JP2005503169A - 薬物動態学に基づく細胞培養システムのためのデバイスおよび方法 - Google Patents
薬物動態学に基づく細胞培養システムのためのデバイスおよび方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
【0001】
(政府の権利に関する言及)
本発明は、少なくとも一部、National Aeronautics and Space Administrationからの助成番号NAG8−1372の下で支援を受けた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0002】
(発明の分野)
本発明の分野は、細胞培養デバイスおよびその使用方法である。
【背景技術】
【0003】
(発明の背景)
薬物動態学は、薬剤および他の生物学的に活性な化合物の、それらが体内に導入された時点から消滅するまでの動向の研究である。例えば、経口薬物についての一連の現象は、種々の粘膜表面からの吸収、血液流を通じた種々の組織への分散、肝臓および他の組織における生体内変換、標的部位での作用、および尿または胆汁における薬物または代謝物の排除を含み得る。薬物動態学は、生物学的系における化合物の代謝に取り組む合理的な手段を提供する。薬物動態学の等式およびモデルの概説については、例えば、PoulinおよびTheil(2000)J Pharm Sci.89(1):16−35;Slobら(1997)Crit Rev Toxicol.27(3):261−72;Haddadら(1996)Toxicol Lett.85(2)113−26:Hoang(1995)Toxicol Lett.79(1−3):99−106;Knaakら(1995)Toxicol Lett.79(1−3):87−98;ならびにBallおよびSchwartz(1994)Comput Biol Med.24(4):269−76を参照のこと。
【0004】
薬物、環境、栄養、消費者製品の安全性、および毒物学研究において研究者の直面する基本的な困難の1つは、代謝データの推定およびインビトロ細胞培養アッセイから動物への危険評価である。適切な薬物動態学原理の適用によりいくつかの結論が導かれ得るが、実質的な制限はなおも存在する。1つの関心は、現在のスクリーニングアッセイが、細胞を、それらの天然の設定でそれらの機能を複製しない条件下で使用することである。循環流、他の組織との相互作用、および生理学的応答と関連する他のパラメーターは、標準的な組織培養形式で見出されない。例えば、マクロ規模の細胞培養類似(CCA)系において、細胞は、チャンバの底で培養される。これらの系は、非生理学的な高い液体 対 細胞の比を有し、そして非現実的な細胞型の比(例えば、肝臓細胞 対 肺細胞の比)を有する。マクロ規模のCCA系の変形型において、細胞は、マイクロキャリアビーズ上で培養される。これらの系は、生理学的条件と非常に類似するが、それらは予測研究について十分に正確な生理学的条件を模倣しないのでなおも不十分である。従って、得られるアッセイデータは、動物において見出される薬物または毒素の曝露パターンに基づいていない。
【0005】
生物内では、濃度、時間、および代謝は相互作用し、薬物動態学的応答または毒物応答の強度および持続時間に影響する。例えば、肝臓機能のインビボでの存在は、薬物の代謝およびバイオアベイラビリティに強く影響を及ぼす。肝臓による活性薬物の排除は、生体内変換および排出により起こる。生体内変換反応としては、多くの化学的に多様な薬物を変換するチトクロムP450酵素により触媒される反応が挙げられる。第2生体内変換フェーズは、水溶性および腎臓を通じた迅速な排除を増加させるために、親水性基(例えば、グルタチオン、グルクロン酸、または硫酸塩)を付加し得る。
【0006】
生体内変換は有益であり得るが、それはまた、望ましくない結果を有し得る。毒性は、化合物と生物との間の複雑な相互作用から生じる。生体内変換プロセスの間に得られる代謝物は、親化合物よりも毒性であり得る。毒性スクリーニングについて大いに使用される単一細胞アッセイは、これらの複雑な細胞内効果および組織内効果を損なう。
【0007】
結果的に、潜在的薬剤に対するヒト応答性の正確な予測は、困難であり、しばしば信頼できないものであり、そして常に高価なものである。ヒト応答を予測する従来方法は、代替物(代表的には、静的な均質のインビトロ細胞培養アッセイまたはインビボ動物研究のいずれか)を使用する。インビトロ細胞培養アッセイは、薬物候補がヒト内で供される複雑な環境を正確に模倣せず、従って、ヒトの危険を正確に予測し得ないため、制限された価値しか有さない。同様に、インビボ動物試験は、インビトロ細胞ベースのアッセイから観察され得ないこれらの複雑な細胞内効果および細胞外効果を考慮し得るが、インビボ動物研究は、極めて高価であり、大きな労働力を要し、時間を消費し、そしてしばしば結果は、ヒトの危険に関する場合、疑いのある関連性を有する。
【0008】
Shulerらに対して発行された米国特許第5,612,188号は、複数コンパートメントの細胞培養システムを記載する。この培養システムは、大きなコンパートメント(例えば、培養チャンバ、センサ、およびポンプ)を使用し、多量の培養培地、細胞、試験化合物の使用を必要とする。この系は、使用するには非常に高価であり、そして使用するために大きな空間を必要とする。この系は、このように大規模であるので、生理学的パラメーターは、インビボ状態で見出されるパラメーターとは大きく異なる。このような大規模で生理学的に現実性のある条件を正確に生成するのは、不可能である。
【0009】
より良好な、より迅速な、そしてより効果的な、インビボ毒性および臨床的薬物性能の予測を提供し得る微小規模のスクリーニングアッセイおよびデバイスの開発は、多くの分野において大きな目的であり、そしてこのことが、本発明において取り組まれる。このような微小規模のデバイスは、生理学的に現実性のあるパラメーターを正確に生成し、そして試験される望まれるインビボ系をより綿密にモデル化する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0010】
(発明の要旨)
微小規模の細胞培養類似(CCA)デバイスのためのデバイス、インビトロ細胞培養物、および方法が提供される。本発明のデバイスは、薬物動態学的パラメーター値がインビボで見出される値と類似する条件下で、細胞をインビトロで維持することを可能にする。目的の薬物動態学的パラメーターとしては、細胞間の相互作用、液体滞留時間、液体 対 細胞の比、器官の相対的な大きさ、細胞による代謝、剪断応力などが挙げられる。細胞の天然の状態を模倣する薬物動態学に基づく培養システムを提供することにより、スクリーニングおよび毒性アッセイの予測値およびインビボでの関連性が増強される。
【0011】
微小規模培養デバイスは、別個であるが相互接続されたチャンバへと分離する流体網のチャネルを備える。この特定のチャンバのジオメトリは、細胞の相互作用、液体の流れ、および液体滞留のパラメーターを提供するよう設計され、これらのパラメーターは、インビボで対応する細胞、組織、または器官について見出されるパラメーターと相関する。流体工学は、循環系またはリンパ系の主要エレメントを正確に表現するよう設計される。1つの実施形態において、これらの要素は、チップ形式に統合される。これらのジオメトリのこの設計および確認は、生理学に基づく薬物動態学(PBPK)モデル(異なる組織を表す相互接続されたコンパートメントとして身体を表す数学的モデル)に基づく。
【0012】
このデバイスは、各培養チャンバに対して、適切な細胞を接種され得る。例えば、肝臓薬物動態学的パラメーターを提供するよう設計されたチャンバは、肝細胞を接種され、そして脂肪組織薬物動態学を提供するよう設計されたチャンバに接種された脂肪細胞と液体接続され得る。この結果は、例えば、組織の大きさの比、組織 対 血液の体積比、モデル化される動物の薬物滞留時間を正確に表現する薬物動態学に基づく細胞培養システムである。
【0013】
1つの実施形態において、系は、第1の微小規模培養デバイスおよび制御機器を備える。第1の微小規模培養デバイスは、培養培地との複数のインビボ相互作用を刺激するジオメトリを有する多くの微小規模チャンバを有する。ここで、各チャンバは、培養培地の流れのための入口および出口、ならびにこれらのチャンバと相互接続する微小流体チャネルを備える。制御機器は、第1の微小規模培養デバイスと接続され、そして第1の微小規模培養デバイスからデータを獲得し、そして、第1の微小規模培養デバイスの薬物動態学的パラメーターを制御するためのコンピューターを備える。
【0014】
別の実施形態において、コンピューターは、マイクロプロセッサ、汎用メモリ、不揮発性保存エレメント、1つ以上のセンサを有する微小規模培養デバイスに対するインターフェースを備える入力/出力インターフェース、およびコンピューターソフトウェアを備える。コンピューターソフトウェアは、センサからのデータを分析して微小規模培養デバイスの多くのチャンバにおける生理学的現象を測定し、微小規模デバイスのチャンバにおける培養培地の液体の流速を調節し、微小規模培養デバイスのチャンバにおける生物学的反応または毒物学的反応を検出し、そして検出の際に、微小規模培養デバイスの1つ以上の薬物動態学的パラメーターを変更するよう、マイクロプロセッサ上で実行可能である。
【0015】
本明細書中で使用する場合、単数形「a」および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の対象を含む。例えば、「化合物(a compound)」は、1つ以上のこのような化合物をいい、「細胞(the cell)」は、特定の細胞ならびに当業者に公知の他のファミリーのメンバーおよびそれらの等価物を含む。
【0016】
(実施形態の詳細な説明)
本発明者らは、微小規模の細胞培養類似(CCA)系を開発した。このような微小規模CCA系は、先行技術の微小規模系を上回る多くの利点を有する。この微小規模系は、より少量の試薬、より少数の細胞(培養細胞ではなく真性のプライマリー細胞の使用を可能にする)を使用し、より生理学的に現実的であり(例えば、滞留時間、器官比、剪断応力)であり、より低いデバイス費用を有し、そしてより小さいサイズである(複数の試験および統計学的分析に利用可能である)。さらに複数のバイオセンサが、同一チップ上に組み込まれ得る。
【0017】
簡単に言うと、本発明のチップは、動物全体またはヒト全体の正確なインビトロ代替物を提供する。このことを達成するために、初期設計を、生理学に基づく薬物動態学(P‘BPK)モデル(特定の器官に特異的な相互接続されたコンパートメントとして身体を表現する数学的モデル)を用いて作成した。PBPKモデルおよび公開された経験的データから、長期にわたる広範な開発プログラムにより、既知の組織サイズの比、組織 対 血液の体積比、薬物滞留時間、および動物全体またはヒト全体の他の重要な生理学的パラメーターを正確に模倣する微小規模デバイスを生成した。本質的に、本発明のチップ技術は、動物全体またはヒト全体の微小規模モデルである(ヒトについては、約1/100,000倍)。
【0018】
作動時には、このデバイスは、生存細胞を、異なる、相互接続された「器官」コンパートメントに分離することにより、再循環性多器官系を複製する(例えば、図15を参照のこと)。流体工学は、循環系の主要エレメントおよび器官系の相互作用が正確に模倣されるように設計される。各器官コンパートメントは、対応する器官全体の主要機能(例えば、肝臓による生体異物代謝)を模倣するよう注意深く選択または操作された特定の細胞型を含む。この細胞型は、接着性または非接着性であり得、そして標準的な細胞培養株またはプライマリー組織に由来する。ヒト細胞は、ヒトの代替物または適切な場合、他の種由来の細胞のために使用される。
【0019】
器官コンパートメントは、「血液代替物」として作用する再循環培養培地により接続される。培地中の試験試薬は分散され、そしてヒト身体または動物全体におけるのと同様に器官コンパートメント中の細胞と相互作用する。種々の細胞型に対するこれらの化合物および/またはそれらの代謝物の効果は、鍵となる生理学的現象(例えば、細胞死、細胞増殖、分化、免疫応答、または代謝経路またはシグナル伝達経路における摂動)を測定またはモニタリングすることにより検出される。さらに、薬物動態学的データは、薬物代謝についての培養培地のアリコートを収集および分析することにより決定され得る。
【0020】
本発明の微小規模チップデバイスは、伝統的な細胞培養アッセイの費用およびスループットの利点、ならびにまた、動物モデル全体の高い情報含有量の両方を提供する。しかし、動物全体の試験とは異なり、このチップは安価であり、そして大部分が使い捨てである。このデバイスの低い流体容量(約5μl)は、微小流体デバイスに特徴的な、高い感度およびスループットを提供する。さらに、このデバイスの読み出しは、非常に融通性であり、そしてアッセイに非依存性である(ほとんど任意の細胞型またはアッセイが、改変なしで使用され得る)。光学的呼掛けおよび読み出し(例えば、蛍光、発光)に基づく多数の生物学的アッセイが利用可能であり、従って、リアルタイムのモニタリングを実行可能にする。あるいは、標準的な病理学的アッセイ、生化学的アッセイ、ゲノムアッセイまたはプロテオームアッセイが、直接利用され得る。なぜなら、このシステムは、伝統的なカバーガラス(22mm×22mm)または96ウェルの形式と完全に適合可能に設計され得るからである。さらに、遺伝子操作された細胞が、専門的な最終使用者の適用のために使用され得る。さらに、さらなるコンパートメントおよびモジュールを包含するための「3D」チップが使用されて、胃腸管または血液脳関門の吸収を分析し得る。
【0021】
伝統的なインビトロアッセイとは異なり、本発明のチップは、生物全体の複雑な複数組織(肝臓、肺、脂肪、循環系など)の生物学を、より綿密に模倣する。薬物候補が、より現実的な動物またはヒトの生理学的環境に曝露され、従って、代表的なインビトロアッセイより高く、より正確な情報内容(例えば、吸収、分布、生体蓄積、代謝、排出、効力および毒性)を提供する。これらの利点は、薬物リードの安全性および効力の予測、ならびに特に、高価な、時間を浪費する、非臨床試験または臨床試験に入る前のそれらの優先に直接影響を与える。この優先は、これらの試験に入る前の潜在的毒性または効力の欠如の迅速かつ直接的な評価を可能にすることによって、薬物開発のスループットを増加させ、毒物学的スクリーニングのために必要とされる動物の数を減少させ、非臨床研究の費用を減少させ、そして臨床試験の効率を増加させる。
【0022】
これらは、本発明のチップ技術の利点のいくつかを実証する。要約すると、伝統的なインビトロ細胞培養アッセイ、動物研究、または臨床試験と比較した場合に、データの獲得が迅速である。このデータはまた、効果的であり、伝統的なインビトロアッセイからは利用可能ではない、高度に予測的な内容を提供する。チップのプラットフォームは、既存のアッセイ(標準的なカバーガラスまたは96ウェルの形式のいずれかで)と完全に適合性であるように設計される。デバイス自体が、任意の動物種または複数の器官コンパートメントの組合せに対して構成可能である。個々のチップは、使い捨てであるように、費用効果的な価格にされる。さらに、このデバイスに低い容量は、潜在的な化合物をスクリーニングする際に、試薬の費用をさらに減少させる。
【0023】
現在利用可能な技術とは異なり、本発明のチップシステムは、臨床段階においてのみでなく、臨床前試験を行うために必要とされる化合物の数をまた減少させることによって、成功率を大いに増加させる。その結果、製薬会社は:(1)開発プロセスの初期に、どの薬物候補がヒトに対して毒性である可能性を有するかを決定し得;(2)ヒトの応答を最良に予測する動物種をより良好に選択し得;そして(3)どの薬物候補が有効である可能性を有するかを決定し得る。従って、本発明のチップは、一般に、成功率を増加させ、そして市場向きの薬物の開発時間を減少させる。
【0024】
(薬物速度論(pharmokinetic)に基づく微小規模培養デバイス)
