CN109010914A - 一种应用于铁超载区域的干细胞支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用于铁超载区域的干细胞支架，所述干细胞支架为具有同心圆结构的双层角蛋白凝胶细胞；由包载去铁胺的低分子量角蛋白水凝胶外层和包裹干细胞和营养因子的高分子量角蛋白水凝胶内层组成；为双层同心圆结构，内层提供细胞生长，外层消除不利环境，从而达到提高细胞生长，增加其存活率，与传统的脑出血术后移植细胞相比，其细胞存活率更高，效果更好。将本发明的双层角蛋白凝胶细胞支架注入脑出血部位，可以同时达到通过凝胶吸附作用快速吸附残留血肿组织周围的过载铁离子，释放包埋的药物对铁离子进行螯合，从而通过消除铁超载，并且移植的干细胞可以提供神经保护作用，还可以分化为神经元和胶质细胞以修复受损部位。

Description

一种应用于铁超载区域的干细胞支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种干细胞支架，特别涉及一种应用于铁超载区域的干细胞支架及其制备方法。
背景技术
铁是人体不可缺少的微量元素，它是构成血红蛋白、肌红蛋白及多种酶的重要成分。但铁在人体内的代谢异常和大量积聚会造成组织局部的铁超载，铁超载的危害主要集中在过多的铁催化产生活性氧自由基，导致组织的氧化，造成细胞毒性损害。临床上，铁超载既可以由HFE基因突变而导致原发性铁超载，又可以由一些出血性疾病包括脑出血等，和多次输血、过度摄入铁剂等原因而造成继发性铁超载。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞群体，已经成功应用于组织工程领域。干细胞具有多向分化潜能已经被体内外试验所验证，通过加入不同的诱导剂，可使干细胞朝不同方向分化。当前干细胞可分化为成骨、成软骨、成脂肪、成肌细胞、神经元等。在很多出血性损伤中常需要进行组织修复以达到功能恢复。以脑出血为例，脑出血发生后会在脑组织内会造成神经组织受损，形成血肿，诱发原发性和继发性脑损伤。随着干细胞理论与技术的发展，干细胞治疗已成为ICH治疗最有可能突破的新技术。近来临床前研究表明ICH后移植外源干细胞对神经功能恢复是有利的，移植的干细胞可进入宿主，不仅可以提供神经保护作用，还可以分化为神经元和胶质细胞以修复受损部位。但依据种子和土壤学说，干细胞是否可在损伤处进行增殖和分化与其所处微环境(土壤)密切相关。已经试验证明铁超载会影响干细胞的增殖和分化，因此，将干细胞直接植入到出血性疾病损伤处的铁超载环境中，将会大大降低其组织修复功能。而现有技术中，应用于铁超载区域的干细胞支架多为单层结构，细胞死亡较多，存活较少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种应用于铁超载区域的干细胞支架及其制备方法，既可有效清除过量铁离子，又可避免药物(去铁胺)对干细胞的影响，用于术后脑出血移植干细胞，支持干细胞在脑血生长、分化，以替代损伤丢失的细胞，并融入神经组织形成环路，改善神经功能恢复，与传统的脑出血术后移植细胞相比，其细胞存活率更高，效果更好。
本发明的应用于铁超载区域的干细胞支架，所述干细胞支架为具有同心圆结构的双层角蛋白凝胶细胞；
进一步，所述双层角蛋白凝胶细胞由包载去铁胺的低分子量角蛋白水凝胶外层和包裹干细胞和营养因子的高分子量角蛋白水凝胶内层组成；
进一步，所述低分子量角蛋白水凝胶外层中的角蛋白浓度高于高分子量角蛋白水凝胶内层中的角蛋白浓度；
进一步，所述低分子量角蛋白水凝胶外层中角蛋白浓度为30-40％，所述高分子量角蛋白水凝胶内层中角蛋白浓度为25-35％；
进一步，所述低分子量角蛋白水凝胶外层中角蛋白浓度为35％，所述高分子量角蛋白水凝胶内层中角蛋白浓度为30％；
