KR102124420B1

KR102124420B1 - 선 스트레인의 조합 및 물성에 따른 구조체 내 미세섬유 정렬 제어 방법

Info

Publication number: KR102124420B1
Application number: KR1020170145075A
Authority: KR
Inventors: 최낙원; 김소현; 정소현; 윤의성; 이창준
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2020-06-18
Also published as: KR20190050010A

Abstract

본 명세서는 미세섬유의 정렬 방법 및 이를 위한 구조체에 관한 것으로서, 본 발명의 일 측면에 따른 탄성기판, 장치, 또는 방법에 의할 때, 탄성기판을 신장 또는 압축시켰다가 회복시키는 방법으로 다양한 방향으로 미세섬유를 정렬시킬 수 있으며, 그에 따라 세포를 다양하고 일정한 방향이나 무늬로 정렬 시킬 수 있으므로, 본 발명의 일 측면을 활용하면 각종 연구에 있어서 사용되는 세포배양 모델을 보다 용이하게 양산하여 제공할 수 있다.

Description

선 스트레인의 조합 및 물성에 따른 구조체 내 미세섬유 정렬 제어 방법{METHOD FOR CONTROLLING MICROFILAMENT ALIGNMENT IN STRUCTURE BY PRE-STRAIN COMBINATION AND PHYSICAL PROPERTIES}

본 명세서는 미세섬유의 정렬을 위한 구조체 및 미세섬유의 정렬 방법에 관한 것이다.

체내의 모든 장기와 조직은 배아상태에서 발달 단계를 거쳐 생성되면서 세포와 세포 외 기질이 특징적인 모습으로 정렬된다. 이러한 구조적 특징에 의해 각 장기와 조직 내에 위치한 세포는 주변의 다른 세포 또는 세포 외 기질과 특징적인 상호작용을 하게 되며, 이러한 상호작용은 각각의 장기가 기능을 수행하는데 있어서 결정적인 역할을 한다. 대표적인 예로서 뇌, 심장, 중추 및 말단 신경 다발, 각종 근육들은 매우 특징적인 구조를 보이며, 이러한 구조가 와해되면 심각한 발달장애를 초래한다.

이러한 세포 및 조직의 특징을 보다 면밀하게 연구하기 위해, 생체 하이드로젤 내에 세포를 심고 배양하여 특정 조직과 유사하게 성장하도록 유도하여 개체에 이식하는 조직공학이라는 기술적 개념이 1993년 Science 저널에 처음으로 발표되었고, 이후 여러 가지 합성 혹은 천연 고분자 생체재료를 활용하여 그 안에 세포를 배양하는 방법인, 동물세포 3차원 배양 기술이 선진국을 중심으로 계속해서 발전하고 있다.

간, 연골, 신장 등 장기에 관해서는 기존의 2차원 세포배양 방식에 비해 생체 내 (in vivo)와 보다 유사한 환경에서 생리학적 모델을 만들고자 하는 시도가 어느 정도 성공을 거두고 있다. 정상적인 장기 모델뿐만 아니라 암 조직 내 세포 주위 미세환경을 모사하는 등 병리학적 모델을 구축하는 데에도 3차원 배양 기술이 도입되어 기존의 2차원 세포 배양에서는 간과되었던 세포-세포, 세포-세포 외 기질 상호 작용에 관해서도 깊이 있는 연구가 꾸준히 진행되고 있다. 2000년대 중반부터는 응용분야가 더욱 확장되어 줄기세포의 3차원 배양도 시도되고 있으며, 특히 2011년 9월 미국국립보건원(NIH: National Institute of Health)에서 국방첨단연구원(DARPA: Defense Advanced Research Projects Agency), 식품약물관리원(FDA: Food and Drug Administration)과 공동으로 5년 동안 7,000만 달러 규모의 조직 칩 프로젝트(Tissue Chip Project)를 시작한다고 계획을 밝힌 바 있다.

그에 따라, 기존에 개발된 세포/조직 칩 기술들과 더불어 관련 분야의 활성화 및 발전이 기대되고 있기는 하나, 세포나 조직의 정렬 및 방향성을 조절하는 기술은 여전히 미흡한 실정이다.

PCT 공개공보 WO2009/073548 A1(2009.06.11)

본 명세서는 미세섬유의 정렬을 가능하게 하는 탄성 구조체 및 미세섬유의 정렬 방법을 제공하고, 그에 따른 세포의 정렬 및 배양 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 일 측면에서 미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 로딩하는 마이크로채널 및 하나 이상의 공동(void)을 포함하는 미세섬유 정렬용 탄성기판을 제공한다.

본 발명은 다른 측면에서, 미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 로딩하는 마이크로채널 및 탄성계수가 다른 둘 이상의 기판을 포함하는 미세섬유 정렬용 탄성기판을 제공한다.

본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 미세섬유 정렬용 탄성기판 및 상기 탄성기판을 신장 또는 압축시키기 위한 장치를 포함하는, 미세섬유 정렬 장치일 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에서, (1) 미세섬유 정렬용 탄성기판에 대하여 일정 방향의 스트레인을 가한 상태로 유지시키는 단계; (2) 미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 상기 탄성 기판 내의 마이크로채널에 로딩하는 단계; 및 (3) 상기 일정 방향의 스트레인을 배제하는 단계를 포함하는, 미세섬유 정렬 방법일 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 미세섬유 정렬용 탄성기판 또는 미세섬유 정렬 방법을 이용하는 세포 배양 방법일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 탄성기판, 장치, 또는 방법에 의할 때, 탄성기판을 신장 또는 압축시켰다가 회복시키는 방법으로 다양한 방향으로 미세섬유를 정렬시킬 수 있으며, 그에 따라 세포를 다양하고 일정한 방향이나 무늬로 정렬 시킬 수 있으므로, 본 발명의 일 측면을 활용하여 각종 연구에 있어서 요구되는 다양한 세포배양 모델을 쉽게 양산하여 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 탄성 기판 내의 공동(201, 202)과 마이크로채널(100, 101)의 세 가지 예를 도시한 것이다(맨 위 그림에서 원형 또는 타원형은 공동이고 굵은 직선은 마이크로채널, 가운데 그림에서 사각형은 공동이고 굵은 직선은 마이크로 채널, 맨 아래 그림에서 두 원은 공동이고 가운데 아령형 모양은 마이크로 채널).
도 2는 본 발명의 일 측면에 따른 공동(201, 202)과 마이크로채널(100, 101)의 세가지 예에 따른 각각의 탄성 기판(10)에 대한 평면도 및 사시도를 예시한 것이다.
도 3은 도 2의 맨 위 탄성기판(10)과 이를 신장시키는 장치(40)를 나타낸 것으로서, 좌측은 탄성기판을 신장시키기 전의 모습을 나타낸 것이고, 우측은 탄성기판을 종방향으로 신장시킨 모습을 나타낸 것이다.
도 4는 도 2의 가운데 탄성기판(10)과 이를 신장시키는 장치(40)를 나타낸 것으로서, 좌측은 탄성기판을 신장시키기 전의 모습을 나타낸 것이고, 우측은 탄성기판을 종방향으로 신장시킨 모습을 나타낸 것이다.
도 5는 도 2의 맨 아래 탄성기판(10)과 이를 신장시키는 장치(50)를 나타낸 것으로서, 좌측은 탄성기판을 신장시키기 전의 모습을 나타낸 것이고, 우측은 탄성기판을 횡방향으로 신장시킨 모습을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 측면에 따른 탄성기판을 도 3과 같이 종방향으로 신장의 스트레인을 가할 경우, 원형 공동 부분에 미치는 스트레인 방향(회색 화살표)과 마이크로채널 부분에 미치는 스트레인 방향(적색 화살표)을 나타낸 것으로, 도면의 하단은 본 발명의 일 측면에 의한 방법에 의해 미세섬유가 정렬된 모습을 형광 염색하고 시각화한 것을 나타낸 것이다(실선 화살표의 방향은 스트레인의 방향을 나타낸 것이고, 실선 화살표의 길이는 스트레인의 크기를 나타낸 것이며, d는 공동의 직경, 각도는 미세섬유가 정렬된 방향을 변형 전 마이크로채널의 길이방향을 기준으로 잰 각도를 뜻함).
도 7은 본 발명의 일 측면에 따른 탄성기판을 도 4와 같이 종방향으로 신장의 스트레인을 가할 경우, 다각형 공동 부분에 미치는 스트레인 방향(회색 화살표)과 마이크로채널 부분에 미치는 스트레인 방향(적색 화살표)을 나타낸 것으로, 도면의 하단은 본 발명의 일 측면에 의한 방법에 의해 미세섬유가 정렬된 모습을 형광 염색하고 시각화한 것을 나타낸 것이다(실선 화살표의 방향은 스트레인의 방향을 나타낸 것이고, 실선 화살표의 길이는 스트레인의 크기를 나타낸 것이며, 각도는 미세섬유가 정렬된 방향을 마이크로채널의 길이방향을 기준으로 잰 각도를 뜻함).
도 8은 오그제틱 구조의 예를 나타낸 것으로서, 위는 신장시키기 전의 구조이고, 아래는 신장시킬 경우의 구조를 나타낸 것이며, 아래 그림에서 검정 화살표는 신장 스트레인의 방향을 나타낸 것이고, 적색 화살표는 팽창하는 방향과 힘을 나타낸 것이다.
도 9는 도 2의 탄성기판 중 예시적으로 맨 아래 기판을 사용하여 횡으로 신장하였을 때를 나타낸 것이고, 하단은 본 발명의 일 측면에 의한 방법에 의해 마이크로채널(101)의 미세섬유가 정렬된 모습을 형광염색으로 확인한 것이다(상단 도면의 독립된 두 원 또는 타원은 공동(201)이고, 공동 사이의 아령형 구조(101)는 마이크로채널임).
도 10은 탄성계수가 다른 두 탄성 기판부(20, 30)를 결합하고 압축하는 경우에 관하여 도시한 것으로서, 좌측 도면의 검정색 사각형은 마이크로채널(10)이고, 우측 도면의 굵은 화살표는 압축 스트레인의 방향을 나타낸 것이다.
도 11은 상기 도 10과 방법으로 탄성계수가 다른 두 탄성 기판부를 결합한 뒤 압축 스트레인을 가하는 방식으로 본 발명의 일 측면에 의한 방법에 의해 미세섬유를 정렬시킨 모습을 확인한 것이고 하단은 이를 형광 염색으로 확인한 것이다(상단 도면의 적색 화살표의 방향은 마이크로채널에서 힘을 받는 부분을 나타낸 것이고, 적색 화살표의 길이는 힘의 크기를 나타낸 것임).
도 12는 본 발명의 일 측면에 따른 선 신장(pre-stretching)에 의한 정렬 방향을 3D 매트릭스로 분석한 것으로서, 좌측 도면에서 굵은 화살표는 신장시킨 후 회복하는 방향이고, 굵고 연한 회색선은 미세섬유와 그 방향이며, 우측 도면은 신장 후 회복된 상태의 미세섬유 방향을 도시한 것이다.
도 13은 상기 도 12를 XY 평면으로 도시한 것이고, 좌측 도면은 선 신장 상태를 나타낸 것이며, 가운데 도면은 신장 후 회복 상태를 나타낸 것이고, 우측 도면은 △L/L에 따른 θ의 양상을 나타낸 것이다(좌측 및 가운데 도면에서 주황색 실선이 미세섬유 및 그 방향을 나타냄).
도 14는 상기 도 12를 YZ 평면으로 도시한 것이고, 좌측 도면은 선 신장 상태를 나타낸 것이며, 가운데 도면은 신장 후 회복 상태를 나타낸 것이고, 우측 도면은 △L/L에 따른 φ의 양상을 나타낸 것이다(좌측 및 가운데 도면에서 녹색 실선이 미세섬유 및 그 방향을 나타냄).
도 15는 상기 도 12를 XZ 평면으로 도시한 것이고, 좌측 도면은 선 신장 상태를 나타낸 것이며, 가운데 도면은 신장 후 회복 상태를 나타낸 것이고, 우측 도면은 △L/L에 따른 φ의 양상을 나타낸 것이다(좌측 및 가운데 도면에서 청색 실선이 미세섬유 및 그 방향을 나타냄).
도 16은 본 발명의 일 측면에 의한 선 압축(pre-compressing)에 의한 정렬 방향을 3D 매트릭스로 분석한 것으로서, 좌측 도면에서 굵은 화살표는 압축시킨 후 회복하는 방향이고, 굵고 연한 회색선은 미세섬유와 그 방향이며, 우측 도면은 신장 후 회복된 상태의 미세섬유 방향을 도시한 것이다.
도 17은 상기 도 16을 XY 평면으로 도시한 것이고, 좌측 도면은 선 압축 상태를 나타낸 것이며, 가운데 도면은 압축 후 회복 상태를 나타낸 것이고, 우측 도면은 △L/L에 따른 θ의 양상을 나타낸 것이다(좌측 및 가운데 도면에서 주황색 실선이 미세섬유 및 그 방향을 나타냄).
도 18은 상기 도 16을 YZ 평면으로 도시한 것이고, 좌측 도면은 선 압축 상태를 나타낸 것이며, 가운데 도면은 압축 후 회복 상태를 나타낸 것이고, 우측 도면은 △L/L에 따른 φ의 양상을 나타낸 것이다(좌측 및 가운데 도면에서 녹색 실선이 미세섬유 및 그 방향을 나타냄).
도 19는 상기 도 16을 XZ 평면으로 도시한 것이고, 좌측 도면은 선 압축 상태를 나타낸 것이며, 가운데 도면은 압축 후 회복 상태를 나타낸 것이고, 우측 도면은 △L/L에 따른 φ의 양상을 나타낸 것이다(좌측 및 가운데 도면에서 청색 실선이 미세섬유 및 그 방향을 나타냄).

