KR101850307B1 - 채널 결합형 스캐폴드의 제조장치 및 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 채널결합형 스캐폴드를 제조하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 명세서는 (1) 기판 표면에 홈을 포함하는 제1탄성기판을 압축하여 홈을 닫는 단계; (2) 닫힌 홈 위에 스캐폴드 조성물을 로딩하는 단계; 및 (3) 탄성기판을 원상회복시키는 단계를 포함하는 채널 결합형 스캐폴드의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 일측면에 있어서 기판 표면에 홈을 포함하고 그 위에 스캐폴드 조성물이 로딩되는 제1탄성기판; 및 탄성기판의 홈을 닫기 위해 그 폭을 압축시키는 압축모듈을 포함하는 채널 결합형 스캐폴드의 제조장치를 제공한다.

Description

채널 결합형 스캐폴드의 제조장치 및 제조방법{Apparatus and method for manufacturing channel-bonding type scaffold}
본 명세서는 채널 결합형 스캐폴드의 제조장치 및 제조방법에 관한 것이다.
우리 몸의 모든 장기와 조직은 배아상태에서 발달단계를 거쳐 생성되면서 세포와 세포를 둘러싸고 있는 세포 외 기질은 특징적인 모습으로 정렬된다. 이러한 구조적 특징에 의해 각 장기와 조직 내에 위치한 세포는 주변의 다른 세포 또는 세포를 둘러싸고 있는 세포 외 기질과 특징적인 상호작용을 하게 되며 이러한 상호작용은 각각의 장기가 기능을 수행하는데 있어서 결정적인 역할을 한다. 대표적인 예로서 뇌, 심장, 중추 및 말단 신경 다발, 각종 근육들은 매우 특징적인 구조를 보이며 이러한 구조가 와해되면 심각한 발달장애를 초래한다. 생체 하이드로젤 내에 세포를 심고 배양하여 특정 조직과 유사하게 성장하도록 유도하여 개체에 이식한다는 조직공학이라는 기술적 개념이 1993년 Science 저널에 처음으로 발표된 이래 동물세포의 3차원 배양 기술은 여러 가지 합성 혹은 천연 고분자 생체재료를 활용하여 그 안에 세포를 배양하는 방법으로 미국을 중심으로 계속해서 발전하고 있다. 간, 연골, 신장 등 장기에 관해서는 기존의 2차원 세포배양 방식에 비해 생체 내 (in vivo)와 보다 유사한 환경에서 생리학적 모델을 만들고자 하는 시도가 어느 정도 성공을 거두고 있다. 정상적인 장기 모델뿐만 아니라 암 조직 내 세포 주위 미세환경을 모사하는 등 병리학적 모델을 구축하는 데에도 3차원 배양 기술이 도입되어 기존의 2차원 세포 배양에서는 간과되었던 세포-세포, 세포-세포 외 기질 상호 작용에 관해서도 깊이 있는 연구가 꾸준히 진행되고 있다. 2000년대 중반부터는 응용분야가 더욱 확장되어 줄기세포의 3차원 배양도 시도되고 있다. 특히, 뇌는 복잡하지만 매우 특징적으로 정렬된 조직이다. 특정 신경세포의 세포체는 뇌 내 특정 층에 선택적으로 분포하며 신경세포에서 뻗어나온 축삭과 수상돌기는 특정 방향으로 가지런히 정렬되어 있는데 이러한 구조적 특징은 뇌신경조직/회로망의 신호 전달에 결정적인 영향을 미친다. 배아상태에서 뇌신경회로망의 정렬 및 조직화가 정상적으로 이루어지지 않으면 자폐 등 각종 정신 장애를 일으키는 것으로 알려져 있다. 신경회로망의 정렬에 관한 연구를 수행하기 위해 현재 쓰이는 기술은 배아 내 전기 천공법 (in utero electroporation)과 기관형적 슬라이스 (organotypic slice) 배양이 대표적이나, 이러한 방법들 대단히 침습적이고 노동 집약적일 뿐만 아니라, 긴 기간 동안 발달단계를 모니터링하는 것이 불가능하며 뇌 안의 특정 지역을 연구하는 데에 최적화 되어 있기 ‹š문에 뇌 내 다른 영역을 연구하기 어렵다는 단점이 있다. 최근 들어 미국과 유럽을 중심으로 시작된 뇌지도 매핑 프로젝트와 맞물려 뇌신경조직/회로망을 3차원 체외 환경에서 구현하려는 노력도 활발해지기 시작했고 따라서 정렬된 생체 재료 구조체 내에서 뇌를 구성하는 신경 세포 및 교세포의 배양이 가능하도록 하는 기술 개발은 중요하며 앞으로도 그 수요가 지속적으로 증가할 것이다. 세포 배양에 쓰이는 대표적인 생체 재료로 우리 몸의 세포 외 기질 구성 중에 가장 큰 비율을 차지하고 있는 섬유질인 콜라겐이 있다. 콜라겐 섬유를 정렬하기 위한 기존 기술로 1) 전기장 또는 2) 자기장을 외부 장치에서 걸거나, 3) 콜라겐 안에 심어진 세포가 콜라겐을 수축하는 성질을 이용하거나, 4) 콜라겐 용액을 좁은 관을 통해 흘려보내면서 유체 흐름에 의한 힘 (전단력)을 이용하는 방법들이 알려져 있다. 외부 장치를 통해 전기, 자기장을 주는 것은 재현성과 실용성이 떨어질 수 있으며 전기, 자기장에 의해 자극을 받은 세포는 생리적 활성이 변하고 상당한 독성이 나타날 수 있다. 또한, 상기 언급한 방법들로는 여러 가지 서로 다른 종류의 콜라겐을 원하는 모양과 크기로 일체형 3차원 구조체를 제작하면서 동시에 섬유를 정렬하기가 어렵다.
이렇게 정렬된 섬유를 포함하는 3차원 구조체를 제작하였다 하더라도 이러한 구조체에 포함된 물질과 어떠한 상호작용을 하는지 관찰하기 위하여 구조체 내부에 원하는 물질을 생체 내에서와 유사하게 공급하는 것은 별개의 문제에 해당한다. 특히, 채널을 포함하는 3차원 구조체를 제조함에 있어서 종래 알려진 기술들에서는 멤브레인 구조를 이용하여 이러한 구조체를 제작하였다. 그러나, 멤브레인 구조를 이용하는 경우에는 상하부 채널간의 물질 이동이 원활하지 않거나 세포의 배양이 불가하다는 문제점이 발생할 수 있다. 또한, 정렬된 섬유를 포함하는 3차원 구조체를 제작함과 동시에 이러한 구조체가 물질간 상호작용을 관찰할 수 있게 소통가능한 채널을 포함하도록 제작하는 것은 더욱 요원하였다.
