JP2015533083A - インビトロで組織及び器官の機能単位を再現するためのマイクロ流体システム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照により開示が本明細書に組み込まれている、2012年9月29日に出願した同時係属の米国仮出願第61/707,907号(Neumannら;発明の名称「Microfluidic System for Reproducing Functional Units of Tissues and Organs In Vitro」)に関連し、その優先権を主張するものであり、さらに、参照によりこれもまた開示が本明細書に組み込まれている、2012年10月31日に出願した同時係属のNeumannらの米国仮出願第61/721,002号の優先権を主張するものである。
一般に、本明細書中で使用する以下の用語は、文脈上別段の解釈が示唆される場合を除き、以下の意味を有する。
組織工学的微小環境(TEM)の作製のためのマイクロ流体デバイスが、本発明者によって開発された。これらのデバイスは、三次元マトリックスが満たされたチャンバーを含む。マトリックスは、種々の細胞種が定着してチューブ状細胞構造を生じることができるチューブ状空洞を含む。これらの細胞チューブは、デバイスの流体チャネルに管腔状に接続しており、したがって、細胞チューブには栄養溶液、被験物質、細胞溶液又は他の流体を灌流させることができる。管腔灌流及びマトリックスを通る灌流又は拡散は、デバイス内における微小環境条件の厳格な制御を可能にする。流体の圧力及び剪断応力は、細胞の形状、増殖、分化及びタンパク質発現に影響を及ぼすことが知られている。
この例中で使用及び企図するTEMチップは、光学的に透明であり、蛍光イメージング、共焦点、明視野及び位相差顕微鏡イメージングとの両立を可能にするように構築されている。インプット又はアウトプット流体ポートのいずれかから収集された流体試料は、オフライン技術、例えば、液体クロマトグラフィー、質量分析、ELISA又はゲル電気泳動を用いて分析できる。マルチコンパートメントTEMチップにおいて、細胞チューブには、細胞接種、栄養及び培養物維持のための最適な培地を独立して灌流させることができる。これらの培地には、生物活性剤(例えば、抗体、薬物、毒素又はワクチン)を補充することができる。特定の研究に関しては、灌流液は、血液、血液成分又は代替血液である可能性もある。管腔流体路はまた、マイクロ粒子、ナノ粒子、単一細胞若しくは細胞集合体(例えば、血液細胞、がん細胞、細胞スフェロイド)、又は微生物(ウイルス、細菌又は寄生虫)の投与に役立つ可能性もある。全ての灌流液は、さらなる分析のために流体サンプリング用ポートを使用して収集できる。加えて、細胞をデバイスから抜き取って、遺伝子又はタンパク質発現を評価することもできる。
TEMチップシステムの重点は、ヒトの生理機能、病態又は生物活性化合物、例えば、医薬、ワクチン、化粧品若しくは毒性化合物への応答を研究するために、ヒト細胞(初代の又は培養された)と共に使用することに置かれる。しかし、TEMチップはまた、例えば、動物の生理機能及び病態を研究するための、薬物応答を実験動物から得られたデータと比較するための並びに動物からヒトに伝染する疾患を研究するための動物細胞の使用に適用できる。
− 「単一臓器」機能サブユニットのインビトロ血管化臓器模倣物としての腎臓、腸及び肝臓3D組織微小環境、
− 多細胞バリア型システムの機能性を実証する血液脳関門モデル、
− 腫瘍生物学におけるアッセイの適合性を実証する及び腫瘍−内皮相互作用に関する研究のための血管化腫瘍モデル、並びに
− 循環腫瘍細胞が血管を通って移動して転移を形成する能力を研究するための血管外溢出モデル。
ここで図3A、図3B及び図3C参照すると、HEK293チューブ及びHUVECから作製された対応する血管細胞チューブを含む腎臓モデルを示す3コンパートメントモデルの一例が4日間にわたって示されている。示した図に関して、スケールバー=150μm。薬物及び他の物質の腎クリアランスの予測のために、ヒト腎臓の多細胞の複雑さ及び3D構造を捕らえるインビトロモデルが非常に望ましい。腎臓TEMチップは、コラーゲンI内の2つのチューブ状空洞のうちの1つにヒト胎児由来腎臓細胞(HEK−293)を播種することによって作製した。次に、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を第2の空洞に播種し、細胞培養培地を用いて連続的に灌流しながら培養した。
ここで図4A〜図4Cを参照すると、HT29細胞株から作製された細胞チューブ及びHUVECから作製された対応する血管細胞チューブを含む腸モデルを含む3コンパートメントセットアップの一例が示されている。示した図に関して、スケールバー=150μm。
