CN110724668B - 一种用于构建体外肿瘤模型的3d支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体是一种用于构建体外肿瘤模型的3D支架及其制备方法和应用。本发明的3D支架主要是由以下重量份配比的原材料组成：SF：Cs：Alg＝1:1:1。本发明还包括所述3D支架在构建体外肿瘤模型中的应用。其优点表现在：1、通过选取各原材料及其之间的最佳配比，优选制备方法，得到降解率适中、膨胀率适中、吸水率高、孔隙率高的3D支架。2、利用3D体外培养系统取代2D细胞培养用于结肠癌体外细胞培养，更加真实地模拟结肠癌细胞在体内的生物学行为，为结肠癌的诊治提供更加可靠的基础研究依据。3、利用该支架构建的肿瘤体外模型既为基层科研机构提供简单方便，同时又与体内肿瘤生长状态接近。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体地说，是一种用于构建体外肿瘤模型的3D支架及其制备方法和应用。
背景技术
细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、毒理学、新药研发、生物工程等各个领域，研究和观察细胞的形态结构和生命活动的技术手段已成为生命研究的一种必要的筛选和预实验手段。
目前，常规的细胞培养模式包括二维细胞培养，是在细胞培养板如2、4、6、12、24、48、96孔细胞培养板或细胞培养瓶、生物反应器等中进行，细胞在培养基中以一种二维方式单层贴壁生长。然而，多项研究发现在体外二维培养的细胞的基因表达、信号转导和形态学都可能与在生物体内三维生长的细胞有差异。
现有技术存在以下缺陷：
1、利用现有的2D细胞培养板，细胞形态发生改变，极性发生改变，骨架发生重构，随之而来的是细胞的生物学行为的改变；
2、利用细胞培养皿或细胞培养板培养细胞存在细胞微环境过于简单的弊端，查阅文献得知，体内结直肠癌细胞微环境存在物理、化学和生物信号等复杂的信号刺激，而细胞培养板或细胞培养皿难以完全模拟上述的物理、化学和生物信号；
3、2D细胞培养板或培养皿培养面积较局限，结肠癌细胞培养需2-3天进行细胞传代，费时费力，细胞培养效率不高，而且传代作为外源性操作告饶。所以利用细胞培养板或细胞培养皿培养细胞较体内肿瘤细胞生物学行为差异较大。
4、利用裸鼠构建体外肠癌模型，需要大量的科研经费投入，需要SPF级的动物房(基层科研机构难以满足)，需要复杂的伦理审核程序，构建结肠癌体外模型成功率低，周期长。
针对上述缺陷，发明人设计了本发明：一种用于构建体外肿瘤模型的3D支架及其制备方法和应用，制得的3D支架具有降解率适中、膨胀率适中、吸水率高、孔隙率高的优点，且所述的3D支架可用于构建体外肿瘤模型中。
关于本发明一种用于构建体外肿瘤模型的3D支架及其制备方法和应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于构建体外肿瘤模型的3D支架。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述3D支架的制备方法。
本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述3D支架的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于构建体外肿瘤模型的3D支架，所述3D支架包括以下重量份配比的原材料：SF：Cs：Alg＝1:1:1，所述3D支架还包括原材料EDC和NHS；；
所述3D支架采用冷冻干燥法制成，所述3D支架的制备方法包括如下步骤：
步骤一：制备丝素蛋白溶液：
(1)取干净蚕茧壳剪成0.5-1cm2的碎片，称重，真空袋中保存备用，准备0.5％的碳酸钠溶液1000ml，并置于水浴锅中加热至沸腾，将5g蚕茧壳加入0.5％的碳酸钠溶液浸没，用搅拌棒搅拌，蚕茧壳煮沸3遍，每遍1个小时；
(2)用自然水洗蚕茧3次，再用去离子水洗3次，然后60℃烘箱10小时；
(3)将(2)干燥后的蚕茧溶解于溴化锂溶液中，配置9M溴化锂溶液，磁力搅拌器60℃搅拌加热，将烘干的丝素加入，使丝素充分溶解；冷却至室温，用布氏漏斗过滤；
(4)透析：滤液装入透析袋中用去离子水4℃冰箱里透析5天，每隔3小时换水一次，以去除丝素溶液中的小分子物质，制得丝素蛋白溶液；
(5)浓缩提纯：将制得的丝素蛋白液体仍由透析袋盛放，放入聚乙二醇6000粉剂中，干燥浓缩，收集液体，将其以3500r/min离心15min，将不溶物去除，留取上清液，置于4℃冰箱中保存，可保存一周；
(6)浓度测定：取3个称量瓶编号洗净后放入60℃恒温烘箱中烘干，充分冷却，称量三者重量，记为M1；各取10ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为M2；放入60摄氏度烘箱中12h取出，冷却后称重记为M3，按公式丝素蛋白溶液浓度％＝(M3-Ml)/(M2-M1)*100％，取三者平均值，得出丝素蛋白浓度为1.5％；