WO 2009073548 A1 US 6544762 B1 US 8691262 B2 US 8597717 B2
Christopher M. Puleo et al., Integration and application of vitrified collagen in multilayered microfluidic devices for corneal microtissue culture, Lab Chip.　2009 Nov 21;9(22):3221-7
본 명세서는 채널이 결합된 스캐폴드를 제조하는 방법 또는 이를 제조하는 장치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 일측면에 있어서, (1) 기판 표면에 홈을 포함하는 제1탄성기판을 압축하여 채널을 닫는 단계; (2) 닫힌 홈 위에 스캐폴드 조성물을 로딩하는 단계; 및 (3) 탄성기판을 원상회복시키는 단계를 포함하는 채널 결합형 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 일측면에 있어서 기판 표면에 홈을 포함하고 그 위에 스캐폴드 조성물이 로딩되는 제1탄성기판; 및 탄성기판의 홈을 닫기 위해 그 폭을 압축시키는 압축모듈을 포함하는 채널 결합형 스캐폴드의 제조장치를 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에 의할 때, 채널이 결합된 스캐폴드를 단순한 방법, 즉 탄성기판을 압축하고, 그 위에 스캐폴드를 로딩하고, 다시 탄성기판을 회복시키는 것만으로 채널이 결합된 스캐폴드를 제조할 수 있으며 그와 더불어 스캐폴드에 포함된 미세섬유 또는 세포들을 특정 방향으로 정렬시킬 수 있다. 그러므로, 세포의 생리적 활성을 유지하여 세포 독성을 막을 수 있기 때문에 정렬시킨 세포의 배양에 있어서도 유용하다. 이에 따라 본 발명을 이용하면 각종 연구에 있어서 사용되는 세포배양 모델을 당업계에 쉽게 양산하여 제공할 수 있다는 장점이 있다. 아울러 본원발명은 특히 환경 변화에 매우 민감한 뇌의 신경세포 및 교세포의 정렬 및 배양에도 사용할 수 있으므로, 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 일측면에 따른 채널결합형 스캐폴드의 제조장치 또는 채널결합형 스캐폴드 조립체를 구성하는 제1탄성기판 및 제2탄성기판의 사시도를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 조립체를 구성하는 제1탄성기판과 제2탄성기판이 서로 결합된 형태로서, PDMS 칩 또는 탄성기판 칩의 사시도를 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일측면에 따른 방법 또는 장치에서 탄성기판을 압축하기 전의 상태를 나타낸 사시도로서, 화살표 방향은 홈에 수직한 방향으로 탄성기판을 압축하는 방향을 나타낸 것이다.
도 3b는 본 발명의 일측면에 따른 방법 또는 장치에서 탄성기판을 압축한 상태를 나타낸 사시도이다.
도 3c는 본 발명의 일측면에 따른 방법 또는 장치에서 압축된 탄성기판의 홈위, 그리고 웰 내에 스캐폴드 조성물을 로딩한 상태를 나타낸 사시도이다.
도 3d는 본 발명의 일측면에 따른 방법 또는 장치에서 압축된 탄성기판을 다시 원상회복 시키는 상태를 나타낸 사시도이다. 화살표 방향은 홈에 수직한 방향으로 탄성기판을 다시 원상회복 시키는 방향을 나타낸 것이다.
도 3e는 본 발명의 일측면에 따른 방법 또는 장치에서 탄성기판이 다시 원상회복 된 후의 상태를 나타낸 사시도이다.
도 4는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 조립체에서 제2탄성기판 또는 웰층 기판의 유입구 및 유출구에 배관이 연결된 상태를 나타낸 사시도이다.
도 5는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 조립체에서 유입구 및 유출구가 3개 존재하고, 이러한 유입구 및 유출구에 배관이 연결된 상태를 나타낸 사시도이다.
도 6a는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 조립체에서 탄성기판의 홈을 포함하는 축에서 자른 단면도를 나타낸 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 조립체에서 탄성기판의 홈과 수직한 축에서 자른 단면도를 나타낸 도면이다.
도 7a는 본 발명의 일측면에 따른 채널결합형 스캐폴드의 제조장치를 나타낸 도면이다.
도 7b는 본 발명의 일측면에 다른 장치 또는 방법에서 탄성기판을 압축하는 모습을 나타낸 도면이다.
도 7c는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에서 탄성기판을 압축한 후 스캐폴드 조성물이 홈의 위, 그리고 웰에 로딩된 상태를 나타낸 도면이다.
도 7d는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에서 탄성기판을 다시 원상회복 시키는 모습을 나타낸 도면이다.
도 7e는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에서 탄성기판을 원상회복 시킨 후의 모습을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 다른 일측면에 따른 채널결합형 스캐폴드의 제조 장치를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에 의하여 제조된 채널결합형 스캐폴드의 구조를 확인한 그림이다.
도 10은 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에 의하여 채널 결합형 스캐폴드를 제조함에 있어서, 스캐폴드에 포함된 콜라겐 섬유의 정렬 여부 및 정렬 방향을 확인한 그림들이다. (A)는 20X 배율에서 수득한 공초점 현미경 이미지를 ZEN 소프트웨어를 이용해 3차원 이미지로 구현한 것이며, (B)는 20X 배율의 직각 뷰 이미지에 해당한다. (C)는 40X 배율에서 수득한 이미지이며, (D)는 (C)를 이용하여 컬러맵핑을 수행한 이미지 결과이고, (E)는 컬러맵핑된 이미지를 이용하여 수득한 극좌표 결과에 해당한다.
도 11은 본 발명의 일측면에 따른 채널결합형 스캐폴드로서 세 개의 채널을 포함하는 스캐폴드의 모습을 A)에 나타내고, 이를 이용하여 채널 내로 형광 물질을 주입하였을 때 그 확산의 모습을 확인한 이미지를 B)에 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일측면에 따른 채널결합형 스캐폴드로서 세 개의 채널을 포함하는 스캐폴드의 모습을 A)에 나타내고, 이를 이용하여 채널 내로 서로 다른 형광 물질을 주입하였을 때 그 확산의 모습을 확인한 이미지를 B)에 나타낸 것이다.
본 발명은 일측면에 있어서, (1) 기판 표면에 홈을 포함하는 제1탄성기판(또는 채널층 탄성기판)을 압축하여 홈을 닫는 단계; (2) 닫힌 홈 위에 스캐폴드 조성물을 로딩하는 단계; 및 (3) 탄성기판을 원상회복시키는 단계를 포함하는 채널 결합형 스캐폴드의 제조방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1탄성기판은 채널층 탄성기판과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며 제2탄성기판은 웰층 탄성기판과 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 스캐폴드 조성물은 미세섬유, 세포, 또는 이들의 혼합물 중 하나일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 미세섬유는 나일론, 폴리아크릴산, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리스티렌, 폴리비닐알코올, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 옥사이드로 구성된군으로부터 선택된 하나 이상인 합성 고분자 섬유 또는 엘라스틴, 젤라틴, 피브리노겐, 피브린, 알지네이트, 셀룰로오스, 실크 피브로인, 키토산, 라미닌, 액틴, 및 콜라겐으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 천연 고분자 섬유일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 미세섬유는 당업계에서 방향성을 가지는 섬유로서 세포 배양시에 사용될 수 있는 것이라면 제한되지 않으며, 특히 이러한 미세섬유는 콜라겐 섬유일 수 있다.
본 명세서에서 "기판"은 탄성을 가지는 물질로 제조된 것이라면 제한 없이 사용 가능하다. 탄성을 가지는 물질의 예시로는 PDMS(polydimethylsiloane)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에 알려진 탄성을 가지는 물질로 알려진 소재라면 제한 없이 사용하여 제작할 수 있다.