进一步，所述高分子量角蛋白水凝胶内层与低分子量角蛋白水凝胶外层的体积比为1：2；
进一步，所述低分子量角蛋白分子量为3-5w，高分子量角蛋白分子量为5w以上。
本发明还公开一种应用于铁超载区域的干细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
a.将低分子量的角蛋白粉末与米诺环素混于水中搅拌制成外层角蛋白凝胶；将高分子量的角蛋白粉末置于水中搅拌制成内层角蛋白凝胶，将细胞与内层角蛋白凝胶混匀；
b.采用分层注射的方式将内外层凝胶结合形成具有双层同心圆结构的双层角蛋白凝胶细胞支架；
进一步，步骤a中，搅拌速度为200-300rpm/min，搅拌时间为5.5-7h；
进一步，步骤a中，搅拌速度为250rpm/min，搅拌时间为6h。
本发明的有益效果：本发明的应用于铁超载区域的干细胞支架，为双层同心圆结构，内层提供细胞生长，外层消除不利环境，从而达到提高细胞生长，增加其存活率，与传统的脑出血术后移植细胞相比，其细胞存活率更高，效果更好。将本发明的双层角蛋白凝胶细胞支架注入脑出血部位，可以同时达到通过凝胶吸附作用快速吸附残留血肿组织周围的过载铁离子，释放包埋的药物对铁离子进行螯合，从而通过消除铁超载，并且移植的干细胞可以提供神经保护作用，还可以分化为神经元和胶质细胞以修复受损部位。
附图说明
图1为实施例1中双层角蛋白凝胶冷冻干燥前后冷冻干燥后的实物图；
图2为实施例1中细胞在双层支架上的死活染色图；
图3为实施例1中双层角蛋白凝胶体外降解。
具体实施方式
本实施例的本发明的应用于铁超载区域的干细胞支架，所述干细胞支架为具有同心圆结构的双层角蛋白凝胶细胞；与传统的脑出血术后移植细胞相比，细胞存活率提高，效果更佳，内层提供细胞生长，外层消除不利环境，从而达到提高细胞生长，增加其存活率，进而可以发挥更好的作用，在脑出血术后及其他不利于细胞移植的环境下，具有极大的潜在应用价值。
本实施例中，所述双层角蛋白凝胶细胞由包载去铁胺的低分子量角蛋白水凝胶外层和包裹干细胞和营养因子的高分子量角蛋白水凝胶内层组成；外层采用包载去铁胺的低分子量水凝胶，其可快速清除损伤处的铁离子并且快速降解；而内层为包裹干细胞和营养因子的高分子量水凝胶，其可长时间支持干细胞的生长和分化。并且双层结构既可有效清除过量铁离子，又可避免药物(去铁胺)对干细胞的影响。
本实施例中，所述低分子量角蛋白水凝胶外层中的角蛋白浓度高于高分子量角蛋白水凝胶内层中的角蛋白浓度；分层结构更稳定，更利于细胞的存活。
本实施例中，所述低分子量角蛋白水凝胶外层中角蛋白浓度为30-40％，所述高分子量角蛋白水凝胶内层中角蛋白浓度为25-35％；提高内外层细胞结构之间的稳定性。
本实施例中，所述低分子量角蛋白水凝胶外层中角蛋白浓度为35％，所述高分子量角蛋白水凝胶内层中角蛋白浓度为30％。
本实施例中，所述高分子量角蛋白水凝胶内层与低分子量角蛋白水凝胶外层的体积比为1：2，便于双层凝胶结构额形成。
本实施例中，所述低分子量角蛋白分子量为3-5w，高分子量角蛋白分子量为5w以上；不同分子量凝胶降解效果不同，其中外层凝胶降解更快，这方便了外层凝胶快速吸附铁离子并降解的目的，内层凝胶降解较慢，这使得细胞更利用生长、分化，增加其移植效果。
实施例一
双层角蛋白凝胶细胞支架的制备过程如下：
室温下配制角蛋白水溶液，所用水为蒸馏水，内层角蛋白浓度为30％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度200-300rpm，时间5.5-7h，使其完全混匀。外层角蛋白浓度为35％、米诺环素浓度为3％，37℃条件下磁力搅拌，250rpm，时间6h，使其完全混匀。
收集大鼠骨髓间充质干细胞，原代培养，至P3收集细胞，与内层凝胶混匀，然后将内外层凝胶分段置于注射器中，比例为1:2，缓慢注入48孔板中，置于铁超载环境下培养24h，进行死活染色。