步骤二：壳聚糖溶液的配制：
称取1.5g CS粉末，加入去离子水定容至100ml，再加入2ml冰乙酸溶液，得到浓度为1.5％的淡黄色粘稠度较高的CS溶液；
步骤三：海藻酸盐溶液的制备：
称取1.5g海藻酸钠，用蒸馏水配制成100ml溶液，在50℃恒温水浴下搅拌1.5h，配制浓度为1.5％的海藻酸钠溶液，于10℃环境静置脱泡24h，备用；
步骤四：丝素蛋白壳聚糖三维支架构建：
(1)交联支架
1)步骤一制得的丝素蛋白溶液、步骤二制得的壳聚糖溶液、步骤三制得的海藻酸盐溶液三者按照重量份配比为1:1:1进行混合并搅拌均匀；
2)继续浸入含50mmol/L的EDC、18mmol/L NHS的95％乙醇水溶液中；
3)于24孔培养板每孔加入1ml混合溶液，96孔培养板每孔加入200μl混合溶液，去除气泡，将培养板依次置于4℃冰箱交联24h，-20℃冰箱冷冻12h，-80℃冰箱冷冻12h，冷冻干燥机冷冻干燥72h，即可得到SF/CS三维多孔支架，Co60辐照灭菌，备用。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的3D支架的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：制备丝素蛋白溶液：
(1)取干净蚕茧壳剪成0.5-1cm2的碎片，称重，真空袋中保存备用，准备0.5％的碳酸钠溶液1000ml，并置于水浴锅中加热至沸腾，将5g蚕茧壳加入0.5％的碳酸钠溶液浸没，用搅拌棒搅拌，蚕茧壳煮沸3遍，每遍1个小时；
(2)用自然水洗蚕茧3次，再用去离子水洗3次，然后60℃烘箱10小时；
(3)将(2)干燥后的蚕茧溶解于溴化锂溶液中，配置9M溴化锂溶液，磁力搅拌器60℃搅拌加热，将烘干的丝素加入，使丝素充分溶解；冷却至室温，用布氏漏斗过滤；
(4)透析：滤液装入透析袋中用去离子水4℃冰箱里透析5天，每隔3小时换水一次，以去除丝素溶液中的小分子物质，制得丝素蛋白溶液；
(5)浓缩提纯：将制得的丝素蛋白液体仍由透析袋盛放，放入聚乙二醇6000粉剂中，干燥浓缩，收集液体，将其以3500r/min离心15min，将不溶物去除，留取上清液，置于4℃冰箱中保存，可保存一周；
(6)浓度测定：取3个称量瓶编号洗净后放入60℃恒温烘箱中烘干，充分冷却，称量三者重量，记为M1；各取10ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为M2；放入60摄氏度烘箱中12h取出，冷却后称重记为M3，按公式丝素蛋白溶液浓度％＝(M3-Ml)/(M2-M1)*100％，取三者平均值，得出丝素蛋白浓度为1.5％；
步骤二：壳聚糖溶液的配制：
称取1.5g CS粉末，加入去离子水定容至100ml，再加入2ml冰乙酸溶液，得到浓度为1.5％的淡黄色粘稠度较高的CS溶液；
步骤三：海藻酸盐溶液的制备：
称取1.5g海藻酸钠，用蒸馏水配制成100ml溶液，在50℃恒温水浴下搅拌1.5h，配制浓度为1.5％的海藻酸钠溶液，于10℃环境静置脱泡24h，备用；
步骤四：丝素蛋白壳聚糖三维支架构建：
(1)交联支架
1)步骤一制得的丝素蛋白溶液、步骤二制得的壳聚糖溶液、步骤三制得的海藻酸盐溶液三者按照重量份配比为1:1:1进行混合并搅拌均匀；
2)继续浸入含50mmol/L的EDC、18mmol/L NHS的95％乙醇水溶液中；
3)于24孔培养板每孔加入1ml混合溶液，96孔培养板每孔加入200μl混合溶液，去除气泡，将培养板依次置于4℃冰箱交联24h，-20℃冰箱冷冻12h，-80℃冰箱冷冻12h，冷冻干燥机冷冻干燥72h，即可得到SF/CS三维多孔支架，Co60辐照灭菌，备用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述制备方法还包括如下步骤：
细胞接种于SF/CS三维多孔支架构建体外肿瘤模型：
将SF/CS三维多孔支架在培养液浸泡24h，预湿后将其置于24孔板内，将调整好浓度的细胞悬液取100ul滴加在材料上，然后将培养板置于震荡器上震荡5min，使细胞均匀接种于SF/CS三维多孔支架中。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的3D支架在构建体外肿瘤模型中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述体外肿瘤模型为结肠癌体外肿瘤模型。
本发明优点在于：
1、优选各原材料及其之间的最佳配比，优化制备方法，得到了降解率适中、膨胀率适中、吸水率高、孔隙率高的3D支架。
2、利用3D体外培养系统取代2D细胞培养用于结肠癌体外细胞培养，更加真实地模拟结肠癌细胞在体内的生物学行为，为结肠癌的诊治提供更加可靠的基础研究依据。
