CN102429890B - 包含细胞的药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了包含细胞的药物组合物及其应用。本发明所述药物组合物，包括微囊和任选的药学可接受的载体，所述微囊包括：(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质；和(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔离膜，其中所述隔离膜是半透膜。本发明还提供了一种微囊，制备所述药物组合物的方法，以及所述药物组合物或微囊在制备用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的医药中的用途。本发明的药物组合物或微囊具有如本发明所述特征。
Description
发明领域
本发明涉及新颖的免疫隔离化细胞的药物组合物，其制备方法及其在肿瘤疾病中的应用。
背景技术
目前采用三大手段(手术切除、化疗、放疗)治疗恶性肿瘤的治愈率很低。手术只能切除肉眼所辨别的肿瘤组织；放疗或化疗仅能杀灭部分的肿瘤细胞，残存瘤细胞成为肿瘤复发和转移的根源；同时，放疗和化疗存在毒副作用大、全身使用的药物进入肿瘤区甚少及易产生耐药等缺点。恶性肿瘤的治疗仍是一世界性难题。
一些蛋白质因子可抑制肿瘤组织的生长，但临床难以应用。研究已显示一些蛋白质等因子可杀死肿瘤细胞和/或抑制肿瘤组织生长，如：肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、血管抑素(Angiostatin，AST)、内皮抑素(Endostatin，EST)等。
由于肿瘤组织的快速生长是与肿瘤血管的快速生长相关，阻断新血管的生成就可有效地抑制肿瘤的生长和转移。实验证明：在肿瘤局部注射大剂量的TNF，证明能直接杀死多种肿瘤细胞或抑制肿瘤增殖，无严重的毒副作用。将AST、EST等因子注射于肿瘤内部或连续静脉注射，可选择性地抑制肿瘤组织内毛细血管的生长，从而可减少肿瘤细胞的血液及营养物的供应，而对正常血管和细胞无抑制作用，具有明确的抑制动物实体瘤生长的作用，如肝癌、肺癌、脑胶质瘤等。该类因子的抗癌效果具有广谱性、低毒性及不易产生耐药性等优点。这些肿瘤抑制因子(TIF)和裸DNA半衰期短、易在体内降解，必须反复多次地大量的注射入肿瘤局部，临床使用困难，特别是对深部肿瘤。而全身使用TIF的毒副作用很大，如低血压等。同时，全身用药后活性成分在肿瘤局部的药物浓度很低，治疗效果差；并且全身使用TIF的价格极昂贵。以上因素使得TIF难以在临床中应用于治疗肿瘤。
将具有分泌抑瘤和/或杀瘤因子功能的细胞植入瘤体内，具有较好的治疗肿瘤效果，但这种治疗方式存在免疫反应和过度生长成瘤的难题。
虽然有研究将TNF或EST基因直接导入肿瘤动物体内或瘤细胞中，产生了一定的抑瘤效应。然而，这种基因治疗方法除了存在注射后易于引起炎症和免疫反应的问题，还存在着目的基因表达不稳定、转染效率低、病毒载体具有潜在地危险性等目前难以解决的问题。
国外有研究尝试将单一种类的EST或者AST基因转染入具有高增殖活性的载体细胞内，并将分泌EST或者AST的基因工程细胞植入模型动物的瘤体内，可观察到肿瘤区血管生成减少，产生了一定的抑制肿瘤生长的效果。但这种抑制肿瘤生长的效果并不理想，尚达不到杀死肿瘤细胞及治疗肿瘤的目的。分析其原因可能为：(1)由于异基因的载体细胞植入不可避免地会引起宿主体产生免疫排斥反应，导致载体细胞死亡；(2)高增殖活性的基因载体细胞会在宿主体内过度的生长，存在载体细胞产生新的肿瘤的危险；(3)植入的基因工程细胞仅能分泌单一种类的抑瘤或杀瘤因子，不足以杀死肿瘤细胞。
已经知晓，免疫隔离膜包裹细胞可防止移植免疫排斥反应。近年发展起来的免疫隔离技术是用能截割大于16万道尔顿分子的半透膜包裹细胞，植入宿主体内后，该膜在允许小分子的营养物和分泌物自由扩散的情况下，能截割大于16万道尔顿的免疫活性物质(免疫球蛋白、免疫活性细胞等)，从而发挥防止免疫排斥反应和维持膜内细胞生存的效应。目前的免疫隔离膜可由多种材料构成，并有多种形式，如中空纤维管、大包囊、微囊、灌流小室等。国内、外均已有研究证明采用免疫隔离膜包裹异基因细胞，植入体内后可有效地防止免疫排斥反应的发生，同时可维持囊内细胞的生存和分泌。实验显示出海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙构成的球型半透膜(APA微囊)具有较好的生物相容性，在小、大动物体内可较长时间(约4年)完好存在。在胰岛、肝细胞、甲状旁腺、肾上腺髓质嗜铬细胞和基因重组人生长激素分泌细胞移植治疗疾病模型动物的研究中，已证明具有保护异种移植物免受宿主免疫系统破坏的作用。
CN1408437A公开了治疗恶性肿瘤疼痛的微囊肾上腺髓质细胞由ACA微囊或APA微囊包埋人或动物的肾上腺髓质细胞形成，微囊截留分子量为68-97.4KD。治疗恶性肿瘤的微囊肾上腺髓质细胞的制备方法包括分离、培养、微囊化、冻存和复温5个步骤，即首先从人或动物的肾上腺体中分离出肾上腺髓质细胞并在培养液中短期培养，然后利用ACA或APA微囊肾上腺髓质细胞并利用液氮冻存，移植前在37℃温度下复温。本发明中治疗恶性肿瘤疼痛的微囊肾上腺髓质细胞存活率高并保有儿茶酚胺分泌功能，移植到人的珠网膜下腔时有明显的镇痛作用并可产生免疫隔离效果，故特别适用于临床治疗恶性肿瘤疼痛。
CN1954887A公开了一种体外抗癌药物筛选模型的制备方法，其特征在于：以海藻酸钠、聚赖氨酸为材料，制备APA微囊化肿瘤细胞;经过培养，微囊内细胞聚集成球并逐渐增大，形成类似于体内的三维生长方式，即为体外抗癌药物筛选模型。
CN1962855A公开了一种构建干细胞体外增殖分化微环境的方法，以海藻酸钠、聚赖氨酸为材料，制备APA微囊化ES细胞；将微囊化ES细胞加入到ES生长培养基中，置37℃，空气中含体积5%CO2的培养箱内培养，每2-3天定期更换培养基，即为干细胞体外增殖分化的微环境。本发明操作简单，既能实现ES细胞体外的高密度培养和规模化扩增，同时又能抑制或者延缓ES细胞走向分化，即最大限度的维持ES细胞未分化潜能的技术方法。本发明不但能实现干细胞在体外的规模化扩增，还可为干细胞与其它转基因细胞的共培养研究提供理想的试验模型，在基础发育生物学和下游的临床应用研究中发挥重要作用。
CN1962856A公开了实现干细胞定向增殖分化的方法，以海藻酸钠、聚赖氨酸为材料，制备APA微囊化小鼠胚胎干细胞；将微囊化小鼠胚胎干细胞定向植入生物体内不同解剖学部位，即可实现干细胞的定向增殖分化。本发明建立了一种操作简单，并可广泛应用于干细胞体内定位移植、回收及体内定向诱导分化研究的新技术。其通过体外制备APA微囊化小鼠ES细胞后再行腹腔内移植、回收，并进一步检测回收细胞的分化状态来实现的；该方法既结合了APA微胶囊免疫隔离的生物学特性及易于定向植入、回收的优势，同时又能够详实考察体内微环境(或组织环境)对干细胞增殖及分化的影响。
CN1730099A公开了免疫隔离化细胞药物，其制备方法和其在杀伤和/或抑制肿瘤中的应用。用于治疗肿瘤的免疫隔离化细胞产品，其组成和用法是：1.可截割免疫活性物质的半透膜--免疫隔离膜包裹活细胞;2.该活细胞可分泌抑制肿瘤生长和/或杀死肿瘤细胞的因子;为两种以上活细胞共包裹;3.将该药物注入肿瘤组织或手术切除后的残余肿瘤组织内，用于杀死肿瘤细胞和/或抑制肿瘤组织的生长。一次性注入后，该细胞药物能在肿瘤组织内长时间地分泌抑瘤和/或杀瘤的因子，发挥治疗肿瘤的作用。
尽管如此，本领域仍然需要有能够克服至少现有技术中存在的问题的免疫隔离化细胞药物，例如具有至少如下一种期待的性能：隔离免疫原性、防止植入细胞过度生长、较高的细胞包裹率、优良的细胞存活性能等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫隔离化细胞的药物组合物，其具有至少如下一种期待的性能：隔离免疫原性、防止植入细胞过度生长、较高的细胞包裹率、优良的细胞存活性能等。本发明人发现，采用本发明方法获得的免疫隔离化细胞的药物组合物，不但可以具有至少一种上述期待的性能，而且具有令人期待的治疗效果。本发明基于此发现而得以完成。