본 명세서에서 "탄성"은 외부 힘에 의하여 구조가 변형 된 뒤, 다시 원상태의 구조로 돌아오는 힘이나 성질을 의미하는 것이며 통상의 기술자가 자명하게 인식할 수 있는 용어에 해당한다. 구체적으로, 특정 구조체(예를 들어, 탄성기판)의 폭이나 길이의 5%이상, 10%이상, 15%이상, 20%이상, 30%이상, 35%이상, 40%이상, 45%이상, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 70%이상 또는 80%이상을 압축한 뒤에 다시 압축 전 원래 폭이나 길이의 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 또는 99% 이상으로 회복되는 성질을 가지는 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 "기판"은 탄성을 가지는 물질로 제조된 구조체라면 제한 없이 사용 가능하다. 탄성을 가지는 물질의 예시로는 PDMS(polydimethylsiloane)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에 알려진 탄성을 가지는 물질로 알려진 소재라면 제한 없이 사용하여 제작할 수 있다.

본 명세서에서 “기판부”는 상기 기판을 포함하는 부분으로서, 기판의 일부를 구성하는 구조체를 포함한다.

본 명세서에서 "미세섬유"는 마이크로미터 이하의 미세단위에서 선상 구조를 가지는 섬유를 의미하는 것으로서, 길고 가늘며 연하게 굽혀질 수 있는 미세 물질을 의미할 수 있다. 이러한 미세섬유는 합성 또는 천연 고분자 섬유에 해당할 수 있으며, 예를 들어 콜라겐 섬유 또는 액틴 섬유와 같은 생체섬유에 해당할 수 있다.

본 명세서에서 “미세섬유 정렬용 탄성기판”이란, 미세섬유를 특정 방향으로 정렬하기 위한 기판으로서 탄성이 있는 기판을 의미하고, 상기 특정 방향은 목적과 의도에 따라 어떠한 방향도 될 수 있고, 한 방향 또는 다수의 방향일 수도 있으며, 일정한 무늬를 이루는 방향도 포함한다.

본 명세서에서 “스트레인(Strain)”이란, 물체에 외력이 작용하면 물체가 저항력이 생겨 변형하는데, 그때의 외력 또는 변형의 정도를 말한다. 즉, 스트레인은 압력, 압박, 인장력 등을 포함하고, 어느 물체가 인장 또는 압축을 받을 때 원래의 길이에 대하여 늘어나거나 줄어든 길이를 비율로 표시한 값을 포함한다.

본 명세서에서 “공동”이란, 본 명세서의 기판 내에 형성된 빈 공간, 빈 구멍 등을 뜻하고, 그 모양에는 한정이 없으며, 기판에 스트레인이 가해질 때 변형될 수 있는 구조를 포함한다. 기판에 스트레인이 가해질 경우 그에 따라 공동 주변에 일정한 방향 또는 다양한 방향의 스트레인이 가감(加減)될 수 있다.

본 명세서에서 “마이크로채널”이란, 마이크로 단위의 폭 또는 깊이를 가지는 통로로서, 미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 로딩하는 통로를 포함한다. 본 명세서에서 마이크로채널은 탄성 기판 내에 위치하며, 모양이나 길이의 제한은 없다.

본 명세서에서 “오그제틱 구조(Auxetic structures)”란, 내부구조를 적절히 설계한 격자 구조로서 인장시 팽창하고 압축시 수축함으로써 음의 프와송비(Poissons ratio)를 갖는데 이러한 특성을 갖는 구조를 말한다. 변형 전후 체적이 일정한 일반적인 재료의 경우，양의 프와송비(Poissons ratio)를 갖는다. 즉，수직방향으로 인장될 경우，체적이 일정하므로 수평방향으로는 수축하게 된다. 그러나, 오그제틱 구조의 경우 음의 프와송비를 가지므로 수직 방향으로 인장시 수평 방향으로도 팽창하고, 수직 방향으로 압축시 수평 방향으로도 수축하며, 수평 방향으로 인장 또는 압축할 경우에 수직 방향에 대해서 각각 팽창 또는 수축하게 된다.

본 명세서에서 “접착제”란, 미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물이 기판이나 마이크로채널 내에서 잘 부착되어 움직이거나 흘러내리지 않도록 해주는 성분이나 원료를 뜻한다.

본 명세서에서 “겔화(gelation)”란, 졸(sol)을 겔로 변화시키는 것을 말한다. 겔화의 일반적 특징으로서는 계(系)의 뚜렷한 탄성 증가, 급격한 점성도 상승 등을 들 수 있다.

의료계나 세포 연구계 등에서 세포나 생체조직의 배양 기술 등에 관한 관심이 증가하고 있는데, 특히 복잡하면서도 매우 특징적으로 정렬된 조직(예를 들어, 뇌, 신경 조직, 근육 조직 등)의 구조적 특징은 해당 조직의 기능에 결정적인 영향을 미친다. 일 예로, 배아상태에서 뇌신경회로망의 정렬 및 조직화가 정상적으로 이루어지지 않으면 자폐 등 각종 정신 장애를 일으키는 것으로 알려져 있다.

현재까지의 세포 및 조직 배양 기술에 대해 여러 가지 문제가 대두되면서, 3차원 체외 환경에서 세포 및 조직 배양을 구현하려는 노력도 활발해지기 시작했다. 정렬된 생체 재료 구조체 내에서 세포의 배양이 가능하도록 하는 기술 개발은 앞으로도 그 수요가 지속적으로 증가할 것이다.