3、克服了现有技术的不足，利用本发明的支架构建的肿瘤体外模型既为基层科研机构提供简单方便的同时又与体内肿瘤生长状态接近，给越来越多的患者带来希望，具有重要的临床应用价值。
4、在组织工程中，已有以下多种支架制备方法：(1)气体发泡法：利用二氧化碳作为致孔剂制成所需孔隙结构，虽然解决了有机溶剂残留问题，但该方法制成的孔多为封闭结构，且孔径较小，不适合广泛使用。(2)微球烧结法：在高温条件下将微球烧结，冷却后即形成多孔支架。该方法存在的缺点同样为有机溶剂残留，孔隙率较低。(3)粒子沥滤法：通过分离粒子滤出法制备多孔支架。即使用溶于水而不溶于有机溶剂的颗粒作为致孔剂，根据不同物质不同的溶解性和挥发性去除致孔剂，从而形成多孔的支架。但该方法制成的支架孔支架连通性较差，且有有机溶剂残留。
本实验采用冷冻干燥法：将需冷冻干燥的材料先快速冷冻，然后在真空条件下将冰转化为水蒸气，再将水蒸气冷凝。该方法没有有机物质的参与，并且直接使用冷冻干燥机即可，操作简便，干燥后的物料保持原来的化学组成和物理性质(如多孔结构、胶体性质等)，热量消耗比其他干燥方法少。操作简便，且制成的多孔支架内部会形成内部连通性较好的疏松多孔的海绵状结构。
5、Qazvini等表明EDC/NHS是一种高效无毒的交联剂，因此我们制备复合支架时加入EDC/NHS作为交联剂提高支架的稳定性。
6、支架原材料：丝素蛋白(silk fibroin,SF)提取于蚕茧，是一种天然的蛋白质聚合物，占丝素重量的70％-80％。SF富含丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸等18种氨基酸，丝素蛋白特征氨基酸具有两性电解性性质，构象分为SilkⅠ和SilkⅡ,SilkⅠ包括无规卷曲和-螺旋，SilkⅡ包括反平行-折叠，并且这两种结构在一定的温度、溶剂极性、PH值、应力等条件下会进行互相转换，正是由于这些氨基酸氨基和侧链的化学修饰，从而可以较容易的改变表明性能。Altman等认为丝素蛋白具有如下优点：(1)有其良好的力学性能，优于其他天然纤维和合成纤维；(2)具有很长的应用历史，如外科领域和化妆品领域；(3)提取工艺相对简单，成本较低，并可制成多种形态；(4)因为SF由多种氨基酸构成，因此可以通过改变这些氨基酸的氨基和化学修饰改变其性能；(5)对肿瘤细胞的排异反应小。
7、壳聚糖(chitosan,CS)是从虾、蟹壳等提取的一种天然多糖，能被生物体内的溶菌酶降解并完全吸收，其降解产物是氨基葡萄糖。其是由甲壳素脱乙酰生成的，是唯一天然产生的阳离子碱性和亲水性多糖，具有较高的生物相容性、可生化性、可塑性和抗菌性。其能与结直肠癌细胞表面的负电荷发生作用，有利于结直肠癌细胞的粘附与聚集。
8、作为海洋源性生物材料，海藻酸盐来自海带、巨藻、墨角藻、泡叶藻等褐藻。生物相容性良好、毒性低、成本相对较低，此外还能被多价离子如Ca2+等温和地交联形成凝胶。
附图说明
附图1是支架大体实物图(A、对照组(SF/Cs组)支架实物图正面照B、对照组(SF/Cs组)支架实物图侧面照C、实验组(SF/Cs/Alg组)支架实物图正面照D、实验组(SF/Cs/Alg组)支架实物图侧面照)。
附图2是支架横切面光镜下照片(A、对照组横切面光镜下照片40X；B、对照组横切面光镜下照片100X；C、实验组横切面光镜下照片40X；D、实验组横切面光镜下照片100X)。
附图3是支架横切面扫描电镜下照片(A、对照组横切面电镜下照片250X；B、对照组横切面光镜下照片650X；C、实验组横切面光镜下照片230X；D、实验组横切面光镜下照片600X)。
附图4是支架理化参数(A、支架孔隙率；B、支架降解率；C、支架吸水率；D、支架膨胀率)。
附图5是CCK8增值实验结果：3D支架(SF/Cs/Alg＝1:1:1)上结肠癌细胞HCT-116细胞较2D细胞培养(B)增殖明显变快。
附图6是携带GFPHCT-116细胞荧光显微镜下照片(A、对照组接种细胞3d；B、实验组接种细胞3d；C、对照组接种细胞7d；D、实验组接种细胞7d)。
附图7是HCT-116细胞接种支架后扫描电子显微镜下照片(A1、对照组接种细胞1d250X；A2、对照组接种细胞1d 4000X；B1、实验组接种细胞1d 210X；B2、实验组接种细胞1d3500X；C1、对照组接种细胞3d 250X；C2、对照组接种细胞3d 3700X；D1、实验组接种细胞3d250X；D2、实验组接种细胞3d 3000X；E1、对照组接种细胞7d 250X；E2、对照组接种细胞7d4000X；F1、实验组接种细胞7d 210X；F2、实验组接种细胞7d 3200X)。
附图8是利用支架构建的体外肿瘤模型和利用裸鼠构建的皮下肿瘤模型HE染色结果(A、对照组支架接种细胞14d；B、实验组支架接种细胞14d；C、裸鼠左侧腋下接种细胞14d)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1制备丝素蛋白溶液
制备方法如下：