发明概述：
本发明第一方面提供一种药物组合物，其包括微囊和任选的药学可接受的载体，所述微囊包括：(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质；和(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔离膜，其中所述隔离膜是半透膜。
本发明第二方面提供一种微囊，其包括：(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质；和(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔离膜，其中所述隔离膜是半透膜。
本发明第三方面提供制备本发明第一方面所述药物组合物的方法
本发明第四方面提供本发明第一方面所述药物组合物或者第二方面所述微囊在制备用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的医药中的用途。
发明详述：
本发明第一方面提供一种药物组合物，其包括微囊和任选的药学可接受的载体，所述微囊包括：
(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质；和
(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔离膜，
其中所述隔离膜是半透膜。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述隔离膜是容许分子量小于15万道尔顿的物质通过但不容许分子量大于15万道尔顿的物质通过的半透膜。在一个实施方案中，所述隔离膜是容许分子量小于12万道尔顿的物质通过但不容许分子量大于16万道尔顿的物质通过的半透膜。在一个实施方案中，所述隔离膜是容许分子量小于10万道尔顿的物质通过但不容许分子量大于16万道尔顿的物质通过的半透膜。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述囊芯分布有网状孔隙。在一个实施方案中，其中所述囊芯分布有稀网状孔隙。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述囊芯分布有网状孔隙，所述网状孔隙的骨架是由包括海藻酸钙的成分组成。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述微囊核芯分布有网状孔隙，孔隙中充填可供所述活细胞存活的液体介质。在一个实施方案中，所述微囊核芯分布有网状孔隙，孔隙中充填可供所述活细胞存活的液体介质，并且所述活细胞存在于所述液体介质中。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述囊芯由海绵状结构构成，该海绵状结构的骨架是由包括海藻酸钙的成分组成，所述活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质存在于该海绵状结构的孔隙中。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述隔离膜包含海藻酸钙和聚赖氨酸。根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述隔离膜是由包括海藻酸钙和聚赖氨酸的成分组成。在一个实施方案中，所述隔离膜是由聚赖氨酸裹覆在所述微囊核芯周围，然后再在由此形成的微囊外周裹覆海藻酸钙而形成的。在一个实施方案中，所述隔离膜是一层以海藻酸钙为基础成分的膜，其中镶嵌有聚赖氨酸。在一个实施方案中，所述隔离膜是由可溶性海藻酸钠与可溶性钙盐(例如氯化钙、乳酸钙)反应后，形成的微粒用聚赖氨酸处理，再用可溶性海藻酸盐(例如海藻酸钠)处理而形成的。由于囊芯呈骨架网格状，其中充满液体介质，活细胞存活于该液体介质中；而在该囊芯外周裹覆所述隔离膜后，由于该隔离膜中镶嵌有聚赖氨酸，即为容许小分子通过而不能容许大分子通过的半透膜，使得微囊外的小分子营养物质可以进入微囊中而为活细胞提供存活的养料，细胞分泌的活性因子和其它排泄物亦可通过半透膜排出；但是细胞以及分泌的具有免疫性的物质不能排出，由此可避免发生免疫反应。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述活细胞是具有增殖活性的细胞。根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述活细胞是来自基因工程的细胞，或者是来自哺乳动物如人、猴、牛、羊、猪或鼠的分泌细胞，优选基因工程细胞。在一个实施方案中，所述活细胞是人胚胎肾293细胞。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述活细胞是能够分泌肿瘤抑制因子(TIF)的细胞(在本文中可简称为TIF细胞)。在一个实施方案中，所述TIF细胞是指在载体细胞中转染了分泌抑制和/或杀伤肿瘤因子基因的工程细胞，它可分泌抑制和/或杀伤肿瘤的因子(包括肿瘤坏死因子、肿瘤血管生长抑制因子等)物质。TIF细胞的获得可用本领域已知的基因转染方法进行。例如，可以使用腺病毒等将目的基因转染入载体细胞，使其可持续地分泌TIF。将TIF细胞在体外培养系统中培养增殖。所述的载体细胞可以是来自哺乳动物如人、猴、牛、羊、猪或鼠的细胞，优选基因工程细胞。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述活细胞是能够分泌活性因子的细胞，所述活性因子选自：肿瘤坏死因子(TNF)、血管抑素(AST)、内皮抑素(EST)、白介素、P53等肿瘤抑制因子，以及它们的亚型。在一个实施方案中，所述活细胞是能够分泌肿瘤坏死因子(TNF)的细胞。在一个实施方案中，所述活细胞是能够分泌TNFα的细胞。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述活性因子选自：肿瘤坏死因子(TNF)、血管抑素(AST)、内皮抑素(EST)、白介素、P53等肿瘤抑制因子，以及它们的亚型。在一个实施方案中，所述活性因子是肿瘤坏死因子(TNF)。在一个实施方案中，所述活性因子是TNFα。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述活性因子是能够抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤组织生长、和/或杀灭肿瘤细胞的任何肿瘤抑制因子(TIF)。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述微囊具有200-450μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-400μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-375μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有275-375μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-350μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-325μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-300μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有225-300μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有225-325μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有225-350μm的平均粒径。