CN104189958B

CN104189958B - 用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法

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Publication number: CN104189958B
Application number: CN201410423055.3A
Authority: CN
Inventors: 曹丰; 邓红兵; 陈江炜; 王亚斌
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2014-08-25
Filing date: 2014-08-25
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2034-08-25
Also published as: CN104189958A

Abstract

本发明涉及一种用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法，包括以下步骤：静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板(mat)；通过层层自组装技术(LBL)将带正电的壳聚糖(CS)和带负电的丝素蛋白(SF)逐层交替组装到纳米纤维表面，组装5.5-10.5层，形成CS-SF复合纳米纤维膜；在该膜表面种植以绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)标记的脂肪间充质干细胞(AD-MSC)或心脏祖细胞(iPS-CPC)种子细胞，通过三维共培养，制得本发明多功能补片。该补片不仅具有良好生物相容性，可作为细胞载体，还具有抗氧化应激的作用，可提高干细胞的存活率，提高治疗效率，还可评估移植干细胞的数量、分布和功能状态，能有效预防心肌梗死后心力衰竭的发生和降低缺血性心肌病的死亡率，为急性心肌梗死的治疗提供一种新的手段。

Description

用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法

技术领域

本发明涉及一种组织工程技术，特别是涉及一种用于促进急性心肌梗死后心肌组织再生和干细胞检测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维补片的制备方法。

背景技术

据2012年世界卫生组织统计，缺血性心脏病已成为世界范围内危害人类健康的第一杀手，占全因死亡率的13.2％，其中约一半患者死于急性心肌梗死。哺乳动物心脏是终末分化器官，一旦坏死难以自身再生修复，随着心肌细胞的坏死和大量丢失进而导致心室重塑的进展，最终进展为心力衰竭。目前传统的治疗方法，如冠脉搭桥手术、药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗等，虽然可明显缓解症状、重建血运、挽救濒死心肌，但对已经坏死的心肌细胞却回天乏术，不能有效降低远期心衰的发生率。心脏移植是治疗终末期心脏病的根治手段，但由于供体缺乏和免疫排斥等因素而无法临床广泛推广。因此，临床急需建立一种抑制心室重塑、促进心肌再生和改善心梗后心功能的治疗方法，有效预防心肌梗死后心力衰竭的发生和降低缺血性心肌病的死亡率。

干细胞(stemcell)的研究为心脏再生带来了曙光。GunnarThomas在1957年将正常人的骨髓移植到白血病患者体内，成功地使干细胞分化为有功能的正常细胞，拉开了再生医学(regenerativemedicine)的帷幕。2001年Orlic等将雄性小鼠的骨髓干细胞移植入雌性小鼠的梗死心肌周边区，发现干细胞可在梗死周边区存活并分化为心肌细胞，同时促进血管新生。这一重要发现引发了心梗干细胞治疗的热潮。大量研究已证实，干细胞可减少心梗面积、抑制心室重塑，改善心功能。对于其作用机制的阐述，主要集中在以下几个方面：1、干细胞通过旁分泌作用和免疫调节作用，改善微环境，提高细胞存活率，促进新生血管形成；2、移植干细胞促进自体干细胞的归巢和分化；3、干细胞分化为有功能的心肌细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞，参与组织修复。治疗急性心梗最常用的干细胞移植途径是冠脉内注射和心肌内注射。大量研究均证实，在干细胞移植后一周内，其存活率不足10％，最终能分化为心肌细胞的更不足2％，且仅局限于梗死边缘区。局部缺血缺氧、氧化应激、炎症反应等因素使得机体微环境不利于干细胞的存活，所以，提高干细胞移植后的存活率成为干细胞治疗的关键所在。基于组织工程技术的心脏补片已成为近年来的研究热点。

