WO2018016656A1 - 骨髄異形成症候群の診断方法 - Google Patents

骨髄異形成症候群の診断方法 Download PDF

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清行 緒方
由美 山元
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Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing myelodysplastic syndrome using a CD33 expression level ratio between granulocytes and CD34 positive cells as an index, a kit for the diagnostic method, and the like.
  • MDS Myelodysplastic syndromes
  • cytopenia leukopenia, anemia, thrombocytopenia due to decreased neutrophils
  • morphological abnormalities 3
  • blasts increase in the bone marrow by more than 20%, making them indistinguishable from acute myeloid leukemia on examination (see “ Say leukemia).
  • MDS inspection findings are diverse. Diagnosis is easy when the bone marrow contains more than 5% blasts or when characteristic cells called cyclic iron blasts can be demonstrated in the bone marrow. However, about half of the MDSs have less than 5% blasts (hereinafter referred to as “low grade MDS”), and no cyclic iron blasts are observed. Diagnosis is also easy when abnormalities characteristic of MDS are detected by chromosome analysis of bone marrow cells by G-staining method (hereinafter referred to as “chromosome analysis”), but such abnormalities are 30% of low-grade MDS. It is only seen in the patients around.
  • Flow cytometry is a method for analyzing characteristics such as expression of cell surface proteins, and is used for diagnosis of acute leukemia and malignant lymphoma.
  • FCM flow cytometry
  • Several groups including the present inventors have attempted to use FCM for diagnosis of MDS (Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • diagnosis is easy if MDS has many blasts, but in the case of low grade MDS, diagnosis with high accuracy is difficult.
  • the known FCM parameters alone have a low diagnostic sensitivity, while the combined use of a number of FCM parameters has the disadvantage of reducing specificity.
  • the inventors have intensively studied and found that the ratio of the expression level of CD33 between granulocytes and CD34 positive cells is useful as a novel parameter for MDS diagnosis. Furthermore, it has been found that a more sensitive diagnosis is possible by combining this parameter with a known parameter.
  • the present invention relates to the following (1) to (8).
  • (1) A method for evaluating the possibility of myelodysplastic syndrome in a subject using the ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells in bone marrow fluid isolated from the subject as an index.
  • (2) When the CD33 expression level ratio between granulocytes and CD34 positive cells is less than the cut-off value, the subject is evaluated as having a high possibility of suffering from myelodysplastic syndrome, (1 ), Wherein the cut-off value is 1.5 to 3.5.
  • the ratio of CD33 expression between granulocytes and CD34 positive cells is less than the cutoff value, and the ratio of CD34 positive myeloblasts, CD34 positive immature B cells, granulocyte SSC, and CD34 positive myeloblasts
  • the subject is evaluated as having a high possibility of suffering from myelodysplastic syndrome, and the cut-off value is 1.5 to 3
  • the method according to (1) which is .5.
  • CD33 expression ratio between granulocytes and CD34 positive cells, CD34 positive myeloblast ratio, CD34 positive immature B cell ratio, granulocyte SSC, and CD45 expression of CD34 positive myeloblasts were scored, respectively,
  • a diagnostic kit for myelodysplastic syndrome comprising an anti-CD34 antibody, an anti-CD33 antibody, and an anti-CD45 antibody.
  • the method of the present invention is excellent in diagnostic sensitivity and specificity, and can differentially diagnose MDS more easily than the conventional diagnostic method using four parameters.
  • the method of the present invention can be differentially diagnosed with higher specificity by combining with the conventional parameters, and therefore can be applied to the diagnosis of low grade MDS, which has been difficult to diagnose conventionally. .
  • FIG. 1-1 shows an outline of gating of a bone marrow cell population.
  • FIG. 1-2 shows an outline of gating of a bone marrow cell population.
  • FIG. 1-3 shows an outline of gating of the bone marrow cell population.
  • Figures 1-4 show an overview of gating of bone marrow cell populations.
  • Fig. 1-5 shows an outline of gating of bone marrow cell population.
  • Figures 1-6 show an overview of bone marrow cell population gating.
  • FIG. 2 shows the results of differentiation between MDS and benign cytopenias when “the ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells” is used as a parameter.
  • the vertical axis indicates “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells” (left: MDS, right: non-clonal cytopeia (benign blood cell reduction)).
  • FIG. 3 shows the results of differentiation between MDS and benign cytopenia using the conventional four parameters.
  • the vertical axis indicates the “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells”, and the numbers indicate the number / number of populations showing abnormal values (left: MDS, right: Non-clonal cytopeia (benign cytopenia)). ).
  • FIG. 4 shows the results of differentiation between MDS and benign cytopenias when “CD34-positive myeloblast ratio” and “SSC of granulocytes” are used as parameters.
  • the vertical axis represents a score based on two parameters, and the number represents the number / population number indicating a score of 2 or more (left: MDS, right: Non-clonal cytopeia (benign cytopenia)).
  • FIG. 5 shows the results of differentiation between MDS and benign cytopenias when “CD33 expression ratio between granulocytes and CD34 positive cells”, “CD34 positive myeloblast ratio” and “SSC of granulocytes” are used as parameters. Show.
  • the vertical axis represents a score based on three parameters, and the number represents the number / population number indicating a score of 2 or more (left: MDS, right: Non-clonal cytopeia (benign cytopenia)).
  • FIG. 6 shows the results of differentiation between MDS and benign cytopenias by scoring of the present invention (method of Example (V)).
  • FIG. 7 shows the results of differentiation between MDS and benign cytopenias by scoring of the present invention (method of Example (V)).
  • Myelodysplastic syndrome to be diagnosed in the present invention is one of the hematopoietic malignant tumors in which hematopoietic cells that have become tumors proliferate in the bone marrow, and abnormal blood cell formation (dysplasia) This name is used because it recognizes cytopenia. Because MDS often transitions to acute myeloid leukemia (it has been proposed that acute myeloid leukemia is diagnosed when myeloblasts exceed 20%), it is sometimes referred to as a preleukemic condition.
  • MDS is refractory anemia, ironblastic refractory anemia, refractory cytopenia with multicytic dysplasia, and ironblastic refractory anemia with multicytic dysplasia, depending on the ratio of bone marrow and blasts, etc. , Increased blast refractory anemia, 5q-syndrome, unclassifiable myelodysplastic syndrome. Unless otherwise specified, all of these are included when referring to MDS in the present invention.
  • Diagnosis of myelodysplastic syndrome uses peripheral blood and bone marrow blast ratio, bone marrow cell dysplasia, gene abnormality, genome analysis, diagnosis by flow cytometry, but conventional methods use MDS, In particular, it is difficult to differentially diagnose low grade MDS with less than 5% blasts with high sensitivity and specificity such as benign cytopenia.