CCAデバイスのためのデバイス、インビトロ細胞培養、および方法が提供される。本発明の方法およびデバイスは、細胞が、生理学的に代表的な環境にインビトロで維持され、これによって、スクリーニングおよび毒性アッセイの推定値およびインビボでの妥当性を改善する手段を提供する。本発明の微小規模の薬物速度論(pharmacokinetic)培養デバイスは、各培養チャンバに対して適切な細胞を播種され、次いで、この培養系は、化合物のスクリーニング、毒性アッセイ、目的の細胞の開発のためのモデル、感染速度論のモデルなどのために使用され得る。入力変数(これは例えば、化合物、サンプル、遺伝子配列、病原体、細胞(例えば、幹細胞または前駆細胞)であり得る)が、樹立された培養系に添加される。種々の細胞出力が評価されて、入力変数に対する細胞の応答(培地のpH、培地中のO2およびCO2の濃度、タンパク質および他の細胞マーカーの発現、細胞の生存性、または培養培地への細胞産物の放出が挙げられる)を決定し得る。
【0025】
培養基材(すなわちデバイス)の設計および構成は、本発明の独特の増殖条件を提供する。各デバイスは、1つ以上のチャンバを備え、これらのチャンバは、流体チャネルによって相互接続されている。各チャンバは、そのデバイスに存在する他のチャンバとは異なる幾何学的構造を有し得る。例えば、デバイスの1つの実施形態は、肺、肝臓、および他の組織を表すチャンバからなる(図18A)。この実施形態における肺チャンバは、液体容量比および液体滞留時間に対する現実的な細胞を達成するために、5μmの高さの隆起を備える(図18B)。この実施形態における肝臓チャンバは、液体容量比および液体滞留時間に対する現実的な細胞を達成するために、20μmの高さの柱を備える(図18C)。このデバイスはまた、培養培地が循環し得るように、入口ポートおよび出口ポートを備える。
【0026】
1つの実施形態において、この培養デバイスは、チップの形式である。すなわち、チャンバおよび流体チャネルが、製造されたマスターから作製または成形されており、その結果、このデバイスは、単一のユニットとしてか、または1つ以上のチャンバを別個のユニットに有するモジュラーシステムとしてかのいずれかで、形成される。一般に、チップ形式は、小規模で提供され、通常、1辺が約10cm以下であるか、または1辺が約5cm以下でさえある。それはなお、1辺がほんの約2cmであっても、それより小さくてもよい。別の例において、チップは、96ウェル形式で収容され得、ここで、各チップは、0.9cm×0.9cm未満である。チャンバおよび流体チャネルは、これに対応して、大きさが微小規模である。
【0027】
別の実施形態において、この培養デバイスは、一体型デバイスの形式であり、使い捨てのプラスチックのポリマーベースの構成要素として製造された複数の微小規模チップを収容する、卓上機器を備える。この機器は、個々のセルチップ、あるいは標準的な96ウェル形式における1つの「チップ」(すなわち、8×12の形式の96個の個々のチップ)を収容するための凹部を有する、基部を備え得る。この機器の頂部は、閉じられる場合、チップを密封し、そして流体相互接続を提供する。この機器は、流体をチップに再循環させるための低容量ポンプ、および試験化合物の導入を提供するため、または化合物を96ウェルプレートもしくは384ウェルプレートから直接引き出すための注入ループを備える小さな三方弁を供える。この機器を使用して、複数の化合物が、効力、毒性、および/または代謝産物生成について、同時に評価され得る。この機器はまた、十分に特徴付けられた生物マーカーを使用して、リアルタイムの生理学的モニタリングのための、チップ上蛍光検出を統合し得る。
【0028】
このデバイスは、細胞および培養培地から信号を得るための機構を備え得る。異なるチャンバおよびチャネルからの信号が、リアルタイムでモニタリングされ得る。例えば、バイオセンサが、このデバイスに一体化され得るか、またはこのデバイスの外部に備えられ得、これは、その系における細胞の生理学的状態の、リアルタイムの読み出しを可能にする。
【0029】
本発明は、ある種の物質(例えば、薬学的組成物、ワクチン調製物、細胞傷害性化学物質、突然変異原、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、阻害性化合物、化学療法剤、および他の化合物または因子の宿主)に対する陽性または陰性の応答を同定するための、ハイスループットのスクリーニングのための理想的なシステムを提供する。試験される物質は、天然に存在する物質または合成物質のいずれかであり得、そして有機物または無機物であり得る。
【0030】
例えば、細胞傷害性化合物の活性は、培養物中の細胞に損傷を与えるかまたは殺傷する能力によって、測定され得る。これは、生体染色技術によって、容易に評価され得る。増殖因子/調節因子の影響は、例えば、全細胞計数、および差示的細胞計数により、マトリックスの細胞含有量を分析することによって、評価され得る。これは、標準的な細胞学的技術および/または組織学的技術(型特異的細胞抗原を規定する抗体を使用する、免疫細胞化学的技術の使用が挙げられる)を使用して、達成され得る。このデバイスにおいて培養される正常な細胞に対する、種々の薬物の効果が、評価され得る。例えば、赤血球形成を増加させる薬物は、骨髄培養物について試験され得る。コレステロール代謝に影響を与える(例えば、コレステロール生成を低下させることによって)薬物は、肝臓系に対して試験され得る。腫瘍細胞の培養物は、例えば、抗腫瘍剤の効力を試験するためのモデル系として、使用され得る。
【0031】
本発明のデバイスは、生理学的条件または病理学的条件の研究のためのモデル系として、使用され得る。例えば、本発明の特定の実施形態において、デバイスは、血液脳関門に対するモデルとして使用され得る;このようなモデル系を使用して、血液脳関門を通る物質の貫通を研究し得る。さらなる実施形態において、そして限定としてではなく、粘膜上皮を含むデバイスは、ヘルペスウイルスまたはパピローマウイルスの感染を研究するためのモデル系として使用され得る;このようなモデル系を使用して、抗ウイルス薬剤の効力を試験し得る。
【0032】
本発明のデバイスはまた、悪性疾患おび疾患の診断および処置を補助するために、使用され得る。例えば、任意の組織(例えば、骨髄、皮膚、肝臓)の生検が、悪性腫瘍に罹患すると疑われる患者から採取され得る。この患者の培養物をインビトロで使用して、細胞傷害性化合物および/または薬学的化合物をスクリーニングし、最も効力のあるもの(すなわち、悪性細胞または疾患細胞を殺傷するが正常細胞を残すもの)を同定し得る。次いで、これらの薬剤を治療的に使用して、患者を処置し得る。
【0033】
本発明のなお別の実施形態において、このデバイスは、インビトロで使用されて、生物学的生成物を高収率で生成し得る。例えば、特定の生物学的産物(例えば、増殖因子、調節因子、ペプチドホルモン、抗体)を多量に天然に産生する細胞、または外来性の遺伝子産物を産生するように遺伝子操作された宿主細胞が、このデバイスをインビトロで使用して、クローン的に増殖され得る。形質転換された細胞が、遺伝子産物を栄養培地に排出する場合、この産物は、標準的な分離技術(例えば、2〜3の例を挙げれば、HPLC、カラムクロマトグラフィー、電気泳動技術)を使用して、使用済み培地または馴化培地から容易に単離され得る。培養物にインビトロで供給するための連続流方法を利用する、「バイオリアクタ」が、考案され得る。本質的に、新鮮な培地がこのデバイスにおける培養物を通り抜けるにつれて、遺伝子産物は、この培養物から放出された細胞と共に、この培養物から洗い流される。遺伝子産物は、使用済み培地または馴化培地の流出物から単離され得る(例えば、HPLCカラムクロマトグラフィー、電気泳動によって)。
【0034】
本発明はまた、種々の環境的条件または化合物の、生物学的系に対する影響をスクリーニングまたは測定するためのシステムを提供する。例えば、空気または水の条件が、このデバイスにおいて、模倣または変化され得る。既知または疑わしい、異なる毒性物質の影響が、試験され得る。本発明は、さらに、消費者の製品(例えば、化粧品、クレンザー、またはローション)をスクリーニングするためのシステムを提供する。本発明はまた、栄養と薬効のある物質(nutriceutical)、栄養補助剤、または食品添加物の安全性および/または効力を決定するためのシステムを提供する。本発明はまた、細胞産物を多量に産生するための、小型のバイオリアクタまたは細胞産生プラットフォームとして使用され得る。
【0035】
本発明のチップ形式の微小規模培養デバイスを使用する、効力または毒性の代表的な実験は、実験の設計に依存して、24〜48時間以下で完了する。しかし、長期間の曝露の影響(例えば、遺伝子毒性、発癌性、または潜在性の疾患)を試験するためには、延長した実験が実施され得る。
【0036】
本発明は、本明細書中に記載されるような、新規のデバイス、システムおよび方法を提供する。一般に、本明細書中において使用される全ての技術用語および科学用語は、明らかに他に示されない限り、本発明が属する分野の当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。明らかにするために、本発明を記載するために本明細書中において使用される特定の用語についての定義が、以下に列挙される。これらの定義は、明らかに他に示されない限り、用語が本明細書全体にわたって使用される場合に、これらの用語に適用される。
【0037】
(用語の定義)
(薬物速度論に基づく培養系:) 細胞が、インビボにおいて見出される薬物速度論的パラメーター値をモデル化する薬物速度論的パラメーター値を提供する条件下に維持される、インビトロの細胞培養系。薬物速度論的培養デバイスは、不連続であるが相互接続されたチャネルに分離されたチャネルの流体ネットワークを備え、ここで、特定のチャンバ構成が、対応する細胞、組織または器官系に対してインビボで見出されるものに対応する細胞相互作用、流体流れ、および流体滞留パラメーターを提供するように設計される。このデバイスは、モデル化される条件に適切な細胞(例えば、肝臓に基づく培養チャンバにおける肝細胞、肺に基づく培養チャンバにおける肺細胞など)を播種されて、培養系を提供する。
【0038】
本発明の培養系は、目的の細胞、組織、または器官系についてインビボで得られる値に匹敵する、少なくとも1つの薬物速度論的パラメーター値、好ましくは、少なくとも2つのパラメーター値を提供し、そして3つ以上の匹敵するパラメーター値を提供し得る。目的の薬物速度論的パラメーターとしては、例えば、細胞間の相互作用、液体の滞留時間、液体対細胞の比、細胞による代謝、またはせん断応力が挙げられる。
【0039】
匹敵する値とは、実際の値が理論値から25%より大きくは逸脱しないことを意味する。例えば、ラットについて肺のコンパートメントにおける液体の滞留時間についての計算値または理論値は、2秒間であり、そしてラットCCAデバイスの肺細胞培養チャンバにおいて測定された実際の値は、2.5±0.7秒間であった。
【0040】
薬物速度論的パラメーター値は、PBPKモデルの式を使用することによって得られる。このような式は、当該分野において記載されており、例えば、PoulinおよびTheil(2000)J Pharm Sci.89(1):16−35;Slobら(1997)Crit Rev Toxicol.27(3):261−72;Haddadら(1996)Toxicol Lett.85(2):113−26;Hoang(1995)Toxicol Lett.79(1−3):99−106;Knaakら(1995)Toxicol Lett.79(l−3):87−98;ならびにBallおよびSchwartz(1994)Comput Biol Med.24(4):269−76(本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。薬物速度論的パラメーターはまた、刊行された文献から得られ得、例えば、Buckpittら、(1984)J.Pharmacol.Exp.Ther,231:291−300;DelRaso(1993)Toxicol.Lett.68:91−99;Haiesら、(1981)Am.Rev.Respir.Dis.123:533−541を参照のこと。
【0041】
目的の特定の生理学的パラメーターとしては、組織または器官の液体滞留時間、組織または器官の質量、液体対細胞の容量比、細胞のせん断応力などが挙げられる。生理学的に関連するパラメーター値は、従来の方法に従って経験的に得られ得るか、または当該分野において公知であり公共に利用可能な値から得られ得る。目的の薬物速度論的パラメーター値は、動物(通常、哺乳動物)から得られるが、他の動物モデル(例えば、昆虫、魚類、爬虫類または鳥類)もまた、用途を見出し得る。哺乳動物としては、実験室動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット)、経済的価値のある哺乳動物(例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、イヌ、またはネコ);霊長類(サル、類人猿、またはヒトが挙げられる);などが挙げられる。異なる値が、異なる年齢(例えば、胎児、新生児、乳児、幼児、成人、または老人)の動物;および異なる生理学的状態(例えば、罹患、薬学的活性剤との接触後、感染後、または変化した大気圧の条件下)に対して得られ得、そして使用され得る。
【0042】
薬物速度論的パラメーター値に関連する情報、およびシステムにおいてモデル化される種々の物質に対して適用可能な質量バランスは、必要に応じて、培養系のデータ処理構成要素(例えば、格納のために保存された汎用メモリにおけるルックアップ表など)に提供される。これらの式は、系における種々の生物学的物質/化学物質についての、生理学に基づく薬物速度論モデルを表す。
【0043】
(薬物速度論的培養デバイス:) 本発明の培養デバイスは、細胞増殖のための基材を提供する。各デバイスは、少なくとも1つのチャンバ、通常は少なくとも2つのチャンバを備え、そして3つ以上のチャンバを備え得、ここで、これらのチャネルは、流体チャネルによって相互接続される。これらのチャンバは、単一の基材上または異なる基材上にあり得る。好ましくは、各チャンバは、そのデバイスに存在する他のチャンバから区別される幾何学的構造を有する。このデバイスは、これらのチャンバおよびチャネルを密封するためのカバーを備え、そして少なくとも1つの入口ポートおよび少なくとも1つの出口ポートを備え、これらは、培養培地の再循環を可能にする。このデバイスは、培養培地をこの系に通してポンピングするための機構を備える。この培養培地は、培養される細胞の生存性を維持するように設計される。このデバイスは、試験化合物がこのシステムに導入され得る機構を備える。
【0044】
本発明の1つの実施形態において、このデバイスは、一辺が約2.5cm以下の単一のユニットとして、微小規模で作製され、好ましくは、相互接続された少なくとも2つのチャンバを備える。2つの器官コンパートメントが、約50〜150μmの幅および15〜25μmの深さのチャネルによって、接続される。例えば、1つのチャンバは肺を表し得、平行チャネル(通常、少なくとも約10個のチャネル、好ましくは、少なくとも約20個のチャネル)の相互接続されたアレイを備える。このようなチャネルは、代表的な微小流体寸法(例えば、約30〜50μmの幅、5〜15μmの深さ、および3〜7mmの長さ)を有し得る。別のコンパートメントは、肺を表し得、蛇行した形状の2つ以上の平行なチャネル(通常、約50〜150μmの幅、15〜25μmの深さ、および5〜15cmの長さ)を備える。
【0045】
このデバイスは、通常、細胞および培養培地から信号を得るための機構を備える。異なるチャンバおよびチャネルからの信号が、リアルタイムでモニタリングされ得る。例えば、バイオセンサが、このデバイスに一体化されるかまたは外部に備えられ得、これは、その系における細胞の生理学的状態の、リアルタイムの読み出しを可能にする。
【0046】
本発明の薬物速度論的培養デバイスは、チップまたは基材として提供され得る。流体力学を増強させることに加えて、このような微小なシステムは、空間を節約し(特に、高度に並行化されたシステムにおいて使用される場合)、そして安価に製造され得る。この培養デバイスは、ポリスチレンが挙げられるがこれに限定されないポリマーから形成され得、そして1回の使用の後に処分され得、滅菌の必要性を排除する。その結果、このインビトロサブシステムは、安価に製造され得、そして広範に使用され得る。さらに、細胞は、三次元の様式で増殖されて、例えば、チューブを形成し得、これは、インビボの環境をより綿密に複製する。
【0047】
任意の特定の薬剤に対する動物の代謝応答をモデル化するために、並行アレイまたは複数アレイのバンクは、複数(すなわち、少なくとも2つ)の細胞培養系を備え、ここで、各システムは、同一であり得るか、または予め決定されたパラメーター値もしくは入力薬剤および濃度が異なり得る。このアレイは、少なくとも約10個のシステムを備え得るか、または100程度に多く、またはそれより多くのシステムでさえあり得る。好都合には、マイクロチップ上の細胞培養システムは、単一のチャンバ内に収容され得、その結果、アッセイ中の全ての細胞培養系が、アッセイの間、同じ条件に供される。