心脏补片是干细胞载体，也是细胞渗透、趋化、定植和生长分化的支架，既要有很好的生物相容性，还要为心室提供适当的机械支撑。因此，材料的选择和设计极为关键。目前研究中用于心脏补片的材料主要包括去细胞生物组织材料(naturalECM)，人工合成材料(artificialmaterials)和生物高分子材料(biopolymermaterials)。去细胞生物组织材料主要取材于心包、网膜、小肠等生物组织。人工合成材料常用的有聚乳酸(PLA)，聚乙二醇(PEG)，聚丙烯(PP)，多聚丙交酯/乙交酯(PLGA)等。生物高分子材料包括丝素蛋白(silkfibrin)，胶原蛋白(collagenIandIII))，海藻酸磷酸盐(alginate)，粘多糖(glycosaminoglycan),明胶(gelatin)，基质胶(matrigel)，壳聚糖(chitosan)，纤维素(cellulose)等。由于保留了包括脉管系统在内的组织支架，去细胞生物组织材料很好的模拟了细胞生长的微环境，但不利于人为改良和调控，不能实现药物或细胞因子缓释，且研究表明，新生组织仍无法与宿主心肌组织形成有效的机电偶联。人工合成材料最先应用于心脏补片，由于材料系人工合成的聚合物，并非机体组成成分，其生物相容性和免疫原性远逊于生物材料，难以模拟细胞外基质成分的结构和功能，近年来已逐渐被生物高分子材料所取代。生物高分子材料是从生物体提取加工而来，相较人工合成材料，其免疫原性低，生物相容性好，很多材料其本身即为细胞外基质的主要成分，如胶原蛋白、基质胶等。还可根据组织特异性使用不同的制作工艺，如真空冻干技术、静电纺丝技术、3D打印技术等，将一种或数种材料加工成具有特定结构和功能的多孔复合材料。生物高分子材料已成为心脏补片的研究热点。

发明内容

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种促进急性心肌梗死后组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维补片的制备方法，其基于组织工程技术，为急性心梗的干细胞治疗提供一种新思路新方法，不仅可以提高干细胞的存活率，提高治疗效率，还可以活体评估移植干细胞的数量、分布和功能状态。

心脏是一个不停搏动的器官，要求作为心脏补片的材料具有一定的可塑性、柔软性、弹性、机械强度等物理特性。同时，作为干细胞生长的支架和外基质(ECM)，良好的亲水性、合适的表面电荷、适当的孔隙尺寸更适合细胞的附着生长。根据以上特点，本发明通过静电纺丝技术，使纤维素在纳米级水平加工为适合细胞生长分化的互相贯通的多孔三维微观结构，并利用层层自组装(LBL)技术，用丝素蛋白(SF)和壳聚糖(CS)对材料表面进行修饰，还可根据需要包被各种细胞因子或药物，从多个方面促进干细胞的附着和生长，提高干细胞治疗的效率。纤维素是自然界取之不尽的资源，具有良好的机械强度和可塑性，利用静电纺丝技术将其加工为纳米纤维，增加其比表面积，有利于细胞的附着和营养交换。Kelley等在1999年发现，限制急性心梗后的心脏扩大，即可抑制左室重塑，改善心功能，并减少二尖瓣反流。纤维素并不能在体内自然降解，所以可稳定地为心室提供机械支撑，起到抑制左室重塑的作用。丝素蛋白取自蚕丝，有良好的生物相容性，柔软性和弹性俱佳，是组织工程的理想材料，尤适于跳动的心脏,且具有缓释作用。壳聚糖是甲壳类节支动物外壳中甲壳素脱乙酰基后的产物，亲水性极好，还是自然界唯一带正电的生物材料，可吸附表面带负电的细胞，其本身还具有一定的抑菌作用，这些特性均有利于干细胞的黏附生长。由三者所制备的本发明复合纳米纤维有望综合优点，弥补缺陷，使之成为理想的心脏补片材料。

大量研究表明，间充质干细胞可作为组织修复理想的种子细胞。胚胎干细胞存在伦理学争议和产生畸胎瘤的问题，骨骼肌成肌细胞无法与宿主心肌形成电偶联，易诱发心律失常，皮质骨干细胞取材不便，分离培养过程复杂，心脏原位干细胞数量极少，难以满足心脏再生的需求。而间充质干细胞来源广泛，取材方便，免疫原性低，且不产生畸胎瘤，连续传代培养和冷冻保存后仍保留多向分化潜能，可作为组织修复理想的种子细胞。其中，脂肪间充质干细胞(AD-MSC)大量存在于脂肪组织，易于扩增，旁分泌作用和分化能力好，作为医学整形的废料，还可加以回收利用，具有良好的临床应用前景。此外，iPS细胞打破了干细胞来源途径的限制，它也具备和胚胎干细胞类似的分化为三个胚层的能力，因其来源于体细胞，避免了伦理学问题，近年来逐渐成为再生领域研究的热门。将iPS细胞诱导分化为心脏祖细胞(iPS-CPC细胞),可避免产生畸胎瘤，并提高定向分化为心肌细胞的效率。所以，本发明采用AD-MSC和iPS-CPC作为心脏补片理想的种子细胞。