  • the specimen (sample) used in the present invention is a bone marrow fluid of a subject, that is, a subject who may have a myelodysplastic syndrome.
  • Bone marrow fluid is collected by bone marrow puncture according to a conventional method, and if necessary, an appropriate amount of an anticoagulant is added and diluted with a buffer solution or a medium.
  • the bone marrow fluid required for one measurement is at least 0.5 to 1 ml, preferably 1 to 2 ml.
  • the number of nucleated cells is counted, and a sample for measurement is preferably prepared so that the number is preferably 100 to 500,000 per test tube.
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • the “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells” can be measured, for example, by the following procedure (FIG. 1). 1) All nucleated cells obtained by removing cell debris from the bone marrow fluid sample are developed with FSC and SSC, and the whole cells are gated (Gate 1). Here, FSC (Forward Scatter) indicates the size of the cell, and SSC (Side Scatter) indicates the intracellular complexity. 2) Gating a cell group having a low SSC value among the cells of (Gate 1) (Gate 2). 3) The cells of (Gate 2) are expanded with CD45 and CD34, and the CD34 positive cell fraction is gated (Gate 3). CD34 positive cells can be identified, for example, using control staining.
  • Cells of (Gate 1) are expanded with CD45 expression and SSC, and a lymphocyte population is gated (Gate 8).
  • Cells of (Gate 8) are expanded with CD33 expression and SSC, and a CD33 negative population is cast (Gate 9).
  • the cells of (Gate 1) are expanded with CD45 expression and SSC, the CD34 positive cells (Gate 4) are back gated, and the mature granulocytes are gated so that immature cells are not mixed with reference to this. (Gate 10).
  • the mode value of the SSC of the cell of (Gate 10) is obtained, and granulocytes showing an SSC below this Mode value are gated (Gate 11).
  • the Mode value is the most existing value in the data, and can be obtained using a normal FCM analysis program. In the case of flow cytometry, the Mode value indicates a peak value and is not affected by abnormal data than the average value.
  • the “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells” is calculated from, for example, the cells gated as described above as “(Gate 11) CD33 expression level of cells ⁇ (Gate 4) CD33 expression level of cells”. It can be obtained (expression amount is geometric average).
  • CD34-positive myeloblast ratio “CD34-positive immature B cell ratio”, “SSC of granulocytes”, and “CD45 expression of CD34-positive myeloblasts” Diagnosis is performed using as an index (parameter).
  • the sensitivity and specificity can be further improved by combining these parameters with a novel parameter “CD33 expression level ratio between granulocytes and CD34 positive cells”.
  • the “CD34-positive myeloblast ratio” can be determined as “(Gate 7) cell number / (Gate 1) cell number”.
  • the “CD34-positive immature B cell ratio” can be determined as “(Gate 6) number of cells / (Gate 4) cells”.
  • SSC of granulocytes can be obtained as “Mode value of cells of (Gate 10) / Mode value of (Gate 9) cells”.
  • CD45 expression of CD34-positive myeloblasts can be determined as “(Gate 9) CD45 expression level of cells / (Gate 7) CD45 expression level of cells” (expression level is geometric mean).
  • various parameters can be measured by flow cytometry using antibodies specific for CD34, CD45, and CD33 antigens.
  • flow cytometry cells suspended in a fluid are guided to the sensing zone one by one, and the fluorescence and scattered light are measured in the single flow to quantitatively analyze a large number of cells one by one in a short time. It is a possible cell measurement method.
  • Imaging cytometry cells on multi-well plates and slide glasses are laser-scanned to obtain fluorescent images, scattered light, and transmitted light images, and image processing is performed, so that one large number of cells can be obtained in a short time. It is a cell measurement method that can be quantitatively analyzed one by one.
  • Method 1 Diagnosis Using Novel Parameters
  • the subject's likelihood of suffering from myelodysplastic syndrome is evaluated using the “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells” as an index. For example, when the value of the “CD33 expression level ratio between granulocytes and CD34 positive cells” is less than the cut-off value, it is evaluated that the subject is likely to have myelodysplastic syndrome.
  • the cut-off value can be set according to the target sensitivity and specificity, but in the case of the “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells”, it is usually in the range of 1.5 to 3.5 (ie 1.5 ⁇ 3.5 or more is judged as normal). In Examples to be described later, the evaluation was performed with the cut-off value set to 2.2.
  • Method 2 Diagnosis using a combination of new parameters and conventional parameters (1)
  • the “CD33 expression ratio between granulocytes and CD34 positive cells” is changed to “CD34 positive myeloblast ratio”, “CD34 positive immature B cell ratio”, “SSC of granulocytes”, and “CD34 positive myeloblasts”.
  • the subject's likelihood of suffering from myelodysplastic syndrome is evaluated. Thereby, sensitivity and diagnostic specificity can be improved.
  • the “ratio of CD33 expression between granulocytes and CD34 positive cells” is less than the cut-off value, and the “CD34 positive myeloblast ratio”, “CD34 positive immature B cell ratio”, “SSC of granulocytes”, When two or more of “CD34 expression of CD34-positive myeloblasts” are abnormal, the subject is evaluated as having a high possibility of having myelodysplastic syndrome.
  • abnormality means that each parameter indicates a value that deviates from the cutoff value (see Ogata K. et al., Haematologica. 94 (8), 1066-1074, 2009).
  • the cut-off value is usually in the range of 2 to 3 for “CD34 positive myeloblast ratio” (normally less than 2 to 3), and is usually 5 to 8 for “CD34 positive immature B cell ratio”. (5 to 8 or more is normal).
  • the stricter cutoff value is usually 1 to 3, and this stricter cutoff value is more specific in evaluating the possibility of myelodysplastic syndrome. Lower.
  • granulocyte SSC it is usually in the range of 6-7 (6-7 or more is normal), and in the case of “CD34 expression of CD34-positive myeloblasts”, it is usually in the range of 4-8 ( This parameter is normal within this range).
  • CD34-positive myeloblast ratio is 2.3 or more
  • CD34-positive immature B cell ratio is less than 5
  • SSC of granulocytes If it indicates less than 7, “CD45 expression of CD34-positive myeloblasts” can be determined as “abnormality is observed” if it indicates 7.7 or more or less than 5.