【0048】
あるいは、複数のチップが相互接続されて、単一のデバイスを形成し得、例えば、胃腸管関門または血液脳関門を模倣し得る。
【0049】
(細胞:) 本発明のアッセイにおいて使用するための細胞は、生物、生物由来の単一の細胞型であり得、そしてインビボの状況において代表的であるような、複数の細胞型の混合物であり得る。培養条件としては、例えば、温度、pH、因子の存在、他の細胞型の存在などが挙げられ得る。先に記載されたような、薬物速度論的パラメーター値が得られ得る動物のいずれかを含む、種々の動物細胞が使用され得る。
【0050】
本発明は、任意の細胞型(初代細胞、幹細胞、前駆細胞、正常な細胞株、遺伝的に改変された細胞株、遺伝的に変更された細胞株、不死化細胞株、および形質転換された細胞株が挙げられる)と共に使用するために適切である。本発明は、単一の細胞型または細胞株、あるいは異なる細胞型の組合せと共に使用するために適切である。好ましくは、培養された細胞は、その天然に存在する対応物における応答を引き起こす刺激に応答する能力を維持する。これらは、真核生物細胞または原核生物細胞のような、全ての供給源に由来し得る。真核生物細胞は、本質的に植物または動物(例えば、ヒト、サル、またはげっ歯類)であり得る。これらは、任意の組織型(例えば、心臓、胃、腎臓、腸、肺、肝臓、脂肪、骨、軟骨、骨格筋、平滑筋、心筋、骨髄、筋肉、脳、膵臓)および細胞型(例えば、上皮、内皮、間葉、脂肪細胞、造血細胞)であり得る。さらに、組織または器官の断面が使用され得る。例えば、動脈、静脈、胃腸管、食道、または結腸の断面が使用され得る。
【0051】
さらに、非ネイティブの「組換え」(「外因性」とも呼ばれる)核酸配列を含むように遺伝子的に変更または改変されたか、あるいは遺伝子機能の獲得または損失を提供するようにアンチセンス技術によって改変された細胞が、本発明において利用され得る。遺伝刺激に改変された細胞を作製するための方法は、当該分野で公知である(例えば、「Current Protocols in Molecular Biology」、Ausubelら編、John Wiley & Sons,New York,NY,2000を参照のこと)。これらの細胞は、末端分化細胞または未分化細胞(例えば、幹細胞)であり得る。本発明の細胞は、生物学的因子および薬学的因子に対して異なって応答し得る種々の遺伝的に多様な個体由来の培養細胞であり得る。遺伝的多様性は、疾患感受性に対する間接的影響および直接的影響を有し得る。直接的な場合において、単一ヌクレオチド多型(SNP)を生じる単一のヌクレオチド変化でさえ、タンパク質のアミノ酸配列を変更し得、そして疾患または疾患感受性に直接的に寄与し得る。例えば、特定のAPOリポ蛋白E遺伝子型は、何人かの個体におけるアルツハイマー病の発症および進行と関連している。
【0052】
特定の多型が、特定の疾患表現形と関連している場合、多型のキャリアとして同定された個体由来の細胞は、コントロールとしての非キャリア由来の細胞を使用して、発生異常について研究され得る。本発明は、特定の遺伝的疾患の症状に関連する発生異常を研究するための実験系を提供する。なぜなら、いくつかの異なる細胞型が、同時に研究され、そして関連の細胞と関連付けられるからである。例えば、ニューロン前駆体、グリア細胞、または神経由来の他の細胞が、神経系に対する化合物の細胞効果を特徴付けるためのデバイスにおいて使用され得る。また、システムは、細胞が遺伝的要素(これは、薬物感受性、ケモカイン応答およびサイトカイン応答、増殖因子、ホルモンおよびインヒビターに対する応答、ならびにレセプターの発現および/または機能における変化に対する応答に影響を及ぼす)を決定するために研究され得るように、構成され得る。この情報は、遺伝的原因の疾患のための処置方法、または遺伝的素因が存在する疾患のための処置方法の設計において貴重であり得る。
【0053】
本発明の一実施形態において、細胞(例えば、肝細胞を含む肝臓細胞;細管細胞を含む腎臓細胞;有機化合物を長期間保持し得る脂肪細胞(adipocyte)を含む脂肪細胞(fat cell))は、薬学的に活性な化合物の無毒化および代謝に関与する。これらの細胞は、培養系において、呼吸および酸素付加プロセスに関与する細胞(例えば、肺細胞)と組み合わされ得る。これらの細胞はまた、目的の薬剤による損傷に対して特に感受性である細胞(例えば、腸上皮細胞、骨髄細胞、および細胞分裂に影響を及ぼす薬剤について、他の通常は迅速に分裂している細胞)と組み合わされ得る。ニューロン細胞は、神経毒性のための薬剤の効果などについてモニタリンスするために、存在し得る。
【0054】
腫瘍の増殖特性、ならびに腫瘍増殖に対する周辺組織および免疫系の応答もまた、興味がもたれる。変性疾患(罹患組織および周辺領域を含む)は、罹患組織の応答および身体の他の部分との相互作用の両方を決定するために、使用され得る。
【0055】
用語「環境」または「培養条件」は、細胞、培地、因子、時間および温度を包含する。環境としてはまた、薬物および他の化合物、特に、大気条件、pH、塩組成、無機質などが挙げられ得る。細胞培養は、代表的に、生理学的条件を模倣する滅菌条件(例えば、加湿した92〜95%空気/5〜8%CO2大気を含むインキュベーター中、37℃)において、実施される。細胞培養は、未規定の生物学的流体(例えば、ウシ胎児血清)を含む栄養分混合物中、または十分に規定された血清を含まない培地中で実施され得る。種々の培養培地が、当該分野で公知であり、そして市販されている。
【0056】
用語「生理学的条件」は、本明細書中で使用される場合、細胞培養条件が、インビボにおける特定の細胞型についての天然の組織条件を可能な限り綿密に模倣するために、非常に詳細にモニタリングされることを意味するように、定義される。これらの条件としては、液体滞留時間(すなわち、液体が器官内に留まる時間)、細胞 対 血液容量の比、細胞に対する剪断応力、天然の器官に適合性のコンパートメントのサイズのようなパラメーターが挙げられる。
【0057】
(スクリーニングアッセイ)
本明細書中で一般に「入力変数」と称される、薬物、毒素、細胞、病原体、サンプルなどは、薬物動態学に基づく細胞系に加え、そして目的の出力変数(例えば、O2の消費、CO2の生成、細胞生存度、または目的のタンパク質の発現)における変化についてこの培養細胞を評価することによって、生物学的活性についてスクリーニングされる。この入力変数は、代表的に、溶液形態または容易に可溶な形態で、培養物中の細胞の培地に加えられる。この入力変数は、フロースルーシステムを使用してか、あるいはボーラスを他の静的溶液に添加して、加えられ得る。フロースルーシステムにおいて、2つの流体が使用され、ここで一方は、生理学的に中性の溶液であり、そして他方は、加えられる試験化合物と同じ溶液である。第1の流体は、細胞を通過し、続いて、第2の細胞を通過する。単一溶液法において、試験入力変数のボーラスが、細胞を取り囲む容量の培地に加えられる。培養培地の全組成は、このボーラスの添加と共に、またはフロースルー方法における2つの溶液間で、有意に変化するべきではない。
【0058】
好ましい入力変数処方物は、全処方物対して有意な効果を有するさらなる成分(例えば、保存剤)を含まない。従って、好ましい処方物は、生物学的に活性な因子および薬学的に受容可能なキャリア(例えば、水、エタノールまたはDMSO)を含む。しかし、因子が、賦形剤を含まない液体である場合、この処方物は、単に化合物自体であり得る。
【0059】
好ましい入力変数としては、ウイルス、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、生分解性ポリマー、放射性標識粒子、放射性標識生体分子、毒素結合粒子、毒素結合生体分子、および安定化剤と結合した粒子または生体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「安定化剤」は、薬物を安定化し、そして制御された放出を提供するために使用される薬剤である。このような薬剤としては、アルブミン、ポリエチレングリコール、ポリ(エチレン−co−酢酸ビニル)、およびポリ(ラクチド−co−グリコリド)が挙げられる。
【0060】
複数のアッセイは、種々の濃度に対する差示的な応答を得るために、異なる入力変数濃度と並行して実施され得る。当該分野で公知のように、薬剤の有効濃度の決定は、代表的に、1:10または他のlogスケールの希釈から得られる濃度範囲を使用する。この濃度は、必要な場合、第2連の希釈物を用いてさらに改良され得る。代表的に、これらの濃度の1つは、ネガティブコントロール(すなわち、0の濃度または検出レベル未満で)としてはたらく。
【0061】
目的の入力変数は、多数の化学的クラスを含むが、しばしば、これらは有機分子である。好ましい実施形態は、サンプル(例えば、環境的サンプルまたは薬物)を毒性についてスクリーニングするための本発明の方法の使用である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み得、そして代表的に、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは、これらの化学的官能基の少なくとも2つを含む。この候補薬剤は、しばしば、上記の官能基の1つ以上で置換された、環状炭素、または複素環式構造および/あるいは芳香族構造または多芳香族(polyaromatic)構造を含む。候補薬剤はまた、生体分子(ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログまたはそれらの組み合わせを含む)において見出される。
【0062】
薬学的に活性な薬物および遺伝的に活性な分子が、含まれる。目的の化合物は、化学療法剤、抗炎症剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、イオンチャネル調節因子、および神経活性化剤を含む。本発明に適切な薬学的因子の例は、以下に記載される因子である:「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、GoodmanおよびGilman,McGraw−Hill,New York.New York,(1996),第9版、以下:Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites;Drugs Acting on the Central Nervous System;Autacoids:Drug Therapy of Inflammation;Water,Salts and Ions;Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism;Cardiovascular Drugs;Drugs Affecting Gastrointestinal Function;Drugs Affecting Uterine Motility;Chemotherapy of Parasitic Infections;Chemotherapy of Microbial Diseases;Chemotherapy of Neoplastic Diseases;Drugs Used for Immunosuppression;Drugs Acting on Blood−Forming Organs;Hormones and Hormone Antagonists;Vitamins,Dermatology;およびToxicologyの節(これらすべては本明細書中で参考として援用される)。毒素、ならびに生物戦因子および化学戦因子(biological and chemical warfare agent)もまた含まれる(例えば、Somani,S.M.(編)「Chemical Warfare Agents」,Academic Press,New York,1992を参照のこと)。
【0063】
試験化合物は、上記の分子のクラスの全てを含み、そして未知の含有物のサンプルをさらに含み得る。多くのサンプルが、溶液中の化合物を含むが、適切な溶媒に溶解され得る固体サンプルもまた、アッセイされ得る。目的のサンプルとしては、環境的サンプル(例えば、地下水、海水、または採掘排液);生物学的サンプル(例えば、作物から調製される溶解物または組織サンプル);製造サンプル(例えば、薬剤の調製の間の時間経過);ならびに分析のために調製される化合物のライブラリなどが挙げられる。目的のサンプルとしては、潜在的な治療的価値についてアッセイされる化合物(例えば、植物細胞または真菌細胞由来の薬物候補)が挙げられる。
【0064】
用語「サンプル」はまた、さらなる成分(例えば、イオン強度、pH、または全タンパク質濃度に影響を与える成分)が添加された上記の流体を含む。さらに、このサンプルは、少なくとも部分的なコンパートメントまたは濃縮を達成するために、処理され得る。生物学的サンプルは、化合物の分解を減少するように注意がはらわれる場合、例えば、窒素下で、冷凍下で、またはそれらの組み合わせで貯蔵され得る。使用されるサンプルの容量は、測定可能な検出を可能にするのに充分であり、通常、約0.1μl〜1μlの生物学的サンプルで、十分である。
【0065】
化合物および候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含む種々の供給源から得られる。例えば、多数の手段が、種々の有機化合物および生体分子のランダム合成および指向された合成(ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む)のために利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリが、利用可能であるか、または容易に生成される。さらに、天然のライブラリおよび化合物または合成的に生成されるライブラリおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生化学的手段によって、容易に修飾され、そしてコンビナトリアルライブラリを生成するために使用され得る。公知の薬理学的因子が、構造的アナログを生成するために、指向されたかまたはランダムな化学修飾(例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化)に供される。
【0066】
(出力変数)
出力変数は、細胞の定量化可能エレメント、特に、ハイスループット系において正確に測定され得るエレメントである。出力は、任意の細胞成分または細胞産物(例えば、生存度、呼吸、代謝、細胞表面決定因子、レセプター、タンパク質、またはそれらのコンフォメーション改変もしくは翻訳後改変、脂質、炭水化物、有機分子もしくは無機分子、mRNA、DNA、あるいはこのような細胞成分由来の部分を含む)であり得る。ほとんどの出力は、定量的読み出しを提供するが、いくつかの例において、半定量的結果または定性的結果が、得られる。読み出しは、単一の決定値を含み得るか、または平均値、中央値もしくは分散を含み得る。特徴的に、読み出し値の範囲は、各出力について得られる。可変性が予測され、そして1セットの試験出力についての値の範囲が、標準的な統計方法を使用して確立され得る。
【0067】
種々の方法が、選択されたマーカーの存在を定量するために利用され得る。存在する分子の量の測定について、従来の方法は、検出可能部分(これは、蛍光性、発光性、放射性または酵素活性であり得る)で、分子を標識することである。蛍光性部分および発光性部分は、任意の生体分子、構造または細胞型を実質的に標識するために容易に利用可能である。免疫蛍光性部分は、特定のタンパク質だけではなく、特定のコンフォメーション、切断産物またはリン酸化のような部位修飾に結合するように指向され得る。個々のペプチドおよびタンパク質は、これらを、細胞内で、緑色蛍光タンパク質キメラとして発現することによって、自己蛍光対に操作され得る(総説については、Jonesら(1999)Trends Biotechnol.17(12):477−81を参照のこと)。
【0068】