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述微囊具有200-450μm的中值粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-400μm的中值粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-375μm的中值粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有275-375μm的中值粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-350μm的中值粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-325μm的中值粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-300μm的中值粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有225-300μm的中值粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有225-325μm的中值粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有225-350μm的中值粒径。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述海藻酸钠具有1万-25万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有1.5万-20万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有2万-15万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有2万-10万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有2万-7.5万道尔顿的分子量。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述海藻酸钙具有1万-25万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钙具有1.5万-20万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钙具有2万-15万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钙具有2万-10万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钙具有2万-7.5万道尔顿的分子量。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中在20°C下以1%水溶液测定，所述海藻酸钠具有1-1000mpa·s的粘度。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有2-750mpa·s的粘度。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有5-500mpa·s的粘度。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有5-250mpa·s的粘度。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有5-200mpa·s的粘度。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有5-100mpa·s的粘度。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述海藻酸钙和聚赖氨酸的摩尔比为(0.001-1000)：1。在一个实施方案中，所述海藻酸钙和聚赖氨酸的摩尔比为(0.01-1000)：1。在一个实施方案中，所述海藻酸钙和聚赖氨酸的摩尔比为(0.1-1000)：1。在一个实施方案中，所述海藻酸钙和聚赖氨酸的摩尔比为(0.1-500)：1。在一个实施方案中，所述海藻酸钙和聚赖氨酸的摩尔比为(0.2-100)：1。在一个实施方案中，所述海藻酸钙和聚赖氨酸的摩尔比为(1-100)：1。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中每个微囊粒子中包含100-100000个细胞。在一个实施方案中，所述每个微囊粒子中包含200-10000个细胞。在一个实施方案中，所述每个微囊粒子中包含250-10000个细胞。在一个实施方案中，所述每个微囊粒子中包含250-7500个细胞。在一个实施方案中，所述每个微囊粒子中包含250-5000个细胞。在一个实施方案中，所述每个微囊粒子中包含250-1000个细胞。在一个实施方案中，所述每个微囊粒子中包含250-500个细胞。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中各微囊粒子中包含的平均细胞数为100-100000个。在一个实施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均细胞数为200-10000个。在一个实施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均细胞数为250-10000个。在一个实施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均细胞数为250-7500个。在一个实施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均细胞数为250-5000个。在一个实施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均细胞数为250-1000个。在一个实施方案中，其中各微囊粒子中包含的平均细胞数为250-500个。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述液体介质选自：细胞培养液(例如DMEM培养液)、动物(例如人)体液、组织(例如肿瘤，例如实体肿瘤)液、生理盐水、缓冲液。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述药学可接受的载体选自：细胞培养液(例如DMEM培养液)、动物(例如人)体液、组织(例如肿瘤，例如实体肿瘤)液、生理盐水、缓冲液。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述液体介质和所述药学可接受的载体相同或者不同。在一个实施方案中，所述液体介质和药学可接受的载体是相同的。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其中所述囊芯中还包含具有分泌第二活性因子功能的第二活细胞。应当理解，在存在第二活性因子和/或第二活细胞的情况下，所述原有的活性因子和活细胞分别为第一活性因子和第一活细胞，以示区别上述另外添加的第二活性因子和第二活细胞。在一个实施方案中，所述第二活性因子与所述第一活性因子相同或不同。在一个实施方案中，所述第二活细胞与所述第一活细胞相同或不同。在一个实施方案中，所述第二活细胞与所述第一活细胞相同，所述第二活性因子与所述第一活性因子不同。