본 명세서에서 "탄성"은 외부 힘에 의하여 구조가 변형 된 뒤, 다시 원상태의 구조로 돌아오는 힘을 의미하는 것이며 통상의 기술자가 자명하게 인식할 수 있는 용어에 해당한다. 구체적으로 본 명세서에서 "탄성 기판"은 그 폭의 5%이상, 10%이상, 15%이상, 20%이상, 30%이상, 35%이상, 40%이상, 45%이상, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 70%이상 또는 80%이상을 압축한 뒤에 다시 압축 전 원래 폭의 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 또는 99% 이상으로 회복되는 성질을 가지는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "미세섬유"는 마이크로미터 이하의 미세단위에서 선상 구조를 가지는 섬유를 의미하는 것으로서, 길고 가늘며 연하게 굽혀질 수 있는 미세 물질을 의미할 수 있다. 이러한 미세섬유는 합성 또는 천연 고분자 섬유에 해당할 수 있으며, 예를 들어 콜라겐 섬유 또는 액틴 섬유와 같은 생체섬유에 해당할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 세포는 생체외에서 배양될 수 있는 세포로서 생명체로부터 수득할 수 있는 세포일 수 있고, 구체적으로 이러한 세포는 신경세포, 교세포, 근세포, 고형암세포, 중배엽 줄기세포 또는 섬유아세포일 수 있다.
본 명세서에서 세포는 생체외에서 배양될 수 있는 세포로서 생명체로부터 수득할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않으며 당업계에서 세포의 배열 또는 정렬에 대하여 실험하기 위해 사용될 수 있는 세포라면 제한되지 않고 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 (1)단계 이전에 (1)'탄성 기판을 접착제로 코팅하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 접착제는 글루타르 알데히드, 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신 및 폴리도파민으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상 일 수 있으나, 콜라겐 젤과 같은 스캐폴드 조성물을 탄성 기판의 웰에 고정시키기 위하여 사용될 수 있는 접착제로서 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 것이나 통상의 기술자가 자명하게 인식할 수 있는 것이라면 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 제(2)단계 이후 (3)단계 이전에 (2)'스캐폴드 조성물이 로딩된 탄성 기판의 압축 상태를 유지하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, (2)'단계는 탄성 기판의 압축 상태를 1분 내지 10분 동안 유지하는 것일 수 있다. 구체적으로 (2)'단계에서는 탄성기판의 압축상태를 1분 이상, 2분 이상, 3분 이상, 4분 이상, 5분 이상, 6분 이상, 7분 이상, 8분 이상, 9분 이상, 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 또는 1시간 이상 유지하거나 1시간 이하, 40분 이하, 30분 이하, 20분 이하, 10분 이하, 9분 이하, 8분 이하, 7분 이하, 6분 이하, 5분 이하, 4분 이하, 3분 이하, 2분 이하, 또는 1분 이하 동안 유지할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, (2)'단계는 탄성 기판의 압축 상태를 유지하여 스캐폴드 조성물을 부분적으로 경화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, (1)단계에서 탄성기판의 압축은 홈과 수직인 방향으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 스캐폴드 조성물에 포함된 미세섬유, 세포, 또는 이들의 혼합물을 압축 또는 원상회복 방향과 평행한 방향으로 정렬하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 (3) 단계는 탄성기판을 원상회복시켜 로딩된 스캐폴드 조성물 하단에 채널을 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 (3)단계 이후에 (3)'스캐폴드 조성물을 겔화시키는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이러한 (3)'단계는 (3)단계와 하기 (4)단계 사이에 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, (3)'단계는 원상회복된 탄성기판을 30℃ 내지 40℃, 구체적으로 37℃의 인큐베이터에서 10분 내지 1시간, 20분 내지 40분, 또는 30분 동안 방치하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 (3)단계 이후에 (4) 정렬된 스캐폴드 조성물을 포함하는 탄성기판을 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 (4) 단계에서 배양은 인큐베이터에서 수행되는 것일 수 있으며, 배양 시간은 1일 내지 5일, 구체적으로 2일 내지 4일 또는 약 3일 일수 있으며, 배양 온도는 30℃ 내지 40℃, 구체적으로 35℃ 내지 39℃, 더 구체적으로 36℃ 내지 38℃일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1탄성기판(채널층 탄성기판)은 그 위에 제2탄성기판(웰층 탄성기판)으로서 제2탄성기판을 관통하는 웰을 포함하는 기판을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 사용되는 탄성기판은 제1탄성기판(채널층 탄성기판)과 제2탄성기판(웰층 탄성기판)이 서로 결합된 형태의 결합체일 수 있으며, 본 명세서에서 제1탄성기판과 제2탄성기판의 결합체는 탄성기판 또는 탄성기판 칩과 서로 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제2탄성기판은 제1탄성기판의 채널 양 끝과 연결되는 유입구 또는 유출구를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, (2) 단계는 스캐폴드 조성물을 웰에 로딩하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 탄성기판은 탄성고분자를 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 탄성기판은 본 명세서에 기재된 탄성을 가지는 기판을 모두 의미하는 것일 수 있으며, 제1탄성기판, 제2탄성기판, 채널층 탄성기판, 웰층 탄성기판, 제1탄성기판과 제2탄성기판의 결합체, 탄성기판 칩, 또는 채널결합형 스캐폴드 조립체를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 탄성고분자(elastomer)는 천연 폴리이소프렌, 합성 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 클로로프렌 고무, 부틸고무, 스티렌-부타디엔 고무, 니트릴 고무, 에틸렌 프로필렌 고무, 에틸렌 프로필렌 다이엔 고무, 에피클로로하이드린 고무, 폴리아크릴 고무, 실리콘 고무, 플루오로실리콘 고무, 플루오로 탄성중합체, 폴리에테르 블록 아미드, 클로로술폰화 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 폴리디메틸실록산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 탄성기판을 구성하는 탄성고분자(elastomer)는 당업계에 널리 알려지거나 당업자가 용이하게 도출할 수 있는 탄성을 가지는 물질로 알려진 소재라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 천연 폴리이소프렌, 합성 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 클로로프렌 고무(폴리클로로프렌 또는 네오프렌), 부틸 고무(이소부틸렌과 이소프렌의 코폴리머), 할로겐화 부틸고무(클로로 부틸 고무 또는 브로모 부틸 고무), 스티렌-부타디엔 고무, 니트릴 고무(부타디엔과 아크릴로니트릴의 코폴리머), 수소화된 니트릴 고무, 에틸렌 프로필렌 고무(에틸렌과 프로필렌의 코폴리머), 에틸렌 프로필렌 다이엔 고무(에틸렌, 프로필렌 및 다이엔-물질의 터폴리머), 에피클로로하이드린 고무, 폴리아크릴 고무, 실리콘 고무, 플루오로실리콘 고무, 플루오로 탄성중합체(바이콘, 테크노플론 등), 퍼플루오로 탄성중합체, 폴리에테르 블록 아미드, 클로로술폰화 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐 아세테이트 등이 