(1)取干净蚕茧壳剪成0.5-1cm2的碎片，称重，真空袋中保存备用，准备0.5％的碳酸钠溶液1000ml，并置于水浴锅中加热至沸腾，将5g蚕茧壳加入0.5％的碳酸钠溶液浸没，用搅拌棒搅拌，蚕茧壳煮沸3遍，每遍1个小时；
(2)用自然水洗蚕茧3次，再用去离子水洗3次，然后60℃烘箱10小时；
(3)将(2)干燥后的蚕茧溶解于溴化锂溶液中，配置9M溴化锂溶液，磁力搅拌器60℃搅拌加热，将烘干的丝素加入，使丝素充分溶解；冷却至室温，用布氏漏斗过滤；
(4)透析：滤液装入透析袋中用去离子水4℃冰箱里透析5天，每隔3小时换水一次，以去除丝素溶液中的小分子物质，制得丝素蛋白溶液；
(5)浓缩提纯：将制得的丝素蛋白液体仍由透析袋盛放，放入聚乙二醇6000粉剂中，干燥浓缩，收集液体，将其以3500r/min离心15min，将不溶物去除，留取上清液，置于4℃冰箱中保存，可保存一周；
(6)浓度测定：取3个称量瓶编号洗净后放入60℃恒温烘箱中烘干，充分冷却，称量三者重量，记为M1；各取10ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为M2；放入60摄氏度烘箱中12h取出，冷却后称重记为M3，按公式丝素蛋白溶液浓度％＝(M3-Ml)/(M2-M1)*100％，取三者平均值，得出丝素蛋白浓度为1.5％，备用。
实施例2制备壳聚糖溶液
制备方法如下：
称取1.5g CS粉末，加入去离子水定容至100ml，再加入2ml冰乙酸溶液，得到浓度为1.5％的淡黄色粘稠度较高的CS溶液。
实施例3制备海藻酸盐溶液
制备方法如下：
称取1.5g海藻酸钠，用蒸馏水配制成100ml溶液，在50℃恒温水浴下搅拌1.5h，配制浓度为1.5％的海藻酸钠溶液，于10℃环境静置脱泡24h，备用。
实施例4丝素蛋白壳聚糖三维支架的构建(一)
构建方法如下：
按照以下重量份配比称取各原材料：
(1)交联支架
1)实施例1-3分别制得的丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液、海藻酸盐溶液三者按照重量份配比为1:1:1进行混合并搅拌均匀；
2)继续浸入含50mmol/L的EDC、18mmol/L NHS的95％乙醇水溶液中；
3)于24孔培养板每孔加入1ml混合溶液，96孔培养板每孔加入200μl混合溶液，去除气泡，将培养板依次置于4℃冰箱交联24h，-20℃冰箱冷冻12h，-80℃冰箱冷冻12h，冷冻干燥机冷冻干燥72h，即可得到SF/CS三维多孔支架，Co60辐照灭菌，备用。
实施例5丝素蛋白壳聚糖三维支架的构建(二)
构建方法如下：
按照以下重量份配比称取各原材料：
(1)交联支架
1)实施例1-3分别制得的丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液、海藻酸盐溶液三者按照重量份配比为1:1:2进行混合并搅拌均匀；
2)于24孔培养板每孔加入1ml混合溶液，96孔培养板每孔加入200μl混合溶液，去除气泡，将培养板依次置于4℃冰箱交联24h，-20℃冰箱冷冻12h，-80℃冰箱冷冻12h，冷冻干燥机冷冻干燥72h，即可得到SF/CS三维多孔支架，Co60辐照灭菌，备用。
实施例6丝素蛋白壳聚糖三维支架的构建(三)
构建方法如下：
按照以下重量份配比称取各原材料：
(1)交联支架
1)实施例1-3分别制得的丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液、海藻酸盐溶液三者按照重量份配比为1:1:0.5进行混合并搅拌均匀；
2)于24孔培养板每孔加入1ml混合溶液，96孔培养板每孔加入200μl混合溶液，去除气泡，将培养板依次置于4℃冰箱交联24h，-20℃冰箱冷冻12h，-80℃冰箱冷冻12h，冷冻干燥机冷冻干燥72h，即可得到SF/CS三维多孔支架，Co60辐照灭菌，备用。
实施例7丝素蛋白壳聚糖三维支架的构建及性能检测
一、实验材料
人结肠癌细胞HCT-116(中国科学院上海生科院提供)；
家蚕茧(江苏徐州农家自养桑蚕)；
壳聚糖粉(上海麦克林生化科技有限公司提供，分子量约90万Da，脱乙酰度≥95％，粘度100-200mpa.s)；
海藻酸钠(生工生物工程(上海)股份有限公司提供，Reagent Grade，Purity≥90％)；
乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(生工生物工程(上海)股份有限公司提供，Reagent Grade)；
N-羟基丁二酰亚胺(生工生物工程(上海)股份有限公司提供，BR Grade，Assay≥98.0％)；
0.5％的碳酸钠溶液；去离子水；9M的溴化锂；醋酸；乙醇水溶液；聚乙二醇6000粉剂(生工生物工程(上海)股份有限公司)；二甲亚砜(DMSO)；CCK-8试剂盒；4％多聚甲醛；伊红；结晶紫；95％乙醇水溶液；0.9％NS；DMEM；FBS；青霉素-链霉素。