对比实施例:室温下配制角蛋白水溶液，所用水为蒸馏水，角蛋白浓度为35％，37℃条件下磁力搅拌，250rpm，6h，使其完全混匀，收集细胞混匀，缓慢注入48孔板中，置于铁超载环境下培养24h，进行死活染色。
实施例二
双层角蛋白凝胶细胞支架的制备过程如下：
室温下配制角蛋白水溶液，所用水为蒸馏水，内层角蛋白浓度为25％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度200rpm，搅拌时间5.5h，使其完全混匀。外层角蛋白浓度为30％、米诺环素浓度为3％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度200rpm，搅拌时间5.5h，使其完全混匀。
收集大鼠骨髓间充质干细胞，原代培养，至P3收集细胞，与内层凝胶混匀，然后将内外层凝胶分段置于注射器中，比例为1:2，缓慢注入48孔板中，置于铁超载环境下培养24h，进行死活染色。
实施例三
双层角蛋白凝胶细胞支架的制备过程如下：
室温下配制角蛋白水溶液，所用水为蒸馏水，内层角蛋白浓度为35％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度300rpm，搅拌时间7h，使其完全混匀。外层角蛋白浓度为40％、米诺环素浓度为3％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度300rpm，搅拌时间7h，使其完全混匀。
收集大鼠骨髓间充质干细胞，原代培养，至P3收集细胞，与内层凝胶混匀，然后将内外层凝胶分段置于注射器中，比例为1:2，缓慢注入48孔板中，置于铁超载环境下培养24h，进行死活染色。
实施例四
双层角蛋白凝胶细胞支架的制备过程如下：
室温下配制角蛋白水溶液，所用水为蒸馏水，内层角蛋白浓度为25％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度300rpm，搅拌时间5.5h，使其完全混匀。外层角蛋白浓度为40％、米诺环素浓度为3％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度200rpm，搅拌时间7h，使其完全混匀。
收集大鼠骨髓间充质干细胞，原代培养，至P3收集细胞，与内层凝胶混匀，然后将内外层凝胶分段置于注射器中，比例为1:2，缓慢注入48孔板中，置于铁超载环境下培养24h，进行死活染色。
实施例五
双层角蛋白凝胶细胞支架的制备过程如下：
室温下配制角蛋白水溶液，所用水为蒸馏水，内层角蛋白浓度为28％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度250rpm，搅拌时间5.5h，使其完全混匀。外层角蛋白浓度为32％、米诺环素浓度为3％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度250rpm，搅拌时间6h，使其完全混匀。
收集大鼠骨髓间充质干细胞，原代培养，至P3收集细胞，与内层凝胶混匀，然后将内外层凝胶分段置于注射器中，比例为1:2，缓慢注入48孔板中，置于铁超载环境下培养24h，进行死活染色。
实施例六
双层角蛋白凝胶细胞支架的制备过程如下：
室温下配制角蛋白水溶液，所用水为蒸馏水，内层角蛋白浓度为32％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度250rpm，搅拌时间6h，使其完全混匀。外层角蛋白浓度为36％、米诺环素浓度为3％，37℃条件下磁力搅拌，搅拌速度250rpm，搅拌时间6h，使其完全混匀。
收集大鼠骨髓间充质干细胞，原代培养，至P3收集细胞，与内层凝胶混匀，然后将内外层凝胶分段置于注射器中，比例为1:2，缓慢注入48孔板中，置于铁超载环境下培养24h，进行死活染色。