ここで図5Aに参照すると、Hep−G2細胞から作製された肝細胞チューブ及びHUVECで作製された血管細胞チューブを含み、両チューブが第3のコンパートメントによって隔てられている肝臓モデルを示す3コンパートメントモデルの一例が示されている。図5Bは、血管を取り囲むマトリックス中に埋め込まれた肝細胞を示す。示した図に関して、スケールバー=150μm。
ここで図6A〜図6Fを一緒に参照すると、2コンパートメントデバイス中の血管細胞チューブ(初代ヒト微小血管内皮細胞から作製)の壁を横切る傍細胞透過性を特に示す血液脳関門モデルの一例が図示されている。
がんTEMチップは、がん細胞と微小血管内皮の細胞との相互作用、例えば、血管内異物侵入及び血管外溢出時のホーミングシグナル(homing signal)、腫瘍血管新生並びに新生血管系によって発現されるマーカーに関する研究を可能にするために開発した。重要なことに、このモデルは抗がん薬のスクリーニング並びに他の治療法、例えば、がん細胞及び腫瘍血管系に対する放射線の効果の評価を可能にする。3コンパートメントチップにおいて、細胞チューブの1つには、がん細胞が細胞チューブ又は細胞シリンダーの形態で定着することができ(図3A、図3B及び図3Cに関して前記で示した通り)、他の細胞チューブには内皮細胞を播種して、がん細胞チューブに向かって出芽する能力を有する血管細胞チューブを作製することができる(以下でより詳細に論じる図8A〜図8F及び9A〜図9Dを参照のこと)。
ここで図10A及び図10Bを一緒に参照すると、がん細胞血管外溢出の一例が示されている。特に図10Aを参照すると、蛍光タグ付き前立腺癌(PC3)細胞は、HUVECチューブの管腔に投与され、HUVECチューブにおいて細胞は、矢印10によって示されるように、内皮芽の内壁に接着する。
TEMチップ設計は、他と統合してより大きなプラットフォームにすることができる単一モジュールとして個々のチップを使用し、それによって、生理的及び病理学的意義を有する多臓器セットアップ、例えば、腸モジュール、肝臓モジュール及び腎臓モジュールの組合せを作製することを可能にする。それぞれが同一の又は異なる種々の組織/臓器種に相当する2個、3個及び最大で10個までのTEMチップを有するプラットフォームを、開発のために提示する。
上記で基本的なマイクロ流体デバイスについて記載したが、次にこれらのデバイスのより具体的な用途を、特にワクチン研究用途に関して扱う。ここでの例は蚊中腸チップ及び細胞を扱うが、本発明はそのように限定するものではない。他の無脊椎動物の細胞を種々の他の用途に使用できることは、この開示の利益を有する当業者には理解されるであろう。例えば、ダニ媒介疾患、例えば、ライム病及び他の関連状態などに関連した潜在的薬物を分析するためにダニ細胞をダニ細胞チップに使用できることが企図される。同様に、マラリアなどを含む寄生虫疾患のための試験チップを作るために、ショウジョウバエからの細胞を使用できる。ここでの例は蚊中腸環境の要約を扱うが、それは、他の無脊椎動物組織、例えば、プラスモディウム属スポロゾイトの培養のための蚊唾液腺微小環境を作製するためにも使用できる。
ここに開示するTEMチップシステムの重点は、蚊中腸様生理機能を発生させ且つ熱帯熱マラリア原虫の昆虫段階の培養を成功させることができる微小環境を作製するために、蚊中腸細胞(初代の又は培養された)を使用することに置かれる。しかし、ここに記載するTEMチップは、他のプラスモディウム属種、例えば、三日熱マラリア原虫又はマウス寄生虫種のプラスモディウム・ベルゲイ、熱帯熱マラリア原虫及びプラスモディウム・ヨエリを培養するのに同様に使用できる。このシステムは、潜在的なマラリアワクチン候補、伝染阻止ワクチン候補又は他の抗マラリア化合物の試験のために最適化されたプラットフォームを提供し、インビトロマラリア原虫培養物に対する及び古典的な膜フィーディングアッセイの現在の「ゴールドスタンダード」の実質的な改善を可能にする。
有用な一実施形態において、前記の蚊中腸チップ内におけるプラスモディウム属の昆虫段階のための培養環境を作製するためのチップモデルを設計した。目標とするエンドポイント段階は、スポロゾイト産生オーシストである。これは、いくつかの、生存可能なより早期の段階の完了を必要とし、したがって最適培養環境内で行われる必要がある寄生虫生活環の後期段階である。プラスモディウム属の寄生虫は、宿主血流中の赤血球(RBC)においてみられる無性生活環で反復複製される。
Claims (33)
- インビトロで組織及び臓器のコンパートメント化微小環境を作製するため並びにコンパートメントに独立して灌流させるためのマイクロ流体システムであって、
システムが第1の灌流路及び第2の別個の灌流路を少なくとも有するマイクロ流体デバイスを含み、