二、仪器
Thermo Scientific Nunc多孔细胞培养板(24孔、96孔)；
100mm皿底内直径85.6mm(耐斯特提供)；
F132592透析膜，标准等级，RC膜，3.5KD，扁平宽度46mm，容积6.4ml/cm F132592-00011M/PK，水浴锅，搅拌棒，磁珠，电动搅拌器，滤纸，滴定管，移液器，注射器，0.22微米除菌滤器，1ml注射器，50ml注射器，精密电子天平，温度计，PH试纸(普通和精密PH试纸)，500ml烧杯，1000ml烧杯，1000ml量筒，2000ml量筒，高压蒸汽灭菌锅，超净台，紫外灭菌橱。
三、操作步骤
步骤一、制备丝素蛋白溶液
(1)从江苏徐州农家购买蚕茧壳(未漂白)，挑选干净蚕茧壳剪成0.5-1cm2的碎片，称重，真空袋中保存备用，准备0.5％的碳酸钠溶液1000ml，用2000ml量筒盛放，并置于水浴锅中加热至沸腾，将5g蚕茧壳少量多次加入0.5％的碳酸钠溶液浸没，用搅拌棒搅拌。
蚕茧壳煮沸3遍，每遍1个小时；
(2)用自然水洗蚕茧3次，再用去离子水洗3次，然后60℃烘箱10小时；
(3)将干燥好的蚕茧溶解于溴化锂溶液中。配置9M溴化锂溶液，磁力搅拌器60℃搅拌加热，将烘干的丝素少量多次加入，使丝素充分溶解；冷却至室温，用布氏漏斗过滤；
(4)透析：滤液装入透析袋(截流分子量为3500Da)中用去离子水4℃冰箱里透析5天，每隔3小时换水一次，以去除丝素溶液中的小分子物质，如：Br-，Li+以及分子量过低的丝素蛋白分子，制得丝素蛋白溶液；
(5)浓缩提纯：将制得的丝素蛋白液体仍由透析袋盛放，放入聚乙二醇6000粉剂中，干燥浓缩，收集液体，将其以3500r/min离心15min，将不溶物去除，留取上清液，置于4℃冰箱中保存，可保存一周；
(6)浓度测定：取3个称量瓶编号洗净后放入60℃恒温烘箱中烘干，充分冷却，称量三者重量，记为M1。各取10ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为M2。放入60摄氏度烘箱中12h取出，冷却后称重记为M3，按公式丝素蛋白溶液浓度％＝(M3-Ml)/(M2-M1)*100％，取三者平均值，得出丝素蛋白浓度为1.5％。
步骤二、壳聚糖溶液的配制
称取1.5g CS粉末，加入去离子水定容至100ml，再加入2ml冰乙酸溶液，得到浓度为1.5％的淡黄色粘稠度较高的CS溶液。
步骤三、海藻酸盐溶液的制备
称取1.5g海藻酸钠，用蒸馏水配制成100ml溶液，在50℃恒温水浴下搅拌1.5h，配制浓度为1.5％的海藻酸钠溶液，于10℃环境静置脱泡24h，备用。
步骤四、丝素蛋白壳聚糖三维支架构建
(1)交联支架
1)丝素蛋白、壳聚糖溶液和海藻酸盐溶液三者混合并搅拌均匀；
2)继续浸入含50mmol/L的EDC、18mmol/L NHS的95％乙醇水溶液中(或者按每100ml混合溶液称取1g EDC，0.26g NHS，分别称取不同组的对应量，并加入1-2ml 95％乙醇溶液，将交联剂(EDC，NHS)加入上述SF、CS混合溶液)；
3)于24孔培养板每孔加入1ml混合溶液，96孔培养板每孔加入200μl混合溶液。去除气泡。将培养板依次置于4℃冰箱交联24h，-20℃冰箱冷冻12h，-80℃冰箱冷冻12h，冷冻干燥机冷冻干燥72h，即可得到SF/CS三维多孔支架材料，Co60辐照灭菌，备用。
步骤五、细胞接种于三维支架构建体外肿瘤模型
将支架材料在培养液浸泡24h，预湿后将其置于24孔板内。将调整好浓度的细胞悬液取100ul滴加在材料上，然会将培养板置于震荡器上震荡5min，使细胞均匀接种于三维支架材料中。将三组均置于同一培养箱1h后，于边缘加入培养基各为200ul，刚浸润支架材料，继续置于培养箱中观察。
步骤六、HCT116细胞构建裸鼠模型。
四、实验结果
1、见图1，从支架的实物图对比可知，实验组和对照组支架外观差异较小，均为圆柱形(24孔细胞培养板为模具)，米白色。对照组支架从模具中取出边缘呈毛糙状(见A图)，实验组从模具中取出边缘呈平滑状(见C图)。施加相同压力条件下(用游标卡尺调至相同刻度，于相同位置处夹持支架5min后，取下支架，相同环境下静置5min后观察并拍照)，对照组呈现明显的凹痕(见A图红色箭头)，实验组支架弹性较好，未见明显凹痕出现(见B图黑色箭头)。实验组和对照组均采用200微升原料溶液冻干而成，采用游标卡尺分别测量两组支架的厚度：实验组支架厚度(6.28±0.02mm)大于对照组支架(5.70±0.01mm)(P<0.05)，由此推测，实验组支架较对照组支架蓬松，即孔径更大，孔隙率更高。
2、将支架用石蜡切片机切成3μm薄片，光学显微镜下观察：见图2，实验组支架横切面孔径明显大于对照组孔径。采用ImageJ软件统计各组1000个孔后，得知对照组支架孔径(255±85μm)小于实验组支架孔径(400±158μm)(P<0.05)。