针对实施例一的结果分析：
体外结果表面，冷冻干燥前可以看见清晰的核壳双层结果，冷冻干燥后同样可以看到清晰的双层结构，这表明利用注射剂分层注射比例为1:2的内外层凝胶可以达到双层凝胶的结构。细胞死活染色上，采用铁超载环境模拟脑出血术后脑部环境，双层凝胶组中，内层支持细胞生长，载米诺环素外层通过凝胶吸附作用快速吸附过载铁离子，释放包埋的药物对铁离子进行螯合，从而消除铁超载。结果表面细胞存活较多，死亡较少。相比于实例组，对比组由于是传统的单层凝胶细胞支架，细胞死亡较多，存活较少。
将实施例一中的双层角蛋白凝胶细胞支架进行体外降解实验：
利用上述方法制备内外层凝胶，各取100ul凝胶分别置于1ml离心管中，加入1mlPBS，置于37度恒温下，每隔一天取100ul液体，并用新的PBS补充，待全部样品收集完，测定不同凝胶的降解率，测定结果如图3所示：内层凝胶为5W分子量以上，浓度为30％，外层凝胶为3-5w分子量，浓度为35％，观察结果可以看到，不同分子量凝胶降解效果不同，其中外层凝胶降解更快，这方便了外层凝胶快速吸附铁离子并降解的目的，内层凝胶降解较慢，这使得细胞更利用生长、分化，增加其移植效果。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种应用于铁超载区域的干细胞支架，其特征在于：所述干细胞支架为具有同心圆结构的双层角蛋白凝胶细胞。
2.根据权利要求1所述的应用于铁超载区域的干细胞支架，其特征在于：所述双层角蛋白凝胶细胞由包载去铁胺的低分子量角蛋白水凝胶外层和包裹干细胞和营养因子的高分子量角蛋白水凝胶内层组成。
3.根据权利要求2所述的应用于铁超载区域的干细胞支架，其特征在于：所述低分子量角蛋白水凝胶外层中的角蛋白浓度高于高分子量角蛋白水凝胶内层中的角蛋白浓度。
4.根据权利要求2所述的应用于铁超载区域的干细胞支架，其特征在于：所述低分子量角蛋白水凝胶外层中角蛋白浓度为30-40％，所述高分子量角蛋白水凝胶内层中角蛋白浓度为25-35％。
5.根据权利要求4所述的应用于铁超载区域的干细胞支架，其特征在于：所述低分子量角蛋白水凝胶外层中角蛋白浓度为35％，所述高分子量角蛋白水凝胶内层中角蛋白浓度为30％。
6.根据权利要求2所述的应用于铁超载区域的干细胞支架，其特征在于：所述高分子量角蛋白水凝胶内层与低分子量角蛋白水凝胶外层的体积比为1：2。
7.根据权利要求6所述的应用于铁超载区域的干细胞支架，其特征在于：所述低分子量角蛋白分子量为3-5w，高分子量角蛋白分子量为5w以上。
8.根据权利要求1所述的应用于铁超载区域的干细胞支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.将低分子量的角蛋白粉末与米诺环素混于水中搅拌制成外层角蛋白凝胶；将高分子量的角蛋白粉末置于水中搅拌制成内层角蛋白凝胶，将细胞与内层角蛋白凝胶混匀；
b.采用分层注射的方式将内外层凝胶结合形成具有双层同心圆结构的双层角蛋白凝胶细胞支架。
9.根据权利要求8所述的应用于铁超载区域的干细胞支架的制备方法，其特征在于：步骤a中，搅拌速度为200-300rpm/min，搅拌时间为5.5-7h。
10.根据权利要求9所述的应用于铁超载区域的干细胞支架的制备方法，其特征在于：步骤a中，搅拌速度为250rpm/min，搅拌时间为6h。
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CN113304322A (zh) * 2021-06-11 2021-08-27 北京中瑞联合生物科技有限公司 一种用于软骨修复的角蛋白材料与细胞复合物及其制备方法

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