JP7259019B2 - フローサイトメトリデータを分析するためのサイズに基づくゲーティング - Google Patents

Description

がんは異常細胞の無秩序な増殖を特徴とする疾患である。正常組織では、細胞は周囲の細胞からのシグナルに応答して組織内で分裂して組織化し、その結果、組織の状況によって注意深く調整された正常な細胞挙動を生じる。がん細胞は周囲の組織からの増殖制限的な状況的手がかりに反応せず、多くの場合、増殖を促し、多くの器官で腫瘍を形成させる遺伝的変化を有する。腫瘍の増殖が進行するにつれて、遺伝的及び表現型の変化が蓄積し続け、がん細胞の集団が抗腫瘍免疫応答などの更なる「チェックポイント」を克服することを可能にし、がん細胞のより攻撃的な増殖表現型として現れる。治療せずに放置した場合、リンパ系又は血流を介して体の離れた部分にがん細胞が広がる転移が起こる可能性がある。転移は複数の部位で続発性腫瘍を形成し、健康な組織に損傷を与える。ほとんどのがんによる死亡はこのような続発性腫瘍によって引き起こされる。

がんの診断及び治療における数十年の進歩にもかかわらず、多くのがんは、それらの発生後期まで検出されないままである。その結果、増殖の初期部位における多くの固形腫瘍は、しばしば空間的に分離された遺伝的及び／又は表現型的に不均一な腫瘍細胞集団を含む。原発性腫瘍内のこれらのがん細胞集団の１つ以上は二次転移性腫瘍を生じ得る。その上、腫瘍塊は正常細胞からなることが多く、この正常細胞は腫瘍によって動員されて支持環境を形成（例えば、血管）するか、又は最初は宿主（例えば、免疫細胞）によって防御機構として腫瘍に引き寄せられたが、後にがんが進化するにつれて克服されたかのいずれかである。

腫瘍試料又は腫瘍塊に由来する試料などの生物学的試料において生じる、細胞集団を含む複数の分析物を計算、検査、及び選別するための一技術は、フローサイトメトリを含む。フローサイトメトリは、光学的及び／又は電子的検出装置を通って流れる粒子の物理的及び／又は化学的特徴の同時マルチパラメトリック分析を可能にする。現在の光学的検出システムは光散乱及び蛍光の変化を監視する。電子検出は、粒子を導電性流体中に懸濁させ、次いでそれらを微小開口又はオリフィスに通すことによって達成される。電子場は開口部又はオリフィスを横切って印加され、電流を生成する。粒子が開口部を通過すると、オリフィスを横切る抵抗が増加する。定電流での抵抗の増加は、粒子の体積に直接関係するオリフィスを横切る電圧の増加をもたらす。測定可能な電圧パルスが生成され、これを分析し、粒子の導電率、抵抗率、キャパシタンス及び形状モデリングなどの更なる操作を行うために使用することができる。

出願人は、有意な情報がサンプリングされた腫瘍から得ることができるように、腫瘍をサンプリングする新しいアプローチを開発した。出願人は、均質化された全腫瘍試料から解離された細胞が、全腫瘍との異なる細胞型を比較的代表することを示しており、例えば、均質化された全腫瘍試料は、腫瘍細胞、免疫細胞、間質細胞等を含む細胞又は細胞集団の不均一な集合体からなることを示している（例えば、ＰＣＴ公開番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８６１号及び同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８３５号を参照されたく、これらの公開は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、出願人は、フローサイトメトリによる更なる下流の分析のために、固定された腫瘍由来の残存する外科材料を混合し、単一の細胞に解離し得ることを示した。

フローサイトメトリ分析について提示される場合、より代表的な情報が提供されるが、不均一な細胞型の集団（ホモジネート由来）はデータ分析を比較的複雑にする。例えば、特定の細胞亜集団（例えば、ＣＤ８陽性のもの）は、他の細胞型と同じ密度プロットグラフ上にプロットされることができ、その亜集団がホモジネート内の細胞の少数を表す場合、不均一な混合物内でのそれらの検出は不明瞭になることがある（例えば、図６参照）。また、これはフローサイトメトリが末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）などのより均質な細胞集団を分析するために伝統的に使用されるという事実に根ざしている（図５Ａと図６をと比較されたい）。したがって、ホモジネートに由来する試料についてのフローサイトメトリから提示されるデータは、当業者にとって馴染みがなく、比較的解釈が困難であると考えられる。

出願人は、例えば、全腫瘍試料に由来する不均一試料からのフローサイトメトリデータの複雑性を低減する方法を開発した。出願人は、デジタル選別又はゲーティングの方法を開発し、それによって腫瘍細胞粒子及び正常細胞粒子（免疫細胞を含む）の不均一な混合物を、充分に規定された集団（例えば、腫瘍集団又は正常細胞集団）に仕分けて、研究、腫瘍分析、及び他の下流処理タスクにおける効率を高めることができる。本明細書に記載されるゲーティング戦略は、容易に分析され、改善されたデータ品質及びデータの異なるサブセット間の相関を導き出す能力をもたらす実質的に均質な集団及び亜集団を提供する。

本開示の一態様では、本方法は、１つ以上のバイオマーカを発現する細胞の割合を定量する方法であって、均質化試料を提供するために全腫瘍試料を均質化することと、ホモジネートから単一細胞を解離することと、１つ以上のバイオマーカの存在に対して均質化試料中の細胞を染色することと、前方散乱（細胞サイズと相関）及び後方散乱（細胞粒度と相関）に基づき均質化試料中の細胞の少なくとも第１の一次ゲーティングを実行して、第１の予測細胞型を有する少なくとも第１の細胞集団を提供することと、第１の細胞集団内の第１の亜集団中の１つ以上のバイオマーカの１番目を発現する細胞の割合を決定することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも第１の細胞亜集団中の細胞の割合を決定する前に、物理選別工程を必要としない。

いくつかの実施形態では、第１の予測細胞型は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、約１２μｍ未満のサイズである。いくつかの実施形態では、均質化組織試料は、染色の前に処理され、更なる処理は、均質化試料内のタンパク質を消化すること、試料を加熱すること、又は均質化試料をフィルタにかけることの少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカの１番目を発現する第１の亜集団中の第１の細胞の割合は、１つ以上のバイオマーカの１番目の存在に基づき第１の集団中における細胞の二次ゲーティングを行うことによって決定される。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカの１番目は、分化バイオマーカのＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１６３、ＣＤ４５ＬＣＡ、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ４５ＲＯクラスタからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のバイオマーカの２番目を発現する第１の細胞集団内の第２の亜集団中の細胞の割合を決定することを更に含み、１つ以上のバイオマーカの１番目及び２番目は異なる。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカの２番目は、分化マーカのクラスタである。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカの２番目は、分化バイオマーカのクラスタ以外のバイオマーカである。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカの２番目は、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ２８、ＣＤ５７、及びＦＯＸＰ３、ＥＰＣＡＭ、ＣＫ８／１８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカの１番目はＣＤ３であり、１つ以上のバイオマーカの２番目は、制御性Ｔ細胞、ヘルパＴ細胞、又は細胞傷害性Ｔ細胞として免疫細胞を分化させるバイオマーカである。

いくつかの実施形態では、本方法は、均質化試料中の細胞の第２の一次ゲーティングを実行して、第２の予測細胞型を有する細胞の少なくとも第２の細胞集団を提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、第２の予測細胞型は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態では、染色体異常を有する細胞の第２の細胞集団内の細胞の割合を決定することを更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、染色体異常（例えば、異数性）を有する細胞の決定された割合を、１つ以上のバイオマーカ（例えば、ＣＤ８陽性細胞と異数性細胞との間の相関）の１番目を発現する細胞の決定された割合と相関させることを更に含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のバイオマーカの１番目を発現する第１の亜集団中の決定された細胞の割合に部分的に基づいて治療決定を行うことを更に含む。