出力変数は、イムノアッセイ技術(例えば、免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ(RIA)、または酵素免疫測定法(ELISA)および関連の非酵素的技術)によって測定され得る。これらの技術は、単一の分子標的への結合に対する高程度の特異性に起因して特に有用であるレポーター分子として、特定の抗体を使用する。細胞ベースのELISAまたは関連の非酵素的方法もしくは蛍光ベースの方法により、細胞表面パラメーターの測定が可能となる。このようなアッセイからの読み出しは、個々の蛍光抗体検出型細胞表面分子またはサイトカインに関連する平均蛍光または平均蛍光強度、中央蛍光強度、蛍光強度の分散、あるいはそれらの間のある関係である。
【0069】
(データ分析)
スクリーニングアッセイの結果は、基準化合物、濃度曲線、コントロールなどから得られた結果と比較され得る。この結果の比較は、適切な演繹プロトコル、AIシステム、統計比較などを使用することによって、達成される。
【0070】
基準出力データのデータベースが、コンパイルされ得る。これらのデータベースは、既知の因子または因子の組み合わせからの結果、ならびに環境的条件下(ここで、単一または複数の環境的条件またはパラメーターが、除去されるかまたは特異的に変更される)で処理された細胞の分析からの基準を含み得る。データマトリクスが、作製され得、ここで、このデータマトリクスの各点は、出力変数からの読み出しに対応し、ここで、各出力についてのデータは、反復測定(例えば、同じ型の複数の個々の細胞)から導かれ得る。
【0071】
この読み出しは、平均、中央値もしくは分散、または測定値に関連する他の統計的もしくは数学的に導かれた値であり得る。この出力読み出し情報は、対応する基準読み出しと直接比較することによって、さらに改良され得る。同一の条件下で、各出力について得られた絶対値は、生きた生物学的系に固有の可変性を示し、そしてまた、個々の細胞可変性および個体間で固有の可変性を示す。
【0072】
(細胞培養物および細胞培養デバイス)
本発明の培養デバイスは、別個であるが相互接続された1つ以上のチャンバに分離された(好ましくは、チップ様式に一体化された)チャネルの微小流体ネットワークを備える。特定のチャンバの形状は、細胞相互作用、液体フロー、および液体対流パラメーター(これは対応する細胞、組織または器官系についてインビボで見出されるパラメーターと相関する)を提供するように、設計される。
【0073】
最適化されたチャンバ形状は、選択された値が得られるまで、流体フローおよび寸法の変化に応答するパラメーター値を試験する手順を繰り返すことによって、開発され得る。基材の最適化は、チャンバの数を選択する工程、細胞 対 容量の適切な比を提供するチャンバ形状を選択する工程、組織サイズ 対 器官サイズの適切な比を提供するチャンバサイズを選択する工程、正確な液体滞留時間を提供する最適な流体の流速を選択する工程、次いで、これらの値に基づいて細胞剪断応力を計算する工程、を包含する。この細胞剪断応力が、最大許容値を越える場合、新たなパラメーター値が選択され、そしてこのプロセスが繰り返される。CCAデバイスの別の実施形態は、細胞が、チャネルまたはチャンバの底部および側面上ではなく、中空チューブ内で増殖する場合を包含する。このような三次元組織構築物において増殖する細胞は、特定のインビボ組織に関してより確実であることが実証されている(Griffith(1998)PhARMA Biol.Biotech.Conf.,Coronado,CA,March 15−18)。
【0074】
3つの主な設計パラメーターが、3−D培養デバイスの作製において考慮される。第1は、流体が特定の組織と接触しているか、ウェル内に存在する滞留時間である。この滞留時間は、血液が器官組織と接触している時間の量を示すように選択され、1回の循環系の通過における1ウェルあたりで表される。第2は、細胞が増殖するチューブの半径である。例えば、肝臓を複製するためのチューブの半径は、200〜400μmの範囲内である。このチューブの半径が大きすぎる場合、細胞は本質的に平坦な表面を示し、そしてこのチューブ上に単層を形成することに注意しなければならない。
【0075】
第3のパラメーターは、各モジュールに達するフローの割合である。フローチャネルの形状を調整することにより、このフローはチャンバから分配される。このチャネルまたはチューブから各モジュールまたはチャンバまでは、代表的に、圧力低下を平衡化しそしてフローを平均化するために、異なる長さである。流体が別の組織から出た後、この流体は、ポンプによって再循環され得る。このチューブを通る流速を、チューブの寸法および滞留時間から計算した。ある流速を仮定して、細胞にかかる剪断応力を計算して、この値が細胞の応力限界を超えないことを保証した。肺組織において必要な非常に短い滞留時間は、この器官についてのウェルおよびチューブのアプローチを不可能にする。この剪断応力は、高すぎ、従って、肺組織部分は、肺組織単層で満ちあふれたままである。
【0076】
本発明のシステムは、相互作用的である(すなわち、コンピューターは、検出するだけではなく、試験における条件を制御する)ため、補正は、動的にこのシステムにおいて行われ、実行されている試験の動力学を研究員に知らせるために適切に記述および文書化され得る。
【0077】
コンピューターによるデータ収集は、各コンパートメントからの試験化学排水の連続的なインラインモニタリングに必要なデータの収集を含む。センサ、好ましくは、フロースルータイプのセンサは、各コンパートメントからの流出と同調して配置され、従って、各コンパートメントからの試験化学排液に関する定量的データを検出、分析および提供する。
【0078】
マイクロプロセッサはまた、特定の試験化学物質についての生理学ベースの薬物動態学(PBPK)モデルを計算するのに役立ち得る。これらの計算は、コンパートメント間の流速およびこのシステムからの試験化学物質の排出速度の設定のための基礎として働き得る。しかし、これらはまた、試験化学物質の理論的推定値として働き得る。この実験の終わりに,PBPK決定により行われる試験化学物質および代謝産物の濃度に関する予測は、センサデータと比較され得る。ハードコピー出力は、このPBPKモデルと実験結果とを比較する。
【0079】
いくつかの原型CCAシステムが、構築されそして試験されている。図17Aは、「第1世代」3コンパートメントデバイスを示す。この寸法は、以下のとおりであった:ウェアは、2cm×2cmであり;肺チャンバは、20個のチャネル(長さ5mm、40μm×20μm(w×d))を有し;肝臓チャンバは、2つのチャネル(長さ100mm、100μm×20μm(w×d))を有した。このデバイスの使用における第1の工程は、全てのチャネルが満たされるまで、シリンジポンプを使用して流体を注入することである。第2に、蠕動ポンプを使用して、この流体を再循環させる。図17Bは、このデバイスの断面図を示し、このシステムのフルイディクスを例示する。400μm厚のエラストマーが、良好な密閉を提供すること、およびプレキシガラスおよびゲル充填チップが、他の材料よりはるかに脆弱性が小さいことが見出された。このデバイスは、大きな圧力低下に伴う問題を有し、そして90°に曲げられた際に漏出が生じた。
【0080】
細胞接着研究を、この「第1世代」デバイスを使用して実施した。L2細胞を、肺チャンバ中に入れ、そしてH4IIE細胞を、肝臓チャンバ中に入れた。ポリ−D−リジンを、このチャンバの表面に吸着させて、チャネル内の細胞の接着を促進した。残念ながら、細胞は、トレンチの外側に接着し、従って、異なる基材を試験し、そして表面を改変した。
【0081】
図18Aは、「第2世代」デバイスを示す。この寸法は、以下のとおりであった:チップは、2cm×2cmであり;エッチングは、深さ20μmであり;肺チャンバは、2mm×2mm(w×l)であり;肝臓チャンバは、7.5mm×100mm(w×l)であった。この肺チャンバは、細胞接着を増大するために、5μmの高さの縁部を備え(図18B)、そして肝臓チャンバは、浸透をシミュレートするために20μmの高さのピラーを備えた(図18C)。
【0082】
図19は、「第3世代」デバイスを示す。この寸法は、以下のとおりであった:チップは、2cm×2cmであり;肺チャンバは、2mm×2mm(w×l)であり;肝臓チャンバは、3.7mm×3.8mm(w×l)であり;そして「他の組織」のチャンバは、7mm×7mm(w×l)であった。流体は、肺チャンバから、その20%が肺チャンバに、そして80%が他の組織のチャンバに、分配された。チャンバの部分(破線)は、圧力低下を減少するために、深さ100μmであり、そして他の部分(実線)は、現実的な液体−細胞の割合を提供するために、深さ20μmである。
【0083】
図20は、5個のコンパートメントPBPKモデルCCAについてのフロー図である。このデバイスは、脂肪細胞のためのチャンバ、ゆっくり灌流する流体のためのチャンバおよび迅速に灌流する流体のためのチャンバを加える。このようなデバイスは、生物蓄積研究、細胞傷害性研究および代謝活性のために使用され得る。他のデバイスは、種々の順列で開発され得る。例えば、気体交換を備える膜ポンプ、または、オンラインバイオセンサー、またはミクロ電気機械(MEM)ポンプ、またはバイオセンサおよび電子的インターフェースが添加され得る。デバイスは、薬物の傾向送達を模倣するように開発され得る。あるいは、デバイスは、血液−脳関門を模倣するように開発され得る。
【0084】
(製造)
細胞培養デバイスは、代表的に、適切に一緒に嵌合するかまたは結合する場合、本発明の培養デバイスを形成する、別々の要素(例えば、チャンバ、チャネル、入り口、または出口)の集合を備える。好ましくは、この要素は、一体化された「チップベース」形式で提供される。
【0085】
デバイスのフルイディクスは、デバイスのサイズについて適切なスケールにされる。チップベースの形式において、流体結合は、「マイクロ流体」であり、このようなシステムは、流体要素(例えば、通路、チャンバまたは導管)を含み、これは、少なくとも1つの内部断面寸法(例えば、0.1μmと500μmとの間の深さまたは幅)を有する。本発明のデバイスにおいて、チャンバ間のチャネルは、代表的に、少なくとも1つの微小規模のチャネルを含む。
【0086】
代表的に、マイクロ流体デバイスは、頂部部分、底部分、および内側部分を備え、ここで、この内側部分は、実質的に、デバイスのチャネルおよびチャンバを規定する。好ましい局面において、底部分は、固体基材を備え、この固体基材は、構造内において実質的に平坦であり、そして少なくとも1つの実質的に平坦な上面を有する。種々の基材材料は、底部分として使用され得る。代表的に、デバイスが微細加工されるので、基材材料は、一般的に、公知の微細加工技術(例えば、フォトリソグラフィー、薄膜堆積、湿式化学エッチング、反応性イオンエッチング、誘導結合プラズマディープシリコンエッチング、レーザーアブレーション、エアアブレーション技術、射出成型、エンボス加工、および他の技術)との適合性に基づいて選択される。
【0087】
本発明の基材材料としては、ポリマー材料(例えば、プラスチック、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリカルボネート、ポリテトラフルオロエチレン(TEFLONTM)、ポリビニルクロリド(PVC)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリスルホンなど)が挙げられる。このような基材は、周知の成型技術(例えば、射出成型、エンボス加工またはスタンピング)を使用して、または鋳型内のポリマー前駆体材料を重合することによって、微細加工されたマスターから容易に製造される。このような重合基材材料は、製造の容易さ、低い費用および使い捨てできること、ならびに最も極端な反応条件に対する一般的な不活性さのために好ましい。これらのポリマー材料は、処理された表面、例えば、誘導体化されたかまたはコーティングされた表面を含み得、そのシステムにおけるそれらの有用性を向上する(例えば、向上した流体方向、細胞付着または細胞分離を提供する)。
【0088】
マイクロ流体デバイスのチャネルおよび/またはチャンバは、代表的に、基材の上面、または底部分に、上記微細加工技術を使用して、微小規模の溝またはクボミ(indentation)として作製される。次いで、マイクロ流体デバイスの上部分の下面(上部分は代表的に第2の平坦な基材を含む)は、底基材の表面上に重ねられそして結合され、デバイスのチャネルおよび/またはチャンバ(内部部分)を、これらの2つの構成要素のインターフェースにおいてシールする。上部分の底部分への結合は、基材材料の性質に依存して、種々の公知の方法を使用して実行され得る。例えば、ガラス基材の場合、高い温度および圧力を使用して、デバイスの上部分を底部分に結合する熱結合技術が使用され得る。ポリマー基材は、使用される温度が、基材材料の過剰な融解を妨げるために一般的により低いことを除いて、類似の技術を使用して結合され得る。代替の方法はまた、デバイスのポリマー部分を一緒に結合するために使用され得、これには、音響溶接技術、または接着剤の使用(例えば、UV硬化性接着剤など)が挙げられる。
【0089】
デバイスは、一般的に、ポンプ(例えば、低い流速の蠕動ポンプ)を備える。小さな穴の可撓性チュービングがデバイスの出口に取り付けられ、蠕動ポンプを通り、デバイスの入り口に取り付けられ、従って、閉じたループシステムを形成する。ポンプは、一般的に、1μL/分のオーダーの流速で作動する。ポンプシステムは、任意の流体ポンプデバイス(例えば、ダイヤフラム)であり得、上記のように、CCAデバイス(チップベースのシステム)と一体化され得るか、または別の成分であり得る。
【0090】
デバイスは、プロセッサに接続されるかまたはプロセッサとインターフェースを取られ得、このプロセッサは、各バイオセンサからの信号を保存および/または分析する。プロセッサは、次いで、データをコンピューターメモリー(ハードディスクまたはRAMのいずれか)に送り、ここから、そのデータが、結果をさらに分析、印刷および/または表示するためのソフトウェアプログラムによって使用され得る。
【0091】
(例示的実施形態の説明)
特定の実施形態の以下の詳細な説明において、添付の図面に対して参照がなされ、この図面は、特定の実施形態の一部を形成し、そして本発明が実行され得る特定の実施形態を例示として示す。他の実施形態が使用され得、構造的変化が、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。
【0092】
図1は、本発明に従うインビトロシステムのブロック図である。肺細胞シミュレーティングチャンバ102は、気体交換デバイス103から酸素付加された細胞培地を受容する。このような酸素付加された培地は、細胞培地が酸素含有気体を吸収し、そして二酸化炭素含有気体を脱着するように、細胞培地を酸素含有気体と接触させることによって得られる。肺細胞シミュレーティングチャンバ102を出る細胞培地は、哺乳動物の動脈血106に類似する。動脈血106を構成する酸素含有培養培地を、次いで、肝臓シミュレーティングチャンバ108、他の組織シミュレーティングチャンバ110、脂肪シミュレーティングチャンバ112、および腎臓シミュレーティングチャンバ114に供給する。肝臓シミュレーティングチャンバ108、他の組織シミュレーティングチャンバ110、脂肪シミュレーティングチャンバ112、および腎臓シミュレーティングチャンバ114から出る培養培地は、哺乳動物の静脈血104と類似する。図1に示されるように、静脈血104に対応する培養培地は、肺細胞シミュレーティングチャンバ102に戻される。本発明のシステムはまた、腸シミュレーティングチャンバ116および腹腔シミュレーティングチャンバ118(これらの両方が、試験化合物の導入のための部位を構成する)を備える。哺乳動物におけるように、廃棄液体115は、腎臓シミュレーティングチャンバ114から取り除かれる。
【0093】
図2は、本発明のシステム200の1つの実施形態の単純化された概略図である。システム200は、肺細胞培養チャンバ210、肝臓細胞培養チャンバ212、脂肪細胞培養チャンバ213、他の組織チャンバ214、および気体交換チャンバ250を備える。チャンバ210、212、213、214および250は、一般的にチップ230と呼ばれるシリコンの基材上に形成される。4つより多くの細胞培養チャンバが単一のチップ230上に収容または形成され得ることが注目されるべきである。流路240は、チャンバ210、212、213、214および250を接続する。
【0094】