分子影像作为一种非侵袭性的检测手段，能够对移植干细胞进行示踪并评价干细胞治疗的效果。分子影像技术主要包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、核磁共振成像(MRI)以及光学成像等。利用这些技术，使我们能够在活体状态下从分子水平观察细胞的功能代谢，对目标分子进行追踪，实现对疾病的诊断和疗效评价。其中，光学成像具有敏感度高、操作简便、成本低、无电离辐射、可长期定量监测等优点，主要包括生物发光成像和荧光成像技术，近年来已广泛用于移植细胞的示踪。生物发光是生物体内荧光素酶催化荧光素将化学能转化为光能而发光，具有灵敏度高、背景低以及信号强度与细胞的数量呈量化关系的优点。荧光成像是特定波长的激发光激发荧光分子而产生荧光，能够活体示踪荧光蛋白，还可利用荧光分子断层扫描技术，通过图像重建提供目标的深度信息以及对目标物进行立体成像。本发明利用萤火虫荧光素酶(Fluc)和绿色荧光蛋白(GFP)双重报告基因对干细胞进行标记，可在活体状态下从分子水平观察细胞的功能代谢，动态连续检测干细胞的归巢、迁移、分布、增殖和分化，评估干细胞治疗效果。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法，包括以下步骤：

(1)静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板(Mat)；

(2)通过层层自组装技术(LBL)将带正电的壳聚糖(CS)和带负电的丝素蛋白(SF)逐层交替组装到步骤(1)得到的纤维素纳米纤维底板表面，组装5.5-15.5层，形成壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维膜；

(3)在步骤(2)得到的复合纳米纤维膜表面种植以绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)标记的脂肪间充质干细胞(AD-MSC)或心脏祖细胞(iPS-CPC)种子细胞；通过三维共培养，制得所述用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片。

本发明制备方法中，静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板(Mat)包括以下具体步骤：

将醋酸纤维素以15-18％的质量浓度溶解至质量比为2:1的丙酮和二甲基乙酰胺(DMAc)混合溶液中，采用静电纺丝装置，将混合溶液吸入带金属针头的塑料注射器进行静电纺丝，其中，静电纺丝的控制电压为15-18千伏，接收距离为18-20cm,滚筒以不高于100米/分的线速度转动，环境温度为22-30℃，相对湿度35-45％，静电纺丝时间为8-16小时；将制备的醋酸纤维素纳米纤维底板，置于真空中室温条件下干燥，以去除溶剂，再将干燥后的所述底板置于氢氧化钠溶液中水解，室温晾干。

所述的纤维素纳米纤维底板(Mat)的制备中，优选金属针头的内径为1㎜；注射器由注射泵以0.5ml/h的速度驱动，制备的醋酸纤维素纳米纤维底板，置于真空中室温条件下干燥时间为至少24小时，干燥后的所述底板置于0.05mol/L氢氧化钠溶液中水解至少七天。

本发明制备方法中，壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维膜的形成包括下列具体步骤：

将带正电荷的壳聚糖以质量浓度为1％至2％的乙酸溶液为溶剂，配成1㎎/L的溶液，PH值调定至5.0，带负电荷的丝素蛋白配成1㎎/L的水溶液，PH调定至5.3，将纤维素纳米纤维底板浸入带正电的壳聚糖溶液至少20分钟，用0.1mol/L的氯化钠溶液漂洗三次，每次2分钟；然后将纤维素纳米纤维底板浸入带负电的丝素蛋白溶液至少20分钟，0.1mol/L的氯化钠溶液漂洗三次,每次2分钟，重复5.5-15.5次，得到覆盖5-10层壳聚糖-丝素蛋白双分子层，最外层覆盖一层壳聚糖的所述壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维膜。

上述复合纳米纤维膜的制备中，还包括将制备好的复合纳米纤维膜用剂量为3kGy的⁶⁰Coγ射线辐照3小时作灭菌处理。

本发明制备方法中，在复合纳米纤维膜表面种植以绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)标记的脂肪间充质干细胞(AD-MSC)或心脏祖细胞(iPS-CPC)种子细胞,进行三维共培养，包括：

将辐照灭菌后的壳聚糖-丝素蛋白纳米纤维膜制成所需的形状和大小，将种子细胞AD-MSC或iPS-CPC消化、重悬，制成单细胞悬液，以20000-200000/cm²的种植密度种植到材料表面，置于37℃、100％湿度、5％CO₂孵箱，共培养24-96小时，使细胞最终密度达到4x10⁵-5x10⁵/cm²,可获得用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片。

本发明所述制备方法中，还包括种子细胞脂肪间充质干细胞(AD-MSC)的分离培养及心脏祖细胞(iPS-CPC)的筛选培养：

(1)脂肪间充质干细胞(AD-MSC)的分离培养包括：取6-8周稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)的雄性FVB小鼠精囊腺、双肾周围脂肪组织，用0.2％Ⅰ型胶原酶，37℃水浴消化1h，直至无肉眼可见组织块，用完全培养液(DMEM/F12培养基含15％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素)置于37℃、100％湿度、5％CO₂孵箱中培养，当细胞长满60％-80％培养瓶时，用0.25％胰酶(含0.01％EDTA)消化传代，选用第二代至第五代AD-MSC作为种子细胞备用；