세포 배양에 쓰이는 대표적인 생체 재료로 우리 몸의 세포 외 기질 구성 중에 가장 큰 비율을 차지하고 있는 섬유질인 콜라겐이 있다. 콜라겐 섬유를 정렬하기 위한 기존 기술로 1) 전기장 또는 2) 자기장을 외부 장치에서 걸거나, 3) 콜라겐 안에 심어진 세포가 콜라겐을 수축하는 성질을 이용하거나, 4) 콜라겐 용액을 좁은 관을 통해 흘려보내면서 유체 흐름에 의한 힘 (전단력)을 이용하는 방법들이 알려져 있다. 외부 장치를 통해 전기, 자기장을 주는 것은 재현성과 실용성이 떨어질 수 있으며 전기, 자기장에 의해 자극을 받은 세포는 생리적 활성이 변하고 상당한 독성이 나타날 수 있다. 또한, 상기 언급한 방법들로는 여러 가지 서로 다른 종류의 콜라겐을 원하는 모양과 크기로 일체형 3차원 구조체를 제작하면서 동시에 섬유를 정렬하기가 어렵다.

본 발명은 일 측면에서, 상기 수요를 충족시킬 수 있고 위와 같은 문제를 해결할 수 있는 미세섬유 정렬용 탄성 기판으로서, 상기 기판은 미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 로딩하는 마이크로채널; 및 하나 이상의 공동(void)을 포함하는, 미세섬유 정렬용 탄성기판일 수 있다.

상기 기판을 신장시키거나 압축시킨 후 회복시키는 것만으로도 마이크로 채널에 여러 부분에 다양한 방향으로 스트레인을 가할 수 있고, 그러한 스트레인의 방향을 고려하여 마이크로 채널 각 부분에서의 미세섬유의 정렬 방향, 무늬 등을 조절할 수 있는 특징이 있다. 그에 따라, 함께 배양하는 세포도 그 방향 및 무늬에 따라 배양 및 증식시킬 수 있는 것이다.

일 구현 예로서, 상기 공동은 마이크로채널과 평행한 방향으로 배열된 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 공동은 마이크로채널과 연결되어 있지 않은, 분리된 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 공동은 상기 마이크로채널을 경계로 좌우 또는 상하에 대칭적 또는 비대칭적으로 형성된 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 공동은 원형, 타원형, 및 삼각형 이상의 다각형 중 하나 이상일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 마이크로채널은 선형, 양 말단의 모양이 원형 또는 타원형인 선형, 또는 양 말단의 모양이 삼각형 이상의 다각형인 선형일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 공동과 마이크로채널은 오그제틱 구조(Auxetic structure)를 이루는 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 오그제틱 구조는 프와송비가 음수일 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 미세섬유 정렬용 탄성 기판으로서, 상기 기판은 미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 로딩하는 마이크로채널; 제1기판부; 및 제1기판부와 탄성계수가 다른 제2기판부를 포함하는, 미세섬유 정렬용 탄성기판일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 두 기판부는 서로 접촉되도록 배치된 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 마이크로채널은 상기 탄성계수가 다른 두 기판부에 걸쳐서 형성된 것일 수 있다. 또한 상기 기판부는 둘 이상일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 탄성기판의 재질은 탄성 고분자일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 탄성 고분자는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS), 폴리메틸메타클릴레이드(polymethylmethacrylate; PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리실릭올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로스아세테이트(cellulose acetate), 폴리에틸렌테레프탈레이트(poly(ethyleneterephthalate; PETP), 천연 폴리이소프렌, 합성 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 클로로프렌 고무, 부틸고무, 스티렌-부타디엔 고무, 니트릴 고무, 에틸렌 프로필렌 고무, 에틸렌 프로필렌 다이엔 고무, 에피클로로하이드린 고무, 폴리아크릴 고무, 실리콘 고무, 플루오로실리콘 고무, 플루오로 탄성중합체, 폴리에테르 블록 아미드, 클로로술폰화 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 폴리우레탄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 측면에서, 상기 제1기판부는, 상기 탄성고분자 및 상기 탄성고분자를 경화시키는 경화제의 중량비를 11이상:1, 12이상:1, 13이상:1, 14이상:1, 15이상:1, 16이상:1, 17이상:1, 19이상:1, 20이상:1, 21이상:1, 22이상:1, 23이상:1, 24이상:1, 25이상:1, 26이상:1, 28이상:1, 30이상:1, 32이상:1, 34이상:1, 36이상:1 또는 38이상:1로 하여 경화시킨 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 제1기판부는, 상기 탄성고분자 및 상기 탄성고분자를 경화시키는 경화제의 중량비를 40이하:1, 38이하:1, 36이하:1, 34이하:1, 32이하:1, 30이하:1, 28이하:1, 27이하:1, 26이하:1, 25이하:1, 24이하:1, 23이하:1, 22이하:1, 21이하:1, 20이하:1, 18이하:1, 16이하:1, 14이하:1, 12이하:1 또는 11이하:1로 하여 경화시킨 것일 수 있다.

일 측면에서 상기 제2기판부는, 상기 탄성고분자 및 상기 탄성고분자를 경화시키는 경화제의 중량비를 5이상:1, 6이상:1, 7이상:1, 8이상:1, 9이상:1, 10이상:1, 11이상:1, 12이상:1, 13이상:1, 14이상:1, 15이상:1, 16이상:1, 17이상:1, 18이상:1 또는 19이상:1으로 하여 경화시킨 것일 수 있다. 다른 측면에서 상기 제2기판부는 20이하:1, 19이하:1, 18이하:1, 17이하:1, 16이하:1, 15이하:1, 14이하:1, 13이하:1, 12이하:1, 11이하:1, 10이하:1, 9이하:1, 8이하:1, 7이하:1 또는 6이하:1로 하여 경화시킨 것일 수 있다.

일 측면에서 상기 제1기판부의 탄성계수(또는 Young’s modulus)는 0.1MPa 이상, 0.2MPa 이상, 0.3MPa 이상, 0.4MPa 이상, 0.42MPa 이상, 0.44MPa 이상, 0.46MPa 이상, 0.47MPa 이상, 0.49MPa 이상, 0.5MPa 이상, 0.6MPa 이상, 0.7MPa 이상, 0.8MPa 이상 또는 0.9MPa 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 제1기판부의 탄성계수(또는 Young’s modulus)는 2.0 MPa 이하, 1MPa 이하, 0.9MPa 이하, 0.8MPa 이하, 0.7MPa 이하, 0.6MPa 이하, 0.5MPa 이하, 0.49MPa 이하, 0.48MPa 이하, 0.47MPa 이하, 0.46MPa 이하, 0.45MPa 이하, 0.44MPa 이하, 0.43MPa 이하, 0.42MPa 이하, 0.4MPa 이하, 0.35MPa 이하, 0.3MPa 이하, 0.25MPa 이하, 0.2MPa 이하 또는 0.15MPa 이하일 수 있다.

일 측면에서 상기 제2기판부의 탄성계수(또는 Young’s modulus)는 1MPa 이상, 1.5MPa 이상, 1.8MPa 이상, 2MPa 이상, 2.2MPa 이상, 2.4MPa 이상, 2.6MPa 이상, 2.8MPa 이상, 3MPa 이상, 3.2MPa 이상, 3.4MPa 이상, 3.6MPa 이상, 3.8MPa 이상, 4.0MPa 이상, 4.5MPa 이상, 5MPa 이상, 5.5MPa 이상, 6MPa 이상, 6.5MPa 이상, 7MPa 이상, 8MPa 이상 또는 9MPa 이상일 수 있다.

다른 측면에서 상기 제2기판부의 탄성계수(또는 Young’s modulus)는 10MPa 이하, 9MPa 이하, 8MPa 이하, 7MPa 이하, 6MPa 이하, 5MPa 이하, 4MPa 이하, 3MPa 이하, 2MPa 이하, 1.8MPa 이하 또는 1.5MPa 이하일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 제1기판부의 탄성고분자 및 경화제의 비율은 제2기판부의 그것과 다른 것일 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 제1기판부의 탄성계수(또는 Young’s modulus)는 제2기판부의 그것과 다른 것일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 마이크로채널은 접착제로 코팅된 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 접착제는 글루타르 알데히드, 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 및 폴리도파민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 일 측면에서, (1) 상기 미세섬유 정렬용 탄성기판에 대하여 일정 방향의 스트레인을 가한 상태로 유지시키는 단계; (2) 미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 상기 탄성 기판 내의 마이크로채널에 로딩하는 단계; 및 (3) 상기 일정 방향의 스트레인을 배제하는 단계를 포함하는, 미세섬유 정렬 방법일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 상기 탄성 기판에 대하여 일정 방향의 스트레인을 가하는 것은, 상기 탄성 기판을 신장하거나 압축하는 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 상기 탄성 기판에 대하여 일정 방향의 스트레인을 가하는 것은, 상기 탄성 기판 내의 공동의 모양, 배치 및 탄성 기판의 탄성계수 중 하나 이상에 따라 마이크로채널의 특정 부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것일 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 마이크로채널의 특정 부분은 마이크로채널의 전부 또는 일부분일 수 있다.