チャンバは、入り口211および出口215を有する。入り口211は、気体交換チャンバ250の一端に配置される。出口215は、肝臓細胞チャンバ212の一端に配置される。チャンバ210、212、213、214および250ならびに流路240が、入り口211と出口215との間に実質的に配置される。システムは、システム200内で流体を循環させるためのポンプ260を備える。マイクロチューブ270は、出口215とポンプ260の入り口側との間を接続する。マイクロチューブ271は、ポンプ260の出口側を入り口211と接続する。細胞培養チャンバ210、212、213、214、気体交換チャンバ250、流路240、およびポンプ260は、システム200を形成する。システムは、さらなる細胞培養チャンバを備え得る。追加される1つの共通細胞培養チャンバは、腎臓をシミュレーティングするものである。
【0095】
図3は、本発明の別の実施形態の概略である。図3において、第1信号経路310、第2信号経路320、および第3信号経路330は、チップ230上に提供される。各細胞培養システム200の種々の局面をモニターするための信号は、チップ230からチップ230の特定の位置において取られ得、そしてチップ230を離れる出力に移動し得る。1つの例として、チップ230上の信号経路310、320、330は、一体化された埋込式の導波管である。チップ230は、このような実施形態において、シリコン、ガラスまたはポリマーから作製され得る。導波管310、320、330は、光をチップの先端に保持し、ここで、変換器312、322、332は、光信号を電気信号に変換するために配置される。次いで、システム200内の細胞は、蛍光、発光、もしくは吸収またはこれらの特性の全てについてモニターされて、システム200内の細胞を問い合わせそしてモニターし得る。蛍光をチェックするには、光源を必要とする。光源は、分子を問い合わせるために使用され、そしてシグナルキャリア(例えば、導波管310、320、330)または光ファイバーは、信号をとらえ、その信号をチップ230から送り出す。信号キャリア310、320、330は、光を、チップの信号運搬部分310、320、330の端部近くの光検出器に向ける。
【0096】
図4は、本発明のシステム200の別の実施形態の概略図である。この実施形態において、バイオセンサ410、420、430、440、450、および460は、チップ230の細胞培養チャンバの上流および下流のチップ上に位置付けられる。バイオセンサ410、420、430、440、450、460は、酸素、二酸化炭素、および/または培地のpHをモニターする。これらのセンサは、システム200のモニタリングおよび健康な環境を維持するために必要とされるように、気体レベルの調節を可能にする。さらに、各細胞コンパートメントのすぐ上流および下流に位置付けられる場合、バイオセンサは、細胞代謝および生存性に対する有用な情報を提供する。
【0097】
図5A〜5Gは、ポリマーベースの使い捨て可能チップ230を作製するために使用される工程を示す。シリコンウェハ20は、薄層のフォトレジスト21でスピンコーティングされる(図5A)。フォトレジスト21は、所望の特徴を含むフォトマスク23を通るUV光22に曝される(図5B)。UVに曝されたフォトレジスト21は、適切な溶液中で現像され、シリコン20を曝す(図5C)。シリコン20は、誘導結合プラズマエッチングシステムを使用して所望の深さまでエッチングされる(図5D)。残るフォトレジストは、適切な溶媒を用いて除去される(図5E)。非常に薄い金(またはTi)プレートベース24を、シリコン基材20上に堆積させ、図5Eに示されるように、電気メッキプロセスのためのテンプレートを作製する。サンプルをニッケルスルファメート型メッキ浴中に浸し、そしてニッケル25を、シリコンテンプレート20の上に、ニッケルの厚みが十分であり、金が伝導層として作用するまで、電気メッキする。ニッケルマスターは、金層を離れて増加し、そして金は、ニッケルマスターの一部になる。これは、図5Fに示される、Ni特徴25を形成する。メッキ速度(メッキ電流、テンプレート直径およびテンプレートの厚みの関数である)を、約45nm/分で較正する。製造後、特徴25は、特徴的寸法を確認するために、顕微鏡を使用して調べられる。得られるニッケル特徴25は、均一でなければならず、そして所望の形状を有さなければならない。ニッケルマスター25およびポリマー基材26を、ポリマーのガラス転移温度のちょうど上まで加熱する。ニッケルマスター25およびポリマー26は、接触され、そしてニッケルマスター25の特徴は、ポリマー基材26にエンボス加工される。ニッケルマスター25は除去され、従って、元のシリコンウェハ20の同一の特徴を含むポリマー26を生成する(図5G)。
【0098】
図6は、本発明のシステム200の第3の実施形態の概略図である。この実施形態において、バイオセンサ600、602、604は、チップ230の周囲に位置付けられる。バイオセンサ600、602、604は、チップ230上に作製されるシステム200の細胞の状態をさらにモニターするために使用される。有利には、チップ230の周囲にバイオセンサ600、602、604を位置付けることによって、チップ230は、最小量の費用で使い捨て可能にされ得る。言い換えると、バイオセンサ600、602、604は、チップ230とともに廃棄される必要がない。バイオセンサ600、602、604はまた、使い捨て可能チップ230を基板上に提供され得ることが注意されるべきである。この特定の選択は、費用効果的ではない。なぜなら、チップ230に配置するバイオセンサ600、602、604もまた、バイオセンサ600、602、604を廃棄するからである。バイオセンサ600、602、604がチップ230と離れて位置付けられる場合、バイオセンサ600、602、604がそれぞれの使用後に処分されるよりも、再使用されるので、より費用効果的である。バイオセンサ600、602、604のそれぞれが、コンピューター620の入力に接続される。
【0099】
図7は、コンピューター620をさらに詳細に示す概略である。コンピューター620は、各チップ230のシステム200の操作をモニターしそして制御する。コンピューター620は、入力/出力インターフェース700および内部レジスター/キャッシュメモリ702を備える。示されるように、マイクロプロセッサ798は、接続716を介してキーボード704に、コネクタ718を介して不揮発性記憶メモリ706、汎用メモリ708、およびルックアップテーブル710に、そしてコネクタ720を介してプリンタ/プロッターレコーダー712およびディスプレイ714にインターフェースをとる。
【0100】
不揮発性記憶メモリ706は、CD書き込み型メモリ、磁気テープメモリー、ディスクドライブなどの形態であり得る。ルックアップテーブル710は、このシステムにおいてモデル化される種々の物質に適用可能な一組のマスバランス(mass balance)式の保存のために蓄えられる汎用メモリ708の一部を物理的に備え得る。これらの式は、システムの種々の生物学的/化学的物質についての生理学に基づく薬物動態学的モデルを表す。内部レジスター/キャッシュメモリ702および汎用メモリ708は、各チップ230のシステム200において実質的にすべての機能を自動的に制御するための複数のプログラム説明書および特別なデータの形態でシステムプログラムを備える。コンピューターはまた、システム200に関連するポンプ260を制御および調節し得る。
【0101】
流体フローもまた、フローメーターからの入力/出力インターフェース700を介してマイクロプロセッサ798への入力として提供され得る。これは、プログラムコマンドの調節によりシステム内の流体の流速に対する正確な制御をい可能にし、このコマンドは、それぞれ、ポンプ制御ラインを介してポンプ260に伝達される。例えば、流速は、導管58において9.5μL/分、フローメーター66を通る2.5μL/分、フローメーター78を通る7μL/分、および導管70の2.5μL/分に設定され得る。レザバ50内の培養培地の温度はまた、マイクロプロセッサ798によって、調節され、このプロセッサは、入力/出力インターフェース700および温度指示ライン728を介して、温度プローブ792からの温度測定を受容する。これらの信号に応答して、ヒーターコイル790は、入力/出力インターフェース700およびヒーターコイル性制御ライン730を介してマイクロプロセッサ798によってオンおよびオフにされる。
【0102】
細胞培養チャンバ210および212における生物学的および毒物学的反応/変化は、それぞれ、センサ600、602、および604によって検出され、そして制御ラインならびに入力/出力インターフェース700を介してマイクロプロセッサ798と連絡する。センサは、試験結果を表す特定の値または範囲波長の点で、試験結果を表すために設計され得る。
【0103】
マイクロプロセッサ798はまた、キーボード704を介して、研究者にインタラクティブな制御を提供するために、プログラムを備えるように非常に容易に適合され得る。これは、例えば、任意の所定の時間において、培養コンパートメントのいずれかの条件に対して特別にチェックするようにコンピューターを指示する。
【0104】
本発明によって提供されるさらなる選択は、CD/テープメモリー706から情報を呼び戻すことによって類似の結果についての以前に保存された試験結果を呼び戻す能力である。このように、メモリ706は、公開された情報、本発明のシステムを用いて実行された以前の実行試験から集めたデータ、または理論的な計算から誘導されるデータからの履歴的データを保持するためにプログラムされ得る。CD/テープメモリーの準備によってまた、システムが、情報検索ツールとして使用され得る。例えば、キーボード704を介してマイクロプロセッサ798に入力される選択情報に基づいて、特定の試験化合物または特定の培養ラインに関する検索データを得ることができる。メモリ706内に大きなライブラリの情報を含むかまたは開発することによって、研究者は、試験実行をより知的に構成および計画し得る。
【0105】
図8は、1つより多くのチップ230が単一のハウジング800内に収容され得ることを示す概略である。ハウジング800は、ハウジング内のチップ230それぞれについて同じ条件に維持する環境チャンバであり得る。ハウジング800は、複数のチップ配置810、812、814、816を備える。各チップ230またはチップ配置810、812、814、816からの出力は、コンピューター620に対する入力である。次いで、コンピューター620は、リアルタイム内の複数のチップ230からシステム200をモニターし得る。
【0106】
図9は、試験が、異なるハウジング800、900内の1セットのチップ230を含み得ることを示す概略である。チップ230の出力は、環境における変化(例えば、温度がわずかに上昇した、など)をモニターし得る。1つのハウジング内のチップのそれぞれが小さな細胞培養物をその上に有するか、またはハウジング800内のチップ230が、互いに相互接続されるチップを有し得、ハウジング内に哺乳動物の異なる部分または相互依存する期間を形成する。
【0107】
図2〜4および6〜9に関して議論されるチップ230は、2次元の細胞培養チャンバ210、212、213、214を使用する。3次元組織培養構築物がそれらの代謝においてより信頼があり得るので、なおべつのチップ1000が、3次元構築物を包含することを取り組む。以下は、マイクロスケール細胞培養アナログデバイス(「CCA」)の作製を記載し、これは、3次元組織をモジュラー形式で組み込む。CCAデバイスまたはチップ1000は、肺細胞チャンバに対するフローオーバーアプローチ、および他の器官に対するフロースルーアプローチを組み込む。CCA設計に対するフロースルーアプローチは、さらに以下に議論される。
【0108】
図10は、チップ1000の概略およびフローレジメを示す。チップ1000は、4つのウェルまたは組織モジュールを備える。チップ1000は、肺ウェル1010、肝臓ウェル1020、脂肪ウェル1030、ならびにゆっくり灌流するウェル1040および迅速に還流するウェル1050を備える。チューブは、チップ1000を通る流体を循環するために使用される。ポンプ1060は、チューブを通して流体を移動させる。肺ウェル1010は、最初にフローの全てを受容する。肺1010の後に、流体は、4つの組織モジュールに分配される。肝臓モジュールは、25%のフローを得、脂肪モジュールは、9%、ゆっくり灌流するモジュールは、15%、そして迅速に灌流するセクションは、51%を得る。フローチャネルの形状を調整することは、肺ウェル1010からフローを分配する。各モジュールに対するチャネルは、圧力低下の平衡をとり、そしてフローのバランスを取るために異なる長さである。流体が他の組織を出た後、ポンプ1060を介して肺コンパートメント内に再循環して戻る。ウェルまたは組織モジュール1020、1030、1040、1050のそれぞれが組織を保持する。組織は、ウェル1020、1030、1040、1050内の微小規模チューブ1022、1032、1042、1052に保持される。図10に示されるように、1つのウェル1020、1030、1040、1050当たり1つのみの微小規模チューブ1022、1032、1042、1052が存在する。複数のマイクロチューブがウェル内に配置されることに注意するべきである。
【0109】
操作において、3次元組織が、CCAデバイスまたはチップ1000に組み込まれ得る2つの方法が存在する。両方の方法が、ポリスチレンまたはガラスの微小規模チューブを介して播種された培地のフローを含む。試験下の細胞は、チューブの内側に接着し、そして3次元組織に凝集する。チューブを収集し、束ね、そしてチップ1000上のウェルに配置する。各ウェルは、水性薬剤が流れて、組織に接触する器官モジュールになる。
【0110】
3次元組織の組み込みを可能にする第1の方法は、フロースルーリアクターストラテジーを含む。開口部がシリコンウェハに形成され、次いでチャネル培地が、開口を通る。開口部の内側表面のシリコンが、細胞のための足場を提供し、これらは、3次元組織に凝集する。この技術をポリマーCCA1000に適用するために、ポリマーチューブは、接着タンパク質を用いて処理され得るか、または細胞が、血清付加培地で培養され得るかのいずれかである。血清および接着タンパク質の両方によって、細胞が、チューブの内側表面に固着し得る。
【0111】
第2の方法は、細胞をHARVミクロ重力リアクター中で培養する工程を包含する。回転するリアクターの中心にチューブの足場を設けることによって、または細胞培地内に浮動性のチューブを導入することによって、細胞は、チューブのいくつかに3次元凝集物を形成する。ミクロ重力内で増殖される細胞の高い活性に起因して、これらの組織構築物は、2次元組織または上記方法で形成される組織と比較して、優れた機能を有する。内側に組織を有するチューブは、重量または密度に従って分離され得、そしてデバイス上に配置され得る。
【0112】
図11は、チップ1000を組み込む細胞培養アナログデバイス1100の部分的に分解した等角図である。チップ1000は、肺細胞培養領域1010およびこの肺細胞培養領域1010に接続された複数のウェルを備える。このウェルは、肝臓組織ウェル1020、脂肪組織ウェル1030、低速灌流ウェル(slowly perfused well)1040、および高速灌流ウェル(rapidly perfused well)1050を備える。種々の組織を含む微小規模のチューブは、ウェル1020、1030、1040および1050内に適合される。各ウェルは、チップ1000に取り付けられたエラストマー底部1110への排出管(output)を備える。エラストマー1110は、ポンプの一部である。アクチュエータ1120は、エラストマーに加圧して、ポンプ作用を生じ、システム1100の流体を移動させるかまたはシステム1100に流体をウェルから肺組織モジュール1010に戻すように、戻りライン1130を介して循環させる。ガラス層は、チップの頂部の上に置かれて、肺組織モジュール1010、および種々のウェル1020、1030、1040、および1050を覆う。チャネル1021、1031、1041、および1051は、種々のウェル1020、1030、1040、および1050を通って特定の流速を生じるような寸法にされることに注意すべきである。種々のチャネル1021、1031、1041、1051の長さおよび幅を合わせるよりむしろ、他のフローレストリクター(flow restrictor)が、種々のウェル1020、1030、1040、および1050への流速内の変動性をもたらすために、チャネルに沿って配置され得ることが企図される。ガラストップ1140は、屈曲する膜と取り替えられ得、プランジャーボール型バルブが付加され得、その結果、チャネル1021、1031、1041、および1051中の流れは、チャネルの直径以外により調節され得る。