本開示の別の態様では、本方法は、組織試料中の複数のバイオマーカのうちの少なくとも第１番目のバイオマーカを発現する細胞の割合を定量する方法であって、均質化試料を提供するために組織試料を均質化することと、複数のバイオマーカの存在に対して均質化試料中の細胞を染色することと、散乱に基づく均質化試料中の細胞の一次ゲーティングを実行して、第１の予測サイズ範囲を有する少なくとも第１の細胞集団を提供することと、第１の集団中の細胞の少なくとも１つの二次ゲーティングを実行することであって、少なくとも１つの二次ゲーティングは少なくとも複数のバイオマーカのうちの１番目のバイオマーカの存在に基づき、かつ少なくとも１つの二次ゲーティングは第１番目のバイオマーカを発現する第１の細胞亜集団を提供することと、第１の細胞亜集団中の複数のバイオマーカのうちの１番目のバイオマーカを発現する細胞の割合を決定することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の亜集団中のそれらの細胞の割合を決定する前に、物理選別工程を必要としない。いくつかの実施形態では、第１の細胞集団は、それらの前方及び後方散乱（すなわち、サイズ及び粒度）に基づいてゲーティングされた（すなわち、選択された）。

いくつかの実施形態では、均質化試料は、少なくともＣＤ３バイオマーカの存在に対して染色される。いくつかの実施形態では、均質化試料は、分化バイオマーカの少なくとも１つの更なるクラスタの存在に対して更に染色される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの二次ゲーティングは、ＣＤ３バイオマーカ（例えば、前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＦＳＣ）対ＣＤ３染色強度の密度プロット）の存在に基づいて行われる。いくつかの実施形態では、別個の二次ゲーティングは、ＣＤ３バイオマーカ、並びにＣＤ４バイオマーカ及び／又はＣＤ８バイオマーカのうちの少なくとも一方の存在に基づいて独立して実行されて、ＣＤ３亜集団、並びにＣＤ４亜集団及び／又はＣＤ８亜集団のうちの少なくとも一方を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３亜集団並びにＣＤ４及び／又はＣＤ８亜集団のうちの少なくとも一方における細胞の割合が、独立して決定／定量される。

いくつかの実施形態では、組織試料は、全腫瘍、部分腫瘍、転移性腫瘍、部分転移性腫瘍、又はリンパ節のうちの少なくとも１つに由来する。いくつかの実施形態では、組織試料は、残存する外科材料又は生検試料の少なくとも１つに由来する。いくつかの実施形態では、均質化組織試料は、染色の前に処理され、更なる処理は、均質化試料内のタンパク質を消化すること、試料を加熱すること、又は均質化試料をフィルタにかけることの少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、複数のバイオマーカは、分化バイオマーカのクラスタ、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、及びＦＯＸＰ３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、分化バイオマーカのクラスタは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８、及びＣＤ５７からなる群から選択される。

本開示の別の態様では、本方法は、均質化組織試料において１つ以上のバイオマーカの少なくとも１番目を発現する細胞の割合を定量する方法であって、均質化試料を単一の細胞に解離して（例えば、更なる混合及び濾過を含む）、単一の細胞から作られた試料（例えば、主に単一細胞を含む試料）を得ることと、１つ以上のバイオマーカの存在に対して細胞を染色することと、フローサイトメータにより細胞をプローブすることと、得られたデータを分析することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、データ分析は、少なくとも２つの連続するゲーティングを実施して、１つ以上のバイオマーカの１番目を発現する少なくとも第１の細胞亜集団を得ることと、第１の亜集団における１つ以上のバイオマーカの１番目を発現する細胞の割合を決定することとを含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの連続するゲーティングは、第１の細胞集団を提供するための一次ゲーティングと、第１の細胞亜集団を提供するための二次ゲーティングと、を含む。いくつかの実施形態では、一次ゲーティングは、前方散乱及び側方散乱に基づく。いくつかの実施形態では、カットオフは、第１の集団が免疫細胞で富化されるように、前方散乱及び側方散乱について選択される。いくつかの実施形態では、複数の二次ゲーティングは、行われる。

いくつかの実施形態では、二次ゲーティングは、分化バイオマーカの少なくとも二つのクラスタについて実行される。いくつかの実施形態では、分化バイオマーカのクラスタは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８、及びＣＤ５７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のバイオマーカの２番目を発現する第２の細胞亜集団中の細胞の割合を決定することを更に含み、１つ以上のバイオマーカの１番目と２番目とは異なる。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカの２番目は、分化マーカのクラスタ以外のバイオマーカである。いくつかの実施形態では、１つ以上のバイオマーカのうちの２番目は、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、及びＦＯＸＰ３からなる群から選択される。

本開示の方法はいくつかの臨床応用を有する。一実施形態では、本方法は、特異的及び非特異的免疫応答を評価するために使用され得る。例えば、本方法は、腫瘍の発生後の免疫機能の変化を決定するため、がんに対する治療コースを決定するため、又は適用される治療が有効であるかどうかを決定するために使用され得る。あるいは、本方法は、ワクチン、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、又は他の治療剤で患者を治療した後の免疫機能の変化を決定するために使用され得る。

本開示の特徴の一般的な理解のために、図面を参照する。図面では、同一の要素を特定するために、全体を通して同様の参照符号が使用されている。

図１は、本開示のいくつかの実施形態による、ホモジネート中の異なる細胞型を定量するためのフローチャートを示す。

図２は、本開示のいくつかの実施形態による、連続ゲーティングを実行するためのフローチャートを示す。

図３は、本開示のいくつかの実施形態による、ホモジネート中の異なる細胞型を定量するためのフローチャートを示す。

図４は、本開示のいくつかの実施形態による、ゲートサイズを選択する工程を示すフローチャートを示す。

図５Ａは、試料が新鮮なリンパ球試料に由来する、ＣＤ４及びＣＤ８細胞の集団を明確に示すＣＤ８対ＣＤ４密度プロットを図示する。図は、フローサイトメトリデータがどのようにしてドットプロットにおいて異なる集団（ＣＤ４陽性、ＣＤ８陽性、及び二重陰性）を示すかを図示する。図示されたデータは、新鮮な血液（細胞混合物ではない）からの免疫細胞のみ（均質な集団）の分析からのものである。

図５Ｂは、ＣＤ８細胞の集団のゲーティングを示すＦＳＣ対ＣＤ８密度プロットを図示する。この図は、全腫瘍（例えば、免疫細胞、腫瘍細胞、上皮細胞からなる非常に不均一な集団）から解離した細胞のフローサイトメトリ分析を示す。別々の細胞集団（図５Ａのドットプロット中の丸印）は図５Ｂには示されておらず、これによりフローサイトメトリのユーザに受け入れられにくいデータとなっている。

図６Ａは、２つのゲーティングが散乱に基づいて選択される、フィルタにかけたホモジネートの密度プロット（ＦＳＣ対ＳＳＣ（側方散乱））を図示する。ホモジネート由来の全てのフィルタにかけられた細胞を図示する。

図６Ｂは、一次ゲーティング後のフィルタにかけられたホモジネートの密度プロット（ＦＳＣ対ＳＳＣ）を図示し、ここでは、デジタル選別された小細胞のみが残る。

図７は、５つのゲーティングが散乱に基づいて選択される、フィルタにかけられたホモジネートの密度プロット（ＦＳＣ対ＳＳＣ）を図示する。

図８Ａは、ＣＤ３マーカについてのゲーティングされた大細胞の分析を図示する（上段２パネル）。右上のパネルは一次抗体が添加されていない対照を示し、左上のパネルは実際の試料を示す。各パネル中の長方形は、ポジティブセル（ＣＤ３陽性細胞）が配置されるべき場所を示す。大細胞は、ＣＤ３陽性を示さなかったが、これは、大細胞が大抵ＣＤ３マーカを発現しない腫瘍細胞であることから予想された。下のパネルは、同じＣＤ３マーカに対する小細胞の分析を示す。小細胞の大部分はＣＤ３を発現したが、これは、小細胞が免疫細胞であったことから予想された。

図８Ｂは、ＣＤ３マーカについてのゲーティングされた大細胞の分析を図示する（上段２パネル）。右上のパネルは一次抗体が添加されていない対照を示し、左上のパネルは実際の試料を示す。各パネル中の長方形は、ポジティブセル（ＣＤ３陽性細胞）が配置されるべき場所を示す。大細胞は、ＣＤ３陽性を示さなかったが、これは、大細胞が大抵ＣＤ３マーカを発現しない腫瘍細胞であることから予想された。下のパネルは、同じＣＤ３マーカに対する小細胞の分析を示す。小細胞の大部分はＣＤ３を発現したが、これは、小細胞が免疫細胞であったことから予想された。