  • Method 3 Diagnosis by combination of new parameters and conventional parameters
  • the “proportion of myelodysplastic syndrome” in a subject can be determined by combining the “CD33 expression ratio between granulocytes and CD34 positive cells” with “CD34 positive myeloblast ratio” and / or “SSC of granulocytes”. evaluate. For example, when the “CD33 expression level ratio between granulocytes and CD34 positive cells” is less than the cut-off value and “CD34 positive myeloblast ratio” and / or “SSC of granulocytes” are abnormal, The subject is assessed as likely to have myelodysplastic syndrome. Note that “abnormality is recognized” means as described in (2) above.
  • Method 4 Diagnosis by combination of new parameters and conventional parameters (3)
  • the new parameter and the conventional parameter are measured, and the result is scored, and then the possibility of suffering from myelodysplastic syndrome is evaluated.
  • the scoring is determined as follows, taking into account the correlation between the deviation from the cutoff value and myelodysplastic syndrome. Therefore, the following cut-off value does not completely coincide with the above-described cut-off value indicating a normal value in relation to the weighting due to the correlation with myelodysplastic syndrome.
  • the scoring used in the examples described later is shown below. 1) 3 points when the “CD33 expression level ratio between granulocytes and CD34 positive cells” is less than 2.2, 2) 3 points when the “CD34 positive myeloblast ratio” is 2.3 or more, 3) 2 points when the “CD34-positive immature B cell ratio” is less than 2, 1 point when it is less than 5, 4) 2 points when “SSC of granulocytes” is less than 7, 5) 2 points when “CD45 expression of CD34-positive myeloblasts” is 7.7 or more, 1 point when it is less than 5.
  • the possibility of suffering from myelodysplastic syndrome is, for example, that the total of the above points is 7 points or more, the total is 5 to 6 points, and the CD34 positive myeloblast ratio or granulocyte SSC is abnormal, or the total is When an abnormality is observed in the CD33 expression level ratio between granulocytes and CD34 positive cells at 4 points or less, the subject is evaluated as having a high possibility of suffering from myelodysplastic syndrome.
  • the present invention also provides a diagnostic kit for the myelodysplastic syndrome described above.
  • the kit of the present invention comprises (i) anti-CD45 antibody, (ii) anti-CD33 antibody, and (iii) CD34 antibody as essential components. These antibodies may be labeled with an appropriate fluorescent dye or the like.
  • kit of the present invention may contain various reagents necessary for measurement, secondary antibodies, substrate solutions, instructions, etc. in addition to the above-described components.
  • Diagnosis system and analysis software The diagnosis method of the present invention can be automated in whole or in part, and the present invention also includes such a myelodysplastic syndrome diagnosis system and diagnostic analysis software for the system. provide.
  • the diagnostic system of the present invention is a system for diagnosing myelodysplastic syndrome and includes flow cytometry and a computer, and executes the following means 1) to 12) or, if desired, further 13).
  • the analysis software of the present invention includes a program for causing the system (flow cytometry and computer) of the present invention to execute the above means 1) to 12) or further 13) if desired.
  • the present invention enables diagnosis of MDS, particularly differential diagnosis between low-grade MDS and benign cytopenias.
  • the present invention can also be used for MDS prognosis prediction, treatment effect prediction, treatment effect determination, and the like.
  • the subject's possibility of suffering from MDS is evaluated, and the subject is determined to have a high possibility of having MDS.
  • a series of treatment strategies is provided that can determine an appropriate treatment method and determine / predict the treatment effect and prognosis.
  • Such a method for treating MDS including diagnosis is also a subject of the present invention.
  • erythropoietin erythropoietin
  • azacitidine bitaza
  • lenalidomide lenalidomide
  • anticancer agents such as cytarabine
  • immunosuppressants such as cyclosporine, or hematopoietic stem cell transplantation
  • Methods and materials (I) Preparation of cells 1) Bone marrow is aspirated into a syringe containing heparin by bone marrow puncture. 2) Count nucleated cells and dispense 100,000 to 500,000 cells per tube into two tubes. 3) Stain with CD45-PerCP, CD33-PE, CD34-APC (fluorescently labeled monoclonal antibodies against human CD45, human CD33, human CD34, respectively) for 15-30 minutes. 4) A hemolytic agent is allowed to act to hemolyze red blood cells. 5) Suspend in phosphate buffer. 6) Analyze by flow cytometry (FCM).
  • FCM flow cytometry
  • FCM analysis 1 Gating of cell population
  • a cell population is gated to analyze parameters such as antigen expression.
  • 11 types of cell populations were gated by the method shown in FIG.
  • special measures were taken for gating.
  • the parameter “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34-positive cells” of the present invention it is necessary to reliably gate granulocytes.
  • a cell plot developed with SSC and CD45 expression is used.
  • SSC is plotted on a logarithmic scale
  • non-cellular components with a high SSC value are mixed into granulocytes with a high SSC value, and the average value of the expression level of CD33 becomes inaccurate.
  • gating limited to SSC low-value granulocytes (Gate 11) was performed. And the reproducibility of gating was ensured by defining the SSC low value as “below the SSC mode value”.
  • CD33 expression of CD34 positive cells (Gate 3) is displayed, particles with CD33 expression of 0 or less are observed. If these particles are mixed in the CD34 positive cells, the average value of the CD33 expression level of the CD34 positive cells is erroneously low. Therefore, by setting Gate 4 excluding these particles, the CD33 expression level of CD34 positive cells was accurately quantified.
  • Gate 1 total nucleated cells
  • Gate 4 CD34 positive cells
  • Gate 6 CD34 positive immature B cells
  • CD34 positive bone marrow CD34 positive bone marrow.
  • Systemic immature cells (Gate 7) myeloblasts are the main constituents and are called CD34 positive myeloblasts for convenience), lymphocytes (Gate 9), granulocytes (Gate 10), SSC low-value granulocytes (Gate) 11).
  • Parameter calculation Parameters invented this time Parameter name: Ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells Calculation method: CD33 expression level of Gate 11 cells * ⁇ CD33 expression level of Gate 4 cells * * The expression level is an example of a known parameter used in combination using a geometric mean [GeoMean]
  • Calculation method Gate 6 cell count ⁇ Gate 4 cell count
  • Granulocyte SSC Calculation method: Mode value of Gate 10 cells / mode value of Gate 9 cells
  • Parameter name: CD45 expression of CD34-positive myeloblasts Calculation method: CD45 expression level of Gate 9 cells * ⁇ CD45 expression level of Gate 7 cells * * The expression level uses geometric mean [GeoMean]
  • the new parameter “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells” alone is considered to have diagnostic value equivalent to the conventional method (Ogata score).
  • FIG. 6 shows the diagnostic procedure using this score and the discrimination result.
  • 14 cases showed 7 points or more, all of which were MDS.
