KR20230146599A - 조직을 세포 현탁액으로 소화하기 위한 미세유체 디바이스 - Google Patents

조직을 세포 현탁액으로 소화하기 위한 미세유체 디바이스 Download PDF

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KR20230146599A
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제러드 하운
샤오롱 추
엘리엇 후이
암리스 카루나라트네
에릭 베르너
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

조직 소화의 속도와 효율성을 개선시키기 위해 샘플에 수력학적 전단력을 사용하는 미세유체 디바이스가 개시된다. 미세유체 채널은 최대 길이 1cm, 직경 1 mm의 조직 표본의 개별 위치에 수력학적 전단력을 인가하여, 수력학적 전단력과 개선된 효소-조직 접촉을 통해 소화를 가속화하도록 설계된다. 미세유체 소화 디바이스는 조직 샘플을 메스로 다지는 필요성을 제거하거나 감소시키는 동시에, 샘플 처리 시간을 감소시키고 세포 생존력을 보존할 수 있다. 또 다른 이점은 하류 미세유체 작업을 통합하여 진보된 세포 처리 및 분석 능력을 가능하게 할 수 있다는 것이다. 디바이스는 단일 세포 기반 분석 기술을 촉진할 뿐만 아니라 조직 공학 및 재생 의학 분야에 사용하기 위해 일차 세포, 전구 세포 및 줄기 세포를 분리하기 위한 연구 및 임상 환경에서 사용될 수 있다.

Description

조직을 세포 현탁액으로 소화하기 위한 미세유체 디바이스
관련 출원
본 출원은, 2018년 8월 28일자로 출원되었고 현재 미국 특허 제10,926,257호로서 허여된 미국 특허 출원 제16/115,434호의 일부 연속 출원이며 또한 2017년 8월 28일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/551,172호에 대한 우선권을 주장하는, 2021년 2월 19일자로 출원된 미국 특허 출원 제17/180,711호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원들은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 35 USC §§ 119, 120 및 임의의 다른 적용 가능한 법령에 따라 우선권을 주장한다.
연방 정부 후원에 관한 진술
연구 및 개발
본 발명은 국립 과학 재단(National Science Foundation)(NSF)이 수여한 보조금 제IIP-1362165호 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 기술 분야는 전반적으로 조직 표본 또는 조직 샘플을 세포 현탁액으로 소화하는 데 사용되는 미세유체 디바이스에 관한 것이다.
지난 10년 동안 여러 생물의학 연구 분야에 걸쳐 조직으로부터 단일 세포를 수확하는 것에 대한 관심이 급속히 성장하였다. 이는 부분적으로 조직 내에서 통상적으로 발견되는 다양한 세포 유형을 식별하고 프로파일링하기 위해 유세포 분석(flow cytometry), 질량 분광법, 및 단일 세포 시퀀싱과 같은 단일 세포 분석 기술의 사용 증가에 의해 주도되었다. 암의 경우, 이를 통해 종양 이질성, 전이 가능성, 및 추정 암 줄기 세포와 같은 희귀 세포 유형의 존재 여부를 평가할 수 있었다. 단일 세포의 분해능에서 획득된 이러한 통찰력은 암에 대한 이해를 획기적으로 변화시키고 있으며, 미래에는 임상 진단에 혁명을 일으키고 맞춤형 환자 관리를 통지할 준비가 다 되어 있다. 조직 공학 분야에서는, 피부, 간, 심장, 췌장 및 신장과 같은 손상된 기관을 대체하기 위한 새로운 구성을 생성하는 데 조직으로부터 일차 세포를 분리하는 것이 중요하다. 마지막으로, 재생 의학의 주요 목표는 중간엽 줄기 세포와 전구 세포를 조직으로부터 분리하여 신체의 병든 부분을 치료하거나 달리 대체하는 것이다. 이러한 모든 용례를 통합하는 공통 주제는 가능한 한 그 원래 표현형 상태를 대표하여 유지되는 생존 가능한 단일 세포가 필요하다는 것이다. 따라서, 신속하고, 조심스럽고 철저한 방식으로 조직으로부터 단일 세포를 유리시킬 수 있게 하는 새로운 기술을 개발하는 것이 중요한 요구 사항이다.
미세유체 기술은 미세 규모에서 세포 샘플을 처리하고 조작하기 위한 간단하면서도 강력한 방법으로서 출현하였다. 그러나, 세포 응집체 및 조직과 함께 작업하도록 개발된 미세유체 디바이스는 소수에 불과하다. Lin 등에 의해 설명된 미세유체 세포 해리 칩(μ-CDC)은 마이크로 필러 어레이를 사용하여 유체 유동 하에 신경구를 분해하도록 설계되었다. Lin 등의 Separation of Heterogenous Neural Cells in Neurospheres using Microfluidic Chip, Anal Chem, 85, 11920-8 (2013)을 참조한다. 그러나, 이 디바이스는 직경이 300 μm 미만인 응집체에만 사용될 수 있었고 여전히 막힘 문제가 있었다. Wallman 등은 디바이스 단면에 걸쳐 배치된 날카로운 실리콘 칼날을 사용하여 신경구를 기계적으로 절단하도록 설계된 바이오그리드(Biogrid) 디바이스를 개시하였다. Wallman 등의 Biogrid - a microfluidic device for large-scale enzyme-free dissociation of stem cell aggregates, Lab Chip, 11(19), pp. 3241-8 (2011)을 참조한다. 이러한 방식의 기계적 절단은 보다 효과적이었지만 가혹하였고 단일 세포가 아닌 더 작은 응집체만 초래되었다. 이전 연구에서는, 암 세포 응집체를 생존 가능한 단일 세포로 매우 효율적이고 빠르게 해리하기 위해 분지 채널 네트워크를 채용하는 미세유체 디바이스가 개시되었다. Qui 등의 Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells, Lab on a Chip, 15.1, 339-350 (2015)을 참조한다. 그러나, 입구는 크기가 1 mm보다 큰 샘플을 수용할 수 없어, 더 큰 조직 표본의 오프칩 다지기 및 소화를 필요로 한다. 전체 규모 조직이 단일 미세유체 용례, 즉, 쥐 간 생검의 배양 및 효소 소화에 채용되었지만, 이 디바이스에는 다수의 제한 사항이 있다. Hattersley 등의 Development of a microfluidic device for the maintenance and interrogation of viable tissue biopsies, Lab Chip, 8(11), pp. 1842-6 (2008)을 참조한다. 예를 들어, 이 디바이스는 조직을 효소로 배양하는 수단만을 제공했을 뿐이며, 소화 시간이 길어진 후에도 세포 수율이 극도로 낮았다.
일 실시예에서, 조직 샘플을 세포 현탁액으로 처리하기 위한 미세유체 디바이스는 내부에 입구, 출구, 및 조직 샘플을 유지하도록 치수 설정된 샘플 챔버가 형성된 기판 또는 칩을 포함한다. 샘플 챔버는 기판 또는 칩에 배치된 복수의 상류 히드로-다지기 미세유체 채널(upstream hydro-mincing microfluidic channel)에 일 측면이 유체 결합된다. 이러한 상류 히드로-다지기 미세유체 채널은 분사 프로세스에서 유체를 조직의 개별 위치로 구동하여, 유체역학적 전단력의 인가와 개선된 효소 침투(유체에 포함됨)를 통해 효과적으로 다진다. 샘플 챔버는 샘플 챔버의 다른 측면이 기판 또는 칩에 배치된 복수의 하류 체 미세유체 채널에 추가로 유체 결합되고 출구에 추가로 유체 결합된다. 하류 체 미세유체 채널은 조직을 제자리에 견고하게 유지하는 동시에 또한 더 작은 응집체와 세포가 샘플 챔버에서 빠져나가게 하는 체로서 작용한다.
몇몇 실시예에서, 미세유체 디바이스는 작은 응집체로부터 단일 세포를 더 잘 유리시키기 위해 이차 미세유체 해리 디바이스와 같은 하류 작업과 결합될 수 있다. 밸브는 또한 임의로 조직의 선택되거나 표적화된 영역 또는 부위에 고도의 전단력을 제공하기 위해 상류 히드로-다지기 미세유체 채널에 통합되거나 관련될 수 있다. 이들 밸브는 챔버 내 조직의 전체 길이를 덮도록 턴온 및 턴오프될 수 있다. 또한, 세포 기반 진단 및 치료를 위한 현장 진단 플랫폼을 생성하기 위해 세포 분류 및 분석 구성요소가 추가될 수 있다.
다른 실시예에서, 미세유체 디바이스를 사용하여 조직을 처리하는 방법은 조직을 샘플 챔버 내에 배치한 다음 소화 효소를 함유한 유체를 입구로 유동시키는 단계를 포함한다. 미세유체 디바이스를 사용하여 처리될 수 있는 조직은 건강한 조직 또는 질병에 걸린 조직을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 특정 실시예에서, 디바이스에 의해 처리되는 조직은 종양 조직을 포함하지만, 다른 조직 유형도 고려된다. 상이한 기관으로부터 획득된 조직도 처리될 수 있다. 예로는 간 조직, 신장 조직, 췌장 조직, 비장 조직, 피부 조직, 심장 조직 등을 포함한다. 유체는 펌프를 사용하여 미세유체 디바이스로 펌핑될 수 있다. 세포 또는 더 작은 조직 응집체는 미세유체 디바이스의 출구로부터 수집될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 미세유체 디바이스로부터 수집된 산출량은 미세유체 디바이스의 입력으로 다시 재순환된다.
몇몇 실시예에서, 조직은 샘플 포트를 사용하여 샘플 챔버에 로딩된다. 몇몇 실시예에서, 샘플 포트에 바늘을 삽입하고 샘플 챔버에 조직을 퇴적시킴으로써 샘플이 로딩된다. 다른 실시예에서, 플러그, 캡 또는 뚜껑이 샘플 챔버를 덮고 미세유체 디바이스에 제거/고정될 수 있다.
1 mm3 내지 50 mm3 범위 내에 치수 설정된 조직 샘플을 세포 현탁액으로 처리하기 위한 미세유체 시스템은 내부에 입구, 출구, 및 조직 샘플을 유지하도록 치수 설정된 샘플 챔버가 형성된 기판 또는 칩으로 형성된 미세유체 디바이스를 포함하고, 샘플 챔버는, 제1 측면이 입구에 추가로 유체 결합된 기판 또는 칩에 배치된 복수의 상류 히드로-다지기 미세유체 채널에 유체 결합되고, 샘플 챔버의 제2 측면이 출구에 추가로 유체 결합된 기판 또는 칩에 배치된 복수의 하류 체 미세유체 채널에 결합되며; 상류 히드로-다지기 미세유체의 폭과 하류 체 미세유체 채널의 폭은 양자 모두 50 μm보다 크고 조직 샘플의 최소 치수보다 작다.