図９Ａは、ＣＤ３バイオマーカを発現する第１の亜集団についての密度プロット（ＦＳＣ対ＣＤ３染色強度）を図示する。

図９Ｂは、ＣＤ８バイオマーカを発現する第１の亜集団についての密度プロット（ＦＳＣ対ＣＤ８染色強度）を図示する。

図９Ｃは、ＣＤ４バイオマーカを発現する第１の亜集団についての密度プロット（ＦＳＣ対ＣＤ４染色強度）を図示する。

図１０は、異なる均質化肺腫瘍試料に由来する細胞亜集団についての密度プロット（ＦＳＣ対ＣＤ８染色強度）を示す。

図１１は、均質化腫瘍試料（パネルＣ）からの未選別細胞を、物理選別後のＣＤ３発現（パネルＡ）及びデジタル選別後のＣＤ３発現（パネルＢ）と比較し、物理選別及びデジタル選別の両方は、データの質を改善し、正確なパーセンタイル値の誘導を可能にする。

図１２は、均質化試料に由来する細胞を染色する方法を図示する。

図１３は、ＣＫ８／１８対前方散乱の密度プロットを図示する。

反対に明確に示されない限り、複数の工程又は行為を含む本明細書において特許請求の範囲に記載される任意の方法において、方法の工程又は行為の順序は、必ずしも方法の工程又は行為が記載される順序に限定されないことも理解されたい。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「又は」という単語は、文脈が明確に別のことを示さない限り、「及び」を含むことを意図している。「含む」という用語は、「Ａ又はＢを含む」がＡ、Ｂ、又はＡ及びＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「又は」は、上記で定義された「及び／又は」と同じ意味を有することを理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であると解釈されるものとする。すなわち、要素の数又はリストの少なくとも１つを含むが、複数、及び必要に応じて追加のリストに記載されていない項目を含むと解釈される。「のうちの１つのみ」又は「のうちの正確に１つ」、又は特許請求の範囲で使用される場合、「から構成される」など、反対に明確に示される用語のみは、数又は要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「又は」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」又は「のうちの正確に１つ」など、排他権の用語が先行する場合にのみ、排他的な代替案（すなわち、「一方又は他方であるが双方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「から本質的に構成される」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

「備える」、「含む」、「有する」などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「備える」、「含む」、「有する」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、各用語は、「備える」という一般的な米国特許法の定義と一致して定義されているため、「少なくとも以下」を意味するオープンな用語として解釈され、また、追加の特徴、限定事項、態様等を除外しないように解釈される。したがって、例えば「要素ａ、ｂ、及びｃを持つ装置」とは、装置が少なくとも成分ａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。同様に、「工程ａ、ｂ、及びｃを含む方法」という句は、本方法が少なくとも工程ａ、ｂ、及びｃを含むことを意味する。更に、工程及びプロセスは本明細書において特定の順序で概説され得るが、当業者は、順序付け工程及びプロセスが変化し得ることを認識するであろう。

本明細書の明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的にリスト化されているありとあらゆる要素の少なくとも１つを含まなくてもなく、要素のリスト内の要素の任意の組合せを除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関連するかどうかにかかわらず、必要に応じて存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（又は、同等に、「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、又は同等に「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（及び必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（及び必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、更に別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＡを含み、少なくとも１つ、必要に応じて２つ以上のＢを含む（及び必要に応じて、他の要素を含む）を指すことができるなどである。

本明細書で使用される場合、「生物学的試料」、「組織試料」、「標本」などの用語は、ウイルスを含む任意の生物から得られる生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、又はそれらの組合せなど）を含む任意の試料を指す。生物の他の例は、哺乳動物（ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、及びブタなどの獣医動物、並びにマウス、ラット、霊長類などの実験動物など）、昆虫、環形動物、クモ形類動物、有袋類、爬虫類、両生類、細菌、及び菌類などを含む。生物学的試料は、組織試料（組織切片や組織の針生検など）、細胞試料（Ｐａｐ塗抹標本若しくは血液塗抹標本などの細胞学的塗抹標本、又はマイクロダイセクションによって得られた細胞の試料など）、又は細胞画分、断片又は細胞小器官（細胞を溶解し、遠心分離などによってそれらの成分を分離することによって得られる）を含む。生物学的試料の他の例は、血液、血清、尿、精液、糞便、脳脊髄液、間質液、粘膜、涙、汗、膿、生検組織（例えば、外科的生検又は針生検によって得られる）、乳頭吸引物、耳垢、乳、膣液、唾液、ぬぐい液（頬スワブなど）、又は最初の生体試料に由来する生体分子を含む任意の材料を含む。特定の実施形態では、「生物学的試料」という用語は、本明細書で使用される場合、対象から得られた腫瘍又はその一部から調製された試料（均質化又は液化された試料など）を指す。

本明細書で使用される場合、「バイオマーカ」という用語は、正常若しくは異常なプロセス、又は状態若しくは疾患（がんなど）の徴候である、血液、他の体液、又は組織中に見出される生物学的分子を指す。バイオマーカは、身体が疾患若しくは状態の治療にどの程度よく応答するか、又は対象が疾患若しくは状態の素因を有するかどうかを決定するために使用され得る。がんの文脈において、バイオマーカとは、体内におけるがんの存在を示す生物学的物質を指す。バイオマーカは、腫瘍によって分泌される分子、又はがんの存在に対する身体の特異的応答であり得る。遺伝的バイオマーカ、エピジェネティックなバイオマーカ、プロテオミクスのバイオマーカ、グリコミクスのバイオマーカ、及び画像バイオマーカは、がんの診断、予後、及び疫学に使用されることができる。このようなバイオマーカは、血液又は血清のような非侵襲的に収集された生体液中でアッセイすることができる。ＡＦＰ（肝がん）、ＢＣＲ－ＡＢＬ（慢性骨髄性白血病）、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２（乳がん／卵巣がん）、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（メラノーマ／大腸がん）、ＣＡ－１２５（卵巣がん）、ＣＡ１９．９（膵がん）、ＣＥＡ（大腸がん）、ＥＧＦＲ（非小細胞肺がん）、ＨＥＲ－２（乳がん）、ＫＩＴ（消化管間質腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、Ｓ１００（メラノーマ）、及びその他の多くを含むが、これらに限定されないいくつかの遺伝子及びタンパク質ベースのバイオマーカが、既に患者のケアで使用されている。バイオマーカは診断（早期がんの同定）及び／又は予後徴候（がんの攻撃性を予測する、対象が特定の治療にどのように反応するかを予測する、及び／又はがんが再発する可能性を予測する）として有用であり得る。

本明細書で使用される場合、「ゲーティング」という用語は、粒子の特徴に基づく試料からの粒子の集団の選択を指す。例えば、粒子の特徴は、前方散乱（ＦＳＣ）、側方散乱（ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＳＣ）、及び／又は蛍光強度に基づいて定義することができる。したがって、必要な特徴を有する粒子はゲートを通過し更なる分析に選択されるが、一方で必要な特徴を有しない粒子は更なる分析に選択されない。デジタルゲーティングとは、全ての細胞の混合物を分析した後、特定の集団を選択してプロット上に示すことを意味する。選択された細胞集団は、全ての細胞の分析後、「デジタル選別される」。物理選別は、全ての細胞から選択された集団を別々のチューブに取り出し、次いで、選択された細胞集団を分析するプロセスである。デジタル選別及び物理選別のどちらも、本明細書に記載されるような特定の細胞集団の分析を達成すると考えられる。

本明細書で使用される場合、用語「均質化すること」とは、生物学的試料の全ての画分が組成において等しいような状態にされるプロセスを指す。本開示において、「均質化」は、概して試料内の大部分の細胞の完全性を維持し、例えば少なくとも５０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は９９．９％以上の割合の試料内の細胞は、均質化プロセスの結果として破裂又は溶解しないであろう。ホモジネートは実質的に個々の細胞（又は細胞のクラスタ）へ解離されてもよく、得られたホモジネート又はホモジネート（複数）は実質的に均質である（類似の要素からなるか若しくは類似の要素で構成されるか、又は全体に均一である）。