  • Eighteen cases showed 5-6 points, 10 of which were abnormal in “CD34-positive myeloblast ratio” or “SSC of granulocytes”, all of which were MDS.
  • 39 cases were 4 points or less, and 5 cases were abnormal in “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells”, 4 of which were MDS and 1 case of benign cytopenia.
  • FIG. 7 summarizes the diagnostic procedure using different subject groups and the discrimination results.
  • Subjects were 23 low-grade MDS patients (excluding RARS and high-grade MDS) and 23 benign cytopenias.
  • Nine of these subjects scored more than 7 points, all of which were MDS.
  • 8 cases showed 5-6 points, all of which had abnormalities in “CD34 positive myeloblast ratio” or “SSC of granulocytes”, all of which were MDS.
  • 29 cases were 4 points or less, 3 of which were abnormal in “ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34 positive cells”, of which 3 were MDS and 0 were benign cytopenias.
  • the present invention can differentially diagnose MDS diagnosis, particularly low-grade MDS and benign cytopenia. Therefore, the present invention is useful for diagnosis and treatment of MDS.

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Abstract

本発明は、診断感度と特異度に優れ、かつ簡便なＭＤＳの診断方法に関する。具体的には、被験者から単離された骨髄液における、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標として、前記被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する方法、ならびに前記評価方法のためのキット等に関する。

Description

骨髄異形成症候群の診断方法
［関連出願］
　本出願は、日本特許出願２０１６−１４１９９６（２０１６年７月２０日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
［技術分野］
　本発明は、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標とした骨髄異形成症候群の診断方法、前記診断方法のためのキット等に関する。
　骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ［ＭＤＳ］）は、高齢者に多発する造血細胞の悪性腫瘍である。その特徴として、１）血球減少（好中球が減少することによる白血球減少、貧血、血小板減少）を起こし、２）顕微鏡検査を行うと、末梢血や骨髄の細胞に形の異常（形態異常＝異形成）があり、３）しばしば、特に病後期に、芽球と呼ばれる未熟な細胞が骨髄中で２０％以上に増加し、検査上では急性骨髄性白血病と区別できない状態となる（これを「白血病化」と言う）。
　ＭＤＳを診断するためには、血球減少を示す患者に骨髄検査（骨髄細胞の採取）を行い、骨髄細胞における異形成を証明した上で、他の異形成を起こしうる疾患（ビタミンＢ１２欠乏やアルコール性造血障害など）を除外する必要がある。しかしながら、異形成の証明は観察者の主観に左右され、再現性に乏しいという欠点がある。また、正常高齢者にも一定の異形成を認めることがあり、診断に苦慮することが多い。
　ＭＤＳの検査所見は多様である。骨髄で芽球が５％を超えている場合や、環状鉄芽球と呼ばれる特徴的な細胞が骨髄で証明できる場合は、診断は容易である。しかしＭＤＳの半数前後は、芽球が５％未満（以下、「低グレードＭＤＳ」と言う）であり、さらに環状鉄芽球も認めない。また、Ｇ分染法による骨髄細胞の染色体分析（以下、「染色体分析」と言う）で、ＭＤＳに特徴的な異常を認める場合も診断は容易であるが、こうした異常は低グレードＭＤＳの３０％前後の患者に見られるにすぎない。
　フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）は、細胞の表面蛋白の発現などの特徴を解析する方法であり、急性白血病や悪性リンパ腫などの診断に用いられている。本発明者を含むいくつかのグループが、ＦＣＭをＭＤＳの診断に用いる試みを行っている（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。しかしＦＣＭを用いる場合でも、芽球が多いＭＤＳであれば診断は容易であるが、低グレードＭＤＳの場合は確度の高い診断は難しい。既知のＦＣＭパラメーターでは、単独では診断感度が低く、一方、数多くのＦＣＭパラメーターを併用すると特異度が低下するという欠点がある。
特開２００５−３７３４３号 特開２００５−２２１３２３号
Ｂｏｒｏｗｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ　１００，５３４−５４０，１９９３ Ｏｇａｔａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９４（８），１０６６−１０７４，２００９
　本発明は、診断感度と特異度に優れ、かつ簡便なＭＤＳの新規な診断方法を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するために鋭意検討し、発明者らは、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がＭＤＳ診断の新規なパラメーターとして有用であることを見出した。さらに、このパラメーターを既知のパラメーターと組み合わせることで、より感度の高い診断が可能となることを見出した。
　すなわち、本発明は以下の（１）~（８）に関する。
（１）被験者から単離された骨髄液における、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標として、前記被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する方法。
（２）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満である場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、（１）に記載の方法であって、前記カットオフ値が１．５~３．５である方法。
（３）さらに、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現から選ばれるいずれか１又は２以上を指標として、骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価することを特徴とする、（１）に記載の方法。
（４）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現のうち２つ以上の指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５~３．５である、（１）に記載の方法。
（５）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率及び／又は顆粒球のＳＳＣの指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５~３．５である、（１）に記載の方法。
（６）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現をそれぞれ点数化し、その合計値によって被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する（１）に記載の方法：例えば、
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は１．５~３．５である；
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」がカットオフ値以上である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は２~３である；
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が第１のカットオフ値未満である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は１~３であり、前記第２のカットオフ値は４~８である；
４）「顆粒球のＳＳＣ」がカットオフ値未満である場合に２ポイント、但し前記カットオフ値は６~７である；
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が第１のカットオフ値以上である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は６~８であり、前記第２のカットオフ値は４~６である；