내부에 입구, 출구, 및 조직 샘플을 유지하도록 치수 설정된 샘플 챔버가 형성된 기판 또는 칩으로 형성된 미세유체 디바이스에서 조직을 처리하는 방법에서, 샘플 챔버는, 일 측면이 기판 또는 칩에 배치된 복수의 상류 히드로-다지기 미세유체 채널에 유체 결합되고 입구에 추가로 유체 결합되며, 샘플 챔버의 다른 측면이 기판 또는 칩에 배치된 복수의 하류 체 미세유체 채널에 결합되고 출구에 추가로 유체 결합하며; 이 방법은 샘플 챔버 내에 조직을 배치하는 단계 및 소화 효소를 함유한 유체를 입구로 유동시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점은 첨부 도면과 관련하여 제시된 다음의 상세한 설명을 고려함으로써 명백해질 것이다:
도 1은 일 실시예에 따른 조직의 처리 및 소화를 위한 미세유체 디바이스의 일 실시예의 평면도를 예시한다.
도 2는 조직의 처리 및 소화를 위한 미세유체 디바이스와 제1 디바이스의 하류에 위치된 이차 미세유체 디바이스를 통합한 시스템의 개략도를 예시한다.
도 3은 조직 샘플을 로딩하기 위한 챔버와 히드로-다지기를 위한 상류(좌측) 및 하류(우측) 체(체 게이트)를 포함하는 유체 "다지기" 채널을 포함하는 레이저 에칭 아크릴 시트의 사진 이미지를 예시한다.
도 4는 2개의 아크릴 시트 또는 다른 경질 플라스틱 시트 사이에 샌드위치된 폴리머 또는 탄성 개스킷 층을 포함하는 일 실시예에 따른 미세유체 디바이스의 분해도를 예시한다. 호스 미늘은 상단 층에 예시되어 있으며 나일론 나사는 디바이스를 함께 유지하는 데 사용된다.
도 5는 도 4에 예시된 완전히 조립된 디바이스의 사진을 예시한다.
도 6은 조직의 처리 및 소화를 위해 미세유체 디바이스를 사용하는 소화 실험에 사용되는 실험 설정을 개략적으로 예시한다. 연동 펌프에 의해 유동이 구동되고 조직 소화는 디바이스 위에 장착된 카메라를 이용하여 시각적으로 모니터링된다.
도 7은 상이한 개수의 히드로-다지기 미세유체 채널(3, 5, 7)이 있는 디바이스의 속도 프로파일을 보여주는 유한 요소 유체 역학 시뮬레이션을 예시한다. 시뮬레이션 결과는 챔버가 비어 있고 모델 조직에 의해 부분적으로 차단된 상태에서 1 mL/분 유량으로 도시되어 있다. 더 적은 수의 히드로-다지기 채널은 더 강한 유체 제트를 생성하여 조직을 전단시키지만, 전체 적용 범위는 더 작다.
도 8a는 일 실시예에 따른 조직의 처리 및 소화를 위한 미세유체 디바이스의 다른 실시예의 분해도를 예시한다.
도 8b는 도 8a의 미세유체 디바이스의 평면도를 예시한다.
도 9a는 일 실시예에 따른 조직의 처리 및 소화를 위한 미세유체 디바이스의 다른 실시예의 분해도를 예시한다.
도 9b는 도 9a의 미세유체 디바이스의 평면도를 예시한다.
도 10은 히드로-다지기 미세유체 채널에 위치된 밸브를 포함하는 미세유체 디바이스의 다른 실시예를 예시한다.
도 11은 일 실시예에 따른 조직의 처리 및 소화를 위한 미세유체 디바이스의 다른 실시예의 분해도를 예시한다.
도 12는 일 실시예에 따른 조직의 처리 및 소화를 위한 미세유체 디바이스의 다른 실시예의 분해도를 예시한다.
도 13a는 Tru-Cut™ 생검 바늘을 사용하여 획득되고 조직 챔버 내부에 배치된 조직 코어의 사진 이미지이다.
도 13b는 3, 5, 및 7개의 히드로-다지기 미세유체 채널이 있는 디바이스에 대한 조직 소화의 저속 촬영 이미지를 예시한다. 유체는 콜라게나제(collagenase)를 포함하고 디바이스를 통해 20 mL/분으로 펌핑된다.
도 13c는 시간의 함수로서 조직 손실을 보여주는 그래프를 예시한다. 조직 손실은 평균 그레이 값과 전체 조직 면적에 기초하여 이미지로부터 정량화된다. 경향은 각각의 설계에서 유사했지만, 3개의 히드로-다지기 미세유체 채널의 변동성이 가장 낮았다.
도 13d는 30분 작동 후 디바이스 유출물의 현미경 사진 이미지를 예시한다. 상단에는 7개의 히드로-다지기 미세유체 채널이 있다. 중앙에는 5개의 히드로-다지기 미세유체 채널이 있다. 하단에는 3개의 히드로-다지기 미세유체 채널이 있다. 스케일 바아는 100 μm이다. 오차 바아는 적어도 3회의 독립적인 실험으로부터의 표준 오차를 나타낸다.
도 14는 조직 소화를 모니터링하는 데 사용되는 이미지 처리 알고리즘을 예시한다. 디바이스 내 소화 중 변화를 정량화하기 위해 조직 크기와 밀도에 대해 이미지를 분석하였다. 먼저, 원시 이미지를 바이너리(상부 화살표) 및 그레이스케일(하부 화살표) 이미지로 별개로 변환하여 각각 윤곽을 보여주고 평균 그레이 값을 정량화하였다. 그 후, 조직 윤곽 내의 영역을 계산하고, 평균 그레이 값을 승산하여, 조직 크기와 밀도를 설명하는 단일 메트릭을 획득하였다.
도 15a는 새로 수확되어 길이 1cm x 직경 1 mm의 피스로 절단되고 디바이스 샘플 챔버 내에 배치된 쥐 간(우측 상단) 및 신장(우측 하단)의 사진 이미지를 예시한다.
도 15b는 3개의 히드로-다지기 미세유체 채널을 포함하는 디바이스에 대한 조직 소화의 저속 촬영 이미지를 예시한다. 소화가 진행됨에 따라 조직 크기와 밀도 양자 모두는 시간 경과에 따라 감소된다.
도 15c는 평균 그레이 값 및 전체 조직 면적에 기초하여 이미지로부터 정량화된 조직 손실의 그래프를 예시하며, 간 및 신장 샘플은 유사한 경향을 보여준다.
도 15d는 CyQUANT® 분석의 결과가 소화 단독, 메스 다지기 및 소화, 또는 총 15, 30, 또는 60분 동안 지속되는 디바이스 처리에 의해 획득된 세포 현탁액을 직접 정량화하는 데 사용됨을 예시하는 그래프를 예시한다. CyQUANT® 신호는 처리 시간에 따라 증가하였으며 신장 샘플의 경우 전체적으로 더 높았다. 디바이스로 처리된 샘플의 신호는 본문의 도 3에 제시된 gDNA 및 세포 계수 결과와 유사하게 다진 대조군보다 일관되게 높았다. 오차 바아는 적어도 3회의 독립적인 실험으로부터의 표준 오차를 나타낸다. *는 동일한 소화 시간에 다진 대조군에 비교하여 p<0.05를 나타낸다.
도 16a는 소화 단독, 메스 다지기 및 소화, 또는 총 15, 30 또는 60분 동안 지속되는 디바이스 처리에 의해 획득된 신장 및 간 조직 세포 현탁액으로부터 추출 및 정량화된 게놈 DNA(gDNA)의 양을 보여주는 그래프를 예시한다. 그래프에서 확인되는 바와 같이, gDNA는 처리 시간에 따라 증가하였으며 신장 샘플의 경우 전체적으로 더 높았다. 디바이스 처리는 동일한 시점에 다진 대조군보다 지속적으로 더 많은 gDNA를 제공하였다. 대부분의 경우, gDNA는 또한 다음 소화 시점보다 더 높았지만, 차이는 현저하지 않았다.
도 16b는 세포 계수기 결과를 보여주는 그래프를 예시하는 것으로, 단일 세포 개수가 gDNA 조사 결과와 대체로 일치하지만 변동성이 더 높다는 것을 보여준다. 또한, 간 값은 이제 유사하게 신장에 필적하였으며, 이는 신장 현탁액에 더 많은 응집체가 포함되었을 수 있음을 시사한다. 오차 바아는 적어도 3회의 독립적인 실험으로부터의 표준 오차를 나타낸다. *는 동일한 소화 시간에 다진 대조군에 비교하여 p<0.05를 나타낸다.
도 16c는 적혈구 용해 후 다진 대조군과 디바이스 유출물의 현미경 사진을 예시한다. 특히, 60분에 대조군에 응집체의 개수가 많다는 점에 유의한다. 스케일 바아는 100 μm이다.
도 17은 소화된 쥐, 간 및 신장 샘플로부터 획득된 세포 현탁액에 대한 FACS 게이팅 데이터를 예시한다. 소화된 쥐 간 및 신장 샘플로부터 획득된 세포 현탁액을 표 1에 나열된 4개 프로브 패널로 착색하고 유세포 분석을 사용하여 분석하였다. 대조군은 동형 일치(IgG2b) PE-복합 항체로만 처리되었다. 취득된 데이터는 순차적 게이팅 방식을 사용하여 평가되었다. 첫째, FSC-A 대 SSC-A 게이트(게이트 1)를 사용하여 원점 근방의 부스러기를 배제하였다. 게이트 2는 FSC-A 대 FSC-H에 기초하여, 단일 세포를 선택하는 데 사용되었다. 게이트 3은 FL2-A 대 SSC-H 플롯의 CD45-PE 신호에 기초하여 CD45+ 백혈구를 구별하였다. CD45-세포 서브세트는 FL4-A 대 SSC-H 플롯에서 Draq5 핵 스테인으로부터의 신호에 기초하여 무핵 RBC와 유핵 조직 세포 서브세트로 추가로 분할되었다. 관심 있는 유핵 조직 세포의 세포질은 FLI-A 대 FSC-H 플롯에서 세포 멤브레인 염료 CellMask™ Green의 신호에 기초하여 인증되었다. 마지막으로, FL3-A 대 SSC-H 플롯의 7AAD 신호에 기초하여 살아있는 조직 세포와 죽은 조직 세포를 구별하였다. 모든 게이트는 60분 동안 소화된 다진 대조군을 사용하여 확립되었다. 열 처리된 세포는 죽은 세포에 대한 적절한 7AAD 신호를 확인하기 위해 양성 대조군으로 사용되었다.
도 18a는 쥐 신장 현탁액의 유세포 분석 결과를 예시한다. 다진 대조군 또는 디바이스 처리로부터 획득된 현탁액에서 백혈구, 적혈구, 및 단일 조직 세포의 개수를 식별하고 정량화하기 위해 유세포 분석을 사용하였다. 각각의 세포 유형의 상대 개수가 도시되어 있다. 적혈구는 거의 모든 모집단 중 가장 높은 비율을 구성하였으며, 모든 다진 대조군 및 디바이스 조건에 걸쳐 모집단 조성에 통계적으로 유의미한 변화는 없었다.