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, (1)단계는 압축 전을 기준으로 홈과 수직한 탄성기판 폭의 5% 내지 80%를 압축하는 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, (1) 단계는 압축 전을 기준으로 홈과 수직한 탄성기판의 폭의 5%이상, 10%이상, 15%이상, 20%이상, 25%이상, 27%이상, 29%이상, 30%이상, 32%이상, 34%이상, 36%이상, 38%이상, 40%이상, 42%이상, 44%이상, 46%이상, 48%이상, 50%이상, 52%이상, 54%이상, 56%이상, 58%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 또는 80%이상을 압축하거나 80%이하, 70%이하, 65%이하, 60%이하, 58%이하, 56%이하, 54%이하, 52%이하, 50%이하, 48%이하, 46%이하, 44%이하, 42%이하, 40%이하, 38%이하, 36%이하, 34%이하, 32%이하, 30%이하, 28%이하, 26%이하, 24%이하, 22%이하, 20%이하, 15%이하, 10%이하, 또는 5%이하를 압축하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, (1) 단계는 압축하여 홈의 폭을 30% 내지 100% 닫는 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, (1) 단계는 압축하여 홈의 폭을 10%이상, 20%이상, 30%이상, 40%이상, 50%이상, 60%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상 또는 100% 닫는 것이거나 100%이하, 99%이하, 95%이하, 90%이하, 85%이하, 80%이하, 75%이하, 70%이하, 60%이하, 50%이하, 40%이하, 30%이하, 20%이하, 또는 10%이하로 닫는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 스캐폴드 조립체를 이용하여 채널 결합형 스캐폴드를 제조하는 방법일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 기판 표면에 홈을 포함하고 그 위에 스캐폴드조성물이 로딩되는 제1탄성기판(또는 채널층 탄성기판)을 포함하며, 상기 홈은 그 위에 스캐폴드 조성물이 로딩되었을 때 채널을 형성하는 것인 스캐폴드 조립체에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 스캐폴드 조립체는, 제1탄성기판의 위에 위치하고 기판을 관통하는 웰을 포함하는 제2탄성기판(또는 웰층 탄성기판)을 더 포함하며, 이때 스캐폴드 조성물은 웰 내부에 로딩되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 조립체는 제1탄성기판의 홈 위에 로딩되는 스캐폴드 조성물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명의 일측면에 따른 스캐폴드 조립체; 및 제1탄성기판의 홈을 닫기 위해 그 폭을 압축시키는 압축 모듈을 포함하는 채널 결합형 스캐폴드의 제조장치에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 일측면에 있어서, 기판 표면에 채널을 포함하고 그 위에 스캐폴드 조성물이 로딩되는 제1탄성기판(또는 채널층 탄성기판); 및 탄성기판의 채널을 닫기 위해 그 폭을 압축시키는 압축모듈을 포함하는 채널 결합형 스캐폴드의 제조장치에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 장치는 제1탄성기판의 위에 위치하고, 기판을 관통하는 웰을 포함하는 제2탄성기판(또는 웰층 탄성기판)을 더 포함하며 이때 스캐폴드 조성물은 웰 내부에 로딩된 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 압축모듈은 탄성 기판의 평행한 두 면과 접촉하는 압축판; 압축판을 구동시켜 탄성기판을 압축시키는 압축부; 및 압축부의 움직임을 제어하는 제어부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 탄성기판은 그 표면에 코팅된 접착제를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제어부는 압축부를 구동시켜 홈과 수직한 탄성기판의 폭의 5% 내지 80%를 압축시키는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 제어부는 본 발명의 일측면에 따른 방법의 (1) 단계에서 홈과 수직한 탄성기판의 폭을 압축시키는 것과 동일하게 압축을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제어부는 압축부를 구동시켜 홈의 폭을 30% 내지 100% 닫는 것일 수 있다. 구체적으로 이러한 제어부는 상기 방법의 (1) 단계에서 홈의 폭을 닫는 것과 동일하게 압축을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 압축판은 둘 이상일 수 있다. 구체적으로 압축판 중 어느 하나는 고정되어 있고 다른 하나가 압축부에 의하여 구동되어 탄성기판을 압축할 수도 있으며, 탄성기판과 접촉하고 있는 압축판이 함께 구동되어 탄성기판을 압축할 수 도 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 압축부는 둘 이상의 수나사 및 암나사를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 압축부의 암나사는 압축판과 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제어부는 압축부의 암나사들을 서로 연결하는 고무벨트를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 제어부의 고무벨트를 돌려 암나사를 이동시키는 것에 의하여 압축 판을 이동시킬 수 있고, 이러한 이동을 통하여 압축판과 접촉하고 있는 탄성기판을 압축할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 압축모듈은 탄성기판의 폭을 압축시킬 수 있는 것이라면 당업계에 널리 알려진 것 또는 당업자가 용이하게 적용할 수 있는 것이라면 제한되지 않으며, 예를 들어 유압 실린더 또는 공기 실린더가 사용될 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 압축판은 탄성기판과 접촉되어 이를 압축시킬 수 있는 것이라면 제한되지 않는다.
구체적으로 본 발명의 일측면에 있어서, 제1탄성기판(또는 채널층 탄성기판)과 제2탄성기판(또는 웰층 탄성기판)은 도 1과 같이 구성될 수 있다. 도 1에 따르면 제1탄성기판(5)은 그 기판의 중앙부 표면에 홈처럼 파여진 채널(6)을 포함할 수 있으며, 이러한 채널의 형상 및 깊이는 통상의 기술자가 용이하게 변경할 수 있는 범위 내에서 제한되지 않는다. 또한, 제2탄성기판(1)은 그 기판의 가운데에 기판을 관통하는 웰(2)을 포함하며 제1탄성기판의 채널 양 끝과 연결되는 유입구(3) 또는 유출구(4)를 더 포함할 수 있다.
도 2에 따르면 제1탄성기판의 위에 제2탄성기판이 결합되어 결합체(7)를 형성할 수 있고, 이러한 결합체는 본 명세서에서 탄성기판 칩 또는 채널결합형 스캐폴드 조립체의 기본적인 구성요소에 해당하는 것이다.
도 3a은 탄성기판 결합체(7)를 채널(6)에 수직인 방향으로 압축하는 모습을 나타낸 것으로서, 이렇게 압축을 수행하게 되면 도 3b에 나타난 바와 같이 제1탄성기판에 포함된 채널(6)이 닫히게 된다. 그런 뒤 도 3c에 나타난 바와 같이 이렇게 닫힌 채널(6) 위, 그리고 웰(2) 내에 스캐폴드 조성물(8)을 로딩한다. 스캐폴드 조성물을 로딩한 뒤, 조성물의 부분 경화를 위하여 압축상태를 유지하고, 도 3d에 나타난 바와 같이 탄성기판 결합체를 다시 원상회복 시킨다. 탄성기판 결합체를 원상회복 시키게 되면 압축방향 또는 원상회복 방향과 평행한 방향, 즉 채널과 수직한 방향으로 스캐폴드 조성물에 포함된 미세섬유 또는 세포들이 정렬되는 효과를 나타내며, 더불어 도 3e에 나타난 바와 같이 하단에 채널이 결합된 스캐폴드 또는 스캐폴드 조립체를 얻을 수 있다.
도 4는 본 발명의 일측면에 따른 방법, 장치 또는 결합체에서 제2탄성기판의 유입구 및 유출구에 배관(9)을 연결한 상태를 나타낸 도면이다. 이러한 배관(9)을 통하여 채널결합형 스캐폴드의 채널로 유입시키고자 하는 물질을 주입할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일측면에 따른 방법, 장치 또는 결합체에서 제1탄성기판이 둘 이상의 채널을 가지고 있고, 제2탄성기판이 둘 이상의 셋트의 유입구 및 유출구를 포함하는 상태의 예시를 나타낸 것이다. 이렇게 둘 이상의 채널을 가지게 되면 각 채널에 서로 다른 종류의 물질을 유입시킬 수 있으며, 스캐폴드 내에서 서로 다른 물질이 어떻게 확산되는지를 비교할 수 있게 된다.