根据本发明第一方面任一项的药物组合物，其可用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌症。在一个实施方案中，所述药物组合物可用于抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤组织生长、和/或杀灭肿瘤细胞。在一个实施方案中，所述的肿瘤是实体瘤或非实体瘤、良性或恶性肿瘤。在一个实施方案中，所述的肿瘤和/或癌症选自肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肠癌、卵巢癌、脑胶质细胞瘤。
基于本发明第一方面，本发明第二方面提供一种微囊，其包括：
(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质；和
(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔离膜，
其中所述隔离膜是半透膜。
本发明第二方面所述微囊与本发明第一方面所述药物组合物中包含的微囊具有相同或相应的特征。
本发明第三方面提供了制备本发明第一方面任一项所述药物组合物的方法，其包括以下步骤：
(1)使具有分泌活性因子功能的活细胞与海藻酸钠溶液混合，制成细胞悬浮液；
(2)利用喷雾装置将步骤(1)所得悬浮液以微滴状态分散于钙溶液(例如氯化钙或乳酸钙溶液)中，待沉淀完全后除去上清液，获得包含活细胞的海藻酸钙微珠沉淀；
(3)将步骤(2)所得沉淀物加入到聚赖氨酸溶液中，混合均匀，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
(4)将步骤(3)所得沉淀物加入到海藻酸钠溶液中，混合均匀，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
(5)将步骤(4)所得沉淀物加入到柠檬酸钠溶液中，混合均匀，待沉淀完全后除去上清液，获得包裹所述活细胞的微囊沉淀物；和任选的
(6)用氯化钠溶液清洗步骤(5)所得沉淀物，再转移到细胞培养液中，即得。
根据本发明第三方面任一项所述方法，其中所述微囊具有200-450μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-400μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-375μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-350μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-325μm的平均粒径。在一个实施方案中，所述微囊具有200-300μm的平均粒径。
根据本发明第三方面任一项所述方法，其中所用的海藻酸钠具有1万-25万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有1.5万-20万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有2万-15万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有2万-10万道尔顿的分子量。在一个实施方案中，所述海藻酸钠具有2万-7.5万道尔顿的分子量。
根据本发明第三方面的方法，其类似地可以获得本发明第二方面的微囊。例如通过步骤(1)至(5)就可以获得。由此，上述步骤(1)至(5)亦是制备本发明第二方面的微囊的方法。
本发明第四方面提供了本发明第一方面任一项所述药物组合物或者第二方面任一项所述微囊在制备用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的医药中的用途。在一个实施方案中，所述医药可用于抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤组织生长、和/或杀灭肿瘤细胞。在一个实施方案中，所述的肿瘤是实体瘤或非实体瘤、良性或恶性肿瘤。在一个实施方案中，所述的肿瘤和/或癌症选自肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肠癌、卵巢癌、脑胶质细胞瘤。
本发明第五方面提供了在有需要的受试者中治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的方法，该方法包括给所述受试者施用有效量的本发明第一方面任一项所述药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物是以有效抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤组织生长、和/或杀灭肿瘤细胞的量施用的。在一个实施方案中，所述的肿瘤是实体瘤或非实体瘤、良性或恶性肿瘤。在一个实施方案中，所述的肿瘤和/或癌症选自肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肠癌、卵巢癌、脑胶质细胞瘤。在一个实施方案中，所述药物组合物施用于所述肿瘤和/或癌症部位。
本发明第六方面提供了用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的本发明第一方面任一项所述药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物可用于抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤组织生长、和/或杀灭肿瘤细胞。在一个实施方案中，所述的肿瘤是实体瘤。在一个实施方案中，所述的肿瘤和/或癌症选自肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肠癌、卵巢癌、脑胶质细胞瘤。
在本发明的任一方面，其中任意两个或更多个实施方案之间所具有的特征可以相互组合，只要它们不会相互矛盾；当然在相互之间组合时，必要的话可对相应特征作适当修饰。例如在提及“根据本发明第一方面任一项的药物组合物”时，其后限定的特征可以适用于本发明第一方面任一实施方案的情形，只要它们不会相互矛盾。另外，对于在本发明任一方面使用的术语和特征，其含义同样适用于其它方面。
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
如本文所述的，术语“药物组合物”，其还可以是指组合物，可用于在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症或不良健康状况。
如本文所述的，术语“受试者”，亦可指“患者”，其通常是指哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中有效实现治疗、预防、缓解、减轻、消除相关疾病及其并发症的剂量。
如本文所述的，术语“免疫隔离化细胞”是指本发明的活细胞，由于其与机体的细胞、组织或器官之间被本发明所述半透膜所隔离，从而其不会与机体发生免疫反应。
如本文所述的，术语“生物相容性”是指不会与机体的细胞、组织或器官发生不利的生物学反应。
如本文所述的，术语“具有分泌活性因子功能的活细胞”是指本发明的活细胞，其具有分泌本发明所述活性因子例如肿瘤坏死因子(TNF)、血管抑素(AST)、内皮抑素(EST)等的能力。本发明所述活细胞可通过本领域已知的任何方法获得分泌活性因子的能力，例如基因工程方法。
如本文所述的，术语“截割”亦可指“截留”，表示可以将较大的物质例如分子量大于16万道尔顿的物质例如本发明所述活细胞“截留”在本发明所述半透膜的一侧而不能自由通过半透膜。