(2)心脏祖细胞(iPS-CPC)细胞的筛选培养包括:取孕12.5天-14.5天的C57孕鼠进行小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的原代分离培养以及饲养层的制备，参照Yamanaka诱导培养miPS的方法，每日换液、每2-3天按1∶8的比例进行单细胞传代培养，将培养3天的miPSCs用0.025％的胰酶消化成单细胞，差速贴壁30min以去除绝大部分饲养层细胞，1小时后，取上清细胞悬液，计数、离心后，使用分化培养基(无Lif，余同miPS培养基)按照每滴20μl，500个/ml的密度将miPS悬液滴加到10cm培养皿盖的内面，皿底加15mlPBS，将皿盖翻转并盖好，进行悬浮培养，肉眼可见悬滴内有白色小颗粒，即为拟坯体(EB)，将拟坯体(EB)移入低黏附培养皿中进行悬浮培养，3天(d)后，将EB转移至预先铺有0.1％明胶的培养板中继续贴壁培养，在贴壁培养后第2天(即诱导后第6天)，使用accutase酶将EB消化至单细胞，用荧光标记的flk-1单克隆抗体，无菌条件下进行流式分选，将flk-1阳性细胞(即iPS-CPC细胞)使用无菌血清收集后使用分化培养基继续贴壁培养。

本发明的有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1、本发明选择CS-SF纳米纤维膜作为补片材料，制备该材料所用的原料均为天然高分子材料。纤维素结构稳定，可塑性强，静电纺丝制备的纳米纤维直径和孔径均匀，其微观结构适合作为支撑细胞生长分化的三维支架。纤维素作为一种结构稳定的大分子高糖，免疫原性低，虽不能在组织中自然降解，但可以稳定存在于心外膜起物理支撑作用，抑制左室重塑。壳聚糖亲水性极好，使得补片在使用过程中不需要人为缝合固定，可直接黏附到心外膜表面。同时，壳聚糖具有良好的生物相容性，临床应用广泛，作为自然界唯一带正电的生物材料，可吸附表面带负电的细胞，其本身具有的抑菌作用，使局部感染发生率极低。丝素蛋白作为一种天然高分子纤维蛋白，具有良好的柔韧性和抗拉伸强度，能适应搏动的心脏。丝素蛋白可在体内缓慢降解，具有缓释效应，在层层自组装过程中包被的细胞因子或药物可随着丝素蛋白的降解持续释放。将三种材料制备成独特的复合纳米纤维膜，一方面，利用纤维素纳米纤维膜的微观结构，为细胞生长分化提供了相互贯通的三维空间，同时也利用纤维素不在体内完全降解的特点，为心室提供持续的机械支撑力，限制心腔扩大，抑制心室重塑，延缓心衰进程；另一方面，利用丝素蛋白和壳聚糖弥补了纤维素生物相容性相对较差的缺陷，并综合了丝素蛋白柔韧性、缓释作用和壳聚糖黏附性强和促细胞生长的作用。

2、本发明选用AD-MSC和iPS-CPC作为种子细胞，AD-MSC在脂肪组织中含量丰富，旁分泌作用和分化能力好，作为医学整形的废料，可加以回收利用，具有良好的临床应用前景。iPS-CPC是由iPS细胞分化而来的心脏祖细胞，无成瘤性，可批量生产，向心肌细胞定向分化的效率高，有大面积推广的潜力。

3、本发明所应用的干细胞稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)，可利用活体成像系统(BLI)实时动态长程观察补片所携带的干细胞的分布和转归，并对补片的治疗作用进行客观有效的评估。

本发明多功能补片不仅具有良好生物相容性，可作为细胞载体，还具有抗氧化应激的作用，可提高干细胞的存活率，提高治疗效率，还可评估移植干细胞的数量、分布和功能状态,能有效预防心肌梗死后心力衰竭的发生和降低缺血性心肌病的死亡率，为急性心肌梗死的治疗提供一种新的手段。

附图说明

图1为纤维素、壳聚糖和丝素蛋白的ζ-电位；

图2a和图2b分别为纤维素纳米纤维底板和壳聚糖-丝素蛋白(CS-SF)纳米纤维膜的X射线光电子能谱分析(XPS)；

图3为壳聚糖-丝素蛋白(CS-SF)纳米纤维膜直径和孔径分布图；

图4为扫描电镜观察CS-SF纳米纤维膜及其与AD-MSC共培养的微观结构；

图5为细胞活体成像系统(BLI)结果；

图6为心梗模型的建立和补片治疗的照片；

图7为小鼠活体成像系统(BLI)结果；

图8为小动物超声检测心功能的结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法，包括以下步骤：

(1)静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板(Mat)；

(3)在步骤(2)得到的复合纳米纤维膜表面种植以绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)标记的AD-MSC或iPS-CPC种子细胞；通过三维共培养，制得所述用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片。