本明細書で使用される場合、「標識」又は「染色」という用語は、分析物に結合することができ、内在化されるか又はそうでなければ吸収され、そして例えば、形状、形態、色、蛍光、発光、リン光、吸光度、磁気特性、又は放射性発光によって検出され得る試薬を意味する。同様に、「標識している」、「染色している」などの用語は、本明細書で使用される場合、一般に、生物学的標本中の特定の分子（脂質、タンパク質、又は核酸など）又は特定の構造（正常又は悪性の細胞、細胞質ゾル、核、ゴルジ装置、又は細胞骨格など）の存在、位置、及び／又は量（濃度など）を検出及び／又は区別する生物学的標本の任意の処理を指す。例えば、染色は、特定の分子又は特定の細胞構造と生物学的標本の周囲の部分との間のコントラストを提供することができ、染色の強度は、標本中の特定の分子の量の尺度を提供することができる。染色は、明視野顕微鏡だけでなく、位相差顕微鏡、電子顕微鏡、及び蛍光顕微鏡などの他の観察ツールを使用して、分子、細胞構造、及び生物の観察を支援するために使用されることができる。システムによって実行されるいくつかの染色は、細胞の輪郭を視覚化するために使用されることができる。システムによって実行される他の染色は、他の細胞成分の染色なしで、又は比較的少ない染色で、染色される特定の細胞成分（分子又は構造など）に依存することができる。システムによって実行される染色方法のタイプの例は、これらに限定されるものではないが、組織化学的方法、免疫組織化学的方法、及び核酸分子間のハイブリッド形成反応などの分子間の反応（非共有結合相互作用を含む）に基づく他の方法を含む。特定の染色法は、これらに限定されるものではないが、一次染色法（例えば、Ｈ＆Ｅ染色、Ｐａｐ染色等）、酵素結合免疫組織化学的方法、及び蛍光原位置ハイブリッド形成（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）などの原位置ＲＮＡ及びＤＮＡハイブリッド形成法を含む。

本明細書で使用される場合、「代表試料」及び「代表的サンプリング」という用語は、全体の構成要素を正確に反映する試料（又は試料のサブセット）を指し、したがって、試料とは集団全体の偏りのない指標である。一般に、これは、代表試料又はその一部の内の異なる細胞型及びそれらの相対的な比率又は割合が、全体の組織標本、概して固形腫瘍又はその一部の内のこれらの細胞型の相対的な比率又は割合を本質的に正確に反映又は模倣することを意味する。本明細書で使用される場合、「シーケンシング」又は「ＤＮＡシーケンシング」とは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド塩基、アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンの順序を決定するための生化学的方法を指す。本明細書で使用される用語として、シーケンシングは、制限なく、並列シーケンシング又は当業者に公知である任意の他のシーケンシング法、例えば、連鎖終止反応法、迅速ＤＮＡシーケンシング法、ワンダリングスポット分析（ｗａｎｄｅｒｉｎｇ－ｓｐｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）、マキサム・ギルバート・シーケンシング法、ダイ・ターミネータ・シーケンシング法、又は任意の他の最新の自動化されたＤＮＡシーケンシング装置を用いることを含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「腫瘍」とは、それ自体は、通常、正常細胞よりも急速に増殖し、かつ治療しなければ増殖し続け、場合によっては隣接構造に損傷をもたらす細胞の異常な新規増殖として定義される、塊又は新生物を指す。腫瘍サイズは様々であり得る。腫瘍は固形であるか又は液体で満たされている場合がある。腫瘍は良性（悪性でない、一般的に無害）又は悪性（転移の可能性がある）の増殖物を指し得る。いくつかの腫瘍は、良性の新芽細胞（上皮内がんなど）と、同時に悪性のがん細胞（腺がんなど）を含み得る。これには全身の複数の部位に位置する新生物が含まれると理解すべきである。したがって、開示目的のため、腫瘍は、原発性腫瘍、リンパ節、リンパ組織、及び転移性腫瘍を含む。

本明細書で使用される場合、「腫瘍試料」という用語は、腫瘍から調製した試料を包含するか、又はがん細胞を潜在的に含む、若しくはがん細胞を含むと疑われる、若しくはリンパ節などのがん細胞の潜在的な存在に対して試験される試料を包含する。

組織からの細胞及び／又は核の分離

図１及び図３を参照すると、いくつかの実施形態では、細胞、核、及び／又は小組織凝集体は、組織試料などの試料から分離される。いくつかの実施形態では、細胞、核、及び／又は小組織凝集体は、組織試料を均質化することによって、組織試料から分離される（工程１００）。いくつかの実施形態では、均質化試料中に存在する細胞、核、及び／又は小組織凝集体を、次いで、フローサイトメトリ分析のために提示する（工程１１０）。解離した細胞、核、及び／又は小組織凝集体を、次いでゲーティングし（工程１２０）、続いて更に分析してもよい。

いくつかの実施形態では、均質化（工程１００）のための組織試料は、腫瘍（がん性又は非がん性）、転移性病変、正常組織、全血、又はリンパ節に由来する。いくつかの実施形態では、組織試料は、残留外科試料、生検試料、又は組織学的試料である。いくつかの実施形態では、組織試料は、新鮮な試料、すなわち保存されていない試料である。いくつかの実施形態では、組織試料は、固定された組織試料である。いくつかの実施形態では、組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料ブロックに由来する。いくつかの実施形態では、複数の組織源を組み合わせ、次いで、細胞及び／又は核を集団組織試料から分離することができる。

組織試料の均質化

いくつかの実施形態では、腫瘍試料、リンパ節試料、及び／又は他の組織試料は、機械的分断装置、例えばブレンダ又はウルトラソニケータ内に試料を置くことによって均質化される（工程３００）。均質化により広範な組織断片が生成される。均質化腫瘍試料又はリンパ節試料を調製する方法は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８６１号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

腫瘍、リンパ節、及び／又は他の組織試料を分離するのに充分な機械的分断に続いて、元の試料内で元々空間的に分離されていた腫瘍細胞の全ての亜集団は、新規の均質化試料全体に分布する。すなわち、腫瘍、１つ以上のリンパ節、又はそれらの任意の組合せを均質化する結果として、腫瘍内の細胞の任意の不均質性は、得られたホモジネート又はその一部若しくは画分内に実質的に均質に（均一に）分布し、その結果、ホモジネート（又は任意のその画分）は、入力であった腫瘍及び／又はリンパ節試料の不均質性を実質的に均質に発現する。腫瘍及び／又はリンパ節を均質化して、その全体における腫瘍を代表する試料（又はホモジネート）を生成することによって、いくつかの実施形態では、腫瘍のランドスケープ（不均質性など）を特徴付けることが可能であり、例えば、ホモジネート全体に含まれる異なる細胞集団又は核集団のそれぞれを分析すること（例えば、患者が特定のタイプの治療の候補であるかどうかを決定するために、特定のタイプの免疫細胞の量を決定すること）が可能であり得る。いくつかの実施形態では、本方法は、異なる腫瘍浸潤リンパ球の相対存在量などの腫瘍浸潤リンパ球を検出するために有用である。

腫瘍からの細胞、核、及び／又は小組織凝集体の解離

均質化試料（工程２００から）を更に解離及び／又は処理して、解離された細胞、核、及び／又は小組織凝集体を得ることができる（工程２１０）。一般に、組織解離には、酵素的解離、化学的解離及び機械的解離、又はそれらの任意の組合せを含む３つの主要な方法がある。解離方法の選択は、通常、組織型及び組織起源に基づいて行われる。

酵素的解離とは、酵素を用いて組織片を消化することで、組織から細胞を放出するプロセスである。多くの異なるタイプの酵素をこのプロセスに使用することができ、当業者が理解するように、特定の酵素は特定の組織種に対してより効果的である。当業者はまた、いずれの酵素的解離プロセスも互いに組み合わせて１つ以上の酵素を使用することができ、又は他の化学的及び／若しくは機械的解離方法と組み合わせて１つ以上の酵素を使用してもよいことを理解するであろう。適当な酵素の例としては、コラゲナーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、ＤＮアーゼＩ、中性プロテアーゼ、及びトリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