일 측면에서 상기 일정 방향 또는 특정 방향은 종방향 또는 횡방향일 수 있고, 스트레인을 가하기 전의 마이크로채널과 평행한 방향 또는 직교하는 방향일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것이, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 신장(stretching)에 의한 스트레인(선 신장에 의한 스트레인, pre-stretched strain)을 일정한 방향으로 가하는 것일 경우, 상기 특정 부분에서는 스트레인의 방향과 수직이 되는 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것이, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 압축(compressing)에 의한 스트레인(선 압축에 의한 스트레인, pre-compressed strain)을 일정한 방향으로 가하는 것일 경우, 상기 특정 부분에서는 스트레인의 방향과 평행한 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것이, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대해 신장에 의한 스트레인과 압축에 의한 스트레인을 둘다 가하는 것일 경우, 더 큰 스트레인이 신장에 의한 스트레인이면 상기 특정 부분에서는 스트레인의 방향과 수직이 되는 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것이, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대해 신장에 의한 스트레인과 압축에 의한 스트레인을 둘다 가하는 것일 경우, 더 큰 스트레인이 압축에 의한 스트레인이면 상기 특정 부분에서는 스트레인의 방향과 평행한 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것일 수 있다.

일 측면에서 상기 특정 부분은, 마이크로채널 전체, 마이크로채널 중 스트레인이 가해지는 부분 전체, 또는 마이크로채널 중 스트레인이 가해지는 부분 일부를 의미하는 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 스트레인은 상기 탄성기판의 폭 또는 길이에 대해, 스트레인을 가하기 전을 기준으로 5% 내지 80%까지 변형되도록 가하는 것일 수 있다. 5% 미만일 경우 스트레인에 의한 영향이 미미하고, 80%를 초과하면 탄성기판에 회복 불가한 변형이 생길 우려가 있어 스트레인에 의한 영향을 알 수 없게 될 가능성이 있다. 일 측면에서 상기 변형은 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 또는 75% 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 변형은 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 또는 10% 이하일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 스트레인은 △L/L의 절대값이 0.001 내지 0.8이 되도록 가하는 것일 수 있다. 이 경우, 예를 들어, 상기 L은 상기 스트레인을 가하기 전 상기 탄성기판의 폭 또는 길이이고, 상기 △L은 상기 스트레인을 가한 후 변화된 만큼의 폭 또는 길이일 수 있다. △L/L의 절대값이 0.001 미만일 경우 스트레인에 의한 영향이 미미하고, 0.8를 초과하면 탄성기판에 회복 불가한 변형이 생길 우려가 있어 스트레인에 의한 영향을 알 수 없게 될 가능성이 있다. 일 측면에서 상기 △L/L의 절대값은 0.001이상, 0.005이상, 0.01이상, 0.05이상, 0.1이상, 0.2이상, 0.3이상, 0.4이상, 0.5이상, 0.6이상, 또는 0.7이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 △L/L의 절대값은 0.8이하, 0.75이하, 0.7이하, 0.6이하, 0.5이하, 0.4이하, 0.3이하, 0.2이하, 0.1이하, 0.05이하, 0.01이하, 0.005이하, 또는 0.001이하일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 (2) 단계의 미세섬유 형성능이 있는 원료는 콜라겐, 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin), 엔탁틴(entactin), 히알루론산(hyaluronic acid), 나일론, 폴리아크릴산, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리스티렌, 폴리비닐알코올, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 옥사이드, 엘라스틴, 젤라틴, 피브리노겐, 피브린, 알지네이트, 셀룰로오스, 실크 피브로인, 키토산, 및 액틴으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 (1) 단계 이전에, 미세섬유 정렬용 탄성 기판을 접착제로 코팅하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 (2) 단계 이후에 상기 원료를 집적시켜 미세섬유 핵(nucleate) 또는 집적체(aggregate)를 형성시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 미세섬유 핵(nucleate) 또는 집적체(aggregate, 예를 들어 피브릴)를 형성시키는 단계에서 상기 형성을 위한 시간은 5분 내지 15분일 수 있다. 일 측면에서 상기 시간은 5분 이상, 6분 이상, 7분 이상, 8분 이상, 9분 이상, 10분 이상, 11분 이상, 12분 이상, 13분 이상, 또는 14분 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 시간은 15분 이하, 14분 이하, 13분 이하, 12분 이하, 11분 이하, 10분 이하, 9분 이하, 8분 이하, 7분 이하, 또는 6분 이하일 수 있다. 상기와 같이, 조성물을 로딩 후 5분 내지 15분간(유도기, Lag phase) 부분적인 겔화(gelation) 과정을 거치게 되는데, 이때 미세섬유 단백질이 자기 조립(self-assembly)을 통해 짧은 피브릴을 생성하게 된다. 상기 유도기가 5분 미만일 경우 자기 조립이 미흡하여 피브릴이 잘 형성되기 전에 힘(strain)이 가해지게 되므로 원하는 패턴이나 방향으로 정렬시킬 수 없게 되고, 15분을 초과할 경우 힘(strain)을 가하기도 전에 섬유가 급격하게 형성되므로 원하는 패턴이나 방향으로 정렬시킬 수 없게 된다.

또 다른 구현 예로서, 상기 미세섬유 핵(nucleate) 또는 집적체(aggregate)를 형성시키는 단계는 상기 조성물을 부분적으로 겔(gel)상태로 경화시키는 단계일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 (3) 단계는 특정 방향의 스트레인을 배제함과 동시에 조성물을 완전히 겔로 경화시키는 단계일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 경화시키는 시간은 15분 내지 2시간일 수 있다. 일 측면에서 상기 경화시키는 시간은 15분 이상, 20분 이상, 25분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 45분 이상, 50분 이상, 55분 이상, 60분 이상, 70분 이상, 80분 이상, 90분 이상, 100분 이상, 또는 110분 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 경화시키는 시간은 2시간 이하, 110분 이하, 100분 이하, 90분 이하, 80분 이하, 70분 이하, 60분 이하, 50분 이하, 45분 이하, 40분 이하, 30분 이하, 25분 이하, 또는 20분 이하일 수 있다. 경화시키는 시간이 15분 미만이면 완전한 경화가 이루어지지 않아 미세섬유가 정렬된 상태로 유지되지 않고, 2시간을 초과하면 과도한 경화 등으로 인해 세포 증식 및 성장이 원활하지 않을 우려가 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 상기 조성물에 1종 이상의 세포 및 줄기세포 중 하나 이상을 더 포함시키는 것인, 세포 배양 방법일 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 (3) 단계 이후에 정렬된 미세섬유를 포함하는 탄성기판을 1종 이상의 세포 및 줄기세포 중 하나 이상이 포함된 세포 배양 배지 내에 배치하여 상기 세포 및 줄기세포 중 하나 이상을 배양하는 단계를 더 포함하는, 세포 배양 방법일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 방법은, 배양시키는 세포를 미세섬유의 정렬 방향이나 무늬로 정렬 및 증식시키는 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 세포는 상피세포, 신경세포, 교세포, 근세포, 섬유아세포, 및 고형암세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본원발명은 특히 환경 변화에 매우 민감한 뇌의 신경세포 및 교세포 뿐만 아니라 상피세포, 근육세포, 줄기세포 등 증식할 수 있는 모든 세포의 정렬 및 배양에 적용할 수 있어, 활용분야가 매우 넓다.

본 발명의 일 측면에 따른 탄성기판 내 공동(void)의 크기(예를 들어, 직경), 모양(원, 사각형, 삼각형, 오각형, 육각형 등), 공동간의 거리, 공동의 개수, 기판의 탄성계수 등에 따라서도 정렬을 조절할 수 있음을 확인하였다. 공동의 모양을 원, 삼각형 이상의 다각형으로 하여 상기와 같은 방법으로 미세섬유를 정렬, 증식, 또는 세포를 증식시킬 경우 그 모양에 따라 마이크로채널의 각 부분에 미치는 영향이 상이하여 그에 따른 특징적인 결과를 얻을 수 있음을 확인하였고, 공동의 크기(예를 들어, 직경), 공동간의 거리, 공동의 개수, 및 기판의 탄성 계수 중 하나 이상을 다르게 하여 상기와 같은 방법으로 미세섬유를 정렬, 증식, 또는 세포를 증식시킬 경우 마이크로채널의 각 부분에 미치는 영향이 상이하여 그에 따른 특징적인 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다(도 6, 도 7, 도 9, 및 도 11 참조).

일 구현 예로서, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것이, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대해 신장에 의한 스트레인과 압축에 의한 스트레인을 둘다 가하는 것일 경우, 더 큰 스트레인이 신장에 의한 스트레인이면 상기 특정 부분에서는 더 큰 스트레인의 방향과 수직이 되는 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것일 수 있다

다른 구현 예로서, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것이, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대해 신장에 의한 스트레인과 압축에 의한 스트레인을 둘다 가하는 것일 경우, 더 큰 스트레인이 압축에 의한 스트레인이면 상기 특정 부분에서는 더 큰 스트레인의 방향과 평행한 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것이, 상기 마이크로채널의 특정 부분에 대해 신장에 의한 스트레인과 압축에 의한 스트레인을 둘다 가하는 것일 경우, 두 스트레인의 합력의 크기 및 방향에 따라 상기 특정 부분에서의 미세섬유의 정렬 및 증식 방향이 정해질 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 합력이 상기 특정 부분에 대한 신장 스트레인일 경우 상기 특정 부분에서는 그 합력의 방향과 수직이 되는 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 합력이 상기 특정 부분에 대한 압축 스트레인일 경우 상기 특정 부분에서는 그 합력의 방향과 평행한 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것일 수 있다.