实施例一静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板(Mat)

例(1).将醋酸纤维素(CA,Mn＝3×10⁴Da,AldrichCo.,USA)以15％的质量浓度溶解至质量比为2:1的丙酮和二甲基乙酰胺(DMAc)混合溶液中，将其吸入带金属针头的塑料注射器，针头内径为1㎜。针头与覆盖有铝箔纸的滚筒收集器相距20㎝，施加的直流电压为16千伏。注射器由注射泵以0.5ml/h的速度驱动，滚筒以100米/分的线速度转动，环境温度为25℃，相对湿度40％，静电纺丝时间为16小时。将制备的CA纳米纤维底板，置于真空中室温条件下干燥24小时，以去除溶剂。再将干燥后的CA纳米纤维底板置于0.05mol/L氢氧化钠溶液中水解七天，室温晾干,得到所需的纤维素纳米纤维底板(Mat)。

例(2).醋酸纤维素(CA，Mn＝3×10⁴Da,AldrichCo.,USA)的质量浓度为16.5％，针头与覆盖有铝箔纸的滚筒收集器相距19㎝，施加的直流电压为18千伏，环境温度为22℃，相对湿度45％，静电纺丝时间为8小时，其它组分、操作条件和过程与上述实施例一例(1)相同，得到所需的纤维素纳米纤维底板(Mat)。

例(3).醋酸纤维素(CA，Mn＝3×10⁴Da,AldrichCo.,USA)的质量浓度为18％，针头与覆盖有铝箔纸的滚筒收集器相距18㎝，施加的直流电压为15千伏，环境温度为30℃，相对湿度35％，静电纺丝时间为12小时，其它组分、操作条件和过程与上述实施例一例(1)相同，得到所需的纤维素纳米纤维底板(Mat)。

实施例二壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维膜的形成

例(1)将带正电荷的壳聚糖(CS,Mw＝2.0×10⁵kDa,DD＝92％，ZhejiangYuhuanOceanBiochemicalCo.,China)，以质量浓度2％的乙酸溶液为溶剂，配成1㎎/L的溶液，PH值调定至5.0，带负电荷的丝素蛋白(SF,AladdinChemicalReagentCo.,China)配成1㎎/L的水溶液，PH调定至5.3。将实施例一获得的纤维素纳米纤维底板浸入带正电的壳聚糖(CS)溶液20分钟，用0.1mol/L的氯化钠溶液漂洗三次，每次2分钟。然后将该纳米纤维底板浸入带负电的丝素蛋白(SF)溶液20分钟，0.1mol/L的氯化钠溶液漂洗三次。每次2分钟。这一过程可使纳米纤维表面覆盖壳聚糖-丝素蛋白(CS-SF)双分子层，重复10.5次，可得到覆盖10层壳聚糖-丝素蛋白(CS-SF)双分子层，最外层覆盖一层壳聚糖(CS)的复合纳米纤维膜。将制备好的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维膜纳用剂量为3kGy的⁶⁰Coγ射线辐照3小时作灭菌处理。

例(2)溶解壳聚糖的乙酸溶液的质量浓度为1％，使纳米纤维表面覆盖壳聚糖-丝素蛋白(CS-SF)双分子层，重复5.5次，其它组分、操作条件和过程包括之后的灭菌处理与上述实施例二例(1)相同，可得到覆盖5层壳聚糖-丝素蛋白(CS-SF)双分子层，最外层覆盖一层壳聚糖(CS)的复合纳米纤维膜。

例(3)溶解壳聚糖的乙酸溶液的质量浓度为2％，使纳米纤维表面覆盖壳聚糖-丝素蛋白(CS-SF)双分子层，重复15.5次，其它组分、操作条件和过程包括之后的灭菌处理与上述实施例二例(1)相同，可得到覆盖15层壳聚糖-丝素蛋白(CS-SF)双分子层，最外层覆盖一层壳聚糖(CS)的复合纳米纤维膜。