3、为了从微观上更加精细地对比两组支架，且为了克服光学显微镜只能观察二维结构的弊端，我们利用扫描电子显微镜观察支架的三维内部孔隙结构。我们将两组支架喷金以后扫描电镜下观察，见图3，可见实验组(图B、D)内部孔径较对照组内部孔径大，且排列更加规则。孔道壁结构更加平滑，从液体动力学角度来说，平滑的孔道壁结构更有利于液体流动，更有利于细胞营养物质和氧气的运输及代谢废物的排出，所有实验组支架更加适合细胞生长及作为体外细胞培养模型。
4、为了对比实验组与对照组支架的理化性质。本课题组从孔隙率、降解率、吸水率以及肿胀率四个参数进行对比。见图4，实验结果表明：实验组的孔隙率均较对照组高，而且实验组中又以SF/Cs/Alg(1:1:1)组支架的孔隙率最高(93.73±1.12％)(可见1:1:1为最优比例)。吸水率：SF/Cs/Alg(1:1:2)组支架有最高的吸水率(5261.70±69.95％)，其次是SF/Cs/Alg(1:1:1)组支架(3872.42±53.39％)。对照组SF/Cs(1:1)组支架有最低的吸水率(2473.38±60.00％)。SF/Cs(1:1)和SF/Cs/Alg(1:1:1)组支架吸水率是有统计学差异的(P<0.001)。膨胀率:SF/Cs/Alg(1:1:2)组支架膨胀率最高，其次是SF/Cs/Alg(1:1:1),andSF/Cs/Alg(1:1:0.5),SF/Cs(1:1).scaffold was the highest among all thescaffolds,followed by SF/Cs/Alg(1:1:1),and SF/Cs/Alg(1:1:0.5),SF/Cs(1:1).实验结果表明SF/Cs(1:1)组支架and SF/Cs/Alg(1:1:1)组支架膨胀率未见明显统计学差异(P＝0.071>0.05)。降解率:SF/Cs/Alg(1:1:2)组支架的降解率最高，其次是SF/Cs/Alg(1:1:1)组支架。SF/Cs和SF/Cs/Alg(1:1:0.5)有相似的降解率。
5、图5为CCK8增值实验结果：本发明3D支架(SF/Cs/Alg1:1:1)上结肠癌细胞HCT-116细胞较2D细胞培养(B)增殖明显变快。
6、见图6，携带GFPHCT-116细胞荧光显微镜下照片显示：接种细胞3天时，未见明显差异(A/B图)。接种细胞第7天，实验组细胞较对照组增殖快，且实验细胞更易于形成球状细胞团。
7、见图7，接种细胞1天时，未见明显差异(A/B图)。接种细胞第3天时，实验组细胞较对照组增殖快，对照组细胞呈环形生长，实验组细胞呈饼型生长。接种细胞第7天时，实验组细胞较对照组增殖快，对照组细胞呈饼形生长，实验组细胞呈球型生长。
8、将HCT-116细胞分别接种于对照组支架(SF/Cs(1:1))、实验组支架(SF/Cs/Alg(1:1:1))和裸鼠左侧腋下，14天后，支架上的细胞用4％多聚甲醛固定，裸鼠被处死，皮下瘤块福尔马林固定，三组组织均进行HE染色，结果显示：实验组支架构建的体外肿瘤模型较对照组支架构建的肿瘤模型更接近裸鼠皮下成瘤的组织形态。
本发明优选各原材料及其之间的最佳配比，优化制备方法，得到了降解率适中、膨胀率适中、吸水率高、孔隙率高的3D支架；利用3D体外培养系统取代2D细胞培养用于结肠癌体外细胞培养，更加真实地模拟结肠癌细胞在体内的生物学行为，为结肠癌的诊治提供更加可靠的基础研究依据；克服了现有技术的不足，利用本发明的支架构建的肿瘤体外模型既为基层科研机构提供简单方便，又与体内肿瘤生长状态接近，且本发明采用冷冻干燥法：将需冷冻干燥的材料先快速冷冻，然后在真空条件下将冰转化为水蒸气，再将水蒸气冷凝。该方法没有有机物质的参与，并且直接使用冷冻干燥机即可，操作简便，干燥后的物料保持原来的化学组成和物理性质(如多孔结构、胶体性质等)，热量消耗比其他干燥方法少。操作简便，且制成的多孔支架内部会形成内部连通性较好的疏松多孔的海绵状结构，具有重要的临床应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种用于构建体外肿瘤模型的3D支架，其特征在于，所述3D支架包括以下重量份配比的原材料：SF：Cs：Alg＝1:1:1，其中，SF：丝素蛋白，Cs：壳聚糖，Alg：海藻酸钠，所述3D支架还包括原材料EDC和NHS；
所述3D支架采用冷冻干燥法制成，所述3D支架的制备方法包括如下步骤：
步骤一：制备丝素蛋白溶液：
(1)取干净蚕茧壳剪成0.5-1cm2的碎片，称重，真空袋中保存备用，准备0.5％的碳酸钠溶液1000ml，并置于水浴锅中加热至沸腾，将5g蚕茧壳加入0.5％的碳酸钠溶液浸没，用搅拌棒搅拌，蚕茧壳煮沸3遍，每遍1个小时；
(2)用自然水洗蚕茧3次，再用去离子水洗3次，然后60℃烘箱10小时；
(3)将(2)干燥后的蚕茧溶解于溴化锂溶液中，配置9M溴化锂溶液，磁力搅拌器60℃搅拌加热，将烘干的丝素加入，使丝素充分溶解；冷却至室温，用布氏漏斗过滤；