コラゲナーゼとは細胞外マトリックスで見出されるタンパク質を消化するのに使用されるタンパク質分解酵素である。酵素プロテアーゼに特有のコラゲナーゼは、結合組織でよく見られる三重らせん天然コラーゲン原線維を攻撃して分解することができる。４つの基本的なコラゲナーゼ型が存在する。すなわち：上皮、肝臓、肺、脂肪、及び副腎組織細胞標本での使用に適している、１型；高いタンパク質分解活性を有することから、心臓、骨、筋肉、甲状腺、及び軟骨の腫瘍由来組織における使用に適している、２型；タンパク質分解活性が低いため乳腺細胞での使用に適している、３型；及び、そのトリプシン活性から、受容体の完全性が重要である膵島及び他の研究プロトコルに適している、４型。

トリプシンは、アルギニン及びリシンアミノ酸のカルボキシル基を含むペプチド結合に対する特異性を有する膵臓セリン（アミノ酸）プロテアーゼとして記載されている。最も特異性の高いプロテアーゼの１つと考えられている。トリプシン単独では、細胞外タンパク質に対する選択性がほとんどないため、通常は組織解離に効果的ではない。通常はコラゲナーゼ又はエラスターゼなどの他の酵素と併用される。

エラスターゼは別の膵臓セリンプロテアーゼであり、中性アミノ酸に隣接するペプチド結合に特異性がある。天然エラスチンを加水分解する能力はプロテアーゼの中でも独特である。エラスターゼはまた血液成分及び細菌にも存在し得る。いくつかの実施形態では、これは、肺組織からのＩＩ型細胞の単離に適している。

ヒアルロニダーゼはポリサッカリダーゼであり、この酵素は組織の解離にしばしば用いられ、典型的にはコラゲナーゼのようなより粗なプロテアーゼと併用される。これはほとんど全ての結合組織にみられる結合に対して親和性を有する。

パパインはスルフヒドリルプロテアーゼであり、広い特異性を有するため、ほとんどのタンパク質基質を膵臓プロテアーゼ、すなわちトリプシン又はエラスターゼよりも完全に分解することができる。パパインは組織から神経物質を単離するためによく使用される。

デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）は、解離培地に漏出し、粘度及び回収問題を増大させ得る核酸を消化するための酵素的細胞単離手順にしばしば含まれる。特定の理論に縛られることを望まないが、ＤＮアーゼＩは、インタクトな細胞を損傷しないと考えられている。

中性プロテアーゼ、例えばＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能）は、穏やかなタンパク質分解活性を有する細菌酵素であり、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）は、細胞膜の完全性を維持するその能力のために、一次及び二次細胞培養物を単離するのに有用である。これは、上皮様細胞と比較して、より効率的に線維芽細胞様細胞を解離することが見出されている。これはＥＤＴＡで阻害される。

トリプシン阻害剤は主にダイズ由来であり、トリプシンを不活性化するので、特定の細胞単離プロトコルに用いられることがある。

化学的解離はカチオンが細胞内結合及び細胞内マトリックスの維持に関与するという事実を利用している。これらのカチオンに結合するＥＤＴＡ又はＥＧＴＡを導入することによって、細胞間結合が破壊され、それによって組織構造の解離が可能になる。

最後に、機械的解離は、組織を小片に切断、スクレーピング、又はスクラッチングすることを必要とし、次いで、組織から細胞を分離するために、細かく切り取られた組織を培地中で洗浄し、時には穏やかな撹拌及び／又は超音波処理もまた使用して、細胞をほぐすのを助ける。他の実施形態では、機械的解離は、本明細書で更に記載するように、試料の均質化を含むことができる。

いくつかの実施形態では、均質化試料又はフィルタにかけられた均質化試料内の細胞は、細胞成分を放出するために溶解される。例えば、細胞は、フレンチプレス又は同様のタイプの溶解装置、マイクロフルイダイザ、粉砕、摩砕、化学的若しくは酵素的溶解（上記を含む）を用いて、及び／又は当該技術分野で公知の他の技術を用いて溶解され得る。いくつかの実施形態では、膜脂質及びタンパク質（ヒストン含む）は、細胞成分を含有する試料から除去される（例えば、界面活性剤又は酵素（プロテアーゼ）を加えることによる）。

均質化試料、代表試料、又は解離試料を個々の核へと更に処理するには、細胞膜を除去する必要がある。新鮮な細胞のための現在の核単離法は、核を遊離する酵素を必要とせず、ホルマリン固定試料からの核単離は一般的な方法ではない。個々の核を効率的に単離するために、正常核と腫瘍核との間の識別を可能にする細胞骨格マーカを維持しつつ、酵素（例えば、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、トリプシン、Ａｃｃｕｍａｘ、コラゲナーゼＨ）を使用して、処理された核からＤＮＡを遊離させるような過度の損傷なしに核を明らかにすることができる。ホモジネート又は代表試料から核を単離する特定の方法は、同時係属中のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８６１号に開示されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ホモジネートは、典型的なブレンダ（ＩＫＡブレンダ）で更に混合され、次いで、異なるサイズの一組のセルストレーナ（例えば、約２０ｕｍ、約１０ｕｍ等）でフィルタにかけられる。いくつかの実施形態では、金属メッシュを使用して、セルストレーナによってフィルタにかける前に大きな組織断片を除去する。いくつかの実施形態では、得られた試料は、所望のマーカで染色することができる単一細胞（ダブレットのように凝集したいくつかの小細胞）から主に構成される。

均質化試料内の細胞の染色

いくつかの実施形態では、解離された細胞及び／又は核は、フローサイトメトリによって試料を評価する前に標識又は染色され、その結果、異なる細胞型が同定され得る（例えば、図１２を参照されたい）。標識又は染色は、フローサイトメトリによって異なる細胞型を同定し得る任意の検出可能な標識又はレポータ部分、例えば、蛍光標識であり得る（図３の工程３１０）。

いくつかの実施形態では、均質化試料を、１つ以上の検出試薬を適用することによって可視化することができる、１つ以上の検出プローブと接触させる（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１７／０８５３０７号を参照されたい）。例えば、いくつかの実施形態では、利用される検出プローブは、免疫細胞マーカに特異的である。いくつかの実施形態では、検出プローブは、Ｔリンパ球及びＢリンパ球を含むリンパ球のマーカに特異的な一次抗体から選択される。他の実施形態では、検出プローブは、白血球、ヘルパＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞のマーカに特異的である一次抗体から選択される。更に他の態様では、検出プローブは、広域スペクトルリンパ球二次バイオマーカに特異的である一次抗体から選択される。

いくつかの実施形態では、抗体は、任意の従来の手順、例えばＷｏｆｓｙら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｌａｂｅｌ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ」、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳ．Ｍ．Ｓｉｉｇｉ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９８０年）によって記載された手順によって、異なる蛍光色素にコンジュゲートされ得る。例えば、異なる免疫細胞型は、異なる細胞型上の抗原に特異的な蛍光標識抗体を用いて決定することができる。異なる細胞型に特異的な蛍光標識抗体の例としては、ＮＫ細胞について、ＣＤ３ ＦＩＴＣ／ＣＤ１６＋ＣＤ５６ＰＥ；Ｂ細胞について、ＣＤ３ ＦＩＴＣ／ＣＤ１９ＰＥ；単球について、ＣＤ４５ ＦＩＴＣ／ＣＤ１４ＰＥ；ヘルパＴ細胞について、ＣＤ３ ＦＩＴＣ／ＣＤ４ＰｅｒＣＰ；ＣＤ８細胞について、ＣＤ３ ＦＩＴＣ／ＣＤ８ＰＥ；ヘルパメモリＴ細胞について、ＣＤ４ＰｅｒＣＰ／ＣＤ４５ ＲＯ ＰＥ；ＣＤ８メモリ細胞について、ＣＤ８ ＦＩＴＣ／ＣＤ４５ＲＯ ＰＥ；ナイーブヘルパＴ細胞について、ＣＤ６２ ＦＩＴＣ／ＣＤ４５ＲＡ ＰＥ／ＣＤ４ＰｅｒＣＰ；ナイーブＣＤ８細胞について、ＣＤ６２ ＦＩＴＣ／ＣＤ４５ＲＡ ＰＥ／ＣＤ８ＰｅｒＣＰが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、細胞又は核を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色する。