도 6a는 본 발명의 일측면에 따른 방법, 장치 또는 결합체에서 탄성기판 칩 또는 탄성기판 결합체의 채널 방향과 평행한 축으로 절단한 단면을 나타낸 것이다. 도 6a에 따르면 제2탄성기판에 포함된 유입구(3) 및 유출구(4)는 제1탄성기판에 포함된 채널(6)의 양 끝과 연결되어 있는 것을 확인할 수 있으며 유입구와 유출구 사이에 제2탄성기판의 웰(2)이 존재하는 것을 확인할 수 있다.
도 6b는 본 발명의 일측면에 따른 방법, 장치 또는 결합체에서 탄성기판 칩 또는 탄성기판 결합체의 채널 방향과 수직한 축으로 절단한 단면을 나타낸 것이다. 도 6b에 따르면 제1탄성기판에 홈처럼 파인 채널(6)이 존재하고 그 위를 제2탄성기판의 웰(2)이 구성하고 있음을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일측면에 있어서 스캐폴드 조성물은 채널(6)위인 웰(2)내에 로딩 및 존재하게 된다.
구체적으로 본 발명의 일측면에 따른 장치는 도 7a와 같이 구성될 수 있다. 도 7a에 따르면 스캐폴드 조성물이 채널(6)위에 로딩되는 제1탄성기판(5)과 웰(2)을 포함하는 제2탄성기판(1)의 결합체(7)가 존재하며 이러한 결합체를 압축하는 압축 모듈(10)은 직접 탄성기판과 접촉하여 압축을 수행하는 압축판(11)과 압축이 수행되도록 압축판을 구동시키는 압축부(12), 그리고 압축부와 연결되어 압축의 수행을 제어하는 제어부(6)를 포함할 수 있다.
도 7b는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에서 압축이 수행되는 것을 예시로 나타낸 것이다. 제어부(13)에 의하여 압축부(12)에서는 압축판(11)을 구동시켜 탄성 기판 결합체(7)를 압축하게 되며, 압축되는 폭과 압축판이 움직이는 시간에 따른 거리는 제어부에 의해서 제어된다. 원하는 압축 폭만큼(예를 들어 압축전 폭의 20% 내지 60%) 압축되면 더 이상 압축이 수행되지 않는다.
도 7c는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에서 압축된 탄성기판 결합체(7)에 스캐폴드 조성물(8)을 로딩하는 것을 나타낸 것이다. 제1탄성기판(5)의 닫힌 채널(6)위인 제2탄성기판(1)의 웰(2) 내부에 스캐폴드 조성물(8)을 로딩하고 압축이 된 상태를 유지하며, 이렇게 압축이 된 상태로 유지하게 되면 로딩된 스캐폴드 조성물을 부분적으로 경화시킬 수 있다.
도 7d 및 도 7e는 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에서 압축 후 탄성기판을 원상회복시키는 모습을 나타낸 것이다. 제어부(13)에서는 압축상태를 해제하기 위하여 압축판(11)을 원상태로 되돌리게 되고 로딩된 스캐폴드 조성물(8)을 포함하는 탄성기판 결합체(7)는 본래 가지고 있는 탄성력에 의하여 도 7e에 기재된 바와 같이 원상 회복방향(압축 회복방향)과 평행한 방향으로 힘을 받으면서 원상태로 회복된다. 이렇게 회복되는 과정에서 로딩된 스캐폴드 조성물(8)이 원상 회복방향과 평행한 방향으로 힘을 받기 때문에 스캐폴드 조성물(8)에 포함된 미세섬유와 세포들이 그 힘에 의하여 원상 회복방향과 평행한 방향으로 정렬되는 효과를 나타낸다. 또한, 원상회복 되는 과정에서 닫혔던 채널(6)이 다시 원래대로 열리기 때문에 이러한 과정을 통하여 스캐폴드 하단에 채널(6)이 형성된 스캐폴드를 제조할 수 있게 된다.
도 8은 본 발명의 다른 측면에 따른 장치를 나타낸다. 도 8에 따르면 제1탄성기판과 제2탄성기판의 결합체, 즉 탄성기판칩이 존재하고 이러한 탄성기판 칩은 제1탄성기판의 표면에 포함된 홈(6)과 제2탄성기판에 포함되고 그 내부에 스캐폴드 조성물이 로딩되는 웰(2)을 포함한다. 이러한 탄성기판칩을 압축하는 압축모듈(10)은 직접 탄성기판과 접촉하여 압축을 수행하는 압축판(11)과 압축이 수행되도록 압축판을 구동시키는 압축부(12), 그리고 압축부와 연결되어 압축의 수행을 제어하는 제어부(13)를 포함할 수 있다. 구체적으로 두 개의 압축판(11) 중에서 압축부(12)와 연결되지 않은 압축판은 고정되어 있으며, 압축부(12)와 연결된 압축판이 압축부에 의하여 이동하여 탄성기판칩(7)을 압축하게 된다. 압축부(12)는 둘 이상의 암나사와 수나사를 포함할 수 있으며, 제어부(13)는 압축부(12)의 암나사들과 연동된 고무벨트 일 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.
[시험예 1] 형광표지 콜라겐(TRITC-labeled collagen)을 이용하여 채널 결합형 스캐폴드의 구조 확인
(1) PDMS 칩 준비 - 1) PDMS 채널층 기판의 준비: PDMS 채널층 기판의 크기는 20 mm (가로) X 20 mm (세로) X 3 mm (두께)이며, 기판 중앙에 위치한 채널의 크기는 0.2 mm (폭) X 0.15 mm (깊이) X 15 mm (길이)이다. 2) PDMS 웰 층 기판의 준비: PDMS 웰 층 기판의 크기는 20 mm (가로) X 20 mm (세로) X 7 mm (두께)이고, 중앙에 위치한 웰의 크기는 5 mm (가로) X 5 mm (세로) X 7 mm (깊이)이다. 3) 산소 플라즈마(plasma) 처리 (80W, 20 sccm, 40초) 후 PDMS 채널층 기판과 PDMS 웰층 기판을 도 2와 같이 결합하여 PDMS 칩을 제조하였다.
(2) 그런 뒤, 결합된 칩 표면을 폴리도파민으로 코팅하였다. 구체적으로 PDMS 웰 내부에 2 mg/ml의 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 10 mM의 Tris-HCl 버퍼(pH 8.5)에 첨가한 용액을 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응 용액을 제거하고 증류수로 3회 세척하였고, 클린 벤치 내에서 건조시켰다.
(3) 건조를 마친 PDMS 칩을 도 8에 기재된 것과 같은 압축기를 사용하여 PDMS 칩을 채널의 수직 방향으로 압축하였다. 압축은 채널과 수직한 웰의 폭이 원래 길이 5 mm에서 2.5 mm가 되도록 압축하였다.
(4) 압축상태의 웰에 형광물질(Tetramethylrhodamine, TRITC)이 표지된 콜라겐 용액(2.5 mg/ml)을 10 μl 로딩하고 4 분간 상온에서 압축상태를 유지시켜 콜라겐 용액을 부분적으로 경화시켰다.