マイクロ流体デバイスが、マトリックスを含むチャンバーをさらに有し、マトリックスが、少なくとも1つの空洞を取り囲み、その管腔が第1の灌流路のみと流体接続しており、細胞がマトリックスと直接接触するように少なくとも1つの空洞に少なくとも1つの細胞種が定着することができ、
マトリックスが、第2の別個の灌流路のみと流体接続している、
システム。 - 少なくとも1つの空洞に、栄養溶液、被験物質、血液、血液成分、代替血液及び溶液中の細胞からなる群から選択される材料が灌流される、請求項1に記載のシステム。
- マイクロ流体デバイスが、ポリマー有機ケイ素化合物、シリコーン、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン及びポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーから製作される、請求項1に記載のシステム。
- チャンバー及び経路が、ガラス板とポリカーボネート板又は透明硬質熱可塑性樹脂板との間に並置された基材中に埋め込まれている、請求項3に記載のシステム。
- マトリックスが、ヒドロゲル、ゲル化された合成又は天然ヒドロゲル、コラーゲンI、フィブリン、コラーゲンI,IV,ヒアルロナンの組合せ、キチン、キトサン、アルギネート、アガロース、ゼラチン、合成マトリックス、生物学的に導かれた(biologically inspired)合成(ハイブリッド)マトリックス、非生物学的なゲル、キトサン、アルギネート、アガロース及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載のシステム。
- 少なくとも1つの空洞に定着している細胞が、腸、肝臓、腎臓及び血液脳関門の組織からなる群に由来する、請求項1に記載のシステム。
- マイクロ流体デバイスが、2つ以上の別個の空洞を含む、請求項1に記載のシステム。
- 空洞の1つに、出芽微小血管を形成する内皮細胞が定着している、請求項7に記載のシステム。
- 栄養溶液による微小血管の灌流が、少なくとも第2の空洞に定着している細胞の成長を支持することができる、請求項8に記載のシステム。
- インビトロで組織及び臓器の機能単位を再現するためのマイクロ流体システムであって、
システムが、第1の灌流路及び第2の別個の灌流路を少なくとも有する複数のマイクロ流体デバイスを含み、
複数のマイクロ流体デバイスがそれぞれ、マトリックスを含むチャンバーをさらに有し、
マトリックスが、少なくとも1つの空洞を取り囲み、その管腔が第1の灌流路のみと流体接続しており、細胞がマトリックスと直接接触するように少なくとも1つの空洞に少なくとも1つの細胞種が定着しており、
マトリックスが、第2の別個の灌流路のみと流体接続しており、
複数のマイクロ流体デバイスが、プラットフォーム上に統合されており、
複数のマイクロ流体デバイスのそれぞれが少なくとも部分臓器モジュールを模している、
システム。 - 臓器モジュールが、腸、肝臓、腎臓及び血液脳関門モジュールからなる群から選択される、請求項10のシステム。
- 複数のマイクロ流体デバイスが接続されて複合システムを形成し、各マイクロ流体デバイスが異なる臓器種に対応している、請求項10に記載のシステム。
- 中央の2コンパートメント肝臓モジュールが、腎臓モジュール、腸モジュール及び少なくとも1つのBBBモジュールに接続されている、請求項11に記載のシステム。
- 臓器モジュールが、血流に相当する共通の流体路を共有する、請求項10に記載のシステム。
- 酸素拡散のための少なくとも1つの経路に連結された入口と、
腸細胞チューブによって吸収されて血管細胞チューブに送られる栄養の注入のための少なくとも1つの経路に連結されたポートと、
分析のための流体を抜き取るための少なくとも1つの経路に連結されたポートと、
肝臓モジュールによって緩衝化/吸収される化合物の注入のための少なくとも1つの経路に連結されたポートと、
肝臓モジュールによって濾過された流体を抜き取るための少なくとも1つの経路に連結されたポートと、
肝臓モジュールから胆汁を抜き取るための少なくとも1つの経路に連結された少なくとも1つのポートと、
血液脳関門試験のための化合物の注入のための少なくとも1つの経路に連結されたポートと、
窒素含有物質の腎臓モジュールへの注入のための少なくとも1つの経路に連結されたポートと、
細胞の注入のための空洞に連結されたポートと
をさらに含む、請求項11に記載のシステム。 - 選択された臓器モジュールを流れる流体を制御するように配置された複数の遮断弁をさらに含む、請求項11に記載のシステム。
- 組織工学的微小環境としての無脊椎動物組織の機能単位をインビトロで再現するためのシステムであって、
第1の灌流路及び第2の別個の灌流路を少なくとも有するマイクロ流体デバイスを含み、