도 18b는 쥐 간 현탁액의 유세포 분석 결과를 예시한다. 다진 대조군 또는 디바이스 처리로부터 획득된 현탁액에서 백혈구, 적혈구, 및 단일 조직 세포의 개수를 식별하고 정량화하기 위해 유세포 분석을 사용하였다. 각각의 세포 유형의 상대 개수가 도시되어 있다. 적혈구는 거의 모든 모집단 중 가장 높은 비율을 구성하였으며, 모든 다진 대조군 및 디바이스 조건에 걸쳐 모집단 조성에 통계적으로 유의미한 변화는 없었다.
도 18c는 신장 샘플에 대한 조직의 mg당 총 및 살아있는 조직 세포 개수의 그래프를 예시한다.
도 18d는 간 샘플에 대한 조직의 mg당 총 및 살아있는 조직 세포 개수의 그래프를 예시한다. 도 18c 및 도 18d 모두에서, 다진 대조군의 경우 소화 시간에 따라 조직 세포 회수가 증가하였지만, 10분을 초과하는 디바이스 처리에서는 현저하게 변하지 않았다. 그러나 중요한 것은, 모든 디바이스 조건이 최대 30분 동안 소화된 다진 대조군보다 더 많은 세포를 산출했다는 것이다. 생존력은 70%만큼 낮게 도달된 가장 긴 시점을 제외하고 모두 >80%를 유지하였다. 도 18a 및 도 18b의 x축은 도 18c 및 도 18d와 동일하다. 오차 바아는 적어도 3회의 독립적인 실험으로부터의 표준 오차를 나타낸다. *는 동일한 소화 시간에 다진 대조군에 비교하여 p<0.05를 나타낸다. #은 15분 동안 소화된 다진 대조군에 비교하여 p < 0.05를 나타낸다.
도 19는 쥐 신장 및 간 세포 생존력 데이터를 예시하는 그래프를 예시한다. 세포 생존력은 다진 대응물에 비교하여 디바이스 처리 조건에 대해 유사하여, 디바이스 처리의 최소 효과를 보여준다. 오차 바아는 적어도 3회의 독립적인 실험으로부터의 표준 오차를 나타낸다.
도 20은 동일한 개수의 상류 히드로-다지기 미세유체 채널과 하류 체 미세유체 채널을 가지며, 디바이스가 대칭이 되게 하는 본 발명의 미세유체 디바이스의 실시예를 도시한다.
도 21a는 더 큰 샘플 크기를 처리하기 위해 샘플 챔버에 병렬로 결합된 복수의 미세유체 디바이스의 사진을 도시한다.
도 21b는 더 큰 샘플 크기를 처리하기 위해 샘플 챔버에 병렬로 결합된 복수의 미세유체 디바이스의 개략도를 도시한다.
도 22는 본 발명의 실시예의 개략도를 도시하고, 출구는 소화된 조직 샘플의 피스를 출구 튜브를 통해 시스템 외부로 지향하기 위한 결합부에 유체 연결되거나 조직 샘플을 추가로 처리하기 위해 디바이스의 입구로 다시 재순환된다. 소화 효소 소스는 출구를 통해 시스템을 빠져나가는 소화된 조직 샘플을 대체하기 위해 미세유체 디바이스의 입구에 도입될 추가 소화 효소를 제공하기 위해 소화 효소 소스에 추가로 유체 연결된다.
도 1은 일 실시예에 따른 조직의 처리 및 소화를 위한 미세유체 디바이스(10)를 예시한다. 특정한 일 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)는 포유동물 대상(예를 들어, 인간)으로부터 획득된 조직을 처리하도록 설계된다. 특히, 미세유체 디바이스(10)는 종양 조직의 처리 및 소화를 위한 특별한 적용성을 갖지만, 미세유체 디바이스(10)를 사용하여 다른 조직 유형을 처리할 수도 있다. 미세유체 디바이스(10)는 본 명세서에 설명된 바와 같이 함께 조립되어 미세유체 디바이스(10)를 형성하는 다수의 층을 사용하여 형성될 수 있는 기판 또는 칩 구조(12)에 형성된다. 미세유체 디바이스(10)는 기판 또는 칩 구조(12)에 정의되거나 형성된 세 가지 주 피처를 포함한다. 이들 피처는 단백질 분해 효소 또는 기타 소화제를 함유한 유체가 샘플 챔버(14)와 샘플(16)의 표면으로 나아가는 동안 샘플(16)을 제자리에 유지하는 샘플 챔버(14)를 포함한다. 따라서, 샘플 챔버(14)는 기판 또는 칩 구조(12)의 일반적으로 고정된 위치에 샘플(16)을 유지한다. 샘플(16)이 샘플 챔버(14)에 유지되게 함으로써, 이는 샘플 혼합을 촉진하고, 효소 활성을 개선시키며, 아래 설명되는 바와 같이, 수력학적 전단력을 인가하여 더 큰 샘플(16)로부터 세포와 응집체를 기계적으로 제거한다.
몇몇 실시예에서, 본 발명은 샘플(16)을 세포 현탁액으로 처리하기 위한 시스템을 특징으로 한다. 시스템은 1 mm3 내지 50 mm3 범위 내의 크기를 갖는 조직 샘플(16)을 포함할 수 있다. 시스템은 미세유체 디바이스(10)를 더 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스(10)는 기판 또는 칩(12)으로서 형성된다. 기판 또는 칩(12)은 입구(22), 출구(28), 및 조직 샘플(16)을 유지하도록 치수 설정된 샘플 챔버(14)가 내부에 형성될 수 있다. 샘플 챔버(14)는 기판 또는 칩(12)에 배치된 복수의 상류 히드로-다지기 미세유체 채널(18)에 제1 측면이 유체 결합될 수 있다. 상류 히드로-다지기 미세유체 채널(18)은 입구(22)에 추가로 유체 결합될 수 있다. 샘플 챔버(14)는 추가로 기판 또는 칩(12)에 배치된 복수의 하류 체 미세유체 채널(24)에 제2 측면이 결합될 수 있다. 하류 체 미세유체 채널(24)은 출구(28)에 추가로 유체 결합될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상류 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 폭과 하류 체 미세유체 채널(24)의 폭은 50 μm보다 클 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상류 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 폭과 하류 체 미세유체 채널(24)의 폭은 조직 샘플(16)의 최소 치수보다 작을 수 있다. 몇몇 실시예에서, 샘플 챔버(14)의 폭은 약 0.5 mm 내지 1 cm의 범위 내에 있을 수 있다. 몇몇 실시예에서, 샘플 챔버(14)의 길이는 50 cm 미만일 수 있고, 샘플 챔버(14)의 높이는 5 cm 미만일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상류 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 개수는 하류 체 미세유체 채널(24)의 개수와 동일할 수 있다(도 20 참조). 상류 히드로-다지기 미세유체 채널(18) 및 하류 체 미세유체 채널(24)의 개수 및 샘플 챔버(14)의 폭은 처리되는 조직 샘플(16)의 크기에 따라 달라질 수 있다. 폭이 더 작은 조직 샘플(16)은 폭이 더 큰 조직 샘플(16)보다 더 효과적으로 처리될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)의 제1 인스턴스는 미세유체 디바이스(10)의 최대 2개의 추가 인스턴스에 결합될 수 있다. 미세유체 디바이스(10)의 얼마나 많은 인스턴스가 미세유체 디바이스(10)의 제1 인스턴스에 결합되는 지에 따라 샘플 챔버(14)의 제3 측면(예를 들어, 측면), 샘플 챔버(14)의 제4 측면(예를 들어, 다른 측면), 또는 그 조합에서 결합이 발생할 수 있다. 이들 상이한 인스턴스는 도 21a 및 도 12b에서 확인되는 바와 같이 동일한 기판 또는 칩(12)에 포함될 수 있다. 도 21a 및 도 21b는 전술한 미세유체 디바이스(10)의 병렬 결합의 실시예를 도시한다. 이는 디바이스를 연장시키거나 확대할 필요 없이 더 큰 샘플 크기를 처리하기 위해 무한한 개수의 미세유체 디바이스(10)가 서로 병렬로 결합되게 한다. 결합된 미세유체 디바이스(10)를 통해 지향되는 유체의 유량은 함께 결합된 미세유체 디바이스(10)의 인스턴스의 개수에 따라 비례해서 증가될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 미세유체 디바이스의 각각의 인스턴스의 샘플 챔버(14)에는 다양한 유형의 조직 샘플(16)이 배치된다. 본 발명에 의해 처리된 조직 샘플(16)의 유형은 신장 조직, 간 조직, 심장 조직, 폐 조직, 유방 종양 조직, 비장 조직, 및 췌장 조직을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)는 메스 다지기와 같은 수동 처리 단계를 필요로 하지 않고 코어 바늘 생검으로부터 획득된 샘플을 세포 현탁액으로 직접 처리하도록 설계된다. 그러나, 다른 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)는 샘플이 일부 기계적 처리(예를 들어, 메스 다지기)를 받은 후에 더 큰 조직 샘플을 처리한다. 샘플 챔버(14)의 특정 크기는 샘플(16)의 크기에 따라 달라질 수 있다. 통상적으로, 샘플 챔버(14)의 폭은 약 0.5 mm 내지 약 10 mm 범위 이내일 수 있고, 샘플 챔버(14)의 길이는 2 cm 미만이며, 샘플 챔버(14)의 높이는 1 cm 미만이다. 예를 들어, 도 1을 참조하면, 일 실시예에서, 샘플 챔버(14)의 폭은 2 mm 이하이고, 샘플 챔버(14)의 길이는 2 cm 미만이며, 샘플 챔버(14)의 높이는 2 mm 미만이다(높이 치수는 페이지 평면에 직교함). 유체는 샘플 챔버(14)의 폭을 따라 화살표 A 방향으로 유동한다. 다른 실시예에서, 샘플 챔버(14)의 폭은 약 1.5 mm 이하이고, 샘플 챔버(14)의 길이는 약 1 cm 이하(예를 들어, 대략 Tru-Cut® 코어 생검 바늘의 크기; 약 1 cm 길이 x 1 mm 직경 조직)이며, 챔버의 높이는 2 mm 미만(예를 들어, 약 1 mm)이다. 또 다른 실시예에서, 샘플 챔버(14)는, 예를 들어 훨씬 더 작을 수 있고, 약 1 mm의 가장 긴 치수를 갖는 샘플(16)을 수용할 수 있다. 예를 들어, 샘플(16)이 일부 기계적 처리(예를 들어, 다지기)를 받는 경우, 샘플 챔버(14)는 훨씬 더 작은 크기를 가질 수 있다. 샘플 챔버(14)의 높이는 다양할 수 있지만 통상적으로 1 cm 미만, 보다 통상적으로 2 mm 미만이다(예를 들어, 본 명세서에 설명된 바와 같이 1 mm의 높이가 사용될 수 있음). 몇몇 실시예에서, 샘플 챔버(14)는 Tru-Cut® 코어 생검 바늘 또는 유사한 디바이스와 같은 조직 생검 디바이스로부터 직접 획득된 샘플(16)을 수용하도록 치수 설정된다.