형광물질이 표지된 콜라겐 용액의 경우, 코닝(Corning)사(USA)에서 구입한 래트 꼬리(rat tail) 유래의 고농도 (8-11 mg/ml) 콜라겐 용액 (Cat. 354249)을 동결건조하여 동결건조시킨 콜라겐을 먼저 준비하였다. 그런 뒤 0.1 M의 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate) 버퍼 (pH 9.0)에 20 mg/ml의 농도로 상기 동결 건조 시킨 콜라겐을 넣은 후 콜라겐이 용액에 고르게 녹도록 4℃에서 24시간 흔들어 주었다. 이러한 용액에 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 10 mg/ml 의 농도로 녹인 TRITC(Tetramethylrhodamine) 용액을 추가한 후, 4℃의 어두운 곳에서 24시간 더 흔들어 주었다. 이때 TRITC 용액은 콜라젠 단백질과 형광물질의 몰비가 3:1이 되도록 추가하였다. 이후 반응시킨 콜라젠/TRITC 용액을 분획분자량(molecular weight cut off)이 25,000 Da인 투석 튜빙(dialysis tubing) 에 넣고 0.1% 아세트산 용액에서 투석을 수행하여 콜라겐에 결합하지 않고 남은 TRITC 분자를 제거하였다. 이때 투석은 4℃, 어두운 곳에서 72시간 이상 수행 하였다.
투석을 수행한 뒤, 튜빙에 남은 용액을 수거하여 동결건조를 수행하였으며, 동결건조기(ilshinBioBase, Kyunggi-do, Korea)에서 40mTorr의 압력과 -60℃의 온도에서 3일 동안 수행하였다. 이렇게 동결 건조된 콜라겐을 0.15%의 아세트산에 10mg/ml의 농도로 녹여 형광물질(TRITC)이 표지된 콜라겐 용액으로 사용하였으며, 이는 아래 실험예에서 동일하다.
(5) 그런 뒤 압축기를 풀어 압축된 PDMS 칩을 원상회복 시키고, 원상회복된 칩은 콜라겐 용액을 완전히 겔화시키기 위하여 37 ℃의 인큐베이터에 30 분간 넣어두었다.
(6) PDMS 칩의 단면 이미징을 위해 먼저 0.25 %의 글루타알데하이드 용액에 PDMS 칩을 그대로 1시간 동안 침지하여 콜라겐 단백질이 고정되도록 하고 칩을 꺼낸 뒤 면도칼을 이용해 채널에 수직한 방향으로 칩 중앙을 절단하였다. 그런 뒤 칩의 단면에 대하여 공초점 현미경(LSM700 confocal laser scanning microscope, Carl Zeiss사, 독일)을 이용해 이미지를 수득하였고, 이러한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9의 결과에 따르면, TRITC 이미지를 통해 PDMS 웰에 형성된 TRITC-표지된 콜라겐 스캐폴드의 구조를 확인할 수 있었다. DIC 이미지와 DIC-TRITC 결합(merged) 이미지를 를 통해 TRITC-표지 콜라겐이 하부의 PDMS 채널로 유입되지 않고 채널 위로 형성되어 채널 결합형 콜라겐 스캐폴드를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다.
[시험예 2] 채널 결합형 스캐폴드의 제조시 콜라겐 용액의 정렬 확인
시험예 1의 공정 중에서 (5)까지 동일하게 수행하여 콜라겐 겔을 겔화시켰다. 다만, 이러한 공정에 있어서 콜라겐 용액의 경우 형광물질로 표지하지 않은 콜라겐 용액으로 채널 결합형 스캐폴드의 제조를 수행하였다.
형광물질로 표시하지 않은 콜라겐 용액의 경우 먼저 Corning사(USA)에서 구입한 래트 꼬리(rat tail) 유래의 고농도 (8-11 mg/ml) 콜라겐 용액 (Cat. 354249)에 10X DMEM (Sigma Aldrich, USA), DMEM (Lonza, Switzerland), 0.5N NaOH를 추가하여 최종 농도는 2.5 mg/ml, 산도는 약 pH 7 의 콜라겐 용액을 제조하였다.
(1) 인큐베이터에서 겔화가 끝난 콜라겐 겔은 콜라겐의 염색을 위해 50μM의 5-(and-6)-카르복시테트라메틸로다민 숙신이미딜 에스테르 (5(6)-TAMRA-SE) (Invitrogen, USA)를 PBS(phosphate-buffered saline)(Lonza, USA)에 혼합한 용액에 PDMS 칩을 담궈 상온에서 1 시간 반응시킨 후, 용액으로부터 칩을 꺼낸 뒤 PBS 로 3회 세척하였다.
(2) 염색을 마친 콜라겐 겔은 공초점 현미경(LSM700 confocal laser scanning microscope, Carl Zeiss사, 독일)을 이용해 20X 배율로 z-stack 이미징을 실시하고 40X 배율로 콜라겐 섬유의 이미징을 수행하였다. 이렇게 수득한 이미지를 도 10에 나타내었다.
(3) 구체적으로, 20X 배율에서 수득한 공초점 현미경 이미지는 현미경 부속 소프트웨어인 ZEN 소프트웨어를 이용해 3차원 이미지(도 10의 (A)) 및 직각 뷰(orthogonal view)(도 10의 (B)) 이미지를 수득하였다.
또한, 40X 배율에서 수득한 이미지(도 10의 (C))는 콜라젠 섬유의 정렬성을 확인하는데 이용하였으며, 정렬성 확인 방법은 다음과 같다. 이미지 J 소프트웨어의 오리엔테이션(Orientation) J 플러그인을 이용하여 이미지 픽셀마다 상의 방향(orientation)을 분석하고 -90°부터 90°까지의 각에 각기 다른 색으로 컬러 맵핑(color mapping)을 수행하였다. 이렇게 컬러맵핑한 이미지 결과는 도 10의 (D)에 해당한다. 컬러 맵핑에서 분석 각의 분포(distribution)는 오리진(Origin) 소프트웨어를 이용해 극좌표(polar plot)를 그려 확인하고 정렬 정도는 정렬 지수(orientation index, OI)를 구해 정량화하였다. 극좌표 결과는 도 10의 (E) 와 같으며, 정렬 지수는 아래와 같은 수학식을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
Figure 112016020922310-pat00001
(상기 식에서
Figure 112016020922310-pat00002
는 방향성을 알고 싶은 기준 각도,
Figure 112016020922310-pat00003
는 이미지 상에서 부분 방향 각도(local orientation angle),
Figure 112016020922310-pat00004
는 특정 부분 방향 각도(local orientation angle) 값을 나타내는 픽셀의 수)
본 실험에서 정렬 정도를 알고 싶은 기준 각도는 압축 회복 축의 방향에 해당하며 이 방향을 0°로 지정하였다. 즉,
Figure 112016020922310-pat00005
따라서 방향 지수의 도출 식은 아래 수학식 2와 같이 간소화 될 수 있다.
[수학식 2]
Figure 112016020922310-pat00006
예컨대 상이 방향성이 없이 랜덤하면 OI 값은 0으로 계산되고, 모든 픽셀에서 상의 방향이 0°이면 OI는 1의 값을 가지며 모든 픽셀에서 상의 방향이 90° 또는 -90°이면 OI값은 -1으로 계산된다. 상기 수학식 2를 이용하여 정렬지수를 계산한 결과 0.74 라는 값을 얻을 수 있었다.