【0113】
チップ1100は、ケイ素から作製され得るが、ポリスチレンまたはいくつかの他の適切なプラスチックからチップ1000を作製するのが最も費用効率的である。各チップは、従来の手段によりケイ素中に最初に形成される。次いで、ニッケルマスター(nickel master)は、ケイ素から形成される。言い換えると、チップ1000は、ポリスチレンおよびシリコーンエラストマーをケイ素およびニッケルマスター上にレプリカ成形することにより製造される。当然のことながら、ポリマーチップの製造における第1の工程は、シリコンウェハ上にチップを作製することである。始めに、フォトレジスト1210の層をシリコンウェハ1200の上に配置する。このフォトレジスト1210の上にマスクを配置する。このマスクは、肺組織培養領域1010のパターンを構成する。マスクにより、UV光を肺領域1010に対応する部分だけ露出するようにフォトレジストに通過させる。次いで、フォトレジストを、開口部1211を生成するように現像する。この開口部は、肺組織培養領域1010に対応する。次いで、フォトレジストを有するシリコンウェハは、エッチングされて、シリコンウェハ1200内に肺の開口部1010が生成される。次いで、そのフォトレジスト1210は、シリコンウェハ1200から除去され、肺のウェル1010を有するシリコンウェハが残る。次いで、フォトレジスト1220の別の層は、ウェハ1200上に配置される。マスクは、ウェハ上に配置される。そのマスクにより、種々のウェルまたは流体チャネル(1021、1031、1041、および1051を含む)の露出が可能になり、これらのウェルまたは流体チャネルを使用して、肺のウェル1010を種々のウェル1020、1030、1040、および1050と接続する。そのマスクは、流体チャネルの領域におけるフォトレジストを露出する。次いで、フォトレジストが現像されて、流体流チャネルに対応する露出されたフォトレジストが除去される。次いで、この露出された領域が所望の深さにエッチングされる。その後、残りのフォトレジスト1220が除去され、肺のウェル1010および他のウェル1020、1030、1040、および1050を有するシリコンウェハ1200が残る。次の工程は、第3の層のフォトレジスト1230をさらに適用することである。マスクは、フォトレジストの上に配置され、そのマスクは、種々のウェル1020、1030、1040、および1050に対応する開口部を有する。そのフォトレジストは、マスキングされ、UV光に露出されて、種々のウェルに対応する開口部が作製される。そのフォトレジストは現像され、ウェル1020、1030、1040、および1050についてのその露出されたシリコン領域が残る。次いで、チップおよびフォトレジスト1230がエッチングされて、ウェル1020、1030、1040、および1050が作製される。組織モジュール1020、1030、1040、1050に対応する開口部が、プラズマにより約750μmの深さにエッチングされる。次いで、その開口部は、テーパー状端部を形成するようにKOHにより、さらに250μm湿式エッチング(wet etch)される。KOHは、54.7°の角度でシリコンの結晶学的平面に沿って、シリコンをエッチングする。次いで、フォトレジストが除去され、シリコンウェハが形成され、このシリコンウェハから、ニッケルマスターが作製され得る。
【0114】
ニッケルは、シリコンチップ上に電気メッキされて、ニッケルマスター1250が作製される。次いで、このニッケルマスターを使用して、ポリマー基材1000を鋳造またはエンボス加工し得る。レプリカ成形については、そのポリマーが溶融されるか、または適切な溶媒中に可溶化され、ニッケルマスター1250上に注がれ、始めのシリコンチップと同じ形状に固化される。エンボス加工については、図5を参照のこと。ポリマーチップ1000は、次いで、シリコーンエラストマー上に1110を介して取り付けられる。ポリマーおよびシリコーンは、層が単一のユニットを形成するように、自己シールしている。空気アクチュエータ(pneumatic actuator)1120は、チップの下に置かれて、種々の組織モジュール1020、1030、1040、1050から回収された流体をポンピングする。刻々と、トラフ(trough)が0.032μlの流体で満たされる。次いで、アクチュエータは、シリコーン上に押し上げられ、コンパートメント(compartment)1010に戻る微小チューブを介して流体を逃がす。エラストマートラフ1110およびアクチュエータ1120は、ポンプ260を形成する(図12に示される)。次いで、そのエラストマーコーティングされたポリメチルメタクリレート(PLEXIGLASTM)1140は、ウェハまたはチップ1000の頂部にシールされる。
【0115】
シリコーンが、液体で満たされるにつれて生成された圧力の力のバランスをとるために、肺細胞コンパートメント1010上のそのポリメチルメタクリレート(PLEXIGLASTM)は除去され、シリコーン膜で置き換えられる。この膜は、シリコーンポンプの作用に応じて上下し、デバイス内の圧力のバランスを保つ。種々の微小規模のチューブは、エラストマーコーティングされたポリメチルメタクリレート(PLEXIGLASTM)をチップ1000の上に配置する前に、ウェルに配置される。微小チューブを取り扱うための機械は、特定の数の組織を負荷したチューブを降ろし、回収する接着アームを備える。その機械は、チューブをデバイスへと移送し、そのチューブを、それぞれのモジュールウェル1020、1030、1040、1050に緊密にパックする。緊密なパックは、摩擦力により、細胞培養アナログデバイスへの何らかの振動に関わらず、適切な位置にチューブを維持することを可能にする。このことにより、それぞれのウェル1020、1030、1040、1050におけるチューブの周りの流体流の漏れが最小になる。緊密にフィットさせても、約5〜10%の流体流が チューブを取り囲み、シリコーン基材またはエラストマートラフ1110に直接流れる。
【0116】
図13は、エラストマートラフを示す。そのエラストマートラフは、本質的に矩形の開口部をそのトラフ中に有する、シリコーンエラストマーの部品である。この矩形の開口部は、ウェル1020、1030、1040、および1050からくる流体の流体リザーバとして働く。そのエラストマートラフ1110は、一方の側方に開口部を有し、参照番号1300により指定されている。戻りライン1130は、エラストマートラフ1110における開口部1300に取り付けられた一方の端部を、およびチップ1000の肺のウェル1010に取り付けられた他方の端部を有する。
【0117】
なお別の実施形態において、そのエラストマートラフ1110は、シリコーンエラストマーポンプ1400と置き換えられ、これは、図14に示される。そのシリコーンエラストマーポンプ1400は、チップ1000上に、および参照番号1100により示されるシステム全体を通して循環システム流をより正確に再現するように設計される。そのポンプ1400は、第1肺状チャンバ1410および第2システムチャンバ1412を備え、これらのチャンバは、別個のアクチュエータ1420および1422により作動される。複数のチャンバ1410および1412を用いると、より生理学的に現実的なポンピングパターンが、チップ1000の底部に複数トラフエラストマー基材とともに作られる。特定の時間感覚で基材の部分を押し上げるアクチュエータを有することによりシリコーンエラストマートラフ1400中に複数チャンバ1410および1412を作製することにより、心臓のポンピング活動がまねられる。
【0118】
図28Aは、本発明の1つの実施形態に従って、微小規模培養デバイスを制御するためのシステムを例示するブロック図である。この実施形態において、システム2800は、制御機器2802に接続された第1微小規模培養デバイス2806を備える。その第1微小規模培養デバイス2806は、培養培地との多くのインビボ相互作用を模倣する幾何学を有する多数の微小規模チャンバ(2808、2810、2812、および2814)を備える。ここで各チャンバは、培養培地の流れのための入り口および出口、ならびにそのチャンバと互いに連絡する微小流体チャネルを備える。制御機器2802は、第1微小規模培養デバイス2806からのデータを獲得し、その薬物動態パラメーターを制御するためのコンピューター2804を備える。
【0119】
別の実施形態において、第1微小規模培養デバイス2806は、コンピューター化(computerized)チップ上に形成される。その第1微小規模培養デバイス2806は、チャンバ中の生理学的事象を測定するために、制御機器2802に連結された1以上のセンサさらに備える。そのセンサは、酸素、二酸化炭素、または培養培地のpHをモニタリングする1以上のバイオセンサを備える。その制御機器2802は、第1微小規模培養デバイス2806を保持し、第1微小規模培養デバイス2806の頂部をシールして、微小流体チャネルを確立する。制御機器2802は、微小流体がデバイスの内外へと流れるように、微小流体の相互連絡を提供する。別の手段において、コンピューター2804は、第1微小規模培養デバイス2806のポンプ速度、温度、実験装置の長さ、およびデータ獲得の頻度からなる群より選択される薬物動態パラメーターを制御する。1つの手段において、コンピューター2804は、オペレータがまた、手動でポンプ速度、デバイス温度、実験装置の長さ、およびデータ獲得の頻度(例えば、15分ごと)を特定するように、設定スクリーンを提供する。別の手段において、コンピューター2804は、第1微小規模培養デバイス2806における流速、チャンバ幾何学、および細胞数からなる群より選択される薬物動態パラメーターを制御する。この手段において、システム2800は、完全な動物による研究および従来の組織培養研究と比較して、より迅速かつより感度の高い応答を提供する。パラメーターを制御することにより、システム2800は、もはや生理学に基づかない。別の手段において、コンピューター2804は、第1微小規模培養デバイス2806における1以上のポンプをさらに制御して、生体で遭遇するものに匹敵するチャンバ(2808、2810、2812、および2814)中の培養培地滞留時間を生成する。別の手段において、コンピューター2804は、生体の模倣した部分と関連する薬物動態パラメーターと一致した様式で、微小流体チャネルに沿って分布した1以上のバルブをさらに制御する。
【0120】
別の実施形態において、システム2800は、培養培地との多くのインビボ相互作用を模倣する幾何学を有する多数の微小規模チャンバを有する第2微小規模培養デバイスをさらに備える。ここで、各チャンバは、培養培地の流れのための入り口および出口、ならびにそれらのチャンバと相互連絡する微小流体チャネルを備える。その制御機器2802は、第2微小規模培養デバイスに連結される。
【0121】
図28Bは、微小規模培養デバイスを制御するためのシステムの別の実施形態を例示するブロック図である。この実施形態において、システム2816は、制御機器2818に連結された第1微小規模培養デバイス2806を備える。その制御機器2818は、コンピューター2804、第1微小規模培養デバイス2806の微小流体チャネル中の微小流体の循環を制御するためポンプ2820、第1微小規模培養デバイス2806の温度を制御するための加熱要素2822、光源2824、および第1微小規模培養デバイス2806内の細胞コンパートメントからの蛍光放出を検出するための光検出器2826を備える。1つの手段において、コンピューター2804は、比色測定、蛍光測定、発光、および放射能測定からなる群より選択される型の測定機器を用いて、蛍光強度についてのデータを記録する。別の手段において、加熱要素2822は、第1微小規模培養デバイス2806を温度37℃に維持する。
【0122】
図29は、本発明の1つの実施形態に従って、微小規模培養デバイスを動的に制御するためのコンピューター化方法を例示するフローチャートである。この実施形態において、そのコンピューターにより自動化された方法2900は、ブロック2902、2904、2906、および2908を包含する。ブロック2902は、微小規模培養デバイスの多くのチャンバにおける生理学的事象を測定するために、多くのセンサからのデータを分析する工程を包含する。ブロック2904は、微小規模培養デバイスのチャンバ中の培養培地の流体流速を調節する工程を包含する。ブロック2906は、微小規模培養デバイスのチャンバ中の生物学的反応または毒物学的反応を検出する工程を包含する。このような検出の際、ブロック2908は、微小規模培養デバイスの1以上の薬物動態パラメーターを変更する工程を包含する。
【0123】
1つの実施形態において、ブロック2906(すなわち、検出する工程)は、微小規模培養デバイスの細胞コンパートメントの寸法の変化を検出する工程を包含する。1つの手段において、ブロック2908(すなわち、変更する工程)は、細胞間の相互作用、液体滞留時間、液体 対 細胞比、細胞による代謝、および微小規模培養デバイスにおける剪断応力からなる群より選択される薬物動態パラメーターを変更する工程を包含する。別の手段において、ブロック2908は、微小規模培養デバイスにおける流速、チャンバ幾何学、および細胞数からなる群より選択される薬物動態パラメーターを変更する工程を包含する。
【0124】
別の実施形態において、そのコンピューターにより自動化された方法2900は、微小規模培養デバイス内のチャンバ幾何学を最適化する工程をさらに包含する。ここで、最適化する工程は、チャンバの量を選択する工程、適切な組織または器官のサイズ比を提供するチャンバ幾何学を選択する工程、適切な液体滞留時間を提供する最適な流体流速を選択する工程、および細胞剪断応力を算出する工程を包含する。
【0125】
別の実施形態において、コンピューターにより自動化された方法2900は、培養培地の温度を調節する工程をさらに包含する。なお別の実施形態において、コンピューターにより自動化された方法2900は、微小規模培養デバイスの細胞コンパートメントからの蛍光の発光を検出する工程をさらに包含する。
【0126】
別の実施形態において、コンピューター読み取り可能な媒体は、上記のコンピューターにより自動化された方法の種々の実施形態を行うためにその媒体に格納された、コンピューターにより実施可能な命令を含む。1つの手段において、そのコンピューター読み取り可能な媒体は、メモリデバイスまたは記憶デバイスを含み得る。別の手段において、そのコンピューター読み取り可能な媒体は、搬送波において具現化されるコンピューターデータシグナルを含む。
【0127】
図30は、本発明の1つの実施形態に従って、微小規模培養デバイスを制御するためのコンピューターを例示するブロック図である。この実施形態において、そのコンピューター3000は、マイクロプロセッサ3002、汎用メモリ3004、不揮発性記憶要素3006、1以上のセンサを有する微小規模培養デバイスに対するインターフェースを含む入力/出力インターフェース3008、およびコンピューターソフトウェアを備える。そのコンピューターソフトウェアは、微小規模培養デバイスにおける多くのチャンバ中の培養培地の流体流速を調節するために、微小規模培養デバイスのチャンバ中の生物学的反応または毒物学的反応を検出するため、および検出の際に、微小規模培養デバイスの1以上の薬物動態パラメーターを変更するために、マイクロプロセッサ3002上で実施可能である。
【0128】
1つの実施形態において、不揮発性記憶要素3006は、公開された情報から採られた履歴データ、以前に実施した試験から集められたデータ、または理論的計算から得られたデータを含む。そのコンピューターソフトウェアは、ポンプ制御ラインを通じて、微小規模培養デバイスの1以上のポンプに命令を送ることにより流体の流速を調節する。1つの手段において、そのコンピューターソフトウェアは、培養培地の温度を調節するために、マイクロプロセッサ3002上でさらに実施可能である。そのコンピューターソフトウェアは、 ヒーターコイル制御ラインを通じて、微小規模培養デバイスのヒーターコイルに命令を送ることにより温度を調節する。
【0129】
別の実施形態において、コンピューター3000は、システム中の種々の生物学的物質または化学的物質についての、生理学に基づいた薬物動態モデルを表す、1セットの質量バランス式を記憶するために、汎用メモリ3004に連結されたルックアップテーブルメモリをさらに備え、およびそのコンピューターソフトウェアを記憶するためのマイクロプロセッサ3002に連結されたキャッシュメモリをさらに備え得る。