(4)透析：滤液装入透析袋中用去离子水4℃冰箱里透析5天，每隔3小时换水一次，以去除丝素溶液中的小分子物质，制得丝素蛋白溶液；
(5)浓缩提纯：将制得的丝素蛋白液体仍由透析袋盛放，放入聚乙二醇6000粉剂中，干燥浓缩，收集液体，将其以3500r/min离心15min，将不溶物去除，留取上清液，置于4℃冰箱中保存，可保存一周；
(6)浓度测定：取3个称量瓶编号洗净后放入60℃恒温烘箱中烘干，充分冷却，称量三者重量，记为M1；各取10ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为M2；放入60摄氏度烘箱中12h取出，冷却后称重记为M3，按公式丝素蛋白溶液浓度％＝(M3-Ml)/(M2-M1)*100％，取三者平均值，得出丝素蛋白浓度为1.5％；
步骤二：壳聚糖溶液的配制：
称取1.5g CS粉末，加入去离子水定容至100ml，再加入2ml冰乙酸溶液，得到浓度为1.5％的淡黄色粘稠度较高的CS溶液；
步骤三：海藻酸盐溶液的制备：
称取1.5g海藻酸钠，用蒸馏水配制成100ml溶液，在50℃恒温水浴下搅拌1.5h，配制浓度为1.5％的海藻酸钠溶液，于10℃环境静置脱泡24h，备用；
步骤四：丝素蛋白壳聚糖三维支架构建：
(1)交联支架
1)步骤一制得的丝素蛋白溶液、步骤二制得的壳聚糖溶液、步骤三制得的海藻酸盐溶液三者按照重量份配比为1:1:1进行混合并搅拌均匀；
2)继续浸入含50mmol/L的EDC、18mmol/L NHS的95％乙醇水溶液中；
3)于24孔培养板每孔加入1ml混合溶液，96孔培养板每孔加入200μl混合溶液，去除气泡，将培养板依次置于4℃冰箱交联24h，-20℃冰箱冷冻12h，-80℃冰箱冷冻12h，冷冻干燥机冷冻干燥72h，即可得到SF/CS三维多孔支架，Co60辐照灭菌，备用。
2.权利要求1所述的3D支架的制备方法，其特征在于，采用冷冻干燥法制成，所述3D支架的制备方法包括如下步骤：
步骤一：制备丝素蛋白溶液：
(1)取干净蚕茧壳剪成0.5-1cm2的碎片，称重，真空袋中保存备用，准备0.5％的碳酸钠溶液1000ml，并置于水浴锅中加热至沸腾，将5g蚕茧壳加入0.5％的碳酸钠溶液浸没，用搅拌棒搅拌，蚕茧壳煮沸3遍，每遍1个小时；
(2)用自然水洗蚕茧3次，再用去离子水洗3次，然后60℃烘箱10小时；
(3)将(2)干燥后的蚕茧溶解于溴化锂溶液中，配置9M溴化锂溶液，磁力搅拌器60℃搅拌加热，将烘干的丝素加入，使丝素充分溶解；冷却至室温，用布氏漏斗过滤；
(4)透析：滤液装入透析袋中用去离子水4℃冰箱里透析5天，每隔3小时换水一次，以去除丝素溶液中的小分子物质，制得丝素蛋白溶液；
(5)浓缩提纯：将制得的丝素蛋白液体仍由透析袋盛放，放入聚乙二醇6000粉剂中，干燥浓缩，收集液体，将其以3500r/min离心15min，将不溶物去除，留取上清液，置于4℃冰箱中保存，可保存一周；
(6)浓度测定：取3个称量瓶编号洗净后放入60℃恒温烘箱中烘干，充分冷却，称量三者重量，记为M1；各取10ml丝素蛋白液放入称量瓶，称重为M2；放入60摄氏度烘箱中12h取出，冷却后称重记为M3，按公式丝素蛋白溶液浓度％＝(M3-Ml)/(M2-M1)*100％，取三者平均值，得出丝素蛋白浓度为1.5％；
步骤二：壳聚糖溶液的配制：
称取1.5gCS粉末，加入去离子水定容至100ml，再加入2ml冰乙酸溶液，得到浓度为1.5％的淡黄色粘稠度较高的CS溶液；
步骤三：海藻酸盐溶液的制备：
称取1.5g海藻酸钠，用蒸馏水配制成100ml溶液，在50℃恒温水浴下搅拌1.5h，配制浓度为1.5％的海藻酸钠溶液，于10℃环境静置脱泡24h，备用；
步骤四：丝素蛋白壳聚糖三维支架构建：
(1)交联支架
1)步骤一制得的丝素蛋白溶液、步骤二制得的壳聚糖溶液、步骤三制得的海藻酸盐溶液三者按照重量份配比为1:1:1进行混合并搅拌均匀；
2)继续浸入含50mmol/L的EDC、18mmol/LNHS的95％乙醇水溶液中；
3)于24孔培养板每孔加入1ml混合溶液，96孔培养板每孔加入200μl混合溶液，去除气泡，将培养板依次置于4℃冰箱交联24h，-20℃冰箱冷冻12h，-80℃冰箱冷冻12h，冷冻干燥机冷冻干燥72h，即可得到SF/CS三维多孔支架，Co60辐照灭菌，备用。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下步骤：
细胞接种于SF/CS三维多孔支架构建体外肿瘤模型：
将SF/CS三维多孔支架在培养液浸泡24h，预湿后将其置于24孔板内，将调整好浓度的细胞悬液取100ul滴加在材料上，然后将培养板置于震荡器上震荡5min，使细胞均匀接种于SF/CS三维多孔支架中。