도 10의 결과에 따르면 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에 의하여 채널결합형 스캐폴드를 제조하는 경우에 있어서, 채널 위에 형성되는 스캐폴드에 포함되는 콜라겐 섬유를 정렬할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 정렬지수 값에 따르면 PDMS 칩에서 콜라겐 섬유가 압축 또는 압축 회복방향과 평행한 방향으로 정렬된 경향을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
그러므로, 본 발명의 일측면에 따른 장치 또는 방법에 의하면 채널이 결합된 스캐폴드를 제조함과 동시에 그러한 스캐폴드에 포함된 콜라겐과 같은 미세섬유들을 압축 또는 압축 회복방향과 평행한 방향으로 일정하게 정렬할 수 있는 효과를 나타내며, 이러한 효과로 인하여 스캐폴드가 미세섬유와 하나 이상의 세포를 포함하는 경우에는 세포도 함께 정렬하는 효과를 나타낼 수 있다.
[시험예 3] 형광 물질을 이용한 채널 결합형 콜라겐 스캐폴드에서의 물질 전달 또는 확산의 확인
(1) PDMS 칩 준비 - 1) PDMS 채널층 기판의 준비: PDMS 채널층 기판의 크기는 20 mm (가로) X 20 mm (세로) X 3 mm (두께--)이며, 중앙에 위치한 세 개의 채널의 크기는 각각 0.2 mm (폭) X 0.3 mm (깊이) X 15 mm (길이)이다. 2) PDMS 웰층 기판의 준비: PDMS 웰층 기판의 크기는 20 mm (가로) X 20 mm (세로) X 7 mm (두께)이고, 중앙에 위치한 웰 의 크기는 10 mm (가로) X 5 mm (세로) X 7 mm (깊이)이며, 채널층 기판의 각 채널의 양 끝과 연결되는 유입구 및 유출구의 크기는 직경 3mm이며, 이러한 유입구 및 유출구에는 용액을 주입할 수 있게 주입통(reservoir)을 설치하였다. 3) 이렇게 준비된 기판을 산소 플라즈마 처리 (80W, 20 sccm, 40 초) 후 PDMS 채널층 기판과 PDMS 웰층 기판을 결합하여 PDMS 칩을 제조하였다.
(2) 그런 뒤, 결합된 칩 표면을 폴리도파민으로 코팅하였다. 구체적으로 PDMS 웰 내부에 2 mg/ml의 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 10 mM의 Tris-HCl 버퍼(pH 8.5)에 첨가한 용액을 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응 용액을 제거하고 증류수로 3회 세척하였고, 클린 벤치 내에서 건조시켰다.
(3) 도 8에 기재된 것과 같은 압축기를 사용하여 PDMS 칩을 채널의 수직 방향으로 압축하였다. 압축은 채널과 수직한 웰의 폭이 원래 길이 10 mm에서 5 mm가 되도록 압축하였다.
(4) 압축상태의 웰에 형광물질(Tetramethylrhodamine, TRITC)이 표지된 콜라겐 용액(25 mg/ml)을 20 μl 로딩하고 5 분간 상온에서 압축상태를 유지시켜 콜라겐 용액을 부분적으로 경화시켰다.
(5) 그런 뒤 압축기를 풀어 압축된 PDMS 칩을 원상회복 시키고, 원상회복된 칩은 콜라겐 용액을 완전히 겔화시키기 위하여 37 ℃의 인큐베이터에 30 분간 넣어두었다.
(6) 중앙의 유입구를 통해서는 중앙 채널(도 9의 채널 2)에 형광표지물질인 10 μM의 FITC 덱스트란 (250kDa) 용액(Sigma Aldrich, USA)을 유입하고 양쪽 끝의 유입구를 통해서 양쪽 채널(도 9의 채널 1, 채널 3)에는 무색의 수용액 PBS(phosphate buffered saline)을 유입하였다. 채널에 용액이 유입된 것을 확인 한 후 주입통에 채워진 용액의 높이는 동일하게 맞춰주었다.
(7) 공초점 현미경(LSM700 confocal laser scanning microscope, Carl Zeiss사, 독일)을 통해 시간 별(주입 직후, 주입후 30분, 1시간, 및 1시간 30분)로 3차원 이미징을 실시하였다. 그리고 3D 이미지 렌더링을 통하여 콜라겐 스캐폴드의 평면도(top view)와 단면도(cross sectional view)를 확인하였다. 평면도의 결과를 도 11의 B)에 나타내고 단면도는 도 11의 C)에 나타내었다.
도 11의 결과에 따르면, 공초점 현미경 이미지의 평면도와 단면도 이미지에서 보여지듯이 콜라겐 스캐폴드 하부의 채널을 통해 콜라겐 젤에 국부적으로 특정 물질을 전달 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 채널로 유입된 물질은 콜라겐 젤 상에서 시간에 따라 확산 되며 이에 따른 농도 구배를 형성할 수 있음을 확인하였다.
[시험예 3] 세포 표지 형광 물질을 이용한 채널 결합형 콜라겐 스캐폴드 내에 집적된 세포군에 국부적으로 상이한 물질의 전달 확인
(1) PDMS 칩 준비 - 1) PDMS 채널층 기판의 준비: PDMS 채널층 기판의 크기는 20 mm (가로) X 20 mm (세로) X 3 mm (두께--)이며, 중앙에 위치한 세 개의 채널의 크기는 각각 0.2 mm (폭) X 0.3 mm (깊이) X 15 mm (길이)이다. 2) PDMS 웰층 기판의 준비: PDMS 웰층 기판의 크기는 20 mm (가로) X 20 mm (세로) X 7 mm (두께)이고, 중앙에 위치한 웰 의 크기는 10 mm (가로) X 5 mm (세로) X 7 mm (깊이)이며, 채널층 기판의 각 채널의 양 끝과 연결되는 유입구 및 유출구의 크기는 직경 3mm이다. 3) 이렇게 준비된 기판을 산소 플라즈마 처리 (80W, 20 sccm, 40 초) 후 PDMS 채널층 기판과 PDMS 웰층 기판을 결합하여 PDMS 칩을 제조하였다.
(2) 그런 뒤, 결합된 칩 표면을 폴리도파민으로 코팅하였다. 구체적으로 PDMS 웰 내부에 2 mg/ml의 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 10 mM의 Tris-HCl 버퍼(pH 8.5)에 첨가한 용액을 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응 용액을 제거하고 증류수로 3회 세척하였고, 클린 벤치 내에서 건조시켰다.
(3) 압축기를 사용하여 PDMS 칩을 채널의 수직 방향으로 압축하였다. 압축은 채널과 수직한 웰의 폭이 원래 길이 10 mm에서 5 mm가 되도록 압축하였다.
(4) 압축상태의 웰에 콜라겐(25 mg/ml)과 교모세포종 세포주(U87-MG. glioblastoma cell line, 107/ml)(한국 세포주 은행에서 입수)의 혼합 용액을 20 μl 로딩하고 5 분간 상온에서 압축상태를 유지시켜 콜라겐 용액을 부분적으로 경화시켰다.
(5) 그런 뒤 압축기를 풀어 압축된 PDMS 칩을 원상회복 시키고, 원상회복된 칩은 콜라겐 용액을 완전히 겔화시키기 위하여 37 ℃의 인큐베이터에 30 분간 넣어두었다.
(6) PDMS 웰의 콜라겐 위로 200 μl의 세포 배양액(MEM(Minimum Essential Media, GIBCO, USA)에 10% FBS(Corning사, USA) 및 100 unit 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신(GIBCO사, USA)을 첨가한 배양액)을 뿌리고 모든 채널에도 배양액을 주입한 후, 37 ℃, 5% CO2 조건의 세포배양 인큐베이터에서 하루간 세포를 배양하였다.