いくつかの実施形態では、検出プローブは、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＬＣＡ（ここで、「ＬＣＡ」とは白血球共通抗原を指す）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ１９、及びＣＤ１６３（例えば、抗ＣＤ抗体）を含むがこれらに限定されない、ある種の受容体及び／又はリガンドに特異的な一次抗体から選択される。他の実施形態では、検出プローブは、ＣＤ４５ＬＣＡに特異的な一次抗体である。いくつかの実施形態では、検出プローブは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（アリゾナ州ツーソン）から入手可能であり、ＣＯＮＦＩＲＭ抗ＣＤ４５、ＬＣＡ（ＲＰ２／１８）（白血球の膜に位置する抗原に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧＩ））という商品名で入手可能な抗ＣＤ４５ＬＣＡ一次抗体である。

いくつかの実施形態では、試料は、少なくともリンパ球マーカの存在に対して染色される。リンパ球マーカには、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８が挙げられる。一般に、ＣＤ３はＴ細胞の「ユニバーサルマーカ」である。いくつかの実施形態では、更なる分析（染色）を行って、特異的な型のＴ細胞、例えば、制御性、ヘルパ、又は細胞傷害性Ｔ細胞の同定を行う。例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＣＤ８バイオマーカ（ＣＤ８は細胞傷害性Ｔリンパ球の特異的マーカである）に対して陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球であるとして、更に区別され得る。ＣＤ３＋Ｔ細胞はまた、パーフォリン（パーフォリンとは細胞傷害性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞の細胞質顆粒で発現する膜分解タンパク質である）に対して陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球としても区別され得る。細胞傷害性Ｔ細胞は、実際に腫瘍細胞を「殺す」エフェクタ細胞である。これらは直接接触して消化酵素グランザイムＢを腫瘍細胞の細胞質に導入し、それによって腫瘍細胞を殺すと考えられている。同様に、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３バイオマーカに対して陽性の制御性Ｔ細胞として更に区別され得る。ＦＯＸＰ３は制御性Ｔ細胞の最も特異的なマーカである核内転写因子である。同様に、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＣＤ４バイオマーカに対して陽性であるヘルパＴ細胞として更に区別され得る。

上記を考慮して、いくつかの実施形態では、均質化試料は、ヘマトキシリン及びエオシン染色によって検出されるように、少なくともＣＤ３又は総リンパ球を含む１つ以上の免疫細胞マーカについて染色され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ８（細胞傷害性Ｔリンパ球のマーカ）、ＣＤ４（ヘルパＴリンパ球のマーカ）、ＦＯＸＰ３（調節性Ｔリンパ球のマーカ）、ＣＤ４５ＲＡ（ナイーブＴリンパ球のマーカ）、及びＣＤ４５ＲＯ（メモリＴリンパ球のマーカ）などの少なくとも１つの更なるＴ細胞特異的マーカもまた含まれ得る。具体的な一実施形態では、ヒトＣＤ３（又はＨ＆Ｅ染色で検出される総リンパ球）及びヒトＣＤ８を含む少なくとも２つのマーカが使用される。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞、例えばＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞は、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ２８、及びＣＤ５７を含む種々のバイオマーカによって更に区別され得る。このように、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、それらの同定のための様々なリンパ球バイオマーカ（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３）、及び更なる分化のための更なるバイオマーカ（ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＰＤ－Ｌ１等）のうちの少なくとも１つで染色される。

細胞集団のゲーティング

組織試料からの細胞、核、及び／若しくは小組織凝集体の分離に続いて、又はより具体的には、均質化（工程３００）並びに細胞、核、及び／若しくは小組織凝集体の染色（工程３１０）に続いて、細胞、核、及び／又は小組織凝集体が、フローサイトメトリ分析のために提供される。いくつかの実施形態では、試料は、電子的又は仮想的に選別される（図１の工程１２０；図３の工程３２０及び工程３３０）。

いくつかの実施形態では、均質化試料（例えば、免疫細胞、腫瘍細胞、上皮細胞を含む全腫瘍から解離した全細胞の集団）からのフローサイトメトリのデータは、分析される不均一な細胞集団の性質に起因して、「低品質」であると考えられる。分析された細胞のこの不均一な集団は、フローサイトメトリのデータにおいて「典型的」であるとして異なる集団において「組織化」されない、異なるサイズ及び顆粒性を有する細胞からなる。フローサイトメトリ分析は、主にドットプロット上の別個の細胞集団の観察に基づいているので、均質化試料からのデータは、別個の細胞集団を定義することができず「奇妙」に見えると考えられる。小細胞についてゲーティングを行う場合、より均質な細胞集団（例えば、類似のサイズ及び粒度を有し、ドットプロット上で異なる集団をもたらす免疫細胞）を分析することができ、その結果、データは従来のフローサイトメトリのデータ（例えば、別個の集団）により類似して見えるようになり、免疫細胞集団の特定の亜集団の染色による蛍光の増加は、描写することがより容易となり得る。このゲーティングはデータを変化させず、すなわち、フローサイトメトリのユーザが慣れ親しんだ方法でデータを描写するだけである。ゲーティングプロセスにより、試料中の全細胞の混合物を分析しても、特定の細胞集団（例えば、免疫細胞）を見ることができるようになる。したがって、得られる選択された細胞集団は、サイズ及び粒度においてより均質であり、フローサイトメトリのデータプロット上で別個の細胞集団として提示される。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞又は核の均質化混合物が、最初にサイズに基づいてゲーティングされ（一次ゲーティング）（工程２００）て、第１のサイズ範囲又は予測細胞型を有する細胞又は核の第１の集団を提供し、次いで、少なくともバイオマーカの発現に基づいて、２度目のゲーティングをされ（二次ゲーティング）（工程２１０）ることによる、ゲーティングスキームを提供する。一次及び／又は二次ゲーティングはそれぞれ１回又は複数回実施することができる。

いくつかの実施形態では、一次ゲーティングは、前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）特性に基づいて、１つ以上の細胞集団を識別するために実施される。前方散乱及び側方散乱により、それぞれ細胞のサイズ及び粒度の推定が得られる考えられるが、これは、試料、レーザの波長、試料及びシース流体の収集角及び屈折率などのいくつかの因子に応じ得る。いくつかの実施形態では、細胞集団を識別することは、細胞型が１つしか存在しない細胞株についてはより直接的であり得るが（図５Ａ参照）、均質化組織試料におけるような複数の細胞型が存在する試料についてはより複雑であり得る。すなわち、均質化試料における細胞の不均質性は、フローサイトメトリのデータの質を有意に低下させる（図５Ａと図５Ｂとを比較されたい）。図５Ａ及び図５Ｂは染色された試料を示し、一方で、図６Ａ及び図６Ｂは前方散乱対側方散乱を示す（マーカを示さず）。

均質化試料が腫瘍試料に由来する実施形態において、当業者は、均質化試料が腫瘍細胞の集団及び免疫細胞などの他の細胞の集団を含むであろうことを認識するであろう。出願人は、そのような細胞集団が物理選別され得ることを以前に示した（その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０５８８０９号を参照のこと）。当業者は、散乱に基づくゲーティング戦略が、腫瘍細胞集団中のそれらの細胞を、均質化試料内に存在する他の集団中におけるそれらの細胞からデジタル選別するために利用され得ることを理解するであろう。

いくつかの実施形態では、そのような一次ゲーティング戦略は、特定の予測サイズ範囲（例えば、約３μｍ～約６μｍのサイズ）又は予測細胞型（例えば、免疫細胞）を有する細胞の選択を可能にする。いくつかの実施形態では、第２のサイズ（例えば、１２μｍより大きいサイズである腫瘍細胞）及び第２のサイズ（例えば、１２μｍより小さいサイズである免疫細胞）を有する細胞の相対的な比率は、異なる集団が推定又は予測されるであろう密度プロットの領域にゲートを配置することによって決定及び／又は定量化されることができる。例えば、均質化腫瘍試料内の異なるタイプの免疫細胞の割合を決定することが所望される場合、操作者は、腫瘍細胞とは異なる免疫細胞の特性、例えば、免疫細胞と腫瘍細胞との間のサイズ差を考慮する一次ゲーティングトレースを選択することができる。