如本文所述的，术语“微囊”，是指一种基本上呈球形的微小颗粒，其表面由聚赖氨酸-海藻酸钙形成半透膜，而其内部是主要由海藻酸钙构成的海绵状骨架，骨架内分布的网格状孔隙间含有本发明所述液体介质以及活细胞。因此，本领域技术人员理解，术语“微囊”的结构是由本发明详细记载所描述的，并且本领域技术人员理解，这种微小颗粒亦可称为“微粒”、“微球”、“颗粒”等。
如本文所述的，短语“微囊细胞包裹量”、“微囊平均细胞包裹量”或者“每个微囊中包含的细胞数平均为”是指一定数目微囊中每个微囊所包裹的细胞数量的平均值。例如，其可以以如下方式测得：取一定数目(例如100个、200个、500个或1000个)的微囊，经测定这些微囊中的总细胞数，由该总细胞数除以微囊数目，即得到的群体中的“个细胞/个微囊”的数值。
如本文所述的，短语“微囊粒径”、“微囊平均粒径”或类似用语是指一定数目(例如100个、200个、500个或1000个)微囊中各个微囊直径的平均值。
本发明提供了一类新的用于杀伤和/或抑制肿瘤的免疫隔离化细胞药物，其包括(1)可分泌抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子的活细胞和(2)包裹所述活细胞的免疫隔离膜。本发明特别地提供的是一种APA微囊化抑瘤和/或杀瘤细胞。缩写“APA”表示“海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙”。术语“APA微囊化”表示用海藻酸钙-聚赖氨酸-海藻酸钙获得的微囊。
如图1所示，描述了本发明APA微囊的示意性结构。其中图1a是本发明上文第二方面所述方法的步骤(1)和(2)所形成的海藻酸钙微珠，即在活细胞与海藻酸钠溶液混合成细胞悬浮液后，向其中以微滴方式加入钙离子(例如氯化钙或乳酸钙溶液)，海藻酸钠形成不溶性的海藻酸钙，由此形成海绵状海藻酸钙微珠沉淀(即本发明所述微囊的囊芯)。图中示意的海绵状网状结构的骨架是由包括海藻酸钙(Alg-Ca)的成分构成，该海绵状的孔隙中容纳有活细胞(C)和介质(M)。接着，图1b示意了本发明上文第二方面所述方法的步骤(3)所形成的沉淀物，即将步骤(2)所得沉淀物加入到聚赖氨酸溶液中，借助海藻酸钙与聚赖氨酸相互之间所荷相反电荷的作用使聚赖氨酸附着于颗粒的表面，即在所述囊芯外围附着大量的聚赖氨酸(PL)。接着，图1c示意了本发明上文第二方面所述方法的步骤(4)所形成的沉淀物，即使图1b的颗粒再次与海藻酸钠溶液接触，借助体系中存在的钙离子(例如氯化钙或乳酸钙溶液，特别是囊芯中残余的钙离子)而使海藻酸钠在颗粒表面固化，由此，颗粒表面的聚赖氨酸(PL)和海藻酸钙层形成本发明所述隔离膜。由于该隔离膜中镶嵌了聚赖氨酸，使得该隔离膜具有半渗透性，即为半透膜(semip-m)，小分子物质或供细胞存活的介质(M)可以通过而大分子物质或细胞(C)不能通过。
在本发明的一个实施方案中，提供了杀伤和/或抑制肿瘤的方法，其包括将免疫隔离化抑瘤和/或杀瘤因子分泌细胞直接植入肿瘤组织内或手术切除后残余的肿瘤组织内。在一个实施方案中，其中的细胞是包裹在本发明的微囊中。
在本发明的一个实施方案中，提供了制备本发明药物组合物或微囊的方法，所述药物组合物或微囊可用作杀伤和/或抑制肿瘤，并且作为外源性的该活细胞与机体发生免疫反应的能力被隔离，该方法的步骤包括：
(1)将活细胞(在本文中亦可称为抑瘤细胞和/或杀瘤细胞)与一种浓度为10-20g/L的海藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每升悬浮液中含0.001-1×1010个细胞；
(2)利用喷雾装置将步骤(1)获得的悬浮液以100-1000μm直径的微滴状态分散于一种浓度为80-120mmol/L的氯化钙或乳酸钙溶液中，放置5-20分钟，待沉淀完全后，除去上清液，获得含抑瘤和/或杀瘤细胞的海藻酸钙微珠沉淀；
(3)将步骤(2)获得的沉淀物加入到一种浓度为0.1-1.0g/L的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
(4)将步骤(3)获得的沉淀物加入到一种浓度为1.0-2.0g/L的海藻酸钠溶液中，混合均匀，放置3-15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
(5)将步骤(4)获得的沉淀物加入到一种浓度为10-100mmol/L的柠檬酸钠溶液中，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得APA微囊化抑和/或杀瘤细胞沉淀物；
(6)将步骤(5)获得的沉淀物加入到一种浓度为9g/L的氯化钠溶液清洗，最后将沉淀物转移入细胞培养液中培养并作为治疗肿瘤的APA微囊化抑瘤和/或杀瘤细胞(APA-TIF细胞微囊)药物保存。
在本发明的一个实施方案中，提供可分泌抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子的活细胞和免疫隔离膜的包裹在制备用于杀伤和/或抑制肿瘤的免疫隔离化细胞药物中用途。
根据本发明，本发明所述抑制肿瘤生长因子和/或肿瘤杀伤因子分泌细胞至少使用一种。
根据本发明，本发明所述肿瘤包括实体瘤或非实体瘤、良性或恶性肿瘤。
根据本发明，本发明中抑瘤细胞或杀瘤细胞可来自基因工程细胞或哺乳动物如人、猴、牛、羊、猪或鼠的分泌细胞，优选基因工程细胞。
根据本发明，本发明中抑瘤细胞或杀瘤细胞为可分泌抑瘤和/或杀瘤因子的基因工程细胞。
根据本发明，本发明的抑瘤细胞和/或杀瘤细胞是以免疫隔离化形式使用的，优选APA微囊化的抑瘤细胞和/或杀瘤细胞。
根据本发明，本发明的APA微囊(免疫隔离膜)可截割大于15万道尔顿分子、允许小于10万道尔顿分子通过，并符合体内植入要求的强度和生物相容度等性质。
根据本发明的APA-TIF细胞微囊药物，在其步骤(2)中优选是将步骤(1)获得的悬浮液以100-500μm直径的微滴状态分散。
在本发明任一方面所述微囊的一个实施方案中，该微囊具有的平均粒径为200-450μm，优选250-400μm，优选275-375μm。在本发明任一方面所述微囊的一个实施方案中，该微囊具有的中值粒径为200-450μm，优选250-400μm，优选275-375μm。
在本发明任一方面所述微囊的一个实施方案中，每个微囊粒子中包含250-5000个细胞，优选250-1000个细胞，优选250-500个细胞。在本发明任一方面所述微囊的一个实施方案中，每个微囊粒子中包含的细胞数平均为250-5000个，优选250-1000个，优选250-500个。在本发明任一方面所述微囊的一个实施方案中，平均细胞含量为250-5000个细胞/微囊，优选250-1000个细胞/微囊，优选250-500个细胞/微囊。
在本发明任一方面所述微囊的一个实施方案中，该微囊具有的平均粒径为200-450μm(优选250-400μm，优选275-375μm)，并且每个微囊中包含的细胞数平均为250-5000个(优选250-1000个，优选250-500个)。本发明人发现具有特定尺寸和细胞包裹量的微囊具有令人期待的优点。
在使用时，只要将本发明APA-TIF细胞微囊注入患者的肿瘤组织内或肿瘤切除后的腔内，即可在24小时内开始产生抑制或杀伤肿瘤细胞的作用，而且一次注射可以维持治疗作用6个月以上。
进一步讲，在本发明中所述的TIF细胞是指在载体细胞中转染了分泌抑制和/或杀伤肿瘤因子基因的工程细胞，它可分泌抑制和/或杀伤肿瘤的因子(包括肿瘤坏死因子、肿瘤血管生长抑制因子等)物质。
TIF细胞的获得可用本领域已知的基因转染方法进行。例如，可以使用腺病毒等将目的基因转染入载体细胞，使其可持续地分泌TIF。将TIF细胞在体外培养系统中培养增殖。
在本发明的APA-TIF细胞微囊药物的制备中，步骤(1)所获得的悬浮液中每升含有0.01-1×1010个细胞，也可以根据载体细胞的生长特性来掌握。例如，高增殖活性的载体细胞可降低细胞密度，而低增殖活性的载体细胞可升高细胞密度。余此类推。