【0130】
別の実施形態において、入力/出力インターフェース3008はさらに、キーボードインターフェース、ディスプレイインターフェース、およびプリンタ/プロッターレコーダーインターフェースを備える。1つの手段において、そのコンピューター3000は、これらの入力/出力インターフェースを使用して、キーボード、ディスプレイ、およびプリンタ/プロッターレコーダー周辺デバイスに接続する。
【0131】
(実験)
以下の実施例は、本発明の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されるのであって、本発明としてみなされるものの範囲を限定することを意図するのではない。
【0132】
使用される数字(例えば、量、温度、濃度)に関して正確性を期す努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が生じる。別段示されない限り、部は、重量部であり;分子量は、重量平均分子量であり;温度は摂氏であり;圧力は大気圧であるかまたは大気圧付近である。
【0133】
(方法)
以下の方法を、実験プロセスにおいて使用した:
細胞培養。細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Manassas,VA)から入手し、組織培養インキュベーター(95% O2/5% CO2)中で推奨される完全増殖培地中で増殖させた。HepG2細胞およびHepG2/C3A細胞については、推奨される培地は、イーグル最小必須培地(アール平衡塩類溶液、2mM L−グルタミン、1.0mM ピルビン酸ナトリウム、0.1mM 非必須アミノ酸、1.5g/L 重炭酸ナトリウム、および10% ウシ胎仔血清を含有する)(EMEM)である。マッコイ5a培地(1.5mM L−グルタミン、1.5g/L 重炭酸ナトリウムおよび10%ウシ胎仔血清を含有する)は、HCT116について推奨される。
【0134】
増殖曲線。増殖曲線を、35mmディッシュに、最初は低密度でその細胞をプレートすることにより決定した。各日に、細胞をトリプシン−EDTAで剥離し、血球計算板を使用して細胞数を目視で数えることにより細胞数を決定した。三連で決定した。
【0135】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)。細胞を、適切な場合、コラーゲン処理、MATRIGELTM処理、またはポリリジン処理したスライドガラス上で培養した。約90%コンフルエントの単層になるまで増殖させたHepG2/C3Aを、トリプシン−EDTAで剥離し、約500g、5分間でペレットにした。RNAを単離し、RNEASYTMキット(Qiagen)を使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。成体ヒト肝臓総RNAを、Ambionから購入した。単離したRNAの量および純度(260/280nm比)を、BIOPHOTOMETERTM分光光度計(Eppendorf)で測定した。次いで、単離したRNAを、2UのDNase Iとともに37℃にて25分間インキュベートし、続いて、DNase不活性化試薬(Ambion)を使用して不活性化した。
【0136】
RT反応を、5μg RNA、10μM オリゴdTプライマーの混合物を使用して行い、72℃で2分間加熱し、続いて氷上に2分間おいた。次に、逆転写酵素緩衝液中に5mM DTT、600μM dNTPミックス、40U rRNasin、200U SUPERSCRIPT IITMを合わせ、42℃で1時間インキュベートした。
【0137】
2.0μlの第1鎖cDNAを、シトクロムP450アイソフォーム特異的プライマー(Rodriguez−Antona,C.,Jover,R.,Gomez−Lechon,M.−J.,およびCastell,J.V.(2000).Quantitative RT−PCR measurement of human cytochrome P−450s:application to drug induction studies.Arch.Biochem.Biophys.,376:109−116)を使用して、50μlのPCR反応系において使用した。PCR条件は、以下の通りであった:94℃で4分、続いて、94℃で40秒、60℃で45秒、72℃で50秒を28サイクル、および最後に72℃にて4分間伸長。
【0138】
PCR産物を、1.2%アガロースゲル上での電気泳動により分離し、SYBR Goldでの染色により可視化し、信頼性を得るために、適切な分子量標準と比較した。増幅したcDNAを定量するために、15μlの各PCR反応物を、0.1×Tris−EDTA緩衝液で希釈し、1:400の終濃度にてPICOGREENTM(Molecular Probes)で染色した。蛍光を、480nm励起および520nm発光にて測定した。結果を、β−アクチンに対して標準化し、少なくとも2回の別個の実験から三連にて行った。
【0139】
細胞生存度アッセイ、細胞死アッセイおよびアポトーシスアッセイ。細胞生存度および細胞死を、トリパンブルー排除またはLIVE/DEAD染色(Molecular Probes)を使用して決定した。トリパンブルー(GIBCO)(通常は、細胞質から排除される)は、死細胞および死につつある細胞を可視的に青色に染色することにより、膜が傷つけられた細胞を同定する。トリパンブルーの0.4%(w/v)溶液の1:1希釈液を、実験の終わりにチップデバイスの再循環培養培地に添加する。この溶液を、チップを通してポンピングして、室温にて30分間で廃棄した。ポンプからハウジングを除去し、反射顕微鏡(Micromaster,Fisher)下で可視化した。
【0140】
LIVE/DEAD染色は、カルセイン(calcein)AMおよびエチジウムホモダイマーからなる2成分染色である。生細胞は、カルセインAMのアセトキシメチルエステル(AM)部分を活発に加水分解して、カルセインの明るい緑色蛍光を生じる。対照的に、膜の完全性が弱められた細胞は、通常は膜不透過性のエチジウムホモダイマーにより、死細胞または死につつある細胞の核が赤色蛍光に染色される。細胞透過性核色素であるHoechst 33342は、全ての細胞についての全体的な色素として作用する。適切なフィルタセットと組むと、生細胞は、緑色を発し、死につつある細胞または死細胞は赤色を発し、そして全ての細胞は、青色の核発光により定量される。本明細書中に記載される実験について、トリパンブルーは、0.2%(w/v)にて、カルセインAMは、1:20,000にて、ヨウ化プロピジウムは、1:5,000にて、Hoechst 33342は10μg/mlにて使用される。細胞を、M2Bio立体蛍光顕微鏡(Zeiss)を用いて可視化した。全ての実験を、少なくとも3回繰り返し、測定を三連で行った。
【0141】
アポトーシス、すなわち、プログラム細胞死は、多くの方法(Smyth,P.G.,Berman,S.A.,およびBursztajn,S.(2000).Markers of apoptosis:methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.Biotechniques,32:648−665)を用いてモニターされ得る。壊死とアポトーシスを区別するために、少なくとも2つの別々のアポトーシス指標が必要とされる(Wronski,R.,Golob,N.,およびGryger,E.,(2002).Two−color,fluorescence−based microplate assay for apoptosis detection.Biotechniques,32:666−668)。1つの方法(アネキシンV−FITC結合)は、アネキシンVが2価のカルシウム存在下でホスファチジルセリンにしっかりと結合するという観察に依存する(Williamson,P.,Eijnde,S.v.d.,およびSchlegel,R.A.(2001).Phosphatidylserine exposure and phagocytosis of apoptotic cells.Apoptosis,L.M.Schwartz,およびJ.D.Ashwell,編(San Diego,Academic Press),339−364頁)。通常、ホスファチジルセリンは、細胞膜の内側リーフレット上に存在するが、アポトーシスの初期に細胞膜に移行する。発蛍光団標識アネキシンに曝露されたアポトーシス細胞は、特徴的な膜染色を呈する。微小規模チップを用いると、アネキシンV−FITC標識は、システムのPBSを用いた最初の洗浄、次いで、アネキシンV−FITC(アネキシンV結合緩衝液(Clontech)中、10 μg/ml)で30分間の再循環により、チップ上で直接的に視覚化された。次いで、細胞は、FITCフィルタセットを用いて直接的に視覚化された。
【0142】
アネキシンV標識とは対照的に、APOPTAGTMキット(Intergen Co.MA)は、免疫蛍光を用いて、アポトーシス性DNA分解および明視化(visualization)の間に露出される遊離3’−OH DNA末端を標識するために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する(Li,X.,Traganos,F.,Melamed,M.R.,およびDarzynkiewicz,Z.(1995).Single−step procedure for labeling DNA strand breaks with flourescein−or BODIPY−conjugated deoxynucleotides:detection of apoptosis and bromodeoxyuridine incorporation.Cytomety 20,172−180)。この方法はアポトーシスに対して高度に特異的であるが、この手順は、固定工程およびインキュベーション工程に起因して、チップ上で実施することができない。簡単に言うと、微小規模チップは、特定の実験条件下(細胞チップを、そのハウジングユニットから取り出し、1%ホルムアルデヒドで固定し、そして製造業者のプロトコルを用いて、APOPTAGTMキットを使用して処理する)で実施された。
【0143】
(微小規模チップの組立ておよび実験方法)
微小規模チップを、以下の通りに組立てた:コンピューター支援設計(CAD)ソフトウェア(Cadence)を用いてパターンを設計し、GCA/Mann 3600F Optical Pattern Generatorを用いて染色体フォトマスクを作製した。次いで、この高解像度パターンを、Karl Suss MA6 Contact Alignerを用いてフォトマスクを介してUV光にウェハを暴露することによって、ポジティブフォトレジスト(Shipley 1813)の薄いコート(約1μm)を備えるシリコンウエハー(直径3インチ)に移した。暴露後、次いで、フォトレジストを現像し、規定したパターンにおいてフォトレジスト層を介してシリコンを暴露する。暴露したシリコンシリコンを、PlasmaTherm SLR 770 ICP Deep Silicon Etch Systemを用いて、特定の深さ(20〜100μm)にエッチングした。フォトレジストを、アセトンを用いてウェハから剥した。個々の22mm2の微小規模チップを、ウェハから切り出し、Nanostrip(Cyantek)中で洗浄し、蒸留水でリンスし、そして170℃にて乾燥オーブンにおいて乾燥させた。
【0144】
器官のコンパートメントにおけるシリコン表面を、細胞接着を容易にするためにコラーゲンで処理した。コラーゲンI型の1mg/ml(約10μl)を微小規模チップの表面上に沈着させ、室温にて30分間インキュベートした。コラーゲン溶液を除去し、そして器官コンパートメントを細胞培養培地でリンスした。細胞を組織培養皿から剥がし、細胞数を決定し、そして濃度を、各細胞コンパートメントにおいて細胞のコンフルエントな単層になるように調製した。例えば、図2(上記)に記載される微小規模チップについて、10μlのL2細胞の懸濁液(2,400細胞/μl)を、細胞チップの肺チャンバ上に沈着させ、そして15μlのH4IIE細胞の懸濁液(3,400細胞/μl)を肝臓チャンバ上に沈着させた。細胞を、CO2インキュベーターにおいて一晩で接着させた。一旦細胞が接着すると、チップをアクリルチップハウジング内に集めた。ハウジングの上部は、チップに細胞培養培地を提供するための流体相互連絡部を備える。ステンレス鋼製チューブを、ミクロボアポンプチュービングに接続し、そして培養培地(試験化合物を有するか、もしくは有さない)を含むミクロ遠心チューブの上端にある小さな穴に挿入する。ポンプチュービングを、蠕動ポンプに接続し、この溶液でプライムし、そしてチップハウジングの注入ポートに接続する。末端に接続されるステンレス鋼製チューブを備えるポンプチュービングの小さなセクションを、排出ポートに接続させ、そしてこのチューブをミクロチューブの上端にある小さな穴に挿入し、従って、再循環流体回路が完成する。機器全体を、37℃のCO2インキュベーター内に設置する。この設定の概略図を図22に示す。
【0145】
(実施例1)
(ラットを模倣するシステムついての計算)
チップの設計において、1000個の必要な全チャンバを、2cm×2cm以内のシリコンチップ上に適合させた。チップのこのサイズは、製造が容易であり、かつ接続チュービングおよびポンプデバイス(流体の流れを方向付けるための使用が意図される)のサイズに適合可能である。各々の変数に対して受容可能な値とともに以下に列挙されるデバイスの設計を制限する、他のいくつかの要因もまた存在した。デバイスのこの1つの実施形態は、2つのコンパートメントシステムからなり、1つのコンパートメントはラットの肝臓を示し、そして1つのコンパートメントはラットの肺を示す。チップの全体のサイズは2cm×2cmであり、そして「肺」チャンバとして機能するために20個の平行チャネル(幅40μm、深さ10μmおよび長さ5mm)、および「肝臓」チャンバとして機能するために2つの平行チャネル(幅100μm、深さ20μmおよび長さ10cmのサーパタイン(serpentine))が相互連絡したアレイからなる。2つの器官コンパートメントは、チャネル(幅100μmおよび深さ20μm)によって接続される。多くの他の可能な幾何学、寸法、チャンバの数などが存在する。この設計を1つの例として選択した。
【0146】
【表1】
(サンプルの計算)
(チャネルまたはチャンバの計算)
これらの計算は、本発明者らが、上記の方法によって、システム1100のためのチップ1000について以前の繰返しから得た流速を仮定する。
【0147】
これにより、Q=8.05×105μm3/トレンチ−秒。
【0148】
次いで、トレンチでの液体滞留時間を、以下の様式によって計算した:
【0149】
【数1】
次に、「細胞−長(cell−length)」における細胞数を計算した
【0150】
【数2】
N長さ=7細胞(各項目の端数は別々に切り捨てる)
次いで、チャネル/チャンバの細胞−長体積(cell−length volume)を計算した。
【0151】
VTCL=(細胞直径)(トレンチ断面積)
VTCL=(7.41μm)・(400μm2)
VTCL=2960μm3
細胞−長体積もまた、決定した。
【0152】
【数3】
液体の細胞−長体積(liquid cell−length volume)は、単にチャネル/チャンバ細胞−長体積から、細胞の細胞−長体積を減算しただけである。細胞の細胞−長体積および液体細胞−長体積の比は、このシステムに対して液体対細胞体積の比を与える。
【0153】
【数4】
所定の流速に関する個々の細胞の剪断力を決定した。液体細胞−長体積および細胞直径に基づいて、液体が貫流するために利用可能な平均表面領域を計算した。
【0154】
【数5】
次いで、チャネル内の流体の平均線速度を決定した。
【0155】
【数6】
層流を仮定して、球上の抵抗を計算するためにストークスの法則を使用して、個々の細胞によって経験した全ての剪断力を見積もった。
【0156】
【数7】
次に、チャネル/チャンバにおける液体の実際の滞留時間を検証し、そしてチャネル/チャンバ内の全細胞数を計算した。
【0157】
【数8】
(I.B.膜酸化の計算)
酸化についてのシリコーン膜の領域を、以下の様式によって決定した:
第一に、細胞について、酸素取込み速度(OUR)を見積もった:
【0158】
【数9】