상기 탄성 구조체 및 방법에 따른 미세섬유 및 세포의 정렬을 실제 형광 염색을 통해 확인하였고, 정렬 방향 및 정렬 정도를 계산하였다. 3D 매트릭스에서 미세섬유의 정렬 방향 및 정렬 정도를 분석하여 도 12 내지 도 19와 같이 나타내었다. 도 12 내지 도 19는 상기의 방법으로 마이크로채널에 스트레인을 가한 상태에서 상기 조성물을 로딩한 후 일정시간 동안 겔화시킨 다음, 상기 스트레인을 배제시키고 겔화를 완료시켰을 때의 미세섬유 및 세포의 정렬 방향을 분석한 것이다.

도 12는 상기 스트레인이 신장(pre-stretched)에 의한 스트레인일 경우를 나타낸 것이고, 3D 매트릭스의 굵은 회색 선은 미세섬유이며, 검정 화살표는 y축 방향으로 선 신장(pre-stretched) 시킨 후 스트레인을 배제시켰을 때 원래 형상으로의 회복 방향이고, l₀는 미세섬유의 길이이며, θ는 xy평면에서 x축을 기준으로 미세섬유까지 잰 각도(또는 호도)이고, φ(그리스어 소문자 피)는 xy평면에서 z축 방향으로 미세섬유까지 잰 각도(또는 호도)이다. λ는 1+ε_pre로 표시되는 탄성 변형의 크기이고, 여기서 ε_pre는 스트레인의 크기 즉 △L/L이다(L은 탄성기판의 y축 방향으로 잰 탄성기판의 본래 길이이고, △L은 상기 탄성기판에 스트레인을 가했을 때 변형된 탄성기판의 y축 방향 길이의 변화값임. 스트레인이 신장이면 △L는 양수이고 스트레인이 압축이면 △L는 음수). ₀ 및 _rs는 각각 스트레인에 의한 변형 전 및 회복 상태를 뜻하고, _yz와 _xz는 각각 yz평면과 xz평면에서 투사했을 때를 나타낸다(예를 들어, “φ₀ _, _yz”는 스트레인에 의한 변형 전에 yz평면에서 투사했을 때의 φ값). 도 13 내지 도 15는 미세섬유를 xy평면에서 투사한 도면(도 13, 미세섬유는 오렌지색선), yz평면에서 투사한 도면(도 14, 미세섬유는 녹색선), xz평면에서 투사한 도면(도 15, 미세섬유는 파란색선)을 각각 나타낸다. 도 13 내지 도 15의 우측 그래프는 스트레인을 가하기 전과 후에 θ와 φ가 △L/L에 따라 변동하는 것을 각각 좌측 및 가운데 그림에 대응하도록 그래프화하고, θ와 φ를 산출하는 수학식을 도출하여 나타낸 것이다.

도 16은 상기 스트레인이 압축(pre-compressed)에 의한 스트레인일 경우를 나타낸 것이고, 3D 매트릭스의 굵은 회색 선은 미세섬유이며, 검정 화살표는 y축 방향으로 선 압축(pre-compressed) 시킨 후 스트레인을 배제시켰을 때 원래 형상으로의 회복 방향이고, l₀는 미세섬유의 길이이며, θ, φ, λ, ε_pre, △L/L, ₀, _rs, _yz, 및 _xz는 도 12 내지 도 15에서의 그것과 같다. 도 17 내지 도 19는 미세섬유를 xy평면에서 투사한 도면(도 17, 미세섬유는 오렌지색선), yz평면에서 투사한 도면(도 18, 미세섬유는 녹색선), xz평면에서 투사한 도면(도 19, 미세섬유는 파란색선)을 각각 나타낸다. 도 17 내지 도 19의 우측 그래프는 스트레인을 가하기 전과 후에 θ와 φ가 △L/L에 따라 변동하는 것을 각각 좌측 및 가운데 그림에 대응하도록 그래프화하고, θ와 φ를 산출하는 수학식을 도출하여 나타낸 것이다.

상기와 같이 정립한 정렬 방향 및 정도에 대해 실제 형광 염색을 통해 확인한 결과, 상기 계산에 따른 정렬 방향 예측이 적중했음을 알 수 있었다(도 6, 도 7, 도 9, 및 도 11 참조).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예들에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 탄성 기판의 제조

본원발명의 일 측면에 따른 탄성 기판을 제조하기 위하여 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS), 폴리메틸메타클릴레이드(polymethylmethacrylate; PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리실릭올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로스아세테이트(cellulose acetate), 폴리에틸렌테레프탈레이트(poly(ethyleneterephthalate; PETP), 천연 폴리이소프렌, 합성 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 클로로프렌 고무, 부틸고무, 스티렌-부타디엔 고무, 니트릴 고무, 에틸렌 프로필렌 고무, 에틸렌 프로필렌 다이엔 고무, 에피클로로하이드린 고무, 폴리아크릴 고무, 실리콘 고무, 플루오로실리콘 고무, 플루오로 탄성중합체, 폴리에테르 블록 아미드, 클로로술폰화 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 폴리우레탄(polyurethanes) 중 하나 이상을 원료로 사용할 수 있다. 이러한 원료들의 특징은 기판으로 제작하였을 때, 세포배양용 하이드로젤 용액을 로딩 전, 중, 후에 적당한 길이 및 다양한 방향으로 신장이나 압축이 가능하다는 점이다. 본원발명은 일 측면에서 그러한 신장이나 압축 또는 이들의 조합과 관계가 있으므로 상기 원료들을 가지고 실시할 수 있는 것이다. 상기 원료의 일 예로 PDMS를 들 수 있다.

PDMS 및 PDMS 경화제(Sylgard 184, Dow Corning사)를 중량비 10:1로 하여 혼합하고, 가스를 제거한 후 주형(master mold)에 투입하였다. 80 ℃에서 1시간 동안 경화시킨 후 PDMS 기판(PDMS 칩)을 주형에서 분리하였다. 가로, 세로 및 두께의 길이는 하기 실시예 및 실험예를 모두 포함할 수 있도록 다양하게 제조할 수 있다.

한편, 마이크로채널과 비대칭의 원형 공동/대칭의 직사각형 공동을 패턴화할 수 있는 주형을 이용하여, 기판에 비대칭의 원형(또는 타원형) 공동(void, 도 1 및 도 2의 201), 대칭의 직사각 공동(202)을 여러 개 형성시켜 PDMS 기판(10)을 제조하였고, 세포를 포함하는 하이드로젤 용액을 로딩하기 위하여 1 x 20 x 0.4 mm의 마이크로 채널(microchannel)을 형성시켰다(도 1 및 도 2의 상단 및 가운데 도면, 100, 101). 원형(또는 타원형) 공동(201)의 직경은 1 내지 10mm가 되도록 다양하게 제조하였고 공동 간의 간격과 공동의 수에도 변화를 주어 제조하였다. 직사각 공동의 한 변의 길이는 2 내지 10mm가 되도록 다양하게 제조하였다.

또한, PDMS 기판(10)에 도 1 내지 도 2의 하단 도면과 같은 모양으로 어그제틱 구조(Auxetic structure)를 이루는 공동(void, 201)과 마이크로채널(101)을 형성시켜, 아령형 모양의 마이크로 채널(101)에 세포를 포함하는 하이드로젤이 로딩될 수 있도록 하였다.

이후, PDMS 기판(특히, 마이크로채널)에 콜라겐이 잘 접착될 수 있도록 글루타르 알데히드, 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 및 폴리도파민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 접착제로 사용하였다. 일 예로, 폴리도파민을 PDMS 기판에 코팅하였다. 구체적으로, 에탄올을 탈이온수와 섞어 20%(v/v) 에탄올 용액을 제조하였다. 상기 20%(v/v) 에탄올로 100 mM의 Trizma® HCl 용액(Tris-HCl, (Sigma, T5941)을 제조하였다. 5 N NaOH를 첨가하여 pH를 8.5로 조정하여 100 mM Tris-HCl 버퍼(완충액)을 제조한 뒤, 4℃에 보관하였다.

또한, 2 mg/mL의 도파민 염산염(dopamine hydrochloride)를 제조하였다. 구체적으로, 20mg의 도파민 염산염(Sigma, H8505)을 9ml의 탈이온수에 첨가하고 도파민 염산염이 용해될 수 있도록 충분한 시간 동안 휘저어 주었다. 이후 상기 100 mM의 Tris-HCl 버퍼 1ml을 첨가하였다. 첨가 이후 도파민이 폴리도파민으로 더 빨리 중합된다. 충분히 휘저어서 2 mg/mL의 도파민 염산염 용액을 완성하였다.

상기 2 mg/mL의 도파민 염산염 용액으로 PDMS 기판을 3시간 동안 암실에서 코팅하였다. 이후 탈이온수로 20분 동안 세척하였다. 상기 세척을 3회 실시하였다.

위와 같이 제조한, 다중모듈 3D 배양 기판을 페트리 디쉬와 같은 세포배양용 용기에 위치시킬 수 있도록 적절히 다듬고 보관하였다.

[실시예 2] 하이드로젤 용액 및 스캐폴드 제조

PDMS 기판에 적용할 하이드로젤 용액(500μL, 0.25 %(w/v), 2.5 mg/ml)을 제조하였다.