在步骤(2)中形成海藻酸钙微珠呈密网格状，其中含有许多TIF细胞。步骤(3)的作用是为了在海藻酸钙微珠表面形成能截割大分子的半透膜。步骤(4)的作用是为了步骤(3)产物表面形成生物相容的膜，获得含TIF细胞的APA微球。在步骤(5)中，柠檬酸钠的钠离子将海藻酸钙微珠中的钙离子置换之后，便使APA微球中芯液化，形成了中芯为稀网格状孔隙的APA微囊，其中含有许多TIF细胞。
对海藻酸钙微珠的形成方法没有特殊限定，只要是能将含有TIF细胞的海藻酸钠悬浮液以足够微小的液滴分散于钙溶液中即可。该海藻酸钠悬浮液微滴的直径通常应在100-1000μm的范围内，优选在180-500μm的范围内，在本发明中更优选在200-400μm范围内。如果微滴直径在1000μm以上，则最后获得的微囊过大，在注射入人或动物的机体时容易引起破裂，因此不好。通常使用的液滴分散方法有针头注射法、喷雾法等，优选是静电微囊发生器之喷雾法。
上面对本发明的技术方案进行了较详细的解释，本领域的技术人员在阅读了上文及下文所附的实施例之后将能很容易地理解本发明。
与本领域的现有同类技术相比，本发明具有如下的积极效果：
通过动物实验证实，使用本发明的APA-TIF细胞微囊可以持续地分泌抑制和/或杀伤肿瘤的因子(TIF)，作用于患者的肿瘤组织细胞。植入的TIF细胞发挥“微型生物泵”的持续、小量分泌效应，在一段较长的时间内，通过其分泌的TIF，达到抑制和/或杀伤肿瘤组织细胞的作用，从而达到治疗肿瘤的目的。
与现有技术相比，本发明具有至少一项以下特点：
1、静脉等方法全身使用TIF，肿瘤组织内药物浓度低，治疗效果差；同时，药物对全身的毒副作用大。而本发明将TIF细胞植入肿瘤组织内，其分泌的肿瘤抑制和/或杀伤因子主要浓集并作用于肿瘤组织局部，治疗效果好、对全身的毒副作用小；
2、直接使用TIF蛋白因子，由于其半衰期短，必须反复多次地长时间地注射于肿瘤组织内，才能达到治疗肿瘤的目的。本发明采用分泌肿瘤抑制和/或杀伤因子的基因工程细胞系(TIF细胞)植入肿瘤组织，通过其持续分泌TIF的微型生物泵作用，发挥抑制肿瘤组织生长的效应。它可解决临床难以实施向肿瘤组织内反复注射TIF蛋白因子的问题；
3、本发明采用同时植入一种或多种分泌肿瘤抑制和/或杀伤因子的基因工程细胞的方法，所分泌的一种或多种TIF，可通过杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤血管组织生长等一种或多种机制的协同效应，更好地发挥治疗肿瘤的作用；
4、本发明以APA微囊包裹TIF细胞，一方面可防止免疫反应发生，另一方面可限制高增殖活性载体细胞的过度生长。大量实验已证实，本发明的APA微囊具有很好的免疫保护作用；
5、按本发明制作的APA微囊体积小(直径100-500um，优选的平均直径为200-400um)，因而至少具有4个优点之一：(1)利于营养物和代谢物的扩散，使囊内细胞易于较长期的存活；(2)微囊的机械强度高；(3)仅需以简单的注射方法即可将微囊注入肿瘤组织内，不需特殊的手术操作植入；(4)微囊对肿瘤周围组织的损伤压迫作用小；
6、按本发明制作的APA微囊强度高、囊球形度高、表面光洁度高，因而其组织相容性好，更适合于体内植入的要求，不易在宿主体内破裂，不易被宿主的炎性细胞包裹而堵塞微囊膜孔；
7、与其它材料的免疫隔离膜相比，APA微囊具有良好的生物相容性；
8、APA-TIF细胞微囊在宿主肿瘤组织内可持续地(例如6个月以上)分泌肿瘤抑制和/或杀伤因子，产生持续的抑制和/或杀伤肿瘤组织细胞的治疗作用。为解决肿瘤复发等难题提供新的方法；
9、与采用人体自然杀伤细胞或因子相比，TIF基因工程细胞可大批量获得；
10、可采用低温技术(例如低于8°C，例如0-8°C，例如0-4°C，或者例如液氮冷冻保存，例如约-80°C)保存APA-TIF细胞微囊，便于长距离运输和批量供应。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
A、实施例部分：具有分泌活性因子功能的活细胞
实施例1：rEST/293基因工程细胞系的建立
1、将人血管内皮抑素(rEST)表达载体转染入人胚胎肾293细胞，以获得稳定分泌人血管内皮抑素的工程细胞(rEST/293)
2、用台盘兰染色法检测rEST/293细胞的存活率；
3、用RT-PCR扩增法从mRNA水平检测转染细胞内皮抑素的表达；
4、从蛋白水平检测转染细胞内皮抑素的表达：用SDS-PAGD检测rEST的特异性；用Western Blot法证实rEST/293细胞表达分泌型蛋白中含有重组rEST，并具有抗原活性；
5、用ELISA法检测细胞分泌的rEST量。
6、转染细胞表达产物内皮抑素的体外生物学活性鉴定：通过血管内皮细胞抑制实验、鸡胚绒毛膜尿囊膜实验，证实rEST/293细胞可抑制血管内皮细胞再生。
实施例2：TNFα/293基因工程细胞系的建立
1、将肿瘤坏死因子α(TNFα)表达载体转染入人胚胎肾293细胞，以获得稳定分泌人血管内皮抑素的工程细胞(TNFα/293)；
2、用台盘兰染色法检测TNFα/293细胞的存活率；
3、用RT-PCR扩增法从mRNA水平检测转染细胞TNFα的表达；
4、用Western Blot法从蛋白水平检测转染细胞TNFα的表达；
5、用ELISA法检测细胞分泌的TNFα量。
6、用MTT比色法测定TNFα对肿瘤细胞的杀伤活性。
应予说明，实施例1、2的方法属于常规技术，它对本发明不起任何限定作用。
B、制备例部分：制备包含细胞的微囊的药物组合物
制备例1：TIF细胞-APA微囊药物的制备
1、使用按实施例1、2的方法获得的TIF细胞(rEST/293细胞：TNFα/293细胞的混合物，两种细胞数的比约1：1)沉淀物(细胞数约为105-107个)，用生理盐水洗涤。
2、向其中加入1ml浓度为15g/L的海藻酸钠(10mpa·s粘度级)溶液，其制成悬浮液。
3、用静电微囊发生器(electrostatic droplet generator)将悬浮液以平均约325μm直径的微滴喷入到100ml浓度为100mmol/L的氯化钙溶液中，获得一种直径在100-500μm范围内的含细胞的海藻酸钙珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。
4、将上面得到的海藻酸钙珠加入到50ml浓度为0.5g/L的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液。
5、将步骤4获得的沉淀物加入到60ml浓度为1.5g/L的海藻酸钠溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液。
6、将步骤5获得的沉淀物加入到60ml浓度为55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得APA-TIF细胞微囊沉淀物。
7、用浓度为9g/L的氯化钠溶液洗涤沉淀物，然后将此沉淀物转移入DMEM培养液中培养，作为注射用APA-TIF细胞微囊药物，待用，即为本发明的药物组合物。
制备例2：包含TNFα/293细胞的微囊药物组合物的制备
参考制备例1的方法进行制备，部分细节具体如下：
1、取实施例2获得的TNF/293基因工程细胞系沉淀物(细胞数约为105-107个)，用生理盐水洗涤，向其中加入1ml浓度为10g/L的海藻酸钠(50mpa·s粘度级)溶液，其制成悬浮液。
2、用静电微囊发生器将悬浮液以平均约300μm直径的微滴喷入到100ml浓度为80mmol/L的氯化钙溶液中，获得直径在100-500μm范围内的含细胞的海藻酸钙珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。
3、将上面得到的海藻酸钙珠加入到50ml浓度为0.1g/L的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液。