미세유체 디바이스(10)의 제2 피처는 샘플 챔버(14)에 유지된 샘플(16)로 지향되는 고속 제트에 유체를 집중시키는 샘플 챔버(14)의 상류에 위치된 복수의 히드로-다지기 미세유체 채널(18)을 포함한다. 도 1에서 확인되는 바와 같은 히드로-다지기 미세유체 채널(18)은 입구(22)로부터 유체를 받는 입구 채널(20)과 유체 결합된다. 따라서, 유체는 화살표 A 방향으로 미세유체 디바이스(10)를 통해 이동한다. 히드로-다지기 미세유체 채널(18)은 샘플(16)의 개별 위치에 수력학적 전단력을 집중시키는 유체 제트를 생성하여, 샘플(16)을 기계적으로 분해하고 단백질 분해 효소를 샘플(16)(즉, 조직) 내부 깊숙히 전달한다. 이는 메스로 조직을 수동으로 다지는 것과 유사하므로, 이를 히드로-다지기 미세유체 채널(18)이라 지칭한다. 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 폭은 다양할 수 있지만 일반적으로 약 50 μm 내지 약 1 mm 범위 내에 있다. 예를 들어, 약 100 μm 내지 약 200 μm 범위 내의 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 폭이 통상적일 수 있지만, 이 특정 범위 밖의 다른 치수가 사용될 수 있다.
마지막으로, 복수의 하류 체 미세유체 채널(24)은 샘플 챔버(14)의 하류에 위치되어 추가 소화를 위해 더 큰 조직 피스와 세포 응집체를 선택적으로 유지하는 체로서 작용한다. 하류 체 미세유체 채널(24)은 더 큰 크기의 조직 부분과 세포 응집체를 유지하여 더 하류로 나아가는 것을 방지하는 체 게이트를 형성한다. 그러나, 더 작은 응집체와 단일 세포는 수집을 위해 또는 잠재적으로 추가 미세유체 처리를 위해 디바이스(10) 밖으로 나아가는 것이 허용된다. 예를 들어, 디바이스(10)를 떠나는 세포는 세포 기반 진단 및 치료를 위한 현장 진단 플랫폼을 생성하기 위해 하류 세포 분류 및/또는 분석을 받을 수 있다.
일 실시예에서, 하류 체 미세유체 채널(24)(히드로-다지기 미세유체 채널(18)과 함께)은 샘플 챔버(14)의 측면 또는 단부를 따라 균등하게 이격되어 샘플 챔버(14) 내의 제자리에 샘플(16)을 견고하게 고정하고 역압을 최소화한다. 하류 체 미세유체 채널(24)의 폭은 다양할 수 있지만 약 10 μm 내지 1 mm 범위 내에 있을 수 있다. 보다 통상적으로, 하류 체 미세유체 채널(24)은 약 100 μm 내지 약 1 mm 범위 내의 폭을 갖는다. 예를 들어, 몇몇 실시예에서, 500 μm 내지 1 mm 범위 내의 폭이 유용하다. 본 명세서에 설명된 실험 동안, 하류 체 미세유체 채널(24)에 대해 500 μm의 채널 폭이 사용되었으며 디바이스는 샘플 챔버(16)의 폭에 걸쳐 7개의 이러한 채널을 편안하게 수용할 수 있다. 복수의 하류 체 미세유체 채널(24)은 유체가 미세유체 디바이스(10)를 떠날 수 있는 출구(28)까지 연장되는 공통 출구 채널(26)로 이어진다.
몇몇 실시예에서, 하류 체 미세유체 채널(24)의 폭은 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 폭보다 클 수 있다. 다른 실시예에서, 하류 체 미세유체 채널(24)의 폭은 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 폭보다 작을 수 있다. 또 다른 실시예에서, 하류 체 미세유체 채널(24)의 폭은 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 폭과 실질적으로 동일할 수 있다.
500 μm는 메스 다지기에 의해 통상적으로 달성되는 조직 피스의 ~1 mm 크기에 필적한다는 점에 유의한다. 이 크기의 응집체는 또한 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제9,580,678호에 개시된 것과 같은 하류 분지 채널 어레이 해리 디바이스에 직접 입력하는 데 이상적일 것이다. 도 2는 제1 디바이스(즉, 디바이스 #1; 미세유체 디바이스(10))로부터의 출력이 추가 조직 해리를 위해 제2 하류 디바이스(100)(디바이스 #2)에 입력되는 그러한 실시예를 예시한다.
예를 들어, 일 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)는 '678 특허에 예시된 것과 유사한 다른 조직 해리 디바이스(100)에 결합된다. 해당 디바이스(100)에서, 치수가 감소하고 일련의 확장 및 수축 영역(도 2에 예시됨)을 갖는 일련의 미세유체 채널 스테이지를 사용하여 세포 클러스터 및 응집체에 전단력을 부여하여 조직을 해리시킨다. 미세유체 디바이스(10)는 도 2에 예시된 바와 같은 디바이스(100)에 결합될 수 있다. 이 실시예에서, 제1 미세유체 디바이스(10)의 출력은 추가적인 조직 해리를 위해 사용되는 제2 미세유체 디바이스(100)의 입력에 결합될 수 있다. 밸브(30)는 2개의 디바이스(10, 100) 사이에 위치되어 제2 조직 해리 디바이스(100)를 통한 선택적 유동을 허용할 수 있다. 또한, 미세유체 디바이스(10, 100) 중 하나 또는 양자 모두 사이의 유동을 재순환시키는 데 사용되는 펌프(32)가 예시되어 있다. 그러나, 예시된 바와 같이 유동을 재순환시키는 것이 아니라, 유동이 임의의 재순환 없이 디바이스를 직접 통과할 수도 있다는 점을 이해하여야 한다.
몇몇 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)의 출구(28)는 결합부에 유체 연결될 수 있다. 결합부는 출구 튜브(31)와 재순환 튜브(33) 양자 모두에 유체 연결될 수 있다. 출구 튜브(31)는 조직 샘플(16)이 펌프(32)에 의해 출구 튜브(31)를 통해 수집 챔버로 지향될 수 있도록 구성될 수 있다. 재순환 튜브(33)는 미세유체 디바이스(10)의 입구(22)에 유체 연결될 수 있고, 미세유체 디바이스(10)를 통해 지향된 소화 효소 유체가 펌프(32)에 의해 재순환 튜브(33)를 통해 입구(22)로 지향될 수 있도록 구성될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 재순환 튜브(33)는 미세유체 디바이스(10)에 도입될 추가 소화 효소를 제공하기 위해 소화 효소 소스에 추가적으로 유체 연결될 수 있다(도 22 참조). 이 프로세스는 조직 샘플(16)을 추가로 처리하는 데 사용된다.
복수의 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 경우, 목표는 효율적인 히드로-다지기를 달성하는 것이다. 더 적은 수의 채널을 사용하면 더 강한 유체 제트가 생성되지만, 조직 단면을 덜 덮게 되어 더 높은 디바이스 역압을 초래한다. 이는 경쟁 요인이기 때문에, 채널 개수를 테스트 변수로서 사용하는 실험이 수행되었으며 3개, 5개, 및 7개의 히드로-다지기 미세유체 채널(18)을 갖는 디바이스를 생성하였다. 도 3은 3개의 히드로-다지기 미세유체 채널(18)과 7개의 하류 체 미세유체 채널(24)을 보여주는 경질 아크릴 시트에 형성된 미세유체 디바이스(10)의 사진을 예시한다. 대안적으로, 미세유체 디바이스(10)의 재료는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)를 포함한다. 도 4는 일 실시예에 따른 미세유체 디바이스(10)의 다층 구성을 예시한다. 이 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)는 입구(22) 및 출구(28)에 유체 결합되는 미늘 단부 또는 배관 연결부(34)(예를 들어, 호스 미늘)를 포함하는 PET로 형성된 상부 기판 층(12a)을 포함한다. 미세유체 디바이스(10)는 내부에 미세유체 피처가 형성된 하부 기판(12b)을 더 포함한다. 이는 도 1의 입구(22), 입구 채널(20), 샘플 챔버(14), 하류 체 미세유체 채널(24), 출구 채널(26), 및 출구(28)를 포함한다. 이러한 특정 실시예에서, (유체 접근을 위한) 홀 또는 비아(35)를 갖는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)(PDMS) 개스킷(12c)은 집합적으로 함께 기판/칩(12)을 형성하는 상부 기판(12a)과 하부 기판(12b) 사이에 샌드위치된다. 개스킷(12c)에는 다른 탄성체나 폴리머가 사용될 수 있다. 이 특정 실시예에서, 체결구(36)(예를 들어, 나사)는 도 5에서 확인되는 바와 같이 단일 구성으로 다수의 기판(12a, 12b, 12c)을 함께 고정하는 데 사용된다.
채널 크기의 경우, 폭이 작을수록 더 강력하고 더 집중된 유체 제트를 생성하게 된다. 따라서, 미세유체 디바이스(10)에서 수행된 실험을 위해, 히드로-다지기 미세유체 채널(18)에 대해 200 μm의 폭이 선택되었으며, 이는 레이저 기반 제조 방법으로 신뢰성 있게 달성될 수 있는 가장 작은 피처 분해능이었다. 그러나, 상류 히드로-다지기 미세유체 채널(18) 뿐만 아니라 하류 체 미세유체 채널(24)에 대해 다른 치수가 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
디바이스(10)는 전술한 바와 같이 제1 기판(12a)에 샘플 챔버(14) 및 히드로-다지기 미세유체 채널(18), 하류 체 미세유체 채널(24), 입구 채널(20), 입구(22), 출구 채널(26), 및 출구(28)의 채널 피처를 에칭하기 위해 레이저를 사용하여 경질 아크릴 시트로 제조되었다. 레이저 출력과 래스터 속도는 약 1 mm의 깊이를 달성하여 채널 높이를 확립하도록 제어되었다. 제2 아크릴 층이 제2 기판(12b)으로서 사용되었으며 입구 및 출구 배관을 연결하기 위해 태핑되고 호스 미늘(34)이 끼워진다. 마지막으로, 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 구성된 개스킷 층(12c)은 아크릴 층(12a, 12b) 사이에 샌드위치되어 방수 밀봉부를 제공한다. PDMS의 변형 가능한 특성과 가능하게는 조직 자체는 조직이 처음에 유로를 방해하는 동안에도 유체 유동 및 역압 문제를 완화해야 한다는 점에 유의한다. 마지막으로, 조립된 디바이스 샌드위치(10)는 도 5에서 확인되는 바와 같이 6개의 나일론 나사(36)를 사용하여 함께 유지된다. 실험 설정은 도 6에 도시되어 있다. 초기 실험의 경우, 단백질 분해 효소 용액을 보존하기 위해 연동 펌프(32)를 사용하여 디바이스를 통해 유체를 재순환시켰다. 물론, 대안 실시예에서, 유동은 연속적이거나 디바이스에서 재순환되기 전에 세포가 제거될 수 있다. 실험 장치에서, 조직 소화의 진행을 모니터링하기 위해 미세유체 디바이스(10) 위에 카메라(38)를 장착하였다.