(7) 인큐베이터에서 칩을 꺼내어 클린 벤치 내에서 유입구 및 유출구에 배관(tubing)을 연결하고 중앙 유입구에 연결된 배관에는 붉은색 세포 표지 형광물질(CellTracker™ Red CMTPX)이 담긴 주사기(syringe)를 연결하고 양쪽 끝의 유입구에는 녹색 세포 표지 형광물질(CellTracker™ Green CMFDA)이 담긴 주사기를 연결하였다.
(8) 그런 뒤, PDMS 칩을 다시 인큐베이터 안에 넣고 배관에 연결된 주사기를 주사기 펌프에 장착한 후 5 μl/분의 속도로 20 분간 각 용액을 주입하였다.
(9) 주입이 완료된 후, 배관과 주사기를 제거하고 공초점 현미경(LSM700 confocal laser scanning microscope, Carl Zeiss사, 독일)을 통해 3차원 이미징을 실시하였다. 이러한 이미징 결과를 도 12의 B)에 나타내었다.
도 12의 결과에 따르면, 3차원 단면도(cross sectional view) 공초점 현미경 이미지에서와 같이 콜라겐 스캐폴드에 중앙부분에 집적된 세포는 중앙 하부 채널을 통해 전달된 CellTracker™ Red CMTPX에 의해 붉은색 형광으로 표지 되었고 스캐폴드 양쪽에 집적된 세포는 양쪽 하부 채널을 통해 전달된 CellTracker™ Green CMFDA를 통해 녹색 형광으로 표지 되었음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 일측면에 따른 채널결합형 콜라겐 스캐폴드를 이용하면 3차원 콜라겐 내에 집적된 세포군에 국부적으로 상이한 물질을 전달할 수 있음을 확인할 수 있었다.
1: 제2탄성기판
2: 탄성기판에 포함되고 그 내부에 스캐폴드 조성물이 로딩되는 웰
3: 유입구
4: 유출구
5: 제1탄성기판
6: 제1탄성기판의 표면에 포함된 홈
7: 제1탄성기판과 제2탄성기판의 결합체, 탄성기판칩
8: 스캐폴드 조성물
9: 배관(tubing)
10: 압축모듈
11: 압축판
12: 압축부
13: 제어부

Claims (25)

  1. 삭제
  2. 표면에 홈을 포함하는 제1탄성기판을 포함하고, 상기 홈은 채널 모양으로 형성된 것이며,
    상기 제1탄성기판의 위에 위치하는 제2탄성기판을 더 포함하고,
    상기 제2탄성기판은 제2탄성기판을 관통하는 웰을 포함하는 것인, 스캐폴드 조립체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제2탄성기판은 제1탄성기판의 홈의 양 끝과 연결되는 유입구 및 유출구를 더 포함하는 것인 스캐폴드 조립체.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 조립체는, 제1탄성기판의 홈 위에 스캐폴드를 더 포함하는 스캐폴드 조립체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 스캐폴드는 미세섬유, 세포, 또는 이들의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 것인, 스캐폴드 조립체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 미세섬유는 나일론, 폴리아크릴산, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리스티렌, 폴리비닐알코올, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 옥사이드로 구성된군으로부터 선택된 하나 이상인 합성 고분자 섬유 또는 엘라스틴, 젤라틴, 피브리노겐, 피브린, 알지네이트, 셀룰로오스, 실크 피브로인, 키토산, 라미닌, 액틴 및 콜라겐으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 천연 고분자 섬유인 스캐폴드 조립체.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 세포는 신경세포, 교세포, 근세포, 고형암세포, 중배엽 줄기세포 또는 섬유아세포인 스캐폴드 조립체.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 제1탄성기판 및 제2탄성기판 중 하나 이상은 탄성고분자를 포함하는 것인 스캐폴드 조립체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 탄성고분자는 천연 폴리이소프렌, 합성 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 클로로프렌 고무, 부틸고무, 스티렌-부타디엔 고무, 니트릴 고무, 에틸렌 프로필렌 고무, 에틸렌 프로필렌 다이엔 고무, 에피클로로하이드린 고무, 폴리아크릴 고무, 실리콘 고무, 플루오로실리콘 고무, 플루오로 탄성중합체, 폴리에테르 블록 아미드, 클로로술폰화 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 폴리디메틸실록산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 스캐폴드 조립체.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 스캐폴드 조립체; 및
    제1탄성기판의 홈을 닫기 위해 제1탄성기판 및 제2탄성기판의 외부에서 상기 기판들의 폭을 압축시키는 압축모듈을 포함하는 채널결합형 스캐폴드의 제조장치.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 압축모듈은 제1탄성 기판 및 제2탄성기판의 평행한 두 면과 접촉하는 압축판; 압축판을 구동시켜 탄성기판을 압축시키는 압축부; 및 압축부의 움직임을 제어하는 제어부를 포함하는 것인 제조장치.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제어부는 압축부를 구동시켜 홈과 수직한 제1탄성기판 및 제2탄성기판의 폭의 5% 내지 80%를 압축시키는 것인 장치.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제어부는 압축부를 구동시켜 홈과 수직한 제1탄성기판 및 제2탄성기판의 폭의 25% 내지 60%를 압축시키는 것인 장치.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 제어부는 압축부를 구동시켜 홈의 폭을 30% 내지 100% 닫는 것인 장치.
  15. 제10항에 따른 장치를 이용하여 채널 결합형 스캐폴드를 제조하는 방법으로서,
    (1) 제1탄성기판 및 제2탄성기판을 압축하여 홈을 닫는 단계;
    (2) 제2탄성기판의 웰 내 및 제1탄성기판의 닫힌 홈 위에 스캐폴드 조성물을 로딩하는 단계
    (2)' 제1탄성기판의 압축 상태를 유지하면서 스캐폴드 조성물을 부분적으로 경화시키는 단계; 및
    (3) 제1탄성기판 및 제2탄성기판을 원상회복시키는 단계를 포함하는 채널 결합형 스캐폴드의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 방법은 (1) 단계 이전에 (1)' 탄성 기판의 표면을 접착제로 코팅하는 단계를 더 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 접착제는 글루타르 알데히드, 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신 및 폴리도파민으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 방법.
  18. 삭제
  19. 제15항에 있어서,
    상기 (2)'단계는 제1탄성 기판 및 제2탄성기판의 압축 상태를 1분 내지 10분 동안 유지하는 것인 방법.
  20. 삭제
  21. 제15항에 있어서,
    상기 (1)단계에서 제1탄성기판 및 제2탄성기판의 압축은 홈과 수직인 방향으로 수행되는 것인 방법.
  22. 제15항에 있어서,
    상기 방법은 스캐폴드 조성물에 포함된 미세섬유, 세포, 또는 이들의 혼합물을 압축 또는 원상회복 방향과 평행한 방향으로 정렬하는 것인 방법.
  23. 제15항에 있어서,
    상기 (1)단계는 압축 전을 기준으로 홈과 수직한 제1탄성기판 및 제2탄성기판의 폭의 5% 내지 80%를 압축하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 (1)단계는 압축 전을 기준으로 홈과 수직한 제1탄성기판 및 제2탄성기판의 폭의 25% 내지 60%를 압축하는 것인 방법.
  25. 제15항에 있어서,
    상기 (1) 단계는 압축하여 홈의 폭을 30% 내지 100% 닫는 것인 방법.
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