实施例三种子细胞AD-MSC的分离培养及iPS-CPC的筛选培养

(1)脂肪间充质干细胞(AD-MSC)的分离培养

取6到8周稳定表达GFP和Fluc的雄性FVB小鼠，脱颈处死后，用75％酒精浸泡5min。在超净台中逐层剪开腹腔，取小鼠精囊腺、双肾周围脂肪组织，用含100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素的PBS液漂洗三次，并仔细清除残留血迹及结缔组织，将脂肪块剪成约1mm³大小，移入离心管中，加5ml0.2％Ⅰ型胶原酶，37℃水浴消化，每10min轻轻摇晃1min，共约1h，使组织与消化酶充分接触，直至无肉眼可见组织块。加入5ml含血清培养液终止消化，1000r/min离心10min。弃上清，用完全培养液(DMEM/F12培养基含15％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素)轻轻吹打重悬后，接种至培养瓶，置于37℃、100％湿度、5％CO₂孵箱中培养，12h后首次换液，以后隔天换液。用倒置相差显微镜观察细胞形态，当细胞长满60％至80％培养瓶时，用0.25％胰酶(含0.01％EDTA)消化传代。选用第二代至第五代AD-MSC作为种子细胞与材料进行共培养。

(2)miPS细胞的培养、拟胚体(EB)的诱导和iPS-CPC细胞的筛选

1.小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的原代分离培养以及饲养层的制备

取孕12.5d至14.5d的C57孕鼠，脱颈处死后，酒精浸泡3min，超净台内逐层剪开腹腔，取出胚胎，去除头、心脏、四肢与尾巴，将胚胎剪碎后，加入0.25％胰酶(含0.038％EDTA)消化5min。加入等量MEF培养基终止消化后，离心，重悬，按照每个T75培养瓶2到3个胚胎的细胞量进行原代培养。以1:4的传代比例将MEF培养至第三代，用50Gy伽马射线照射MEF抑制其生长。按6×10⁴/cm²的密度接种到预先铺有0.1％明胶的培养瓶中，接种后第2至10d的细胞即可用作miPS细胞的饲养层。

2.小鼠诱导性多功能干细胞(miPS)细胞的培养

参照Yamanaka诱导培养miPS的方法，每日换液、每2至3天(d)按1∶8的比例进行单细胞传代培养。miPS培养基：Knockout-DMDM(Gibco公司)，15％ES验证的胎牛血清(PAA公司),1％非必需氨基酸(PAA公司),1％L-谷氨酰胺(PAA公司),0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco公司)，1％青/链霉素(PAA公司),1000IU/mlLif(Millipore公司)。

3.拟胚体(EB)的诱导

将培养3d的miPSCs用0.25％的胰酶消化成单细胞，差速贴壁30min以去除绝大部分饲养层细胞。1小时后，取上清细胞悬液，计数、离心后，使用分化培养基(无Lif，余同miPS培养基)按照每滴20μl，500个/ml的密度将miPS悬液滴加到10cm培养皿盖的内面，皿底加15mlPBS，将皿盖翻转并盖好，孵箱中培养48h后取出，肉眼可见悬滴内有白色小颗粒，即为EB。用1ml的微量加样器将EB移入低黏附培养皿中进行悬浮培养。悬浮培养3d后，将EB转移至预先铺有0.1％明胶的培养板中继续贴壁培养。

4.心脏祖细胞(iPS-CPC)细胞的筛选

在贴壁培养后第2天(即诱导后第6天)，使用accutase酶将EB消化至单细胞。离心，弃上清，PBS洗3次。加入100ul荧光标记的flk-1单克隆抗体，37℃静置1小时。轻轻吸去上清，PBS洗1次。无菌条件下进行流式分选，将flk-1阳性细胞(即iPS-CPC细胞)使用无菌血清收集后使用分化培养基继续贴壁培养。

实施例四在CS-SF复合纳米纤维膜表面种植AD-MSC或iPS-CPC种子细胞,进行三维共培养

(1)将辐照灭菌后的CS-SF纳米纤维膜制成所需的形状和大小，将AD-MSC或iPS-CPC消化、重悬，制成单细胞悬液，以10⁵/cm²(10⁵/ml)的细胞浓度的种植密度种植到材料表面，其中，AD-MSC培养液：DMEM/F12培养基含15％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素，miPS-CPC分化培养液：Knockout-DMDM(Gibco公司)，15％ES验证的胎牛血清(PAA公司),1％非必需氨基酸(PAA公司),1％L-谷氨酰胺(PAA公司),0.1mMβ-巯基乙醇(Gibco公司)，1％青/链霉素(PAA公司)，将其置于37℃、100％湿度、5％CO₂孵箱，共培养48h，即可获得所需的用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能(心脏)补片。

(2)细胞种植密度为2x10⁵/cm²，共培养24h，其它组分、操作条件和过程与上述实施例四例(1)相同，即可获得所需的用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能(心脏)补片。