전산 유체 역학 시뮬레이션은 1 mL/min의 유량을 사용하여 각각 3개, 5개, 및 7개의 히드로-다지기 미세유체 채널(18)에 대해 COMSOL Multiphysics 소프트웨어를 사용하여 수행되었다(도 7). 이들 시뮬레이션은 유동을 방해하기 위해 샘플 챔버(14) 내에 모델 조직이 있거나 없는 상태에서 수행되었다. 예상된 바와 같이, 3개의 히드로-다지기 미세유체 채널(18)을 갖는 설계는 가장 높은 유체 속도 또는 가장 강한 유체 "절단"을 생성하였다. 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 개수를 증가시키면 조직에 걸쳐 더 잘 분산되는 약한 "절단"이 제공된다.
도 8a, 도 8b, 도 9a 및 도 9b는 조직 또는 다른 샘플을 샘플 챔버(16)에 로딩하는 데 도움이 되는 피처를 포함하는 미세유체 디바이스(10)의 2개의 대안 실시예를 예시한다. 미세유체 디바이스(10)는 미세유체 디바이스(10)를 형성하기 위해 인접한 층 사이의 계면에 도포되는 접착제 또는 글루의 도움으로 함께 압력 적층될 수 있는 복수의 층(12a, 12b, 12c)을 포함한다. 대안적으로, 층(12a, 12b, 12c)은 도 4 의 실시예에서 사용된 것과 같은 체결구를 사용하여 함께 고정될 수 있다. 도 8a 및 도 8b의 실시예에서, 개방된 윈도우(40)는 샘플(16)이 겸자를 사용하여 로딩될 수 있게 하는 미세유체 디바이스(10)의 상단 층(12a)에 제공된다. 이어서, 실리콘 고무 재료 등으로 형성된 플러그(42)를 윈도우에 배치하고 접착 테이프 또는 글루로 고정한다. 중간층(12c)은 제1 기판(12a)에 형성된 샘플 챔버(14)에 샘플(16)이 로딩될 수 있도록 내부에 형성되는 홀 또는 비아(44)를 포함한다.
도 9a 및 도 9b의 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)는 샘플 챔버(14)에 샘플(16)을 로딩하는 데 사용될 수 있는 미세유체 디바이스(10)의 측면에 위치된 샘플 포트(46)를 갖는다. 이러한 설계는 도 9b에서 확인되는 바와 같이 바늘(50)로 실리콘 고무 격막(48)을 관통함으로써 미세유체 디바이스(10)의 측면을 통한 접근을 가능하게 한다. 일 실시예에서, 이 바늘(50)은 코어 바늘 또는 펀치 생검과 같이 샘플(16)(예를 들어, 조직)을 추출하는 데 사용되는 것과 동일하다. 격막(48)을 관통한 후, 바늘(50)은 샘플 챔버(14)에 샘플(16)을 안착시키고 제자리에 남아(격막(48)을 관통하여) 미세유체 디바이스(10)를 밀봉한다. 대안 실시예에서, 격막(48)은 미세유체 디바이스(10) 외부의 유체 또는 다른 내용물의 누설 없이 바늘(50)이 미세유체 디바이스(10)로부터 제거될 수 있도록 자체 밀봉 격막(48)일 수 있다.
도 10은 히드로-다지기 미세유체 채널(18)의 하나 이상이 개별 밸브(54)에 의해 선택적으로 턴온되거나 턴오프될 수 있는 미세유체 디바이스(10)의 하나의 대안 실시예를 예시한다. 유체 유동 방향은 도 10의 화살표 A로 나타낸다. 이와 관련하여, 소수의 히드로-다지기 미세유체 채널(18)을 순차적으로 사용하여 샘플(16)의 큰 면적을 다지는 옵션이 제공된다. 예를 들어, 히드로-다지기 미세유체 채널(18) 중 하나 또는 소수는 임의의 특정 시간에 개방되어 높은 분사력 또는 전단력이 샘플(16)에 부여될 수 있다. 그 다음, 밸브(들)(54)가 폐쇄될 수 있고, 샘플(16)의 상이한 영역을 목표로 하는 다른 밸브(54) 또는 밸브 세트(54)가 턴온될 수 있다. 밸브(54)는 본 기술 분야에 알려진 미세유체 밸브(54)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형 가능한 멤브레인을 사용하여 채널 내 유동을 구동시키는 미세유체 밸브(54)가 알려져 있으며 일 예로서 사용될 수 있다. 이 프로세스는 전체 샘플(16)을 다지기 위해 임의의 횟수의 사이클 동안 계속될 수 있다.
도 11은 미세유체 디바이스(10)의 다른 실시예를 예시한다. 이 미세유체 디바이스(10)는 본 명세서에 설명된 바와 같이 경질 아크릴 또는 PET를 사용하여 다층 구성으로 형성된다. 이 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)는 다수의 층(60a, 60b, 60c, 60d, 60e, 60f)으로 형성된다. 층(60a, 60b, 60c, 60d, 60e, 60f)은 미세유체 디바이스(10)를 형성하기 위해 인접한 층 사이의 계면에 도포되는 접착제 또는 글루(예를 들어, 실리콘 또는 아크릴 기반 글루 또는 접착제)의 도움으로 함께 압력 적층된다. 층(60a)은 베이스 또는 하단 층의 역할을 한다. 층(60b)은 내부에 입구 채널(20), 출구 채널(26) 뿐만 아니라 히드로-다지기 미세유체 채널(18) 및 하류 체 미세유체 채널(24)이 형성되어 있다. 층(60c)은 내부에 층(60b)의 입구 채널(20) 및 출구 채널(26)과 연통하는 비아(62) 뿐만 아니라 입구(22) 및 출구(28)에 대한 접근을 제공하는 구멍 또는 홀(64)이 형성되어 있다. 층(60d)은 층(60c)의 비아(62)와 연통하는, 내부에 형성된 샘플 챔버(14)를 포함한다. 층(60d)은 구멍 또는 홀(64)을 더 포함한다. 층(60e)은 구멍 또는 홀(64)에 추가하여 샘플 챔버(14)에 대한 접근을 제공하는 비아(66)를 포함한다. 이 비아(66)는 기계적으로 처리된(예를 들어, 다진) 샘플(16)을 수용하도록 크기 설정된 약 1 mm의 직경을 가질 수 있다. 층(60f)은 상단 층이고 미세유체 디바이스(10) 내/외로의 유체 접근을 제공하는 미늘 단부(34)를 포함한다. 또한, 층(60f)은 비아(66)와 연통하고 샘플 챔버(14)로 전달하는 로딩 포트(68)를 포함한다. 유체 및 조직/세포가 미세유체 디바이스(10) 내부에 유지되도록 로딩 후 캡(도시되지 않음)이 로딩 포트(68) 위에 배치될 수 있다.
로딩 포트(68)는 로딩을 위해 주사기 등과 접경하는 루어 단부로서 구성될 수 있다. 이 실시예에서, 다진 샘플(16)(예를 들어, 다진 조직)은 미세유체 디바이스를 통해 유체를 유동하기 전에 로딩 포트(68)에 로딩된다. 이 실시예의 한 대안에서, 출구 채널(26)과 연통하는 하류 체 미세유체 채널(24)은 더 큰 샘플 피스(16)의 통과가 디바이스(10)의 하류로 유동하는 것을 제한하는 필터링 능력을 포함할 수 있다. 필터링은 비아(62)에 의해 제공될 수도 있다.
도 12는 미세유체 디바이스(10)의 다른 실시예를 예시한다. 이 미세유체 디바이스(10)는 본 명세서에 설명된 바와 같이 경질 아크릴 또는 PET를 사용하여 다층 구성으로 형성된다. 이 실시예에서, 미세유체 디바이스(10)는 다수의 층(70a, 70b, 70c, 70d)으로 형성되고, 본 명세서에 설명된 바와 같이, 샘플(16)이 미세유체 디바이스(10)에 로딩된 후 디바이스를 폐쇄하는 데 사용되는 캡 또는 뚜껑(72)을 포함한다. 층(70a, 70b, 70c, 70d)은 미세유체 디바이스(10)를 형성하기 위해 인접한 층 사이의 계면에 도포되는 접착제 또는 글루의 도움으로 함께 압력 적층된다. 층(70a)은 베이스 또는 하단 층의 역할을 한다. 층(70b)은 내부에 입구 채널(20)과 출구 채널(26)이 형성되어 있다. 층(70c)은 내부에 층(70b)의 입구 채널(20) 및 출구 채널(26)과 연통하는 비아(74) 뿐만 아니라 입구(22) 및 출구(28)에 대한 접근을 제공하는 구멍 또는 홀(76)이 형성되어 있다. 층(70d)은 층(70c)의 비아(74)와 연통하는, 내부에 형성된 샘플 챔버(14)를 포함한다. 층(70d)은 또한 도 4, 도 5, 도 8a, 도 8b, 도 9a, 도 9b 및 도 11에 예시된 바와 같은 미늘 단부(34)(도 12에는 예시되지 않음)를 수용할 수 있는 구멍 또는 홀(78)을 포함한다.
이 실시예에서, 샘플(16)은 샘플 챔버(14)에 직접 로딩될 수 있다. 샘플 챔버(14)에 샘플(16)을 로딩한 후, 캡 또는 뚜껑(72)은 이어서 샘플 챔버(14) 위의 층(70d)에 고정되어 미세유체 디바이스(10)의 외부 환경으로부터 샘플 챔버(14)를 밀봉한다. 캡 또는 뚜껑(72)은 접착제 등을 사용하여 층(70d)에 고정될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 캡 등(72)은 미세유체 디바이스(10)가 여러 번 사용될 수 있도록 제거 가능할 수 있다. 그러나, 다른 실시예에서, 캡 또는 뚜껑(72)은 영구적인 방식으로 층(70d)에 고정된다. 접착제 또는 글루에 대한 대안으로서, 캡 또는 뚜껑(72)은 클램프, 나사, 밴드, 클립 등과 같은 하나 이상의 체결구(도시되지 않음)를 사용하여 층(70d)에 고정될 수 있다.
