，其血管抑制率(78％)明显高于空微囊组、APA-rEST/293微囊组(66％)及APA-TNFα/293微囊组(9％)。

实验例的结果表明：与对照组C6脑胶质瘤模型大鼠相比，APA-rEST-TNFα/293微囊植入C6脑胶质瘤鼠的瘤体内(APA-TIF细胞微囊组)，可使肿瘤体积减小、瘤内微血管密度降低、死亡细胞数量明显增多、荷瘤鼠存活率增高、生存时间延长(P＜0.01)。并且，APA-rEST-TNFα/293微囊的作用强于单一的APA-rEST/293微囊或APA-TNFα/293微囊。

Claims (14)

1.用于杀伤和/或抑制肿瘤的免疫隔离化细胞药物，其包括可分泌抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子的活细胞和免疫隔离膜的包裹。

2.根据权利要求1所述药物，该可分泌抑制肿瘤生长因子或肿瘤杀伤因子的活细胞和免疫隔离膜的包裹为APA微囊化抑瘤和/或杀瘤细胞。

3.根据权利要求2所述药物，该APA微囊包裹至少两种可分泌抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子的活细胞。

4.权利要求1所述药物的制备方法，其步骤如下：

(1)将抑瘤细胞和/或杀瘤细胞与一种浓度为10-20g/L的藻酸钠溶液混合，制成悬浮液。

(2)利用喷雾装置将步骤(1)获得的悬浮液以100-1000μm直径的微滴状态分散于一种浓度为80-120mmol/L的氯化钙或乳酸钙溶液中，放置5-20分钟，待沉淀完全后，除去上清液，获得含抑瘤和/或杀瘤细胞的藻酸钙微珠沉淀。

(3)将步骤(2)获得的沉淀物加入到一种浓度为0.1-1.0g/L的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物。

(4)将步骤(3)获得的沉淀物加入到一种浓度为1.0-2.0g/L的藻酸钠溶液中，混合均匀，放置3-15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物。

(5)将步骤(4)获得的沉淀物加入到一种浓度为10-100mmol/L的柠檬酸钠溶液中，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得APA微囊化抑瘤和/或杀瘤细胞沉淀物。

(6)将步骤(5)获得的沉淀物加入到一种浓度为9g/L的氯化钠溶液清洗，最后将沉淀物转移入细胞培养液中培养并作为治疗肿瘤的APA微囊化抑瘤和/或杀瘤细胞药物保存。

5.根据权利要求4的方法，其中步骤(1)中至少使用两种可分泌抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子的活细胞。

6.可分泌抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子的活细胞和免疫隔离膜的包裹在制备用于治疗和/或抑制肿瘤的免疫隔离化药物中用途。

7.根据权利要求6的用途，其中抑瘤细胞和/或肿瘤杀伤细胞至少使用两种可分泌抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子的活细胞。

8.根据权利要求6的用途，所述肿瘤包括实体瘤或非实体瘤、良性或恶性肿瘤。

9.根据权利要求6的用途，其中抑瘤细胞和/或肿瘤杀伤细胞来自基因工程细胞或哺乳动物。

10.根据权利要求9的用途，其中基因工程细胞为分泌抑瘤和/或杀瘤因子的基因工程细胞。

11、根据权利要求9的用途，所述哺乳动物为人、猴、牛、羊、猪或鼠。

12.根据权利要求6的用途，其中抑瘤和/或杀瘤细胞是APA微囊化的抑瘤和/或杀瘤细胞。

13.根据权利要求12的用途，其中APA微囊可截割大于15万道尔顿分子、允许小于10万道尔顿分子通过，并符合体内植入要求的强度和生物相容度。

14.根据权利要求6的用途，其中抑瘤和/或杀瘤细胞是以免疫隔离化形式使用的。