(3)细胞种植密度为20000/cm²，共培养96h，其它组分、操作条件和过程与上述实施例四例(1)相同，即可获得所需的用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能(心脏)补片。

本发明多功能补片的表征鉴定及在体应用：

1.纤维素、壳聚糖和丝素蛋白的ζ-电位

我们用电位测定仪测定了CA、CS、SF三种材料的ζ-电位，以明确LBL的具体实施方式，如图1所示，在PH为6.04、6.44、6.84条件下，CA、CS、SF的ζ-电位分别为﹣21.3、﹢25.4、﹣10.2(mV)。

2.纤维素纳米纤维底板和壳聚糖-丝素蛋白(CS-SF)纳米纤维膜的X射线光电子能谱分析(XPS)

为了进一步证实LBL的实施效果，我们用XPS检测材料表面的元素分布，如图2a和图2b所示：纤维素底板膜表面检测得到的C,O元素(图2a)，当自组装层数为10.5时(图2b)，膜表面除了C,O元素外，还检测出N,S元素。在三种材料中，氮元素可以作为壳聚糖的特征元素，硫元素可以作为丝蛋白的特征元素。这说明，经过LBL后，一定量的壳聚糖和丝素蛋白在静电相互作用力的驱动下都成功组装至纤维素纳米纤维底板表面。以上结果证实了LBL改性纳米纤维膜上的元素组成与相应的组装材料的存在。

3.扫描电子显微镜(SEM)观察CS-SF纳米纤维膜及其与细胞共培养后的微观结构

为了观察材料的微观结构以及和共培养后细胞(AD-MSC)的形态和生长状态，我们用扫描电子显微镜(S3400N,HITACHI,Japan)对材料进行了观察，加速电压为5.00kV。如图4所示，纳米纤维为粗细均一的细丝状，随机但均匀分布。我们选取50个随机视野对纳米纤维的直径和孔径进行了测量统计，如图3所示。种子细胞与材料共培养48h后，与材料黏附紧密，多数细胞呈梭形或多角形分布于材料表面，部分细胞重叠，成三维生长，细胞表面及周围可见颗粒状结构，可能为细胞分泌的细胞因子或蛋白质，说明细胞生长状态良好。细胞伸出伪足，细胞微丝互相缠绕或相互连接，呈网状结构，部分细胞部分或全部迁徙到材料孔隙内部，说明CS-SF纳米纤维膜具有很好的细胞相容性，如图4所示。

4.细胞生物发光成像(BLI)

取已知数量的AD-MSC细胞加入96孔板，每孔加生物发光成像底物D-luc3μl，于小动物活体成像系统(IVIS，Dynamic)中检测细胞荧光素酶(Fluc)的表达与细胞数量的关系。结果显示，Fluc的表达随细胞数量的增加而增加，定量分析显示光学信号强度与细胞数量呈线性相关，如图5所示。

5.心梗模型的建立和补片治疗

取8周雄性FVB小鼠，由小动物气体麻醉系统使用2％异氟烷进行麻醉，逐层分开胸壁，由第四肋间进胸，小心将心脏挤出体外，在距左心耳下缘3㎜处用6-0丝线结扎冠状动脉前降支，缝扎宽度2㎜，深度约1㎜，术中可见结扎线以下左心室心肌发白，术中心电图可见ST-T段抬高，说明小鼠急性心梗模型建立成功。心梗同时，小心拨开心包，在结扎线以下梗死区心外膜表面贴覆种植有AD-MSC的纳米纤维膜(6×6㎜²，细胞数0.5×10⁵)，如图6所示。小心将心脏送入胸腔，轻轻挤压排气后关胸。

6.小鼠BLI监测干细胞存活和转归

为监测移植干细胞在小鼠体内的存活，在术后3d、7d、14d、28d分别对小鼠进行BLI活体成像。小鼠胸部脱毛后，腹腔注射生物发光成像底物D-luc50μl，小鼠活动5分钟后，由小动物气体麻醉系统使用2％异氟烷对其进行麻醉。如图7所示，小鼠术后3d、7d、14d、28d，小鼠的荧光素酶(Fluc)的信号逐渐降低，但干细胞在移植28d后干细胞仍有存活。

7.心脏超声监测

在术后3d、7d、14d、28d对小鼠进行超声心功能监测。结果显示，相较心梗组，本发明多功能补片对心功能有明显改善作用，如图8所示。

Claims

1.一种用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板(Mat)；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，静电纺丝技术制备纤维素纳米纤维底板(Mat)包括以下具体步骤：