쇠고기 간 조직을 사용한 초기 디바이스 최적화. 도 1에 예시된 것과 같은 미세유체 소화 디바이스의 성능은 먼저 샘플 조직으로서 쇠고기 간을 사용하여 평가되었다. Tru-Cut® 생검 바늘을 사용하여 모델 조직 코어를 추출하고 샘플 챔버(14)에 로딩하였다(도 13a). 그 후, 디바이스를 콜라게나제를 함유한 PBS 완충액으로 프라이밍하고, 밀봉한 후, 연동 펌프로 달성될 수 있는 최고 유량인 20 mL/분으로 유동을 시작하였다. 소화를 모니터링하기 위해 도 6에서 확인된 바와 같이 디바이스 위에 장착된 카메라(38)를 사용하여 5분마다 조직 표본의 이미지를 취득하였고, 실험은 총 30분 동안 수행되었다(도 13b). 각각의 이미지를 취득한 후, 유동을 잠시 역전시켜 체 미세유체 채널로 삼출된 조직을 제거하였다. 조직 삼출은 3개의 히드로-다지기 채널을 사용하여 가장 광범위하게 이루어졌으며, 이는 생성되는 더 높은 수력학적 힘을 반영한다. 조직 면적 및 픽셀 밀도에 기초하여 각각의 시점에서 디바이스에 남아 있는 간 조직의 양을 평가하기 위해 ImageJ 및 MATLAB를 사용하여 이미지를 처리하였다(도 14 참조). 초기 조직 질량에 의해 정규화된 후, 소화 프로파일을 도 13c에 플롯팅하였다. 결과는 3개의 디바이스 모두에서 명목상 유사했는데, 처음 5분 동안 조직이 40% 극적으로 감소한 다음, 5분 간격으로 조직이 ~10%씩 더 점진적으로 감소하였다. 초기 강하는 주로 픽셀 밀도 감소와 상관되며, 이는 조직 감량 또는 적혈구 세정을 반영했을 수 있다. 후속 점진적인 위상은 주로 조직 질량의 손실을 반영한다. 30분 후, 3개의 디바이스 설계 모두로부터 조직의 약 80%가 제거되었다. 그러나, 3개의 히드로-다지기 미세유체 채널이 있는 디바이스는 특히 나중 시점에서 실험 사이의 낮은 변동성 측면에서 가장 일관된 결과를 제공하므로, 추가 평가를 위해 선택되었다. 30분 동안의 디바이스 처리 후 수집된 디바이스 유출물의 대표적인 현미경 사진이 도 13d에 도시되어 있다. 모든 경우에, 샘플 유출물은 주로 더 큰 조직 응집체, 조직 세포, 및 적혈구의 혼합물로 구성되었다.
새로운 쥐 기관으로부터 획득된 세포 현탁액의 평가. 다음으로, 새로 절제된 쥐의 간 및 신장 샘플을 사용하여 3개의 히드로-다지기 채널 설계를 테스트하였다. 이들 살아있는 조직은 향후 용례에 사용될 샘플을 더 잘 대표하며, 결과적인 세포 현탁액은 품질을 위해 직접 분석될 수 있다. 간은 일반적으로 해리되기 가장 쉬운 조직 중 하나로 고려되지만, 간세포는 취약한 것으로 잘 알려져 있다. 신장은 높은 생리학적 수력학적 압력 하에서 기능하고, 긴밀한 세포간 연결부를 가지며, 특수한 기저 멤브레인을 갖는 혈관 및 상피 세뇨관의 조밀한 어레이로서의 구조로 인해 해리하기 어려운 조직으로 고려된다. 수확 직후, 조직을 메스를 이용하여 ~1 cm x 1 mm x 1 mm 피스로 절단하고(도 15a 참조) 중량을 달았다. 그 후, 쇠고기 간에 대해 설명한 바와 같이 소화 디바이스 실험을 수행하였으며, 콜라게나제는 샘플 수집 전 15분 또는 30분 동안 재순환되었다. 이미지는 5분마다 다시 촬영되었으며 조직 손실을 모니터링하기 위해 처리되었으며, 이는 쇠고기 간과 유사하였다(도 15b 및 도 15c 참조). 대조군은 원추형 튜브에서 15, 30 또는 60분 동안 콜라게나제로 소화하기 전에 메스를 이용하여 ~1 mm3 피스로 더 다졌다. 이들 샘플을 지속적으로 교반하고, 5분마다 와류시켰다. 조직을 다지지 않고 단지 30분 동안 소화한 별개의 대조군이 포함되었다. 소화 후, 디바이스 처리 샘플과 대조군 샘플을 와류 및 피펫팅에 의해 기계적으로 처리하고, 70 μm 세포 여과기를 통해 필터링한 다음, DNase로 처리하여 세포외 DNA를 제거하였다. 그 후, QIAamp® DNA 키트를 사용하여 추출한 전체 게놈 DNA(gDNA)에 기초하여 세포 함량을 평가하였다. 다진 대조군의 경우, gDNA는 소화 시간에 따라 점진적으로 증가하였다(도 16a). 신장 샘플은 소화 60분 후 조직의 mg당 약 100 ng의 gDNA를 산출한 반면, 간은 이 값의 절반 미만이었다. 다지지 않은 대조군으로부터는 약간 적은 양의 gDNA가 획득되었지만, 차이는 현저하지 않았다. 동일한 소화 시간에 비교했을 때 디바이스 처리는 대조군보다 훨씬 더 많은 gDNA를 산출하였다. 그 차이는 양쪽 조직 유형 모두에서 15분 후에 약 5배, 30분 후에는 3 내지 4배였다. 더욱이, 디바이스 처리는 다음으로 더 긴 소화 시점에서 적어도 다진 대조군만큼 많은 gDNA를 생성하였다. 따라서, 미세유체 소화 디바이스는 소화 효율을 크게 개선시키고 소화 시간을 단축시킬 수 있다. gDNA 결과를 확증하는 CyQUANT® 분석을 사용하여 손상되지 않은 세포 현탁액 내에서 DNA를 평가하였다(도 13d 참조). 마지막으로, 각각의 세포 현탁액의 대표적인 샘플을 적혈구 용해 완충액으로 처리한 후, 자동화 계수기로 세포 개수를 정량화하고 위상차 현미경 검사법으로 세포를 시각화하였다. 주로 단일 세포를 반영하지만 일부 작은 클러스터를 포함할 수도 있는 세포 수는 gDNA 결과와 유사하였다(도 16b). 주요 차이점은 이제 간이 신장에 필적한 값을 제공한다는 것이다. 이는 신장 세포의 상당한 부분이 세포 여과기를 통과하여 용해되어 gDNA를 획득할 수 있는 응집체에 남아 있을 수 있음을 시사한다. 대안적으로, 세포 계수기는 간 현탁액에서 더 많은 부스러기를 검출했을 수 있으며, 이는 다진 대조군과 디바이스 처리 샘플 모두에 대한 현미경 사진에서 볼 수 있다(도 16c).
유세포 분석을 사용한 세포 유형, 개수 및 생존력의 분석. 최종 평가는 단일 세포 개수와 생존력을 결정하는 데 중점을 두었다. 다지지 않은 대조군을 제거하고 10분 디바이스 처리를 추가한 것을 제외하고는, 이전 섹션에서 설명한 바와 같이 새로운 쥐 신장 및 간 샘플을 준비하고 소화하였다. 소화된 세포 현탁액을 40 μm 세포 여과기를 통해 여과하고 다음 4개의 형광 프로브 패널로 라벨 표시하였다: 인지질 세포 멤브레인을 착색하는 CellMask™ Green, 모든 세포 내의 DNA를 착색하는 Draq5, 플라즈마 멤브레인이 파괴된 죽은 세포 내에서만 DNA를 착색하는 7AAD, 및 백혈구를 착색하는 CD45(아래 표 1).
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이 패널은 조직 세포를 비세포 부스러기, 무핵 적혈구, 및 백혈구와 구별할 수 있는 동시에, 생존력을 평가할 수 있다. 착색된 세포 현탁액을 BD Accuri™ Flow Cytometer로 분석하여 방법 섹션에 설명되고 도 17에 도시된 게이팅 프로토콜을 사용하여 각각의 세포 유형의 개수를 획득하였다. 각각의 세포 유형의 상대적인 개수를 비교하면(도 18a 및 도 18b), 적혈구가 15분 동안 소화된 다진 대조군을 제외한 모든 세포의 대부분을 구성하였다. 예상치 못하게, 적혈구 비율은 조직이 더 철저하게 소화됨에 따라 약간 증가하였지만 이 효과는 크지 않았다. 백혈구 비율은 안정적으로 유지되었으며, 소화 시간에 따라 약간 감소하였다. 주로 상피일 것으로 예상되는 조직 세포 수를 신장 및 간 샘플에 대해 정량화하고, 도 18c 및 도 18d에 각각 나타내었다. 조직 세포 수는 다진 대조군의 경우 간보다 신장에서 2 내지 5배 높았으며, 양자 모두 소화 시간에 따라 증가하였다. 15 내지 30분 사이에는 10배 이상 증가하였고, 30 내지 60분 사이에는 5배 증가하였다. 디바이스 처리를 이용하면, 10 내지 15분 시점 사이에는 거의 변화가 없었지만, 10분은 신장 샘플의 높은 변동성과 관련이 있다. 처리 시간을 30분으로 연장하면 두 조직 유형 모두에서 세포 개수가 ~50% 정도만 증가하였지만, 차이는 크지 않았다. 다진 대조군과 비교하면, 디바이스 처리는 동일한 소화 시점에서 우수한 결과를 다시 제공하였다. 신장의 경우, 세포 개수 차이는 15분에 30배, 30분에 4배였다. 간의 경우에 차이는 이들 값의 약 절반이었다. 더욱이, 15분 디바이스 처리는 30분 동안 소화된 다진 대조군과 유사하거나 더 나은 결과를 산출하였다. 그러나, 60분 동안 소화된 다진 대조군은 이제 가장 높은 세포 개수를 제공하여, 30분 디바이스 처리를 신장의 경우 50%, 간의 경우 100% 초과하였다. 이 발견은 특히 신장의 경우 gDNA 결과와 대조되지만, 일반적으로 CyQUANT® 및 세포 계수기 데이터와 일치한다. 따라서, 소화 디바이스에 의해 해방된 새로운 세포의 상당한 부분은 작은 응집체 또는 클러스터 내에 존재할 가능성이 높으며, 이는 가장 작은 채널 피처 크기가 200 μm임을 고려하면 합리적이다. 마지막으로, 손상되지 않은 멤브레인을 갖는 건강한 세포로부터 배제된 DNA 염료를 사용하여 생존력을 평가하였다. 생존력은 60분 동안 소화된 다진 대조군과 30분 디바이스의 경우를 제외하고 모든 신장 샘플에 대해 약 80%였으며, 양자 모두 70%로 떨어졌다(도 19 참조). 간의 경우, 생존력은 다진 대조군의 경우 약 90%, 10분 및 15분 디바이스 처리의 경우 80%, 30분 디바이스 처리의 경우 70%였다. 각각의 조건으로부터 획득한 살아있는 조직 세포의 개수도 도 18c 및 도 18d에 제시되어 있다. 신장의 경우, 30분 디바이스 처리는 60분 동안 소화된 다진 대조군과 거의 동일한 개수의 살아있는 단일 조직 세포를 생성하였다. 10분 및 15분 디바이스 처리는 이 값의 약 절반을 생성했지만, 그 시간은 매우 짧다. 간의 경우, 살아있는 단일 조직 세포의 개수는 10분 이상 디바이스 처리를 통해 증가하지 않았다. 이는 간세포의 취약한 특성 때문일 가능성이 높으며, 디바이스를 통해 재순환하는 동안 손상되거나 완전히 파괴되었을 수 있다. 전반적으로, 미세유체 소화 디바이스는, 이러한 조직 유형이 일반적으로 해리하기가 더 어려운 것으로 고려된다는 점에도 불구하고 신장 샘플에 대해 더 나은 성능을 수행하였다. 이는 더 견고한 신장 세포와 해리되기 위해 더 높은 전단력이 필요한 밀도가 높은 신장 조직의 조합 때문일 가능성이 높다.