　とした場合に、その総計が７ポイント以上か、総計が５~６ポイントでＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常が認められるか、あるいは総計が４ポイント以下で顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、（１）に記載の方法。
（７）フローサイトメトリー又はイメージングサイトメトリーを用いて各指標の測定が行われる、（１）~（６）のいずれかに記載の方法。
（８）抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３３抗体、及び抗ＣＤ４５抗体を含む、骨髄異形成症候群の診断用キット。
　本発明の方法は、診断感度と特異度に優れ、４つのパラメーターを用いた従来の診断方法よりも簡便にＭＤＳを鑑別診断することができる。また、本発明の方法は、従来のパラメーターと組合せることで、より高い特異度でＭＤＳを鑑別診断することができ、それゆえ従来診断が困難であった低グレードのＭＤＳの診断にも適用できる。
図１−１は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。 図１−２は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。 図１−３は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。 図１−４は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。 図１−５は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。 図１−６は、骨髄細胞集団のゲーティングの概略を示す。 図２は、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」をパラメーターに用いた場合のＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。図中、縦軸は「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を示す（左：ＭＤＳ、右：Ｎｏｎ−ｃｌｏｎａｌ　ｃｙｔｏｐｅｉａ（良性血球減少））。 図３は、従来の４つのパラメーターを用いた場合のＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。図中、縦軸は「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」、数字は異常値を示した数／母集団数を示す（左：ＭＤＳ、右：Ｎｏｎ−ｃｌｏｎａｌ　ｃｙｔｏｐｅｉａ（良性血球減少））。 図４は、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び「顆粒球のＳＳＣ」をパラメーターに用いた場合のＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。図中、縦軸は２つのパラメーターによるスコア、数字はスコア２以上を示した数／母集団数を示す（左：ＭＤＳ、右：Ｎｏｎ−ｃｌｏｎａｌ　ｃｙｔｏｐｅｉａ（良性血球減少））。 図５は、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」と、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び「顆粒球のＳＳＣ」をパラメーターに用いた場合のＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。図中、縦軸は３つのパラメーターによるスコア、数字はスコア２以上を示した数／母集団数を示す（左：ＭＤＳ、右：Ｎｏｎ−ｃｌｏｎａｌ　ｃｙｔｏｐｅｉａ（良性血球減少））。 図６は、本発明のスコアリング（実施例（Ｖ）の方法）によるＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。 図７は、本発明のスコアリング（実施例（Ｖ）の方法）によるＭＤＳと良性血球減少の鑑別結果を示す。
１．骨髄異形成症候群
　本発明の診断対象となる「骨髄異形成症候群」とは、腫瘍化した造血細胞が骨髄中で増殖する、造血器悪性腫瘍の一つであり、血球形成の異常（異形成）と血球減少を認めることからこの名称が用いられる。ＭＤＳはしばしば急性骨髄性白血病に移行する（骨髄芽球が２０％を超えると急性骨髄性白血病と診断されることが提案されている）ため、前白血病状態と呼ばれることもある。
　ＭＤＳは、骨髄と芽球の割合等により、不応性貧血、鉄芽球性不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、多血球異形成を伴う鉄芽球性不応性貧血、芽球増加型不応性貧血、５ｑ−症候群、分類不能型骨髄異形成症候群に分類することができる。特記しない限り、本発明においてＭＤＳと言う場合にはこれらのすべてが含まれる。
　骨髄異形症候群の診断には、末梢血と骨髄の芽球比率、骨髄細胞の異形成のほか、遺伝子異常、ゲノム解析、フローサイトメトリーによる診断が利用されているが、従来の方法では、ＭＤＳ、とくに芽球が５％未満の低グレードＭＤＳを、良性血球減少等と高い感度と特異性で鑑別診断することは困難である。
２　検体・試料（骨髄液、骨髄細胞）
　本発明で使用される検体（試料）は、被験者、すなわち骨髄異形成症候群の罹患可能性がある対象の骨髄液である。骨髄液は、常法にしたがい骨髄穿刺により採取し、必要であれば適当量の抗凝固剤を加え、緩衝液あるいは培地で希釈する。１回の測定に必要な骨髄液は、少なくとも０．５~１ｍｌ、好ましくは１ｍｌ~２ｍｌである。採取した骨髄液は、有核細胞の数をカウントし、好ましくは１試験管あたり１０~５０万個となるように測定用サンプルを調製する。
３　測定対象・測定方法
３．１　新規パラメーター
　本発明では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を指標（パラメーター）とすることで、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する。
　「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」は、たとえば、以下の手順で測定することができる（図１）。
１）骨髄液サンプルから細胞の破片を除いた全有核細胞をＦＳＣとＳＳＣで展開し、この細胞全体をゲーティングする（Ｇａｔｅ　１）。ここで、ＦＳＣ（前方散乱：Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｓｃａｔｔｅｒ）は細胞の大きさを、ＳＳＣ（側方散乱：Ｓｉｄｅ　Ｓｃａｔｔｅｒ）は細胞内の複雑さを示す。
２）（Ｇａｔｅ　１）の細胞のうち、ＳＳＣ低値の細胞群をゲーティングする（Ｇａｔｅ　２）。
３）（Ｇａｔｅ　２）の細胞をＣＤ４５とＣＤ３４で展開し、ＣＤ３４陽性細胞画分をゲーティングする（Ｇａｔｅ　３）。ＣＤ３４陽性細胞は、コントロール染色を用いるなどして、特定することができる。
４）（Ｇａｔｅ　３）の細胞のＣＤ３３発現を解析し、ＣＤ３３発現が０未満のもの（細胞ではない小粒子）を除外し、細胞のみをゲーティングする（Ｇａｔｅ　４）。
５）（Ｇａｔｅ　４）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性細胞をゲーティングする（Ｇａｔｅ　５）。
６）（Ｇａｔｅ　４）の細胞（赤）と（Ｇａｔｅ　５）の細胞（青）を重ねて表示し、ＳＳＣ低値かつＣＤ４５比較的低値の細胞集団をゲーティングする（Ｇａｔｅ　６）。
７）（Ｇａｔｅ　４）の細胞から（Ｇａｔｅ　６）の細胞を除いた細胞集団をゲーティングする（Ｇａｔｅ　７）。
８）（Ｇａｔｅ　１）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、リンパ球集団をゲーティングする（Ｇａｔｅ　８）。
９）（Ｇａｔｅ　８）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性の集団をケーティングする（Ｇａｔｅ　９）。
１０）（Ｇａｔｅ　１）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ　４）をバックゲートし、これを参考にしながら、未熟細胞が混入しないように、成熟顆粒球をゲーティングする（Ｇａｔｅ　１０）。
１１）（Ｇａｔｅ　１０）の細胞のＳＳＣのＭｏｄｅ値を求め、このＭｏｄｅ値以下のＳＳＣを示す顆粒球をゲーティングする（Ｇａｔｅ　１１）。なお、Ｍｏｄｅ値とは、データの中でもっとも多く存在する値で、通常のＦＣＭ解析プログラムを用いて求めることができる。フローサイトメトリーの場合、Ｍｏｄｅ値はピーク値を示し、平均値より異常データの影響を受けない。
　「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」は、たとえば、上記のようにゲーティングされた細胞から、「（Ｇａｔｅ　１１）細胞のＣＤ３３発現量÷（Ｇａｔｅ　４）細胞のＣＤ３３発現量」として求めることができる（発現量は幾何平均）。
３．２　従来のパラメーター
　従来のＭＤＳの診断方法では、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」、「顆粒球のＳＳＣ」、及び「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」を指標（パラメーター）として診断を行う。本発明はこれらのパラメーターに、新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を組み合せて用いることで、さらにその感度と特異性を向上させることができる。
　上記各パラメーターは、たとえば、上述のようにゲーティングされた細胞から、次のようにして求めることができる。