4.权利要求1所述的3D支架在构建体外肿瘤模型中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述体外肿瘤模型为结肠癌体外肿瘤模型。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2745539A1 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Reneuron Limited | Cellular compositions for use in therapy |
| WO2010148275A2 (en) * | 2009-06-18 | 2010-12-23 | Kiyatec, Llc | Bioreactor system |
| CN104189958A (zh) * | 2014-08-25 | 2014-12-10 | 中国人民解放军总医院 | 用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法 |
| CN104342405A (zh) * | 2014-08-20 | 2015-02-11 | 苏州堪赛尔生物技术有限公司 | 一种肿瘤微环境的体外构建方法及其在药敏筛选中的应用 |
| CN104830774A (zh) * | 2014-02-11 | 2015-08-12 | 天津卫凯生物工程有限公司 | 一种细胞三维培养支架、其制备方法及用途 |
| CN106039400A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-10-26 | 浙江大学 | 冰晶模板法制备规则片层结构三维生物支架的方法和应用 |
| CN211445769U (zh) * | 2019-11-20 | 2020-09-08 | 上海市第五人民医院 | 一种用于构建体外肿瘤模型的3d支架 |
Family Cites Families (2)
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| US9157908B2 (en) * | 2011-04-22 | 2015-10-13 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Chitosan-alginate scaffold cell culture system and related methods |
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2745539A1 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Reneuron Limited | Cellular compositions for use in therapy |
| WO2010148275A2 (en) * | 2009-06-18 | 2010-12-23 | Kiyatec, Llc | Bioreactor system |
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| CN104189958A (zh) * | 2014-08-25 | 2014-12-10 | 中国人民解放军总医院 | 用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法 |
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Fabrication of quaternary composite scaffold from silk fibroin, chitosan, gelatin, and alginate for skin regeneration";Sharma 等;《JOURNAL OF APPLIED POLYMER SCIENCE》;第132卷(第44期);42743 * |
| "Preparation and Characterization of a Novel Triple Composite Scaffold Containing Silk Fiborin, Chitosan, and Alginate for 3D Culture of Colonic Carcinoma Cells In Vitro";Su 等;《MEDICAL SCIENCE MONITOR》;第26卷;e922935 * |
| "体外构建三维细胞培养支架及其在肿瘤化疗药物筛选中的应用研究";钮慧;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》(第2期);E079-193 * |
| "促细胞生长包被丝素蛋白的制备";赵培 等;《武汉大学学报(理学版)》;第57卷(第4期);329-334 * |
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