マイクロ流体デバイスが、マトリックスを含むチャンバーをさらに有し、マトリックスが、少なくとも1つの空洞を取り囲み、その管腔が第1の灌流路のみと流体接続しており、細胞がマトリックスと直接接触するように少なくとも1つの空洞に少なくとも1つの無脊椎動物細胞種が定着することができ、
マトリックスが、第2の別個の灌流路のみと流体接続している、
システム。 - 無脊椎動物の組織工学的微小環境が、寄生虫の培養に利用される、請求項17に記載のシステム。
- 無脊椎動物細胞が、蚊中腸細胞、蚊細胞、初代無脊椎動物細胞、培養無脊椎動物細胞、初代蚊中腸細胞、培養蚊中腸細胞、ハエ細胞、害虫細胞、マダニ細胞及びショウジョウバエ細胞からなる群から選択される、請求項17に記載のシステム。
- 無脊椎動物細胞が蚊中腸細胞を含み、寄生虫の培養が、マラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)の昆虫段階、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)又は齧歯類寄生虫種のプラスモディウム・ベルゲイ(Plasmodium berghei)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)及びプラスモディウム・ヨエリ(Plasmodium yoelii)を培養することを含む、請求項18に記載の方法。
- 空洞に蚊中腸細胞が定着して、インビボ様臓器生理機能を有する蚊中腸構造が生成される、請求項17に記載の方法。
- 潜在的なマラリアワクチン候補、伝染阻止ワクチン候補又は他の抗マラリア化合物の試験に試験微小環境を用いることをさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1つの空洞に定着している細胞が肝細胞であり、前赤血球段階のマラリア原虫である熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、プラスモディウム・ベルゲイ(Plasmodium berghei)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、プラスモディウム・オバール・クルチシ(Plasmodium ovale curtisi)、プラスモディウム・オバール・ワリケリ(Plasmodium ovale wallikeri)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、二日熱マラリア原虫(Plasmodium knowlesi)及び/又はプラスモディウム・ヨエリ(Plasmodium yoelii)の培養に微小環境が使用される、請求項1に記載のシステム。
- 微小環境が、潜在的なマラリアワクチン候補、伝染阻止ワクチン候補又は抗マラリア化合物の試験に使用される、請求項23に記載のシステム。
- 空洞に、蚊唾液腺からの細胞が播種される、請求項17に記載のシステム。
- 少なくとも1つの空洞に、樹立昆虫細胞株からの細胞が播種される、請求項17に記載のシステム。
- 少なくとも1つの空洞に、細胞付着を増強するアミノ酸又はタンパク質が灌流され、したがって細胞接着を増強するアミノ酸又はタンパク質でコーティングされる、請求項17に記載の方法。
- 蚊幼虫の細胞調製物に由来する不死化蚊細胞であって、公表され、ATCC/MR4に既に寄託されている細胞が、空洞に定着している、請求項17に記載のシステム。
- 細胞が4A−3B細胞を含む、請求項28に記載の方法。
- 少なくとも1つの空洞に、栄養溶液、被験物質、血液、血液成分及び代替血液からなる群から選択される材料が灌流される、請求項7又は19に記載の方法。
- マイクロ流体デバイスが、ポリマー有機ケイ素化合物、シリコーン、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、環状オレフィンコポリマー、ポリスチレン及びポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーから製作される、請求項17に記載の方法。
- チャンバー及び経路が、ガラス板とポリカーボネート板又は透明硬質熱可塑性樹脂板との間に並置された基材中に埋め込まれている、請求項17に記載の方法。
- マトリックスが、ヒドロゲル、ゲル化された合成又は天然ヒドロゲル、コラーゲンI、フィブリン、コラーゲンI,IV,ヒアルロナンの組合せ、キチン、キトサン、アルギネート、アガロース、ゼラチン、合成マトリックス、生物学的に導かれた合成(ハイブリッド)マトリックス、非生物学的なゲル、キトサン、アルギネート、アガロース及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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