수력학적 전단력과 단백질 분해 소화의 조합을 사용하여 cm x mm 스케일의 조직으로부터 단일 세포를 추출하거나 분리하는 데 사용되는 미세유체 디바이스(10)가 개시되어 있다. 신장 및 간 조직 샘플을 이용하여 미세유체 소화 디바이스를 테스트한 결과, 메스를 이용하여 다져야 하는 표준 방법에 비교하여 DNA 및 단일 조직 세포의 회수 개선이 일관되게 관찰되었다. 짧은 처리 시간에서의 디바이스 성능은, 10분 처리가 1시간 동안 메스 다지기 및 소화의 50% 이내이지만 생존력이 개선된 결과를 산출했기 때문에 특히 흥미로웠다. 회수 개선은 DNA에서 가장 눈에 띄었으며, 이는 현재 디바이스 설계가 작은 응집체 또는 클러스터 내에 상당한 개수의 세포를 남겨두었을 수 있음을 시사한다. 디바이스 기능 및 작동의 개선은 채널 크기 감소, 유량 증가, 조직의 상이한 영역으로 유동을 지향하기 위해 도 10에 예시된 바와 같은 밸브(54) 설치와 같은 히드로-다지기 개선에서 발견될 수 있다. 이러한 접근법은 또한 조직의 응집 해리를 개선시킬 수 있다. 또한, 소화 디바이스는 수력학적 마이크로-메스를 갖는 분지 채널 어레이와 같은 도 2에 예시된 것과 같은 다른 해리 디바이스(100)와 쌍을 이룰 수 있다. 초기 조직 소화 중에 세포가 손상되었을 수 있거나, 특히 간의 경우 디바이스를 통해 반복적으로 재순환하는 동안 세포가 손상되었을 수 있다는 증거가 일부 관찰되었다. 따라서, 차세대 설계는 재순환이 아닌 여과 또는 다른 물리적 분리 수단을 통해 단일 세포가 해방되는 즉시 제거하는 방법을 모색할 것이다. 미세유체 디바이스(10)는 진단 목적을 위한 다양한 암 유형의 고형 종양과 같은 다른 조직 및 조직 공학과 재생 의학에 사용하기 위한 피부, 심장 및 지방과 같은 다른 건강한 조직과 함께 사용될 수 있다. 즉, 미세유체 디바이스(10)와 관련하여 다양한 조직 유형이 사용될 수 있다. 이는 암 조직과 같은 질병이 있는 조직을 포함하거나 건강한 조직을 포함할 수 있다. 더욱이, 조직 또는 샘플은 다수의 다양한 기관 또는 조직 유형으로부터 획득될 수 있다.
예
다음은 본 발명의 비제한적인 예이다. 상기 예는 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하도록 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 등가물 또는 대체물은 본 발명의 범위 내에 있다.
유체 역학 시뮬레이션. 디바이스 채널 내의 유동 프로파일(도 7에 예시됨)은 COMSOL Multiphysics 소프트웨어를 사용하여 시뮬레이션되었다. 이는 유한 요소 유체 역학 시뮬레이션에서 나비에-스토크스 방정식과 연속 방정식을 결합하는 것을 수반한다. 유체 유동은 층류인 것으로 가정되었으며, 채널 벽에는 비슬립 경계 조건이 강제되었다. 1 mL/분의 유량이 사용되었지만, 유동 프로파일은 실험에 사용된 최대 20 mL/분의 다양한 유량에서 동일하게 유지되었다. 유일한 차이점은 최대 유속의 대응 변화이다.
디바이스 제조. 소화 디바이스는 Onshape 소프트웨어를 사용하여 설계되었다. 유체 채널 및 호스 미늘 개구는 VLS 4.60 60W CO2 레이저(애리조나주 스코츠데일 소재의 Universal Laser Systems)를 사용하여 레이저 에칭되었다. 채널 설계는 디바이스의 하단 층 역할을 하는 6" x 6" 광학적으로 투명한 캐스트 아크릴 시트(일리노이주 엘므허스트 소재의 McMaster-Carr)에 에칭되었다. 그 후, 호스 미늘 개구를 태핑하여 나사부를 제공하였다. 5 mm 슬래브를 주조하고 메스로 절단하여 PDMS(위스콘신주 제르맨타운 소재의 Ellsworth Adhesives)로부터 개스킷을 준비하였다. 디바이스는 상단과 하단 아크릴 층 사이에 PDMS 개스킷을 배치하여 조립하고 나일론 나사로 고정하였다. 디바이스의 입구와 출구는 맞춤형 Arduino Uno R3 마이크로제어기에 의해 제어되는 연동 펌프에 연결되었다.
조직 모델. 쇠고기 간은 현지 정육점에서 구입하였고 임상 생검을 획득한 것과 유사한 방식으로 Tru-Cut™ 생검 바늘(일리노이주 버넌 힐스 소재의 CareFusion)을 사용하여 조직 코어를 추출하였다. 간단하게, 폐색 장치를 후퇴시켜 표본 노치를 덮고 바늘이 조직에 삽입되는 동안 캐뉼러 핸들을 견고하게 유지하였다. 조직에 표본 노치를 위치 설정할 수 있기까지 폐색 장치를 빠르게 전진시켰고, 캐뉼러 핸들을 빠르게 전진시켜 조직을 절단하였다. 표본 노치에서 획득한 조직을 핀셋을 사용하여 디바이스로 전달하였다. 쥐 간과 신장은 희생된 C57B/6 또는 BALB/c 쥐(메인주 바 하버 소재의 Jackson Laboratory)로부터 수확되었으며, 이는 University of California, Irvine, 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Angela G. Fleischman 박사의 호의로)에 의해 승인된 연구 조사에서 폐기물로 간주되었다. 동물의 기관을 메스를 이용하여 길이 1 cm x 직경 1 mm 피스로 절단하고, 각각의 질량을 기록하였다. 쥐 신장을 대칭 방식으로 슬라이스하여 피질과 수질을 모두 포함하는 조직학적으로 유사한 부분을 획득하였다.
조직 샘플의 소화. 소화 디바이스는 먼저 200 μL 콜라게나제 유형 I(브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재의 Stemcell Technologies)로 프라이밍되었으며 최적의 효소 조건을 보장하기 위해 인큐베이터 내부에서 37℃로 가열되었다. 그 후, 디바이스를 조립하기 전에 조직을 챔버 내부에 배치하고, 나일론 나사로 고정한 다음, 1 mL 콜라게나제로 충전하였다. 연동 펌프를 이용하여 디바이스를 통해 20 mL/분으로 유체를 유동시켜 실험을 시작했으며, 매 5분마다 유동을 역전시켜 하류 체 게이트로부터 조직을 제거하였다. 디바이스 유출물은 원추형 튜브에 직접 펌핑하여 수집되었다. 대조군은 메스를 이용하여 ~1 mm3 피스로 사전에 다지거나 다지지 않고 1 mL 콜라게나제를 함유한 원추형 튜브에서 소화하였다. 튜브를 37℃ 인큐베이터 내부에 배치하고 회전 혼합기에서 부드럽게 교반하였다. 5분마다, 튜브를 와류시켜 조직을 기계적으로 파괴하고 소화를 최대화하였다. 소화 절차의 종결 시에, 모든 세포 현탁액을 반복적으로 와류시키고 피펫으로 이동시켜 응집체를 기계적으로 파괴하고 5분 동안 37℃에서 DNase I(10 μL; 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 Roche)로 처리하였다.
조직 소화를 모니터링하기 위한 이미지 분석. 디바이스 작동 중에, 조직의 이미지는 도 6에 예시된 바와 같이 디바이스 바로 위에 장착된 카메라를 사용하여 5분마다 캡처되었다. 조직의 경계를 식별하기 위해 먼저 바이너리로 변환함으로써 ImageJ를 사용하여 원시 이미지를 처리하였다(도 14 참조). 그 후, 평균 그레이 값을 조직 경계 내에서 결정하고, 면적을 승산하여 조직 크기와 밀도를 설명하는 단일 메트릭을 획득하였다. 각각의 시점의 결과는 실험 전 초기 값에 의해 정규화되었으며, 남아있는 조직의 백분율로서 나타낸다.
세포 현탁액으로부터 회수된 DNA의 정량화. 소화된 세포 현탁액의 DNA 함량은 추출 및 정제 뿐만 아니라 형광 DNA 스테인을 사용한 세포 내 직접 평가에 의해 평가되었다. 두 경우 모두, 남아있는 조직과 큰 응집체를 제거하기 위해 먼저 70 μm 세포 여과기를 사용하여 샘플을 필터링하였다. 제조업자의 지침에 따라 QIAamp® DNA Mini Kit(메릴랜드주 제르맨타운 소재의 Qiagen)를 사용하여 정제된 게놈 DNA(gDNA)를 분리하고 Nanodrop ND-1000(매사추세츠주 월섬 소재의 Thermo Fisher)을 사용하여 정량화하였다. 제조업자의 지시에 따라 CyQUANT® NF 세포 증식 분석 키트(매사추세츠주 월섬 소재의 Thermo Fisher)를 사용하여 세포 내의 DNA를 라벨 표시하였다. 간단하게, 샘플을 35 mg/L 중탄산나트륨 및 20 mM HEPES가 보충된 HBSS에 현탁시키고 불투명 96-웰 플레이트(뉴욕주 코닝 소재의 Corning)에 3회 첨가하였다. 그 후, 동일한 체적의 CyQUANT® 염료를 각각의 웰에 첨가하고, 200 RPM으로 연속 혼합하면서 40분 동안 37℃에서 배양한 다음, Synergy 2 플레이트 판독기(버몬트주 위누스키 소재의 BioTek)를 사용하여 형광 신호를 정량화하였다. HBSS 및 CyQUANT® 염료만 수용한 웰을 배경 제거에 사용하였다. gDNA 및 형광 강도는 초기 조직 질량에 의해 정규화되었다.