将醋酸纤维素以15-18％的质量浓度溶解至质量比为2:1的丙酮和二甲基乙酰胺(DMAc)混合溶液中，采用常规静电纺丝装置，将混合溶液吸入带金属针头的塑料注射器进行静电纺丝，其中，静电纺丝的控制电压为15-18千伏，接收距离为18-20cm,滚筒以不高于100米/分的线速度转动，环境温度为22-30℃，相对湿度35-45％，静电纺丝时间为8到16小时；将制备的纤维素纳米纤维底板，置于真空中室温条件下干燥，以去除溶剂，再将干燥后的所述底板置于氢氧化钠溶液中水解，室温晾干。

3.如权利要求2所述的制备方法，特征在于，其中金属针头的内径为1㎜；注射器由注射泵以0.5ml/h的速度驱动，制备的纤维素纳米纤维底板，置于真空中室温条件下干燥时间至少为24小时，干燥后的所述底板置于0.05mol/L氢氧化钠溶液中水解至少七天。

4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维膜的形成包括下列具体步骤：

将带正电荷的壳聚糖以质量浓度为1％至2％的乙酸溶液为溶剂，配成1㎎/L的溶液，PH值调定至5.0，带负电荷的丝素蛋白配成1㎎/L的水溶液，PH调定至5.3，将纤维素纳米纤维底板浸入带正电的壳聚糖溶液至少20分钟，用0.1mol/L的氯化钠溶液漂洗三次，每次2分钟；然后将纤维素纳米纤维底板浸入带负电的丝素蛋白溶液至少20分钟，0.1mol/L的氯化钠溶液漂洗三次,每次2分钟，重复5.5-15.5次，得到覆盖5-15层壳聚糖-丝素蛋白双分子层，最外层覆盖一层壳聚糖的所述复合纳米纤维膜。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括将制备好的复合纳米纤维膜用剂量为3kGy的⁶⁰Coγ射线辐照3小时作灭菌处理。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在复合纳米纤维膜表面种植以绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)标记的脂肪间充质干细胞(AD-MSC)或心脏祖细胞(iPS-CPC)种子细胞,进行三维共培养，包括：

将辐照灭菌后的壳聚糖-丝素蛋白纳米纤维膜制成所需的形状和大小，将种子细胞脂肪间充质干细胞(AD-MSC)或心脏祖细胞(iPS-CPC)消化、重悬，制成单细胞悬液，以20000-200000/cm²的细胞浓度的种植密度种植到材料表面，将其置于37℃、100％湿度、5％CO₂孵箱，用细胞脂肪间充质干细胞(AD-MSC)培养液或心脏祖细胞(iPS-CPC)分化培养液共培养24-96小时，可获得用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括种子细胞脂肪间充质干细胞(AD-MSC)的分离培养及心脏祖细胞(iPS-CPC)的筛选培养：

(1)脂肪间充质干细胞(AD-MSC)的分离培养包括：取6-8周稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)的雄性FVB小鼠精囊腺、双肾周围脂肪组织，用0.2％Ⅰ型胶原酶，37℃水浴消化1小时，直至无肉眼可见组织块，用完全培养液置于37℃、100％湿度、5％CO₂孵箱中培养，当细胞长满60％-80％培养瓶时，用含0.01％EDTA的0.25％胰酶消化传代，选用第二代至第五代AD-MSC作为种子细胞备用；所述完全培养液为DMEM/F12培养基含15％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素；

(2)心脏祖细胞(iPS-CPC)细胞的筛选培养包括:取孕12.5天-14.5天的C57孕鼠进行小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的原代分离培养以及饲养层的制备，参照Yamanaka诱导培养小鼠诱导性多功能干细胞(miPS)的方法，每日换液、每2至3天按1∶8的比例进行单细胞传代培养，将培养3天的鼠源诱导性多功能干细胞(miPSCs)用0.25％的胰酶消化成单细胞，差速贴壁30min以去除绝大部分饲养层细胞，1小时后，取上清细胞悬液，计数、离心后，使用分化培养基按照每滴20μl，500个/ml的密度将miPS悬液滴加到10cm培养皿盖的内面，皿底加15mlPBS，将皿盖翻转并盖好，进行悬浮培养，肉眼可见悬滴内有白色小颗粒，即为拟坯体(EB)，将拟坯体(EB)移入低黏附培养皿中进行悬浮培养，3天后，将拟坯体(EB)转移至预先铺有0.1％明胶的培养板中继续贴壁培养，在贴壁培养后第2天，即诱导后第6天，使用Accutase酶将拟坯体(EB)消化至单细胞，用荧光标记的flk-1单克隆抗体，无菌条件下进行流式分选，将flk-1阳性细胞，即心脏祖细胞(iPS-CPC)使用无菌血清收集后使用分化培养基继续贴壁培养；所述分化培养基无Lif，余同miPS培养基。