　「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」は、「（Ｇａｔｅ　７）細胞数／（Ｇａｔｅ　１）細胞数」として求めることができる。
　「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」は、「（Ｇａｔｅ　６）細胞数／（Ｇａｔｅ　４）細胞」として求めることができる。
　「顆粒球のＳＳＣ」は、「（Ｇａｔｅ　１０）の細胞のＭｏｄｅ値／（Ｇａｔｅ　９）細胞のＭｏｄｅ値」として求めることができる。
　「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」は、「（Ｇａｔｅ　９）細胞のＣＤ４５発現量／（Ｇａｔｅ　７）細胞のＣＤ４５発現量」として求めることができる（発現量は幾何平均）。
３．３　測定手段
　本発明において、各種パラメーターの測定は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３３抗原に特異的な抗体を使用して、フローサイトメトリーにより測定することができる。フローサイトメトリーは、流体に懸濁させた細胞を１個ずつセンシングゾーンに導き、その単一の流れにおいて、蛍光や散乱光を測定することで、多量の細胞を短時間に１個ずつ定量解析できる細胞測定法である。
　フローサイトメトリーに代えて、イメージングサイトメトリーを用いて測定することもできる。イメージングサイトメトリーは、マルチウェルプレートやスライドグラス上の細胞を、レーザー走査して、その蛍光イメージや散乱光・透過光イメージを取得し、画像処理することにより、多量の細胞を短時間に１個ずつ定量解析できる細胞測定法である。
４．診断方法（罹患可能性の評価方法）
　本発明では、新規パラメーターを用いた４つの診断方法（ＭＤＳの罹患可能性の評価方法）を提供する。
（１）方法１：新規パラメーターによる診断
　方法１では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を指標として被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。
　例えば、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」の値がカットオフ値未満である場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。カットオフ値は、目的とする感度と特異度によって設定できるが、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」の場合、通常１．５~３．５の範囲にある（すなわち１．５~３．５以上を正常と判断する）。後述する実施例では、前記カットオフ値を２．２として評価を行った。
（２）方法２：新規パラメーターと従来のパラメーターの併用による診断（１）
　方法２では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」、「顆粒球のＳＳＣ」、及び「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」から選ばれるいずれか１又は２以上と組み合わせて被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。これにより、感度、診断特異度を向上させることができる。
　たとえば、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満であり、かつ、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」、「顆粒球のＳＳＣ」、及び「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」の２つ以上に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。
　ここで、「異常が認められる」とは、各パラメーターがカットオフ値を逸脱した値を示すことを意味する（Ｏｇａｔａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９４（８），１０６６−１０７４，２００９参照）。カットオフ値は、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」の場合、通常２~３の範囲にあり（２~３未満を正常とする）、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」の場合は通常５~８の範囲にある（５~８以上を正常とする）。後者の場合、さらに厳しいカットオフ値は通常１~３であり、この厳しいカットオフ値は、骨髄異形成症候群の罹患可能性の評価をする上で、より特異性が高いが、逆に感度は低くなる。「顆粒球のＳＳＣ」の場合、通常６~７の範囲にあり（６~７以上を正常とする）、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」の場合、通常４~８の範囲にある（このパラメーターについては、この範囲内を正常とする）。
　たとえば、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」であれば、２．３以上を示す場合、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」であれば、５未満を示す場合、「顆粒球のＳＳＣ」であれば、７未満を示す場合、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」であれば、７．７以上あるいは５未満を示す場合には、「異常が認められる」と判断できる。
（３）方法３：新規パラメーターと従来のパラメーターの併用による診断（２）
　方法３では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び／又は「顆粒球のＳＳＣ」と組み合わせて被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。
　例えば、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満であり、かつ、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び／又は「顆粒球のＳＳＣ」に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。なお、「異常が認められる」とは、上記（２）に記載したとおりの意味である。
（４）方法４：新規パラメーターと従来のパラメーターの併用による診断（３）
　方法４では、新規パラメーターと従来のパラメーターをそれぞれ測定し、その結果を点数化したうえで、被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。
　点数化は、前記カットオフ値からの逸脱と骨髄異形成症候群との相関を加味して、たとえば次のように決定される。したがって、骨髄異形成症候群との相関による重みづけとの関係で、下記のカットオフ値は前述した正常値を示すカットオフ値とは完全に一致してはいない。
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は１．５~３．５である；
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」がカットオフ値以上である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は２~３である；
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が第１のカットオフ値未満である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は１~３であり、前記第２のカットオフ値は４~８である；
４）「顆粒球のＳＳＣ」がカットオフ値未満である場合に２ポイント、但し前記カットオフ値は６~７である；
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が第１のカットオフ値以上である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は６~８であり、前記第２のカットオフ値は４~６である。
　一例として、後述する実施例で使用した点数化を以下に示す。
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」が２．２未満である場合に３ポイント、
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」が２．３以上である場合に３ポイント、
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が２未満である場合に２ポイント、５未満である場合に１ポイント、
４）「顆粒球のＳＳＣ」が７未満である場合に２ポイント、
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が７．７以上である場合に２ポイント、５未満である場合に１ポイント。
　骨髄異形成症候群の罹患可能性は、たとえば、上記点数の総計が７ポイント以上か、総計が５~６ポイントでＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常が認められるか、あるいは総計が４ポイント以下で顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。
５．診断用試薬・キット
　本発明は、上記した骨髄異形成症候群の診断用キットも提供する。本発明のキットは、（ｉ）抗ＣＤ４５抗体、（ｉｉ）抗ＣＤ３３抗体、及び（ｉｉｉ）ＣＤ３４抗体を必須の構成要素とする。これらの抗体は適当な蛍光色素等で標識されていてもよい。