図６の二パラメータ密度プロットに示されるように、一次ゲーティング戦略（工程２００又は工程３３０）は、前方散乱及び側方散乱に基づいて、腫瘍細胞を含む大細胞から小細胞が分離され得るように選択され得る。図６に示すように、比較的小さな免疫細胞は、ＦＳＣ対ＳＳＣの二パラメータ密度プロット上のゲート（試料の他の細胞と比較して免疫細胞の物理的性質を推定するゲート）をトレースすることによって、均質化腫瘍試料に両方とも存在する大腫瘍細胞からデジタル的に分離されることができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞が腫瘍細胞よりも比較的小さいことを考慮すると、前方散乱軸上のゲートトレースの上限は、一次ゲーティング後に生成される細胞集団がより小さい免疫細胞で富化されるように選択される（図４の工程４００を参照されたい）。同様に、免疫細胞が腫瘍細胞よりも複雑性が低く、したがって粒度が低いことを考慮すると、側方散乱の上限は、腫瘍細胞と比較して顆粒性が低下したそれらの細胞に富む集団を提供するように選択される（図４の工程４１０を参照されたい）。

上記の例における一次ゲーティングが免疫細胞の集団（すなわち、均質化試料中の腫瘍細胞からデジタル的に分離された免疫細胞）を適切に予測したことを確認するために、同じマーカ（ＣＤ３）について同じ試料（大細胞及び小細胞集団）に由来する２つの異なる細胞集団に対してのＦＳＣ対バイオマーカ染色強度のプロットを作成した。図８Ａは、一次ゲーティング後に戻された予測免疫細胞集団における細胞の存在を示す、ＦＳＣ対ＣＤ３バイオマーカ染色の密度プロットを提供する。対照試料は、ＣＤ３を標的とする抗体による染色が存在しない各集団について、比較的に説明される。同様に、図８Ｂは、一次ゲーティング後に戻された予測腫瘍細胞集団における細胞の存在を示す、ＦＳＣ対ＣＫ８／１８腫瘍バイオマーカ染色の密度プロットを提供する。再び、対照試料はＣＫ８／１８腫瘍バイオマーカを標的とする抗体による染色が存在しない各集団について、比較的に説明される。図８Ａ及び図８Ｂを比較することによって、ゲーティング戦略が、細胞のサイズに基づいて免疫細胞集団を適切に予測することが明らかである。

サイズ及び／又は粒度に基づいて、不均一な均質化腫瘍試料に由来する細胞集団を予測する際の一次ゲーティングの有用性は、図７で更に例示されており、これは、単一の均質化試料上で実行される５つの異なるゲートトレース（標識１、２、３、４、及び５）を示す。各ゲートトレース、すなわちトレース１、２、３、４、及び５は、散乱に基づいて異なる特性を有する異なる細胞集団を提供するように選択された。この特定の例では、異数性、すなわち異常な数の染色体の存在を有する可能性が高いトレースに基づいてゲートが選択された。このような異常細胞が腫瘍細胞である可能性が高く、したがって大きいということを知っていたので、ゲート４及び５をトレースして、大細胞を豊富に含む集団を得た。細胞の０．６４％のみが異数性を有したゲートトレース１（免疫細胞などの小細胞を持つと予測される）と比較して、ゲートトレース４及び５で作製した亜集団における細胞の１３．２２％及び８．８９％が異数性を有した。トレース２及び３のそれぞれ２．１４％及び２．３２％の細胞は、ゲート１のために選択されたトレースと比較してより高い粒度を有するそれらの細胞を包含すると予測されるトレース選択に基づいて、異数性を有した。ここで、異数性を有する細胞が最も多い亜集団を捕捉するための最適なゲートは、異数性を有する細胞の特徴であると考えられていた高い粒度及び大きな細胞サイズを考慮した、ゲート４であった。出願人は、前方散乱及び側方散乱に基づく一次ゲーティングが、実施例３に記載されるような腫瘍マーカ（例えば、ＣＫ８／１８）の存在に基づく一次ゲーティングよりも、異数性の良好な推定を提供することを示した。

いくつかの実施形態では、二次ゲーティング（工程２１０又は工程２４０）は、一次ゲーティング中に同定された細胞集団内から特定の細胞型の発現パターンを決定するために実施される。これは、バイオマーカの数が増加した場合は特に有用である考えられる。例えば、連続する二次ゲーティング（工程３５０、破線で示す）を多重アッセイにおいて使用して、均質化試料において異なるバイオマーカを発現する特定の細胞亜集団を同定することができる。いくつかの実施形態では、各二次ゲーティングは、一次ゲーティング工程の後に同定された第１の細胞集団における前方散乱（ＦＳＣ）対バイオマーカ染色強度の二パラメータ密度プロットにトレースを適用することによって実行される。

一例として、リンパ球は、前方散乱及び側方散乱に基づいて一次ゲーティングを行うことによって同定され得る（図６を参照のこと）。第１の二次ゲーティングを行って、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を同定及び定量することができる（図９Ａ）。第２及び第３の二次ゲーティングを、同様に、ＣＤ４及びＣＤ８の発現に基づいてＣＤ３陽性Ｔ細胞を分化させるために行ってもよい（図９Ｂ～図９Ｃを参照のこと）。この特定の例では、３つの二次ゲーティングを実施し、特定の強度カットオフを有するトレースを適用して、ＣＤ３、ＣＤ８、及びＣＤ４バイオマーカのそれぞれを発現するそれらの亜集団を同定する。各亜集団についてのバイオマーカ発現の割合はまた、二次ゲーティング後にも決定され得る。図１０は、異なる患者試料からの均質化試料に由来するＣＤ８陽性免疫細胞の割合の生成を図示する。いくつかの実施形態では、このタイプのデータは、単一細胞に解離された全腫瘍試料からの異なるマーカの発現を定量的に測定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、これらの発現レベルは、患者の診断、予後、及び治療状態と相関させることができた。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリは、ＩＨＣと比較してより定量的であり、多重化に適している。いくつかの実施形態では、全腫瘍が分析されるという事実は、腫瘍の不均質性の増加を説明しすることができ、そしてより良好な相関を提供し得る。出願人は、本発明の方法によって取得されたそのようなデータが、実施例１に記載されるような実際の物理選別法から取得されたデータと良好に比較することを示した。

いくつかの実施形態では、各マーカについて同一又は異なるゲートが、フローサイトメトリ実施間の変動性に応じて選択される。次いで、陽性細胞を同定するのに役立つゲートが選択される（対照に存在せず、試料にのみ表れた細胞）。いくつかのプロセスでは、コンピュータによって実装されたアルゴリズムを用いてプロセスが自動化される。

上記の原理は、他の型の免疫細胞を同定及び／又は定量するために、並びに任意の集団又は亜集団内の更に別の亜集団を同定するために、他のバイオマーカに拡張され得る。例えば、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＡバイオマーカの相対的発現は、ＣＤ４及びＣＤ８集団に基づいて、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８＋ナイーブ細胞、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ２８＋メモリ細胞、及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８－エフェクタ細胞を同定するために使用され得る。この原理は、更に追加のマーカによって続けることができる。

上記の同定された方法は、分化マーカのクラスタを発現する細胞の量又は相対量を定量することに限定されない。いくつかの実施形態では、上述の方法は、異なる患者におけるある型の免疫細胞の割合を決定するために、並びに例えば、（ｉ）それらの患者が例えば特定のタイプの治療から利益を得るかどうかを決定するために、又は（ｉｉ）腫瘍の進行及び／若しくは治療を監視するために、適用され得る。他の実施形態では、本開示の方法は、実施例２に記載されるように、２つ以上のバイオマーカの発現又はバイオマーカの発現と、染色体異常との間の新しい相関を同定するために利用され得る。