구체적으로, 콜라겐 용액(0.9%(w/v), Corning사, 354249) 139μL (139 mg)를 1mL의 마이크로튜브에 투입하였다. 50 μL의 10x DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium, Sigma-Aldrich사, D2429)와 308 μL의 1x DMEM(Lonza사, 12-604F)를 마이크로튜브에 추가하였다. 1ml 피펫 팁으로 천천히 저어주었다. 그 후 0.5N NaOH 3 μL를 투입하고 같은 피펫 팁으로 천천히 저어주었다. 여기까지는 콜라겐의 겔화를 방지하기 위해 얼음 내에서 실시하였다. 상기 하이드로젤 용액의 원료로 콜라겐 이외에도 콜라겐과 같은 섬유성 하이드로젤(예를 들어, 피브린(fibrin)) 및 전기방사 (electrospinning)을 통해 생산한 섬유성 재료(예를 들어, 전기방사를 통해 생산된 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin), 엔탁틴(entactin), 히알루론산(hyaluronic acid), 나일론, 폴리아크릴산, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리스티렌, 폴리비닐알코올, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 옥사이드, 엘라스틴, 젤라틴, 피브리노겐, 피브린, 아가로즈, 알지네이트, 셀룰로오스, 실크 피브로인, 키토산 및 액틴)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있고 이들 중 둘 이상의 혼합물을 사용할 수도 있음을 확인하였고, 실험 설계, 대상 세포의 종류 등 특성에 맞게 적절한 것을 선택할 수 있다.

상기 방법으로 제조된 하이드로젤 용액 또는 상기 용액에 섬유아세포를 포함시킨 것(cell-seeded collagen)을 PDMS 기판에 로딩한 후, 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 겔화(gelation)시켰다. 하이드로젤의 탈수를 방지하기 위해 습한 환경을 유지하는 것이 바람직하므로, 페트리디쉬 내의 PDMS 기판 주위에 젖은 티슈를 배치하고 뚜껑을 닫았다. 또한, 하이드로젤 내에 도입된 세포의 3D 배양을 위해 겔화는 세포 배양용 인큐베이터 내(37℃, 이산화탄소 5%)에서 실시하였다.

이렇게 제조된 하이드로젤 스캐폴드를 PBS(phosphate buffer saline) 또는 세포배양용 배지 내에 보관하였다.

[실시예 3] 형광 분석을 위한 염색

공초점 형광 현미경(inverted confocal laser scanning microscope, LSM 700, Carl Zeiss사, 독일)을 통한 콜라겐 섬유의 시각적 확인을 위하여 라벨링을 실시하였다. 구체적으로, tetramethylrhodamine(TRITC; Life Technologies)를 이용하여 0.1 M 소듐바이카보네이트 완충액(sodium bicarbonate buffer, pH 9) 내의 하이드로젤 용액(예를 들어, 2 mg /ml의 콜라겐)을 dimethyl sulfoxide(DMSO)내의 10 mg/ml의 TRITC와 혼합하였다. 이후, 이 혼합물을 4℃ 암실에서 24시간 동안 교반하였다. 4℃의 0.1% [w/v] 아세트산을 이용한 투석을 통해 결합되지 않은 TRITC 분자를 제거하였다. 이렇게 라벨링된 하이드로젤 용액을 상기 실시예 2에 적용하였다.

상기 라벨링은 5-(and-6)-Carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester를 이용하여 실시할 수도 있다. 구체적으로, 5-(and-6)-Carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester (5(6)-TAMRA, SE, mixed isomers; TAMRA, SE; Invitrogen, C1171) 용액을 DMSO와 혼합하여 100mM의 TAMRA를 준비한 후 -20℃에 보관하였다. PBS로 희석하여 50μM의 TAMRA를 만들었다. 상기 50μM의 TAMRA 용액을 상기 실시예 2에서 겔화가 끝난 하이드로젤 스캐폴드에 적용한 후 암실에서 1시간 동안 염색하였다. 그 후 PBS로 3회(회당 20분씩) 세척하였다.

[실시예 4] 선 신장(pre-stretching)에 의한 정렬 여부 확인

PDMS 기판을 신장시키기 위한 장치(도 3 내지 도 5에서 40, 50. 클램핑 바와 같이, 상기 PDMS 기판을 신장시키기 위해 일정한 힘을 부여할 수 있는 기구는 어떤 것이든 사용 가능함)를 이용하여 PDMS 기판을 신장 및 원상회복시켜 하이드로젠 피브릴(fibril)이 정렬되는 방향을 확인하였다.

구체적으로, PDMS 기판(10, 두께 1 내지 10 mm)을 원하는 길이(△L, △L>0)까지 신장(즉, 기판의 Y축 길이 L에서 L+△L까지 신장)시킨 후(선신장, pre-stretching), 상기 하이드로젤 용액 또는 상기 용액에 섬유아세포를 포함시켜(cell-seeded collagen) 마이크로 채널에 로딩하였다. 상온에서 5분 내지 15분간 부분적인 겔화(산성의 콜라겐 원료는 단일 단백질 및 짧은 피브릴 조각으로 구성되어 있고 0.5N NaOH에 의해 중화되면, 상기 시간 동안 콜라겐 단백질의 자기 조립(self-assembly)에 의해 집적체(aggregate) 또는 미세섬유 핵(nucleate)이 생기게 됨)를 일으킨 후, 힘(스트레인)을 제거하고 졸 상태의 콜라겐을 포함하는 PDMS 기판을 37℃, 5% 이산화탄소 하에서 완전히 겔화(30분 내지 1시간) 시켰다.

위와 같이 제조한, 이방성/불균질(치밀)/다중모듈 3D 배양 기판을 페트리 디쉬에 위치시켰다. 이후, 공초점 마이크로 현미경을 이용해 젤 섬유의 이미지을 확인한 결과, △L/L이 커질수록, 콜라겐 섬유가 특정 방향으로 단일하게 정렬되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 분석 결과에 의할 때 PDMS 기판의 신장 방향에 대해 90 °, 270 ° 방향으로 콜라겐 섬유가 정렬됨을 확인하여, 콜라젠 섬유가 PDMS 기판(10)의 신장 방향에 대해 수직 방향으로 일정하게 정렬되었음을 알 수 있었다.

[실시예 5] 선 압축(pre-compressing)에 의한 정렬 여부 확인

PDMS 기판(10)을 압축시키기 위한 장치(도 3 내지 도 5에서 40, 50. 상기 PDMS 기판을 압축시키기 위해 일정한 힘을 부여할 수 있는 기구는 어떤 것이든 사용 가능함)를 이용하여 PDMS 기판을 압축 및 원상회복시켜 하이드로젠 피브릴(fibril)이 정렬되는 방향을 확인하였다.

구체적으로, PDMS 기판(10, 두께 1 내지 10mm)을 원하는 길이(△L, △L<0)까지 압축(즉, 기판의 Y축 길이 L에서 L+△L까지 압축)시킨 후(선압축, pre-compression), 상기 하이드로젤 용액 또는 상기 용액에 섬유아세포를 포함시킨 것을 마이크로 채널에 로딩하였다. 상온에서 5분 내지 15분간 부분적인 겔화(산성의 콜라겐 원료는 단일 단백질 및 짧은 피브릴 조각으로 구성되어 있고 0.5N NaOH에 의해 중화되면, 상기 시간 동안 콜라겐 단백질의 자기 조립(self-assembly) 및 짧은 피브릴이 생기게 됨)를 일으킨 후, 힘(스트레인)을 제거하고 졸 상태의 콜라겐을 포함하는 PDMS 기판을 37℃, 5% 이산화탄소 하에서 완전히 겔화(30분 내지 1시간) 시켰다.

위와 같이 제조한, 이방성/불균질(치밀)/다중모듈 3D 배양 기판을 페트리 디쉬에 위치시켰다. 이후, 공초점 형광 현미경을 이용해 젤 섬유의 이미지을 확인한 결과(3D reconstruction은 ZEN 2012 소프트웨어(Carl Zeiss)를 이용하였다), 기판을 많이 압축할수록 즉 △L/L의 절대값이 커질수록, 콜라겐 섬유가 특정 방향으로 단일하게 정렬되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 분석 결과에 의할 때 PDMS 기판의 압축 방향에 대해 0 °, 360 ° 방향으로 콜라겐 섬유가 정렬됨을 확인하여, 콜라젠 섬유가 PDMS 기판의 압축 방향에 대해 평행하게 정렬되었음을 알 수 있었다.

[실험예 1] 원형(또는 타원형) 공동 및 마이크로채널이 포함된 탄성 구조체 실험

도 2의 상단 도면과 같이 비대칭 원형(또는 타원형) 공동(void, 201) 패턴과 마이크로채널(1 X 20 X 0.4 mm, 100)을 포함하는 PDMS 기판(10)을 제조하였다. 구체적인 제조방법은 상기와 같고, 원형(또는 타원형) 공동은 3 내지 7mm로 다양하게 변경하여 제조하였다(도 6). 공동 간의 간격 및 개수도 도 6과 같이 다양하게 변화시켰다.

이후, 실시예 4와 같이 실시하되, △L/L을 0.3으로 하여 선 신장(pre-stretched) 시켰다. 선 신장 상태에서 마이크로채널의 모양은 도 6와 같이 변형되고, 이 상태에서 마이크로채널의 모양도 변형된다. 마이크로채널의 각 부분에서의 힘(strain)의 방향은 도 6의 적색 화살표와 같이 도식화된다.

즉, 콜라겐 섬유의 정렬 방향은 그 부분에서 받는 스트레인(힘)의 방향의 90도 또는 270도 방향이므로, 신장하기 이전의 마이크로채널의 길이 방향을 0도라고 할 때, 마이크로채널 중 A 영역에서의 콜라겐 섬유의 정렬 방향은 45도 방향이 됨을 알 수 있었다. 또한, 마이크로채널 중 B 영역에서의 콜라겐 섬유의 정렬 방향은 -45도 방향이 됨을 알 수 있었다.

이를 응용하면, 원형(또는 타원형) 공동의 직경, 간격, 개수에 따라 마이크로채널의 각 부분에 미치는 힘의 방향과 크기를 조절할 수 있고, 그에 따라 콜라겐 섬유의 정렬을 원하는 방향으로 조절할 수 있게 되어, 세포를 배양할 때 정렬 및 증식에 대한 방향성을 조절할 수 있게 되는 것이다.