4、将上步沉淀物加入到60ml浓度为1.0g/L的海藻酸钠溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液。
5、将上步沉淀物加入到60ml浓度为15mmol/L的柠檬酸钠溶液中，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得APA-TIF细胞微囊沉淀物。
6、用浓度为9g/L的氯化钠溶液洗涤沉淀物，然后将此沉淀物转移入DMEM培养液中培养，作为注射用APA-TIF细胞微囊药物，待用，即为本发明的药物组合物。
制备例3：包含TNFα/293细胞的微囊药物组合物的制备
参考制备例1的方法进行制备，部分细节具体如下：
1、取实施例2获得的TNF/293基因工程细胞系沉淀物(细胞数约为105-107个)，用生理盐水洗涤，向其中加入1ml浓度为20g/L的海藻酸钠(100mpa·s粘度级)溶液，其制成悬浮液。
2、用静电微囊发生器将悬浮液以平均约370μm直径的微滴喷入到100ml浓度为120mmol/L的氯化钙溶液中，获得直径在100-500μm范围内的含细胞的海藻酸钙珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。
3、将上面得到的海藻酸钙珠加入到50ml浓度为1.0g/L的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液。
4、将上步沉淀物加入到60ml浓度为2.0g/L的海藻酸钠溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液。
5、将上步沉淀物加入到60ml浓度为100mmol/L的柠檬酸钠溶液中，在室温下放置5-10分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得APA-TIF细胞微囊沉淀物。
6、用浓度为9g/L的氯化钠溶液洗涤沉淀物，然后将此沉淀物转移入DMEM培养液中培养，作为注射用APA-TIF细胞微囊药物，待用，即为本发明的药物组合物。
制备例4：包含rEST/293细胞的微囊药物组合物的制备
参考制备例2的方法，以平均约270μm直径的微滴用静电微囊发生器将悬浮液喷入到钙溶液中，使用实施例1获得的rEST/293细胞和200mpa·s粘度级的海藻酸钠进行制备。获得包含rEST/293细胞的微囊药物组合物。
制备例5：包含TNFα/293细胞的微囊药物组合物的制备
参考制备例3的方法，以平均约350μm直径的微滴用静电微囊发生器将悬浮液喷入到钙溶液中，使用实施例1获得的rEST/293细胞和300mpa·s粘度级的海藻酸钠进行制备。获得包含rEST/293细胞的微囊药物组合物。
制备例6-10：本发明微囊药物组合物的制备
基本上分别参照制备例1-5的方法，但在用静电微囊发生器将悬浮液以一定直径的微滴喷入到氯化钙溶液中时，控制的微滴直径分别大约在275μm、300μm、325μm、350μm、375μm。分别制备得到的制备例6-10的5批本发明微囊药物组合物。经下文所示方法测定，本制备例得到的制备例6-10的5批本发明微囊药物组合物的微囊平均粒径分别为279μm、305μm、328μm、355μm、373μm，微囊平均粒径均在275-375μm的范围内。制备例6-10的微囊平均细胞包裹量分别为：260个细胞/个微囊、410个细胞/个微囊、490个细胞/个微囊、370个细胞/个微囊、310个细胞/个微囊，均在250-500个细胞/个微囊的范围内。
比较例1-10：包含细胞的微囊药物组合物的制备
分别参照制备例1-10的方法，分别以平均约50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、400μm、450μm、500μm、750μm、和1000μm直径的微滴，用静电微囊发生器将悬浮液喷入到钙溶液中，分别得到比较例1-10的微囊药物组合物。
经下文所示方法测定，比较例1-10分别得到的微囊药物组合物，它们的微囊平均粒径分别为39μm、105μm、148μm、215μm、253μm、390μm、455μm、508μm、755μm、983μm；它们的微囊平均细胞包裹量分别为：30个细胞/个微囊、70个细胞/个微囊、135个细胞/个微囊、183个细胞/个微囊、220个细胞/个微囊、535个细胞/个微囊、760个细胞/个微囊、1260个细胞/个微囊、2030个细胞/个微囊、2960个细胞/个微囊。
比较例11-12：包含细胞的微囊药物组合物的制备
参照制备例1的方法，所用细胞沉淀物的细胞数约为103-106个，以平均约320μm直径的微滴，用静电微囊发生器将悬浮液喷入到钙溶液中，得到比较例11的微囊药物组合物。经测定，所得微囊平均粒径为335μm，微囊平均细胞包裹量为180个细胞/个微囊。
参照制备例1的方法，所用细胞沉淀物的细胞数约为107-1011个，以平均约320μm直径的微滴，用静电微囊发生器将悬浮液喷入到钙溶液中，得到比较例11的微囊药物组合物。经测定，所得微囊平均粒径为325μm，微囊细胞包裹量为980个细胞/个微囊。
比较例13-14：包含细胞的微囊药物组合物的制备
参照制备例1的方法，所用细胞沉淀物的细胞数约为105-109个，以平均约200μm直径的微滴，用静电微囊发生器将悬浮液喷入到钙溶液中，得到比较例13的微囊药物组合物。经测定，所得微囊平均粒径为205μm，微囊细胞包裹量为380个细胞/个微囊。
参照制备例1的方法，所用细胞沉淀物的细胞数约为103-105个，以平均约500μm直径的微滴，用静电微囊发生器将悬浮液喷入到钙溶液中，得到比较例14的微囊药物组合物。经测定，所得微囊平均粒径为515μm，微囊细胞包裹量为410个细胞/个微囊。
C、试验例部分：对本发明包含细胞的微囊的药物组合物的性能考
察
试验例1：APA-TIF细胞微囊对C6脑胶质瘤大鼠的治疗作用
试验材料与方法：
1、在裸鼠上建立C6脑胶质瘤鼠模型；
2、将制备例1获得的APA-rEST-TNFα/293细胞微囊(约105-107个细胞的量)植入C6脑胶质瘤模型鼠的瘤体内；
3、21天后将小鼠处死，行组织病理学检查。与对照组C6脑胶质瘤模型鼠比较，APA-rEST-TNFα/293细胞微囊植入组C6脑胶质瘤体内新生血管数量明显减少、死亡细胞数量明显增多。具体结果见表1。
表1：
| 组别 | 血管分数 | 凋亡指数(％) |
| APA-rEST-TNFα/293细胞微囊组 | 6.31±5.20* | 11.2±0.5* |
| 空囊对照组 | 38.27±5.91 | 3.8±2.5 |
*表示p<0.05。
试验例1的结果表明：与对照组C6脑胶质瘤模型大鼠相比，APA-rEST-TNFα/293微囊植入C6脑胶质瘤鼠的瘤体内(APA-TIF细胞微囊组)，可使肿瘤体积减小、瘤内微血管密度降低、死亡细胞数量明显增多、荷瘤鼠存活率增高、生存时间延长(P<0.01)。
另外，参考试验例1的方法，使用制备例6获得的微囊药物组合物进行试验，结果表明：与对照组C6脑胶质瘤模型大鼠相比，APA-TNFα/293微囊植入C6脑胶质瘤鼠的瘤体内(APA-TIF细胞微囊组)，可使肿瘤体积减小、瘤内微血管密度降低、死亡细胞数量明显增多、荷瘤鼠存活率增高、生存时间延长(P<0.01)；制备例6获得的微囊药物组合物在血管分数和凋亡指数(％)方面均分别与制备例1的药物组合物的结果接近(相差不超过20%，例如制备例6微囊药物组合物的血管分数为7.07)。然而在根据本试验例的方法中，分别使用对比例1、6、11~14的微囊药物组合物进行试验，结果这些试药产生的血管分数均在14~26之间，而凋亡指数(%)在5.2~8.1之间。
实验例2：APA-TIF细胞微囊对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用
在经典的鸡胚尿囊膜血管生成实验中，结果显示：制备例1获得的APA-rEST-TNFα/293微囊培养上清液可明显减少新生血管的数量，其血管抑制率(81%)明显高于空微囊组、APA-rEST/293微囊组(45%)及APA-TNFα/293微囊组(11%)。