実施例１－物理選別とデジタル選別との比較

物理選別プロセスの結果を本明細書に記載される方法によるデジタルゲーティング方法の結果と比較した。物理的に選別された小細胞をＣＤ３マーカ（全ホモジネート由来の小細胞）について分析した。小細胞（免疫細胞）は、予想通りＣＤ３マーカを発現した（別々かつ異なるＣＤ３集団（陽性細胞７３．７１％）を示す、図１１のパネルＢを参照されたい）。全体として、図１１は、物理選別法及びデジタル選別法が同様の結果をもたらすことを示す。解離した腫瘍からの全ての細胞をＣＤ３及びＤＡＰＩについて染色し、フローサイトメトリによって分析し、小細胞（免疫）をゲーティングした。これを図１１のパネルＡに示す。ゲーティングとは、混合した細胞集団内のとある集団（本明細書では免疫細胞）を調べる方法である。解離した腫瘍からの全ての細胞をＤＡＰＩのみについて染色し、次いでフローサイトメトリによって分析した。小細胞（免疫細胞）を選別し（細胞混合物から物理的に分離）、ＣＤ３について染色し、次いでフローサイトメトリによって再度分析した。データを図１１のパネルＡに示す。両方の場合の割合も、分析された集団内の陽性細胞の割合を表す。図１１のパネルＡの場合、分析された集団は選別した細胞（純粋試料）であるため、割合は極めて高かった。図１１のパネルＢの場合、分析された試料は、より純度の低い小細胞集団にゲーティングされたため（いくつかの大細胞は分析された集団において方法が見つかる場合がある）、割合はより低かった。図１１のパネルＣは、ゲーティング又は選別を伴わない同じ細胞混合物の分析を図示する。データの質はより悪かった（塗抹の低割合である不明瞭な陽性細胞集団）。

実施例２－ＣＤ８＋として同定された細胞と異数性との相関

腫瘍異数性及び腫瘍浸潤リンパ球は異なるがん種で逆比例すると考えられている。腫瘍ホモジネート及びフローサイトメトリを使用して、異数性及び腫瘍浸潤リンパ球の両方について試料を分析し、同じ相関を認めた。例えば、本明細書に記載の技術に従って、同じ全腫瘍を均質化し、フィルタにかけた。次いで、解離した細胞のアリコートを、ＣＤ３の存在又はＣＤ３について染色し、ＤＡＰＩ（２－（４－アミジノフェニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボキサミジン）でもまた染色した。染色された試料はフローサイトメトリ分析のために提供され、得られたデータは異数性（ＤＡＰＩから）及びマーカ（ＣＤ３又はＣＤ８）について分析された。試料プロセスを、異なるがん種、例えば肺がん及び結腸がんに対して繰り返した。腫瘍異数性及び腫瘍浸潤リンパ球は、異なるがん種で反比例することが再び観察された

実施例３－散乱に基づく一次ゲーティングとバイオマーカ発現に基づく一次ゲーティングとの比較

図７は前方及び側方サイズを示すドットプロットを提供する（サイズ対粒度）。プロット上の異なる位置を分析した場合、異数性はサイズ及び粒度と共に増加することが観察されたが、これは腫瘍細胞が異数体細胞より比較的大きくか粒度が大きいために予想された。ＣＫ８／１８染色対前方散乱を示すドットプロットを用いる以外は、同じ分析も実施した（図１３）。大細胞は予想通り異数体が多いと決定され、ＣＫ８／１８もまた異数体が多いと予想された。また、ＣＫ８／１８陽性と考えられる小細胞（図１３の右下４分の１）は、ほとんど異数体を有さず、非腫瘍細胞である可能性が高いことを意味していたので、サイズはＣＫ８／１８よりも更に優れた腫瘍細胞の予測因子であることが決定された。全ての大細胞（ＣＫ８／１８陽性又は陰性）は、腫瘍細胞であることを意味する異数性がより高かった。図７及び図１３の両方は、サイズについての適切なゲーティングが、腫瘍バイオマーカについての染色の必要なしに、細胞を腫瘍又は免疫として規定するのに充分であったことを確認する。

本明細書中で言及される及び／又は出願データシートにおいてリスト化される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、及び刊行物の概念を使用して更に別の実施形態を提供するように修正することができる。

本開示は、いくつかの例示的な実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の原理の精神及び範囲内に含まれるであろう多くの他の変更及び実施形態が当業者によって考案されることができることを理解されたい。より具体的には、合理的な変形及び変更は、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、及び添付の特許請求の範囲内の主題の組合せ構成の構成部品及び／又は配置において可能である。構成部品及び／又は配置の変形及び変更に加えて、代替の使用法も当業者にとって明らかであろう。

Claims (16)

1. １つ以上のバイオマーカを発現する細胞の割合を定量する方法であって、
   均質化試料を提供するために全腫瘍試料を均質化することと、
   前記１つ以上のバイオマーカの存在に対して前記均質化試料中の細胞を染色することと、
   サイズ及び粒度散乱に基づく前記均質化試料中の前記細胞の少なくとも第１の一次ゲーティングを実行して、第１の予測細胞型を有する少なくとも第１の細胞集団を提供することと、
   前記第１の細胞集団内の第１の亜集団中の前記１つ以上のバイオマーカの１番目を発現する細胞の第１の割合を決定することと、
   前記１つ以上のバイオマーカの２番目を発現する前記第１の細胞集団内の第２の亜集団中の第２の細胞の割合を更に決定することと、を含み、前記１つ以上のバイオマーカの前記１番目及び２番目が異なる、方法。
2. 前記方法が、少なくとも第１の細胞亜集団中の第１の細胞の割合を決定する前に、物理選別工程を必要としない、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の予測細胞型が、免疫細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記免疫細胞が、約１２μｍ未満のサイズである、請求項３に記載の方法。
5. 前記１つ以上のバイオマーカの前記１番目を発現する前記第１の亜集団中の第１の細胞の割合が、前記１つ以上のバイオマーカの前記１番目の存在に基づき前記第１の亜集団中における前記細胞の二次ゲーティングを行うことによって決定される、請求項３に記載の方法。
6. 前記１つ以上のバイオマーカの前記１番目が、分化バイオマーカのＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ４５ＲＯクラスタからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記１つ以上のバイオマーカの前記２番目が、分化マーカのクラスタである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記１つ以上のバイオマーカのうちの前記２番目が、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＤ２８、ＣＤ５７、及びＦＯＸＰ３からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記１つ以上のバイオマーカの前記１番目が、ＣＤ３であり、前記１つ以上のバイオマーカの前記２番目が、調節性Ｔ細胞、ヘルパＴ細胞、又は細胞傷害性Ｔ細胞として前記免疫細胞を分化させるバイオマーカである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記均質化試料中の前記細胞の第２の一次ゲーティングを実行して、第２の予測細胞型を有する少なくとも第２の細胞集団を提供することを更に含む、請求項６に記載の方法。
11. 前記第２の予測細胞型が、腫瘍細胞である、請求項１０に記載の方法。
12. 染色体異常を有する前記第２の細胞集団内の細胞の第３の割合を決定することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記染色体異常を有する前記決定された第３の細胞の割合を、前記１つ以上のバイオマーカの前記１番目を発現する細胞の前記決定された第１の割合と相関させることを更に含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記均質化試料が、染色の前に更に処理され、前記更なる処理が、前記均質化試料内のタンパク質を消化すること、前記均質化試料を加熱すること、又は前記均質化試料をフィルタにかけることの少なくとも１つを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記１つ以上のバイオマーカの前記１番目を発現する前記第１の亜集団中の前記決定された細胞の割合に部分的に基づいて治療決定を行うことを更に含む、請求項１に記載の方法。
16. １つ以上のバイオマーカを発現する細胞の割合を定量する方法であって、
    前記１つ以上のバイオマーカの存在に対して試料中の細胞を染色することと、
    サイズ及び粒度散乱に基づく前記試料中の前記細胞の少なくとも第１の一次ゲーティングを実行して、第１の予測細胞型を有する少なくとも第１の細胞集団を提供することと、
    前記第１の細胞集団内の第１の亜集団中の前記１つ以上のバイオマーカの１番目を発現する細胞の第１の割合を決定することと、
    前記１つ以上のバイオマーカの２番目を発現する前記第１の細胞集団内の第２の亜集団中の第２の細胞の割合を更に決定することと、を含み、前記１つ以上のバイオマーカの前記１番目及び２番目が異なる、方法。

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