　また、本発明のキットは、上記した構成要素のほか、測定に必要な各種試薬、二次抗体、基質溶液、説明書等を含んでいてもよい。
６．診断システム、解析ソフト
　本発明の診断方法は、その全部または一部を自動化することが可能であり、本発明は、そのような骨髄異形成症候群の診断システム、前記システムのための診断解析ソフトも提供する。
　本発明の診断システムは、骨髄異形成症候群の診断用システムであって、フローサイトメトリー及びコンピュータを含み、下記の１）~１２）の手段、あるいは所望によりさらに１３）の手段を実行する。
１）骨髄液サンプルから細胞の破片を除いた全有核細胞をＦＳＣとＳＳＣで展開し、この細胞全体をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ　１）。
２）（Ｇａｔｅ　１）の細胞のうち、ＳＳＣ低値の細胞群をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ　２）。
３）（Ｇａｔｅ　２）の細胞をＣＤ４５とＣＤ３４で展開し、ＣＤ３４陽性細胞画分をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ　３）。
４）（Ｇａｔｅ　３）の細胞のＣＤ３３発現を解析し、ＣＤ３３発現が０未満のもの（細胞ではない小粒子）を除外し、細胞のみをゲーティングする手段（Ｇａｔｅ　４）。
５）（Ｇａｔｅ　４）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性細胞をケーティングする手段（Ｇａｔｅ　５）。
６）（Ｇａｔｅ　４）の細胞（赤）と（Ｇａｔｅ　５）の細胞（青）から、ＳＳＣ低値かつＣＤ４５比較的低値の細胞集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ　６）。
７）（Ｇａｔｅ　４）の細胞から（Ｇａｔｅ　６）の細胞を除いた細胞集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ　７）。
８）（Ｇａｔｅ　１）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、リンパ球集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ　８）。
９）（Ｇａｔｅ　８）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性の集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ　９）。
１０）（Ｇａｔｅ　１）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ　４）をバックゲートし、これを参考にしながら、未熟細胞が混入しないように、成熟顆粒球をケーティングする手段（Ｇａｔｅ　１０）。
１１）（Ｇａｔｅ　１０）の細胞のＳＳＣのＭｏｄｅ値を求め、このＭｏｄｅ値以下のＳＳＣを示す顆粒球をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ　１１）。
１２）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を「（Ｇａｔｅ　１１）細胞のＣＤ３３発現量／（Ｇａｔｅ　４）細胞のＣＤ３３発現量」として計算する手段。
１３）所望により、さらに「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」＝「（Ｇａｔｅ　７）細胞数／（Ｇａｔｅ　１）細胞数」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」＝「（Ｇａｔｅ　６）細胞数／（Ｇａｔｅ　４）細胞数」、「顆粒球のＳＳＣ」＝「（Ｇａｔｅ　１０）の細胞のＭｏｄｅ値／（Ｇａｔｅ　９）細胞のＭｏｄｅ値」、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」＝「（Ｇａｔｅ　９）細胞のＣＤ４５発現量／（Ｇａｔｅ　７）細胞のＣＤ４５発現量」のうち１又は２以上を計算する手段（発現量は幾何平均）。
　本発明の解析ソフトウェアは、本発明のシステム（フローサイトメトリー及びコンピュータ）に、上記１）~１２）の手段、あるいは所望によりさらに１３）の手段を実行させるためのプログラムを含む。
７．骨髄異形成症候群の治療戦略
　本発明は、ＭＤＳの診断、とくに低グレードのＭＤＳと良性血球減少等との鑑別診断を可能とする。本発明は、ＭＤＳの診断に加えて、ＭＤＳの予後予測、治療の効果予測、治療効果の判定等にも利用できる。
　本発明の方法（診断方法）、キット、あるいはシステム（解析ソフト）を使用することで、被験者のＭＤＳの罹患可能性を評価し、被験者がＭＤＳである可能性が高いと判定された被験者には、適切な治療方法を決定し、その治療効果や予後を判定・予測することができるという一連の治療戦略が提供される。そのような、診断を含むＭＤＳの治療方法も、本発明の対象である。
　ＭＤＳの治療方法としては、エリスロポイエチン、アザシチジン（ビターザ）、レナリドミド（レブラリド）の投与のほか、シタラビンなどの抗がん剤投与、シクロスポリンなどの免疫抑制剤投与、あるいは造血幹細胞移植が挙げられる。
　以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．方法と材料
（Ｉ）細胞の準備
１）骨髄穿刺で、ヘパリン入りのシリンジに骨髄液を吸引する。
２）有核細胞をカウントし、試験管あたり１０−５０万個の細胞を、２本の試験管に分注する。
３）ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ，ＣＤ３３−ＰＥ，ＣＤ３４−ＡＰＣ（それぞれ、蛍光標識されたヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ３４に対するモノクローナル抗体）で１５−３０分間染色する。
４）溶血剤を作用させ、赤血球を溶血させる。
５）リン酸緩衝液に浮遊させる。
６）フローサイトメトリー（ＦＣＭ）で解析する。
（ＩＩ）ＦＣＭ解析
１）細胞集団のゲーティング
　ＦＣＭ解析では、細胞集団をゲーティングして抗原発現などのパラメーターを解析する。本実施例では、図１に示した方法で１１種類の細胞集団をゲーティングした。また解析の再現性を確保するため、ゲーティングにも特別な工夫を行った。
　本発明のパラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」では、顆粒球を確実にゲーティングする必要がある。このゲーティングには、ＳＳＣとＣＤ４５発現で展開した細胞プロットを用いるが、ＳＳＣを対数目盛でプロットすると、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞などの未熟細胞との分離が困難となるため、等分目盛でプロットする。一方、等分目盛でプロットした場合、ＳＳＣ高値の顆粒球に、ＳＳＣ高値の非細胞成分が混入し、ＣＤ３３発現量の平均値は不正確となる。これを回避するため、ＳＳＣ低値顆粒球（Ｇａｔｅ　１１）に限定したゲーティングを行った。そして、ＳＳＣ低値を「ＳＳＣ　ｍｏｄｅ値以下」と定義することで、ゲーティングの再現性を担保した。
　また、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ　３）のＣＤ３３発現を表示した場合、ＣＤ３３発現が０以下の粒子が認められる。ＣＤ３４陽性細胞にこれらの粒子が混在したままでは、ＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量の平均値は誤って低値となる。そこで、この粒子を除外したＧａｔｅ　４を設定することで、ＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量を正確に定量した。
　ゲーティングした１１種類の細胞集団の中で、パラメーターの計算に用いるものは、全有核細胞（Ｇａｔｅ　１）、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ　４）、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞（Ｇａｔｅ　６）、ＣＤ３４陽性骨髄系未熟細胞（（Ｇａｔｅ　７）骨髄芽球が主な構成成分であり、便宜上ＣＤ３４陽性骨髄芽球と呼ぶ）、リンパ球（Ｇａｔｅ　９）、顆粒球（Ｇａｔｅ　１０）、ＳＳＣ低値顆粒球（Ｇａｔｅ　１１）、である。
２）パラメーターの算出
今回発明したパラメーター
　パラメーター名：顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比
　　算出法：Ｇａｔｅ　１１細胞のＣＤ３３発現量＊÷Ｇａｔｅ　４細胞のＣＤ３３発現量＊
　　＊発現量は幾何平均［ＧｅｏＭｅａｎ］を用いる
併用する既知のパラメーター例
　パラメーター名：ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率
　　算出法：Ｇａｔｅ　７細胞数÷Ｇａｔｅ　１細胞数
　パラメーター名：ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率
　　算出法：Ｇａｔｅ　６細胞数÷Ｇａｔｅ　４細胞数
　パラメーター名：顆粒球のＳＳＣ
　　算出法：Ｇａｔｅ　１０細胞のｍｏｄｅ値÷Ｇａｔｅ　９細胞のｍｏｄｅ値
　パラメーター名：ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現
　　算出法：Ｇａｔｅ　９細胞のＣＤ４５発現量＊÷Ｇａｔｅ　７細胞のＣＤ４５発現量＊
　　＊発現量は幾何平均［ＧｅｏＭｅａｎ］を用いる
（ＩＩＩ）被験者
１）低グレードＭＤＳ患者３４例（ＲＡＲＳ、ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ　ＭＤＳは除いた）
２）臨床現場でＭＤＳと鑑別が必要である、血球減少を来す良性疾患の患者（以降、良性血球減少と表記）３７例
２．結果と考察