세포 현탁액의 세포 계수 및 이미징. 소화된 유출물을 수집하고, 70 μm 세포 여과기를 사용하여 여과한 다음, 염화암모늄, 탄산칼륨, 및 EDTA(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Biolegend)를 함유한 적혈구 용해 완충액과 함께 실온에서 5분 동안 배양하였다. 세포 농도는 유형 S 카세트(아이다호주 헤일리 소재의 Orflo)가 있는 Moxi Z 세포 계수기를 사용하여 결정하고, 회수된 총 체적과 초기 조직 질량을 사용하여 조직 질량당 세포 개수로 전환하였다. 샘플을 12-웰 플레이트로 전달하고, 세포가 가라앉을 때까지 1시간 동안 기다린 다음, 4x 대물렌즈가 있는 호프만 위상차 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하여 이미징을 수행하였다.
단일 세포의 유세포 분석. 소화된 쥐 신장 및 간 세포 현탁액을 FACS 튜브(뉴욕주 코닝 수재의 Corning)로 균등하게 분할하고 1% BSA 및 0.1% NaN3이 보충된 FACS 완충액(1X PBS, Ca 및 Mg 양이온이 없는 pH 7.4)에 재현탁시켰다. 샘플을 먼저 0.5X CellMask™ Green(매사추세츠주 월섬 소재의 Thermo Fisher) 및 2.5 μg/mL 항-쥐 CD45-PE 단일 클론 항체(클론 30-F11(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 BioLegend))로 37℃에서 20분 동안 착색하고 원심 분리에 의해 FACS 완충액으로 2회 세정하였다. 그 후, 세포를 12.5 μM Draq5(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 BioLegend) 및 5 μg/mL 7AAD(캘리포니아주 샌 디에고 소재의 BD Biosciences)가 보충된 FACS 완충액에서 재현탁하고 Accuri Flow Cytometer(BD Biosciences)에서 분석하기 전에 최소 15분 동안 얼음 위에 유지하였다. 동형 일치 PE-복합 단일 클론 항체(클론 RTK4530, 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 BioLegend)를 대조군으로 사용하였다. FlowJo 소프트웨어(오리건주 애슐랜드 소재의 FlowJo)를 사용하여 유세포 분석 데이터를 보상하고 분석하였다. 보상은 메스로 다지고 60 mi 동안 소화된 신장 및 간 조직을 사용하여 결정되었으며, 각각의 프로브에 대해 개별 양성 및 음성 서브세트를 획득하기 위해 4개의 상이한 준비로 분배되었다. 4개의 준비는 1) 음성 대조군 CompBeads(직경 3.0-3.4 μm, 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 BD Biosciences) 및 CellMask™ Green 멤브레인 스테인, 2) 용해된 RBC 및 CD45-PE 항체, 3) 7AAD 스테인이 있는 살아있는 및 죽은(55℃에서 30분 동안 열 사멸된) 세포, 및 4) Draq5 스테인으로 세포 분율을 포함한다. 각각의 보상 샘플 내의 양성 및 음성 하위 모집단을 둘러싸는 게이트를 FlowJo에 입력하여 보상 매트릭스를 자동으로 계산하였다. 마지막으로, 순차적 게이팅 방식을 사용하여 다양한 세포 하위 모집단을 식별하였다. (도 17 참조). 모든 세포 이벤트를 선택하고 추가 분석으로부터 부스러기를 배제하기 위해 SSC-A 대 FSC-A 게이트가 생성되었다. FSC-H 대 FSC-A 게이트를 사용하여 단일 세포에만 집중하기 위해 분석 모집단으로부터 다세포 응집체를 제거하였다. 백혈구는 먼저 CD45 발현(FL2-A 또는 PE 대 SSC-H)에 기초하여 단일 세포 모집단과 구별되었다. 무핵 적혈구는 Draq5 핵 스테인(FL4-A 또는 Draq5 대 SSC-H)이 없음으로 구별되었다. 최종 남아있는 단일 세포(CD45 음성, Draq5 양성)의 세포질은 CellMask™ Green 스테인(FL1-A 또는 CellMask™ green 대 FSC-H)을 사용하여 세포 멤브레인을 검출하여 확인하였다. 마지막으로, 살아있는 유핵 조직 세포와 죽은 유핵 조직 세포 비율은 7AAD 신호(FL3-A 또는 7AAD 대 SSC-H)에 기초하여 식별되었다.
통계. 데이터는 최소 3회의 독립적인 실험으로부터 결정된 평균 ± 표준 오차로서 표현된다. P-값은 다양한 실험 조건 사이의 평균 및 표준 오차에 기초하여 학생 t-테스트를 사용하여 계산되었다.
본 발명의 실시예가 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 일 실시예의 양태는 이러한 대체 또는 조합이 본 명세서에서 명시적으로 설명되지 않더라도 다른 실시예와 관련하여 사용될 수 있다. 또한, 공개 Qiu 등, Microfluidic device for rapid digestion of tissues into cellular suspensions, Lab Chip, 17, 3300 (2017) 및 그 보충 정보가 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시예가 도시되고 설명되었지만, 첨부된 청구범위의 범위를 초과하지 않는 수정이 이루어질 수 있다는 것이 본 기술 분야의 숙련자에게 쉽게 명백할 것이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 다음의 청구범위에 의해서만 제한되어야 한다. 몇몇 실시예에서, 본 특허 출원에 제시된 수치는 각도, 치수 비율 등을 포함하여 실척으로 작성되었다. 몇몇 실시예에서, 도면은 단지 대표일 뿐이고 청구범위는 도면의 치수에 의해 제한되지 않는다.
아래 청구범위에 언급된 참조 번호는 단지 본 특허 출원의 검토를 용이하게 하기 위한 것이며, 예시적이고, 어떤 방식으로든 청구범위의 범위를 도면의 대응 참조 번호를 갖는 특정 피처로 제한하도록 의도되지 않는다.
따라서, 본 발명은 다음 청구범위 및 그 등가물을 제외하고는 제한되어서는 안 된다.

Claims (22)

1 mm3 내지 50 mm3 범위 내에 치수 설정된 조직 샘플을 세포 현탁액으로 처리하기 위한 미세유체 시스템이며,
미세유체 디바이스를 포함하고, 미세유체 디바이스는:
내부에 입구, 출구, 및 조직 샘플을 유지하도록 치수 설정된 샘플 챔버가 형성된 기판 또는 칩을 포함하고, 샘플 챔버는, 제1 측면이 입구에 추가로 유체 결합된 기판 또는 칩에 배치된 복수의 상류 히드로-다지기 미세유체 채널에 유체 결합되고, 샘플 챔버의 제2 측면이 출구에 추가로 유체 결합된 기판 또는 칩에 배치된 복수의 하류 체 미세유체 채널에 결합되며;
상류 히드로-다지기 미세유체의 폭과 하류 체 미세유체 채널의 폭은 양자 모두 50 μm보다 크고 조직 샘플의 최소 치수보다 작은, 시스템.
제1항에 있어서, 샘플 챔버의 폭은 약 0.5 mm 내지 1 cm의 범위 내에 있는, 시스템.
제2항에 있어서, 샘플 챔버의 길이는 50 cm 미만이고, 샘플 챔버의 높이는 5 cm 미만인, 시스템.
제3항에 있어서, 샘플 챔버의 폭은 2.0 mm 이하이고, 샘플 챔버의 길이는 2 cm 이하이며, 샘플 챔버의 높이는 2 mm 미만인, 시스템.
제1항에 있어서, 샘플 챔버는 제거 가능한 플러그에 의해 외부 환경에 대해 폐쇄되어 있는, 시스템.
제1항에 있어서, 샘플 챔버는 기판 또는 칩의 측면에 위치된 격막을 포함하는, 시스템.
제1항에 있어서, 상류 히드로-다지기 미세유체 채널은 약 100 μm 내지 약 200 μm 범위의 폭을 갖는, 시스템.
제1항에 있어서, 하류 체 미세유체 채널은 약 10 μm 내지 약 1 mm 범위 내의 폭을 갖는, 시스템.
제1항에 있어서, 하류 체 미세유체 채널은 약 500 μm 내지 약 1 mm 범위 내의 폭을 갖는, 시스템.
제1항에 있어서, 체 미세유체 채널의 개수는 상류 히드로-다지기 미세유체 채널의 개수와 동일한, 시스템.
제1항에 있어서, 소화 효소를 함유한 유체를 입구로 펌핑하도록 구성된 펌프를 더 포함하는, 시스템.
제11항에 있어서, 유체는 미세유체 디바이스로부터 획득한 재순환된 유체를 포함하는, 시스템.
제12항에 있어서, 출구는 결합부에 유체 연결되고, 결합부는 출구 튜브 및 재순환 튜브에 유체 연결되며, 재순환 튜브는 입구에 유체 연결되고, 조직 샘플은 출구 튜브를 통해 지향되고 유체는 재순환 튜브를 통해 지향되는, 시스템.
제1항에 있어서, 복수의 히드로-다지기 미세유체 채널 내에 위치된 복수의 밸브를 더 포함하고, 복수의 밸브는 개별 히드로-다지기 미세유체 채널을 턴온/턴오프하도록 구성되는, 시스템.
제1항에 있어서, 미세유체 디바이스의 출구에 결합된 이차 조직 해리 디바이스를 더 포함하는, 시스템.
제1항에 있어서, 비아에 의해 샘플 챔버에 연결된 로딩 포트를 더 포함하는, 시스템.
제1항에 있어서, 기판 또는 칩은 함께 샌드위치된 다수의 층을 포함하는, 시스템.
제17항에 있어서, 샘플 챔버는 하나의 층에 배치되고, 샘플 챔버에 유체 결합되는 입구 채널과 출구 채널은 각각 별개의 층에 위치되는, 시스템.
제18항에 있어서, 샘플 챔버는 표면 층에 배치되고, 미세유체 디바이스의 외부 환경으로부터 샘플 챔버를 밀봉하기 위한 캡 또는 뚜껑을 더 포함하는, 시스템.
제1항에 있어서, 미세유체 디바이스의 제1 인스턴스는 미세유체 디바이스의 최대 2개의 추가 인스턴스에 결합될 수 있고, 결합은 샘플 챔버의 제3 측면, 샘플 챔버의 제4 측면, 또는 그 조합에서 발생하는, 시스템.
내부에 입구, 출구, 및 조직 샘플을 유지하도록 치수 설정된 샘플 챔버가 형성된 기판 또는 칩을 포함하는 미세유체 디바이스에서 조직을 처리하는 방법이며, 샘플 챔버는, 일 측면이 기판 또는 칩에 배치된 복수의 상류 히드로-다지기 미세유체 채널에 유체 결합되고 입구에 추가로 유체 결합되며, 샘플 챔버의 다른 측면이 기판 또는 칩에 배치된 복수의 하류 체 미세유체 채널에 결합되고 출구에 추가로 유체 결합되며, 방법은:
샘플 챔버 내에 조직을 배치하는 단계; 및
소화 효소를 함유한 유체를 입구로 유동시키는 단계를 포함하는, 조직 처리 방법.
제21항에 있어서, 출구에서 빠져나오는 유체를 포획하고 포획된 유체를 입구로 재순환시키는 단계를 더 포함하는, 조직 처리 방법.
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