[실험예 2] 다각형 공동 및 마이크로채널이 포함된 탄성 구조체 실험

도 2의 중간 그림과 같이 대칭 사각형 공동(void, 202) 패턴과 마이크로채널(1 X 20 X 0.4 mm, 100)을 포함하는 PDMS 기판(10)을 제조하였다. 구체적인 제조방법은 상기와 같고, 사각형 공동은 정사각형 형태로 한 변의 길이를 3 내지 7mm로 다양하게 변경하여 제조하였다.

이후, 실시예 4와 같이 실시하되, △L/L을 0.3 내지 0.5로 하여 선 신장(pre-stretched) 시켰다(도 4). 선 신장 상태에서 마이크로채널의 모양은 도 7과 같이 변형되고, 이 상태에서 힘(strain)의 방향과 크기는 화살표의 방향과 크기와 같이 도식화될 수 있다. 선 신장되는 길이가 길어지면, 즉 당기는 힘이 커지면 마이크로 채널 중 각 영역에 대한 스트레인(힘)의 방향과 크기가 변화됨을 알 수 있었다(도 7의 적색 화살표 참조).

특정 위치(영역)에서 콜라겐 섬유의 정렬 방향은 그 특정 위치(영역)에서의 선 신장 방향의 90도 또는 270도 방향이므로, △L/L이 0.3일 때 마이크로채널의 길이 방향을 0도라고 할 경우, 도 7의 C영역에서의 콜라겐 섬유의 정렬 방향은 신장 방향에 대하여 90도 또는 270도가 되어, 마이크로채널의 길이 방향에 대해서는 0도가 됨을 알 수 있었다. 즉, 도 7의 C영역에서는 선 신장의 힘의 방향이 지배적으로 영향을 미침을 알 수 있었다. 또한, 도 7에서 마이크로채널의 D영역에서는 선 신장에 의한 영향이 거의 미치지 않아 불규칙하게 정렬(random)됨을 알 수 있었다.

한편, △L/L을 0.5로 크게 하였을 때 마이크로채널의 길이 방향을 0도라고 할 경우, C1영역에서의 콜라겐 섬유의 정렬 방향은 신장 방향에 대하여 90도 또는 270도가 되어, 마이크로채널의 길이 방향에 대해서는 0도가 됨을 알 수 있었고, 선 신장의 힘의 방향이 지배적으로 영향을 미침을 알 수 있었다. 또한, C2영역에서의 콜라겐 섬유의 정렬 방향은 마이크로채널의 길이 방향에 대해 70도가 되어 힘(합력)의 방향인 적색 화살표 방향에 대해 직각 방향으로 정렬됨을 알 수 있었고, C3영역에서의 콜라겐 섬유의 정렬 방향은 마이크로채널의 길이 방향에 대해 -70도가 되어 힘(합력)의 방향인 적색 화살표 방향에 대해 직각 방향으로 정렬됨을 알 수 있었다. △L/L을 0.5로 크게 하였을 때 D 영역의 경우, 도 7의 우측 그림과 같이 선 신장으로 오히려 선 압축(Pre-compressed)된 효과가 발생하여 신장의 방향인 흰색 화살표 방향과 평행(즉 마이크로채널의 길이 방향에 대해 90도)하게 정렬됨을 확인하였다.

이를 응용하면, 공동의 크기, 힘의 크기, 마이크로채널과 공동과의 위치 관계에 따라 마이크로채널에 미치는 힘의 방향을 조절할 수 있고, 그에 따라 콜라겐 섬유의 정렬을 원하는 방향으로 조절할 수 있게 되어, 세포를 배양할 때 정렬 및 증식에 대한 방향성을 조절할 수 있게 되는 것이다.

[실험예 3] 오그제틱 구조의 탄성 구조체 실험

변형 전후 체적이 일정한 일반적인 재료의 경우， 양의 프와송비(Poissons ratio)를 갖는다. 수평 방향으로 인장될 경우， 체적이 일정하므로 수직 방향으로는 수축하게 된다. 그러나, 내부 구조를 적절히 설계한 격자 구조의 경우 수평 방향으로 인장시 수직 방향으로 팽창하고，수평 방향으로 압축시 수직 방향으로 수축함으로써 음의 프와송비를 갖는데, 이러한 특성을 갖는 구조를 오그제틱 구조체(Auxetic structure)라고 한다. 도 8, 도 1 및 도 2의 하단 그림의 구조를 갖는 구조체가 그 예가 될 수 있다.

본원발명의 일 측면에 따른 탄성기판(10)에도 이러한 오크제틱 구조의 공동을 형성시켜 섬유 정렬 방향을 확인하였다. 구체적으로, 도 2의 하단 그림과 같이 공동(void, 201)과 마이크로채널(101)을 포함하는 PDMS 기판(10)을 제조하였다. 구체적인 제조방법은 상기와 같고(단, 음의 프와송비를 갖도록 하기 위해 탄성기판의 원료 대 경화제의 중량 비율을 10:1로 조정), 위쪽 공동과 아래쪽 공동(검정 테두리의 흰색 원)은 마이크로채널(아령 모양의 도형 부분)을 기준으로 대칭적으로 배치하고 직경은 3 내지 7mm로 다양하게 변경하여 제조하였다. 마이크로채널은 채널 자체(1 X 20 X 0.4 mm)와 양 말단의 원형(또는 타원형) 웰(well)(직경은 공동과 같고 깊이는 채널 부분과 같음)을 포함하도록 하였다.

이후, 실시예 4와 같이 실시하되, △L/L을 0.3으로 하여 선 신장(pre-stretched) 시켰다. 선 신장 상태에서 마이크로채널의 모양은 도 9의 상단 그림과 같이 변형되고, 이 상태에서 힘(strain)의 방향과 크기는 화살표의 방향과 크기와 같이 도식화될 수 있다. 즉, 마이크로채널 중 양 말단의 원형(또는 타원형) 웰 영역은 선 신장 방향에 대해 90도로 정렬됨을 확인하였고, 양 말당의 원형(또는 타원형) 웰이 아닌 가운데 영역은 (오그제틱 구조이기 때문에)가로 방향으로 선 신장했음에도 세로 방향으로 수축하지 않고 세로 방향으로 선 신장하므로 화살표 방향에 대해 직각으로 정렬됨(즉, 마이크로채널 길이 방향에 대해 0도로 정렬됨)을 확인하였다.

이를 응용하면, 공동을 오그제틱 구조로 배치함에 따라 마이크로채널에 미치는 힘의 방향을 조절할 수 있고, 그에 따라 콜라겐 섬유의 정렬을 원하는 방향으로 조절할 수 있게 되어, 세포를 배양할 때 정렬 및 증식에 대한 방향성을 조절할 수 있게 되는 것이다.

[실험예 4] 탄성계수가 다른 탄성 구조체의 실험

탄성기판의 물성을 변화시켜 섬유 정렬 방향을 확인해 보았다. 원료 및 경화제 등의 혼합 비율이 달라 탄성 계수가 다른 두 조성으로 칩을 제작하게 되면, PDMS 기판에 동일한 스트레인을 인가하더라도 각 부분(soft, stiff)에 인가되는 스트레인을 다르게 할 수 있기 때문이다. 즉, 탄성기판의 원료의 종류를 변화시키거나, 원료 대 경화제의 중량 비율을 변경하여 탄성계수(modulus)를 변화시켜 섬유 정렬에 미치는 영향을 규명하였다.

구체적으로, 도 10과 같이 탄성계수(특히, Young’s modulus)가 다른 두 개의 탄성 기판부(제1기판부(20) 및 제2기판부(30))을 접합시킨 후 양 기판을 가로지르는 마이크로채널(10)을 형성시켰다. 하나의 탄성 기판부는 탄성기판의 원료 대 경화제의 비율을 10:1로 하였고(stiff 기판, Young’s modulus는 3 MPa), 다른 하나의 탄성 기판부는 탄성기판의 원료 대 경화제의 비율을 달리(25:1) 하였다(soft 기판, Young’s modulus는 0.45 MPa). 또한, 원료 대 경화제의 비율이 아니라, 탄성기판의 원료 자체를 다르게 하거나 경화 조건을 달리하여 탄성계수를 변화시킬 수도 있다. 예를 들어, soft 기판은 PDMS를 원료로 제조한 기판, stiff 기판은 자외선 경화 고분자(예를 들어, SU-8, 폴리우레탄 아크릴레이트(PUA), 폴리에스테르 아크릴레이트, 실리콘 아크릴레이트 등이 있을 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 라디칼 중합 타입이나 카티온 중합 타입 중 어느 것도 사용 가능하다)를 사용할 수 있음을 확인하였다.

이후, 접합된 두 개의 기판을 하나의 기판으로 보고, 실시예 4 및 실시예 5와 같이 선 신장 또는 선 압축 실험을 실시하였고, 선 압축의 경우 가로 방향으로 실시하였으며, △L/L의 절대값을 0.3으로 하였다. 그 결과, soft 기판의 경우 마이크로채널 부분에 선 압력의 효과가 영향을 미쳐 압축 방향과 평행한 방향, 즉 마이크로채널의 길이 방향에 대해 0도로 정렬됨을 확인하였다. 반면, stiff 기판의 경우 선 압축의 영향을 거의 받지 않았음을 확인하였다. 다만, △L/L의 절대값을 달리할 경우 stiff 기판에도 영향이 어느 정도 미칠 수 있고 soft 부분은 더 크게 영향을 받을 것임을 알 수 있고, 그에 따라 정렬의 방향성이나 경향을 조절할 수 있음을 알 수 있었다(도 11).