实验例3：微囊粒径测定和外形观察
方法：分别取制备例1-5和比较例1-5的微囊药物组合物，用水适当稀释，在显微镜下观察并计数，并计算微囊平均粒径(以150~200个微囊的数值进行统计)，粒度分布曲线显示本发明制备例获得的微囊的粒径分布呈令人满意的窄范围分布(未图示出)。结果见表2。此外，在显微镜下观察到微囊粒子基本上呈球形。
表2：微囊平均粒径
| 试样 | 制备例1 | 制备例2 | 制备例3 | 制备例4 | 制备例5 |
| 平均粒径μm | 320 | 298 | 375 | 275 | 348 |
实验例4：微囊细胞包裹量的测定
取各制备例或比较例的微囊各100个，在DMEM培养液中按标准方法培养。同时取一系列不同浓度的相应细胞对照培养。在培养48小时后，用ELISA法测定微囊试液或对照试液中rEST量和/或TNFα量。对于细胞对照，获得细胞浓度对rEST量和/或TNFα量之间的对应关系曲线，由此关系曲线算得平均每个微囊中的细胞数。结果见表3。
表3：微囊细胞包裹量
| 试样 | 制备例1 | 制备例2 | 制备例3 | 制备例4 | 制备例5 |
| 细胞数/个微囊 | 330 | 440 | 500 | 250 | 380 |
实验例5：细胞活性考察
分别取制备例1-10和比较例1-14的微囊适量(折合细胞计均为50万个)各约1000个，在DMEM培养液中按标准方法培养。分别在培养1、2、5、10、15、20天后，取出培养液并更换新培养液，用ELISA法测定培养液试样中rEST量和/或TNFα量。对于各种试药，以其在第48小时(第2天)分泌的rEST量和/或TNFα量(如果有rEST量和TNFα量两者，则以TNFα计)为100%，计算各测试点rEST和/或TNFα的相对百分量。
结果表明制备例1-10的微囊均在1-20天的测试期间均以稳定的、令人满意的结果分泌rEST或TNFα，各测试点的相对百分量均在80%~140%之间。比较例1~5虽然在1-10天的测试期间稳定地分泌rEST或TNFα，但其量一直较低，相对于其对应制备例试样(例如比较例1相对于制备例1，以此类推)在48小时时rEST和/或TNFα的相对百分量100%而言，这些试药的rEST和/或TNFα的相对百分量在30~70%之间。比较例6-10则在1-20天的测试期间，相对于其对应制备例试样(例如比较例6相对于制备例6，以此类推)在48小时时rEST和/或TNFα的相对百分量100%而言，虽然早期(1-5天)有较多量的rEST或TNFα分泌(在90%~180%之间)，但其量随着培养时间延长渐渐下降(在第10天以后均下降到70%以下)，特别是对于粒径较大的比较例10下降更明显(在第10天以后均下降到35%以下)。比较例11、13的微囊在1-20天的测试期间稳定但总量较低的量分泌rEST或TNFα(在相同时期大约相当于制备例1的60%~80%)，比较例12、14的微囊类似于比较例7，rEST或TNFα分泌量随着培养时间延长渐渐下降。
Claims (11)
1.一种药物组合物，其包括微囊和任选的药学可接受的载体，所述微囊包括：
(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质；和
(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔离膜，
其中：
所述隔离膜是半透膜，并且该隔离膜包含海藻酸钙和聚赖氨酸，海藻酸钙和聚赖氨酸的摩尔比为(0.001-1000)：1；
所述微囊具有275-375μm的平均粒径，并且每个微囊粒子中包含250-500个细胞；
所述囊芯由海绵状结构构成，该海绵状结构的骨架是由包括海藻酸钙的成分组成，所述活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质存在于该海绵状结构的孔隙中；
所述活细胞是人胚胎肾293细胞。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述活性因子选自：肿瘤坏死因子、血管抑素、内皮抑素、白介素、P53，以及它们的亚型。
3.根据权利要求1的药物组合物，其中所述活性因子是能够抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤组织生长、和/或杀灭肿瘤细胞的肿瘤抑制因子。
4.根据权利要求1的药物组合物，其中所述海藻酸钙具有1万-25万道尔顿的分子量。
5.根据权利要求4药物组合物，所述海藻酸钙是可溶性海藻酸钠与可溶性钙盐反应形成的，其中在20°C下以1%水溶液测定，所述海藻酸钠具有1-1000mpa·s的粘度。
6.根据权利要求1的药物组合物，其中所述液体介质选自：细胞培养液、动物体液、组织液、生理盐水、缓冲液。
7.根据权利要求1-6任一项的药物组合物，其中所述药学可接受的载体选自：细胞培养液、动物体液、组织液、生理盐水、缓冲液。
8.一种微囊，其包括：
(1)囊芯，其中含有具有分泌活性因子功能的活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质；和
(2)包裹所述囊芯的生物相容性隔离膜，
其中：
所述隔离膜是半透膜，并且该隔离膜包含海藻酸钙和聚赖氨酸，海藻酸钙和聚赖氨酸的摩尔比为(0.001-1000)：1；
所述微囊具有275-375μm的平均粒径，并且每个微囊粒子中包含250-500个细胞；
所述囊芯由海绵状结构构成，该海绵状结构的骨架是由包括海藻酸钙的成分组成，所述活细胞和可供所述活细胞存活的液体介质存在于该海绵状结构的孔隙中；
所述活细胞是人胚胎肾293细胞。
9.根据权利要求8的微囊，其具有以下任一项的特征：
(a)所述活性因子选自：肿瘤坏死因子、血管抑素、内皮抑素、白介素、P53，以及它们的亚型；
(b)所述活性因子是能够抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤组织生长、和/或杀灭肿瘤细胞的肿瘤抑制因子；
(c)所述海藻酸钙具有1万-25万道尔顿的分子量；
(d)所述海藻酸钙是可溶性海藻酸钠与可溶性钙盐反应形成的，其中在20°C下以1%水溶液测定，所述海藻酸钠具有1-1000mpa·s的粘度；
(e)所述液体介质选自：细胞培养液、动物体液、组织液、生理盐水、缓冲液。
10.制备权利要求1-7任一项所述药物组合物的方法，其包括以下步骤：
(1)使具有分泌活性因子功能的活细胞与海藻酸钠溶液混合，制成细胞悬浮液；
(2)利用喷雾装置将步骤(1)所得悬浮液以微滴状态分散于氯化钙或乳酸钙溶液中，待沉淀完全后除去上清液，获得包含活细胞的海藻酸钙微珠沉淀；
(3)将步骤(2)所得沉淀物加入到聚赖氨酸溶液中，混合均匀，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
(4)将步骤(3)所得沉淀物加入到海藻酸钠溶液中，混合均匀，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；
(5)将步骤(4)所得沉淀物加入到柠檬酸钠溶液中，混合均匀，待沉淀完全后除去上清液，获得包裹所述活细胞的微囊沉淀物；和任选的
(6)用氯化钠溶液清洗步骤(5)所得沉淀物，再转移到细胞培养液中，即得。
11.权利要求1-7任一项所述药物组合物或者权利要求8-9任一项所述微囊在制备用于治疗和/或预防肿瘤和/或癌症的医药中的用途。
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| CN1730099A (zh) * | 2005-08-03 | 2006-02-08 | 崔和厚 | 免疫隔离化细胞药物,其制备方法和其在杀伤肿瘤中的应用 |
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