（Ｉ）新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」の値について、２．２未満をカットオフポイントにすることで、ＭＤＳと良性血球減少の鑑別が可能であった。このパラメーターを用いた場合、２６例が陽性（２．２未満）で、その内訳はＭＤＳ２２例、良性血球減少４例であった。すなわち診断感度は６４．７％、診断特異度は８４．６％であった（図２）。
（ＩＩ）既知の方法（４つのパラメーターを用い、２つ以上が陽性であった場合ＭＤＳと判断する方法、所謂Ｏｇａｔａ　ｓｃｏｒｅ）を用いた場合、３３例が陽性で、その内訳はＭＤＳ　２６例、良性血球減少７例であった。すなわち診断感度は７６．５％，診断特異度は７８．８％であった（図３）。
　以上から、新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」は単独で、従来の方法（Ｏｇａｔａ　ｓｃｏｒｅ）と同等の診断価値があると考えられる。
考察１：
　上記（Ｉ）（ＩＩ）の方法では、診断特異度８０％前後であるため、これをさらに向上させるため、特異性の高いパラメーターに限定して再度診断価値を検討した。
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の４つのパラメーターの中で、特異度の高いパラメーターは「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」と「顆粒球のＳＳＣ」である。この２つが陽性を示したのは８例で、その内訳はＭＤＳ８例、良性血球減少０例であった。すなわち診断感度は２３．５％，診断特異度は１００％であった（図４）。
（ＩＶ）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」と「顆粒球のＳＳＣ」に新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を加えた場合、いずれか２つが陽性を示したのは２０例で、その内訳はＭＤＳ　２０例、良性血球減少０例であった。すなわち診断感度は５８．８％，診断特異度は１００％であった（図５）。
考察２
　新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を従来のパラメーターと併用することで、従来の方法より診断的価値の高いＦＣＭ診断検査を構築することが可能である。
（Ｖ）新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を従来のパラメーターと併用する上で、（ＩＶ）とは異なった方法の例を示す。
　各パラメーターが異常値を示した場合、以下の様にポイントを付与し、各患者ｄａｔａのスコアを計算する。「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」が２．３以上に３ポイント、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が２未満に２ポイント、５未満に１ポイント、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が７．７以上に２ポイント、５未満に１ポイント、「顆粒球のＳＳＣ」が７未満に２ポイント、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」が２．２未満に３ポイント。
　図６にこのスコアを用いた診断手順と鑑別結果を記載した。１４例が７ポイント以上を示し、その全てがＭＤＳであった。１８例が５−６ポイントを示し、うち１０例が「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」あるいは「顆粒球のＳＳＣ」に異常があり、その全てがＭＤＳであった。３９例が４ポイント以下であり、うち５例が「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」に異常があり、その内訳はＭＤＳ４例、良性血球減少１例であった。
　すなわち、「７ポイント以上」、「５−６ポイントを示し、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常がある」、あるいは「４ポイント以下で、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常がある」を用いた場合、診断感度は８２．４％，診断特異度は９６．６％であった。
　さらに、異なった被験者群を用いて、（Ｖ）の方法でＭＤＳの診断を行った。図７に異なった被験者群を用いた診断手順と鑑別結果をまとめて示す。被験者は低グレードＭＤＳ患者２３例（ＲＡＲＳ、ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ　ＭＤＳは除いた）、良性血球減少２３例である。これらの被験者の中で９例が７ポイント以上を示し、その全てがＭＤＳであった。また、８例が５−６ポイントを示し、その全例が「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」あるいは「顆粒球のＳＳＣ」に異常があり、その全てがＭＤＳであった。２９例が４ポイント以下であり、うち３例が「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」に異常があり、その内訳はＭＤＳ３例、良性血球減少０例であった。
　すなわち、この異なった被験者群を用いた解析では、「７ポイント以上」、「５−６ポイントを示し、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常がある」、あるいは「４ポイント以下で、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常がある」を用いた場合、診断感度は８７．０％、診断特異度は１００％であった。
考察３：
　新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を従来のＦＣＭパラメーターと併用することで、ＭＤＳを診断する上で、従来以上に実用的なレベルの感度、特異度を持つ検査を構築することができる。
　本発明は、ＭＤＳの診断、とくに低グレードのＭＤＳと良性血球減少とを鑑別診断することができる。それゆえ本発明は、ＭＤＳの診断及び治療に有用である。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims (8)

  1. 被験者から単離された骨髄液における、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標として、前記被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する方法。
  2. 顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満である場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法であって、前記カットオフ値が１．５~３．５である方法。
  3. さらに、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現から選ばれるいずれか１又は２以上を指標として、骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現のうち２つ以上の指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５~３．５である、請求項１に記載の方法。
  5. 顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率及び／又は顆粒球のＳＳＣの指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５~３．５である、請求項１に記載の方法。
  6. １）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は１．５~３．５である；
    ２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」がカットオフ値以上である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は２~３である；
    ３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が第１のカットオフ値未満である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は１~３であり、前記第２のカットオフ値は４~８である；
    ４）「顆粒球のＳＳＣ」がカットオフ値未満である場合に２ポイント、但し前記カットオフ値は６~７である；
    ５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が第１のカットオフ値以上である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は６~８であり、前記第２のカットオフ値は４~６である；
    　とした場合に、その総計が７ポイント以上か、総計が５~６ポイントでＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常が認められるか、あるいは総計が４ポイント以下で顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  7. 　フローサイトメトリー又はイメージングサイトメトリーを用いて各指標の測定が行われる、請求項１~６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３３抗体、及び抗ＣＤ４５抗体を含む、骨髄異形成症候群の診断用キット。
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