선 신장의 경우 가로 방향으로 실시하였고, △L/L의 절대값을 0.3으로 하였다. 그 결과, soft 기판의 경우 마이크로채널 부분에 선 신장의 효과가 영향을 미쳐 신장 방향과 직교하는 방향, 즉 마이크로채널의 길이 방향에 대해 90도로 정렬됨을 확인하였다. 반면, stiff 기판의 경우 선 신장의 영향을 거의 받지 않았음을 확인하였다. 다만, △L/L를 달리할 경우 stiff 기판에도 영향이 어느 정도 미칠 수 있고 soft 부분은 더 크게 영향을 받을 것임을 알 수 있고, 그에 따라 정렬의 방향성이나 경향을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

상기 실시예 및 실험예들은 콜라겐과 섬유아세포(예를 들어, fibroblast 3T3 cell line)를 대상으로 하여 수행하였으나, 콜라겐과 같이 미세단위에서 선상 구조를 가지는 섬유로서 길고 가늘며 연하게 굽혀질 수 있는 합성 또는 천연 고분자 섬유를 이용하여도 마찬가지로 미세섬유가 정렬되는 결과를 얻을 수 있을 것이며, 세포도 섬유아세포 외에 생체 내외에서 배양될 수 있는 세포라면 그 종류의 제한 없이 동일한 결과로서 세포가 함께 정렬되는 결과를 얻을 수 있을 것이다.

10: 기판
20: 제1기판부
30: 제2기판부
40, 50: 신장 장치 또는 압축 장치
100, 101: 마이크로채널
201, 202: 공동

Claims

미세섬유 정렬용 탄성 기판으로서, 상기 기판은
미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 로딩하는 마이크로채널; 및
상기 탄성 기판을 관통하는 하나 이상의 공동(void)을 포함하고,
상기 공동은 탄성 기판에 스트레인이 가해질 때 변형되는 것이며,
상기 공동은 상기 마이크로채널과 분리된 것이고, 상기 공동은 상기 마이크로채널과 평행한 방향으로 배열되며, 상기 마이크로채널을 경계로 좌우 또는 상하에 대칭적 또는 비대칭적으로 형성된 것이고,
상기 마이크로채널은 선형, 양 말단의 모양이 원형 또는 타원형인 선형, 또는 양 말단의 모양이 삼각형 이상의 다각형인 선형인, 미세섬유 정렬용 탄성기판.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 공동은 원형, 타원형 및 삼각형 이상의 다각형 중 하나 이상인, 미세섬유 정렬용 탄성기판.
삭제
제1항에 있어서, 상기 공동과 상기 마이크로채널은 오그제틱 구조(Auxetic structure)를 이루는 것인, 미세섬유 정렬용 탄성기판.
제 1 항에 있어서, 상기 공동의 변형에 의해 상기 마이크로채널의 각 부분에 미치는 힘의 방향 또는 크기가 서로 다른, 미세섬유 정렬용 탄성기판.
미세섬유 정렬용 탄성 기판으로서, 상기 기판은
미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 로딩하는 마이크로채널;
제1기판부; 및
제1기판부와 탄성계수가 다른 제2기판부를 포함하고,
상기 제1기판부 및 제2기판부는 서로 접촉되도록 배치된 것이고,
상기 마이크로채널은 상기 제1기판부 및 제2기판부에 걸쳐서 형성된 것인, 미세섬유 정렬용 탄성기판.
제1항, 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 상기 탄성 기판, 또는 제8항의 상기 제1기판부 또는 제2기판부의 재질은 탄성 고분자인, 미세섬유 정렬용 탄성기판.
제9항에 있어서, 상기 탄성 고분자는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS), 폴리메틸메타클릴레이드(polymethylmethacrylate; PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리실릭올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로스아세테이트(cellulose acetate), 폴리에틸렌테레프탈레이트(poly(ethyleneterephthalate; PETP), 천연 폴리이소프렌, 합성 폴리이소프렌, 폴리부타디엔, 클로로프렌 고무, 부틸고무, 스티렌-부타디엔 고무, 니트릴 고무, 에틸렌 프로필렌 고무, 에틸렌 프로필렌 다이엔 고무, 에피클로로하이드린 고무, 폴리아크릴 고무, 실리콘 고무, 플루오로실리콘 고무, 플루오로 탄성중합체, 폴리에테르 블록 아미드, 클로로술폰화 폴리에틸렌, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 폴리우레탄으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인, 미세섬유 정렬용 탄성기판.
제1항, 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로채널은 접착제로 코팅된 것인, 미세섬유 정렬용 탄성기판.
제11항에 있어서, 상기 접착제는 글루타르 알데히드, 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, 및 폴리도파민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 미세섬유 정렬용 탄성기판.
제1항, 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미세섬유 정렬용 탄성기판 및 상기 탄성기판을 신장 또는 압축시키기 위한 장치를 포함하는, 미세섬유 정렬 장치.
(1) 제1항, 제4항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미세섬유 정렬용 탄성기판에 대하여 일정 방향의 스트레인을 가한 상태로 유지시키는 단계;
(2) 미세섬유 형성능이 있는 원료를 포함하거나 미세섬유를 포함하는 조성물을 상기 탄성 기판 내의 마이크로채널에 로딩하는 단계; 및
(3) 상기 스트레인을 배제하는 단계
를 포함하는, 미세섬유 정렬 방법.
제14항에 있어서, 상기 (1) 단계의 상기 탄성 기판에 대하여 일정 방향의 스트레인을 가하는 것은, 상기 탄성 기판을 일정 길이 만큼 신장하거나 압축하는 것인, 미세섬유 정렬 방법.
제14항에 있어서, 상기 (1) 단계의 상기 탄성 기판에 대하여 일정 방향의 스트레인을 가하는 것은, 상기 탄성 기판 내의 공동의 모양, 배치 및 탄성 기판의 탄성계수 중 하나 이상에 따라 마이크로채널의 전부 또는 일부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것인, 미세섬유 정렬 방법.
제16항에 있어서, 상기 마이크로채널의 전부 또는 일부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것이, 상기 마이크로채널의 전부 또는 일부분에 신장(stretching)에 의한 스트레인을 일정한 방향으로 가하는 것일 경우, 상기 전부 또는 일부분에서는 스트레인의 방향과 수직이 되는 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것인, 미세섬유 정렬 방법.
제16항에 있어서, 상기 마이크로채널의 전부 또는 일부분에 대하여 일정한 방향의 스트레인을 가하는 것이, 상기 마이크로채널의 전부 또는 일부분에 압축(compressing)에 의한 스트레인을 일정한 방향으로 가하는 것일 경우, 상기 전부 또는 일부분에서는 스트레인의 방향과 평행한 방향으로 미세섬유를 정렬 및 증식시키는 것인, 미세섬유 정렬 방법.
제14항에 있어서, 상기 (1) 단계의 스트레인은 상기 탄성기판의 폭 또는 길이에 대해, 스트레인을 가하기 전을 기준으로 5% 내지 80%까지 변형되도록 가하는 것인, 미세섬유 정렬 방법.
제14항에 있어서, 상기 (1) 단계의 스트레인은 △L/L의 절대값이 0.001 내지 0.8이 되도록 가하는 것인, 미세섬유 정렬 방법.
(상기 L은 상기 스트레인을 가하기 전 상기 탄성기판의 폭 또는 길이이고, 상기 △L은 상기 스트레인을 가한 후 변화된 만큼의 폭 또는 길이임)
제14항에 있어서, 상기 (2) 단계의 미세섬유 형성능이 있는 원료는 콜라겐, 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin), 엔탁틴(entactin), 히알루론산(hyaluronic acid), 나일론, 폴리아크릴산, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리스티렌, 폴리비닐알코올, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 옥사이드, 엘라스틴, 젤라틴, 피브리노겐, 피브린, 알지네이트, 셀룰로오스, 실크 피브로인, 키토산, 및 액틴으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 미세섬유 정렬 방법.
제14항에 있어서 상기 (2) 단계 이후에 상기 조성물을 부분적으로 겔화(gelation)시키며 원료를 집적시켜 미세섬유 핵(nucleate) 또는 집적체(aggregate)를 형성시키는 단계를 더 포함하는, 미세섬유 정렬 방법.
제22항에 있어서 상기 미세섬유 핵(nucleate) 또는 집적체(aggregate)를 형성시키는 단계에서 형성 시간은 5분 내지 15분인, 미세섬유 정렬 방법.
제14항에 있어서, 상기 (3) 단계는 일정 방향의 스트레인을 배제함과 동시에 조성물을 완전히 겔로 경화시키는 단계인, 미세섬유 정렬 방법.
제24항에 있어서, 상기 경화에 소요되는 시간은 15분 내지 2시간인, 미세섬유 정렬 방법.
제14항의 미세섬유 정렬 방법에서 미세섬유 정렬용 탄성기판에 로딩되는 상기 조성물에 1종 이상의 세포 및 줄기세포 중 하나 이상을 더 포함시키고, 상기 조성물을 상기 탄성기판내의 마이크로채널에 로딩한 후 상기 1종 이상의 세포 및 줄기세포 중 하나 이상을 배양하는 단계를 포함하는, 세포 배양 방법.
제14항의 미세섬유 정렬 방법에 의하여 정렬된 미세섬유를 포함하는 탄성기판을 1종 이상의 세포 및 줄기세포 중 하나 이상이 포함된 세포 배양 배지 내에 배치하여 상기 세포 및 줄기세포 중 하나 이상을 배양하는 단계를 더 포함하는, 세포 배양 방법.