次いで、これが液体培地を再酸化するために十分であるか否かを決定するために、膜の内側の酸素分圧を計算した。これは、多孔性膜を通るガスの流量についての方程式を使用して実行され、ここで、Qは膜の透過性である。Jは、細胞内のガスの流量を示し、そしてzは、膜の厚みである。
【0159】
【数10】
この圧力は、膜との接触する200秒において、液体培地を酸素で飽和するのに十分である。膜の領域を、内部酸素分圧を最大にするために反複様式で決定した。
【0160】
(原則的な設計の見積もり)
(ラットモデル)
【0161】
【数11】
(滞留時間の見積もり)
(ラット組織における実際の(標的)滞留時間)
【0162】
【数12】
(実施例2)
(4つの器官コンパートメントチップ)
以下の4つの器官コンパートメントからなるように、チップを設計した−生体異物代謝を担う器官を示す「肝臓」コンパートメント、標的組織を示す「肺」コンパートメント、疎水性化合物の生体蓄積のための部位を提供する「脂肪」コンパートメント、および非代謝組織(非蓄積組織)における循環パターンの模倣を補助する「他の組織」コンパートメント(図15)。これらの器官および他の器官のコンパートメント(例えば、腎臓、心臓、結腸または筋肉)は、CADファイルとして十分にモジュール化され得、そして任意の形状または組み合わせにおいて作製され得る。このデバイス自体、任意の基材(例えば、シリコン、ガラスまたはプラスチック)において製造され得る。
【0163】
一旦、細胞が適切なコンパートメントに播種されると、このチップを、Luciteマニホールドにおいて組み立てた。このマニホールドは4つのチップを保持し、そして細胞がインサイチュで観察され得るように、透明な上端を備える。上端は、チップに細胞培養培地を提供するための流体内部連絡を備えた。培養培地を、蠕動ポンプを用いて0.5μl/分の流速でチップを通してくみ上げた。培養培地を、流体のレザバ(全量、約15〜50μl)、ミクロボアチュービング、ならびにチップのコンパートメントおよびチャネルからなる選択したループにおいて再循環させた。
【0164】
肝臓コンパートメントにおいてヒトHepG2−C3A細胞および標的組織コンパートメントにおいてHT29結腸癌細胞を有する3コンパートメントシステムを使用して、144時間よりも長い連続操作下で、細胞が生存し続けることを見出した。HepG2−C3A細胞は、新鮮な初代肝細胞と匹敵するレベルで、種々の肝臓代謝酵素を発現することが既知の、十分に特徴付けられたヒト肝臓細胞株である。これらの実験において、細胞を適切なコンパートメントに播種し、そして特別に処方した細胞培養培地を、144時間までシステムを通して再循環させた。種々の経過時間で、培養培地を、LIVE/DEAD蛍光試薬(二重蛍光染色[Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oregon,USA])を含むPBSに30分間置換した。細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化し、そして同一視野の蛍光画像を適切なフィルタセットを使用して得た。生存細胞は緑色蛍光を呈したが、死細胞は赤色蛍光を呈した(データは示さず)。
【0165】
(実施例3)
(チップにおける薬物代謝)
2つの広範に使用されるプロドラッグ(テガフールおよびスリンダクスルホキシド)の代謝を、3つのコンパートメント(肝臓、標的組織、および他の組織)を含む微小規模チップを用いて研究した。両方のプロドラッグは、肝臓に存在する酵素による活性代謝物への転換を必要とし、そして標的器官に対する細胞傷害性効果を有する。プロドラッグのスリンダクスルホキシドについて、その抗炎症性および癌化学予防特性は、そのスルフィド代謝物およびスルホン代謝物に由来し、肝臓酵素スルホキシドレダクターゼによって触媒される。スルフィド代謝物(および第二のスルホン代謝物)は、特定の癌細胞(例えば、結腸癌)においてアポトーシスを誘導することが実証されている。
【0166】
適切な処置レジメンは、5−FU自体は正常細胞に対してかなり毒性なので、プロドラッグのテガフール[5−フルオロ−1−(2−テトラヒドロフリル)−2,4(1H,3H)−ピリミジンジオン]の投与を必要とする。しかし、スリンダクとは違って、テガフールは、チトクロムP450 2A6によって最初に肝臓において5−FUに転換される。
【0167】
スリンダクの効果を試験するために、微小規模チップに、肝臓コンパートメントにHepG2−C3A細胞を、そして標的組織コンパートメントにHT29ヒト結腸癌細胞を播種した。100μモルのスリンダク(製造業者を必要とする)を、24時間、再循環培地に添加し、そしてチップを上記の通り処理した−生存細胞は緑色蛍光を呈したが、死細胞は赤色蛍光を呈した(データは示さず)。HepG2−C3A肝細胞の非存在下では、最小レベルの細胞死(ビヒクルコントロールに類似する)を観察した。これらの結果は、薬物が、肝臓コンパートメントにおいて代謝され得、その結果、その代謝物が生存する動物およびヒトにおいて行うと同様な生物学的な効果を誘導する標的に循環されることを実証する。
【0168】
癌治療プロドラッグテガフールを、微小規模チップシステムで試験した。有効性のために、テガフールは、肝臓に存在するチトクロム P450酵素による、代謝活性形態(5−フルオロウラシル(5−FU))への代謝活性化を必要とする(Ikeda,K.,Yoshisue,K.,Matsushima,E.,Nagayama,S.,Kobayashi,K.,Tyson,C.A.,Chiba,K.,およびKawaguchi,Y.(2000).Bioactivation of tegafur to 5−fluorouracil is catalyzed by cytochrome P−450 2A6 in human liver microsomes in vitro.Clin.Cancer Res.,6,4409−4415;Komatsu,T.,Yamazaki,H.,Shimada,N.,Nakajima,M.,およびYokoi,T.(2000).Roles of cytochromes P450 1A2,2A6,and 2C8 in 5−fluorouracil formation from tegafur,an anticancer prodrug,in human liver microsomes.Drug Met.Disp.,28,1457−1463;Yamazaki,H.,Komatsu,T.,Takemoto,K.,Shimada,N.,Nakajima,M.,およびYokoi,T.(2001).Rat cytochrome P450 1A and 3A enzymes involved in bioactivation of tegafur to 5−fluorouracil and autoinduced by tegafur liver microsomes.Drug Met.Disp.,29,794−797.A proper therapeutic regimen requires administration of its pro−drug,tegafur,as 5−FU itself is very toxic to normal cells.5−FU is currently the most effective adjuvant therapy for patients with colon cancer(Hwang,P.M.,Bunz,F.,Yu,J.,Rago,C.,Chan,T.A.,Murphy,M.P.,Kelso,G.F.,Smith,R.A.J.,Kinzler,K.W.,およびVogelstein,B.(2001).Ferredoxin reductase affects p53−dependent,5−fluorouracil−induced apoptosis in colorectal cancer cells.Nat.Med.,7,1111−1117.)Like most chemotherapeutic agents,5−FU induces marked apoptosis in sensitive cells through generation of reactive oxygen species(Hwang,P.M.,Bunz,F., Yu,J.,Rago,C.,Chan,T.A.,Murphy,M.P.,Kelso,G.F.,Smith,R.A.J.,Kinzler,K.W.,およびVogelstein,B.(2001).Ferredoxin reductase affects p53−dependent,5−fluorouracil−induced in colorectal cancer cells.Nat.Med.,7,1111−1117)。
【0169】
結腸癌細胞に対するテガフールの細胞傷害性効果を測定するために、微小規模チップを、肝臓コンパートメント中のHepG2−C3Aおよび標的組織コンパートメントのHCT−116ヒト結腸癌細胞を用いて調製した。テガフールを、種々の濃度で24時間再循環培地に添加して、細胞を、Hoechst33342(膜透過性DNA色素)およびエチジウムホモダイマー(膜不透過性DNA色素)を用いて標識した(方法の節を参照のこと)。全細胞が青の蛍光発色する一方、死細胞は、蛍光性の赤のエチジウムホモダイマーにより印付けられた(データは示さず)。テガフールは、この微小規模チップシステムにおいて、用量依存様式で、HCT−116細胞に対して細胞傷害性であったが、これは、従来の細胞培養アッセイでは効果的でなかった(図16Aおよび図16B)。さらに、5−FUは、従来の細胞培養アッセイにおいて細胞死を誘発したが、細胞傷害性は、微小規模チップを用いたテガフールへの24時間の曝露と比較して、48時間の曝露後まで観察されなかった。
【0170】
肝臓コンパートメントがテガフールの生物活性化を引き起こすことを実証するために、微小規模チップを、HCT−116細胞のみを用いて播種した。肝臓コンパートメントでは、細胞は存在しなかった。テガフールまたは5−FUを、再循環培養培地に24時間添加して、そして、このチップを、上記のように処置した(データは示さず)。テガフールは、肝臓コンパートメントの非存在下では、HCT−116細胞の顕著な細胞死を引き起こさなかったが、活性代謝産物である5−FUは、かなりの細胞死を引き起こした。さらに、HT−29結腸癌細胞をHTC−116と置き換えた場合、テガフールは、有効でなかった(データは示さず)。これは、HT−29細胞中に存在する変異体p53に起因するようであり、これが、5−FU細胞傷害性に必要である。一緒にすると、これらの実験によって、テガフールは、スリンダクと同様に、このテガフールが癌細胞を排除するために別の器官コンパートメントに循環される肝臓コンパートメントにおいて、活性薬物まで代謝されたことが実証される。これらの効果は、チップを用いて機械的に区別可能であった−スリンダクは、活性p53の非存在下でさえ効果的であったが、テガフールはそうではなかった。
【0171】
(実施例4)
(単一器官コンパートメントにおける複数の細胞培養)
単一器官コンパートメント中で複数の細胞型の混合物を使用することもまた、可能である。1つの研究において、肝実質細胞の細胞株HepG2/C3A(ATCCから)を、肝臓コンパートメントにおいて使用する。この細胞を、1.5mM L−グルタミン、1.5g/L炭酸水素ナトリウム、および10%ウシ胎仔血清を含む、マコイ5A培地中で増殖させる。インビボ器官をより厳密に模倣するために、一次肝実質細胞および線維芽細胞の混合物を、マクロファージ(クッパー細胞)と共に、1:2の比率で使用し得る。
【0172】
別の例において、肺上皮細胞由来の細胞または細胞株の混合物を、肺組織をより厳密に模倣するために使用する。これは、I型上皮細胞、II型上皮細胞(顆粒様肺胞細胞)、線維芽細胞、マクロファージおよび肥胖細胞の混合物を含む。
【0173】
(実施例5)
(チップベースの系における組織培養条件の最適化)
2つの異なるラット細胞培養株である、H4IIE(ラット肝臓細胞株)およびL2(ラット肺細胞株)に適合する組織培養培地を、作り出した。予備実験は、DMEMとHams F12Kの1:1の混合物の培地(2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウムおよび10%のウシ胎仔血清(FBS)を補充した)が、微小規模チップにおいて、20時間までの連続操作の間、H4IIE細胞およびL2細胞の両方の生存度を維持することを示した。この培地処方を、全てのラットベースの微小規模チップ研究のために使用した。
【0174】
ヒトの肝臓機能を現実的に模倣する適切なヒト肝臓細胞株を、選択した。さらに、微小規模チップでヒト細胞株を維持するのに最適な細胞培養培地処方を、決定した。HepG2細胞株およびHepG2/C3A(HepG2のサブクローン)細胞株中での3つの重要なシトクロムであるP450(CYP)アイソフォーム(1A2、3A4および2D6)の基底発現レベルを、試験した。CYP−1A2、CYP−2D6およびCYP−3A4を、試験した。なぜならば、これらは、全ての公知の薬物の80〜90%の代謝を占めるからである(Hodgson,J.,(2001)ADMET−turning chemicals into drugs.Nat.Biotech.,19,722−726)。HepG2肝臓細胞株のC3Aサブクローンを試験した。なぜならば、この細胞株は、より「肝臓様」の特徴(特に、親細胞株と比較して、はるかに高いCYP発現)を示す、高度に選択された細胞株であることが報告されているからである(Kelly,J.H.(1994).Permanent human hepatocyte cell line and its use in a liver assist device(LAD)。米国特許第5,290,684号)。RT−PCR分析は、HepG2/C3A細胞における基底のCYPレベルが、HepG2親株よりも有意に高く、そして、成体ヒト肝臓と比較し得ることを確認した(図23)。
【0175】
HepG2/C3A細胞を、全ての続く実験において、肝臓代理として使用した。微小規模チップ実験の間に使用するための共通の培地を選択するために、多数の培地成分を、比較した(DMEM、マコイ5a、RPMI 1640、MEM、F12、F12K、Waymouth’s、CMRL、MEMおよびIscoveの改変ダルベッコ培地)。無機塩、グルコース、アミノ酸組成、およびビタミン含量の分析は、EMEM、DMEM、マコイ5aおよびRPMIが、試験された培地の、最も適切な「共通」培地であった。数継代後、次いで、細胞を分配して、以下の培地中でサブ培養した:
Earle平衡塩類溶液、2mM L−グルタミン、1.0mM ピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、1.5g/L 炭酸水素ナトリウム、および10% ウシ胎仔血清を含む、Eagle最小必須培地(EMEM)。
【0176】
4mM L−グルタミン、4.5g/L グルコース、1.5g/L 炭酸水素ナトリウム、および10%ウシ胎仔血清を含む、ダルベッコ改変Eagle培地(DMEM)。
【0177】
1.5mM L−グルタミン、1.5g/L 炭酸水素ナトリウム、および、10% ウシ胎仔血清を含む、マコイ5a培地(McCoy’s)。
【0178】
2mM L−グルタミン、4.5g/L グルコース、1.0mM ピルビン酸ナトリウム、1.5g/L 炭酸水素ナトリウムを含む、RPMI1640培地(RPMI)。
【0179】
各培地中の両方の細胞株についての増殖曲線を、次いで、方法の節で記載したように決定した(図24)。DMEMが、HepG2/C3A細胞には不適切であることが見出された。なぜならば、約5継代後の細胞形態および細胞接着において顕著な変化が観察されたからである(示さず)。同様に、RPMIにおける、3日後のHepG2/C3AおよびHCT116の生存度および増殖の顕著な減少に注目した。両方の細胞株は、それらの好ましい培地と比較して、McCoy’sおよびEMEMにおいて良好に増殖した。
【0180】
次に、RT−PCRを使用して、EMEMか、または、McCoy’sのいずれかにおいてHepG2/C3A細胞が増殖する際の、これらのCYPアイソフォームの発現レベルを調査した(方法の節参照)(図25)。この結果は、EMEMが、CYP発現を維持するためにMcCoy’sより優れており、そして、HepG2/C3Aのための好ましい培地であることを示した。CYP発現に対する異なる増殖基質の効果を研究した(図26)。標準的組織培養で処置したポリスチレンでの増殖した細胞に対して、付着基質としてポリ−D−リジンか、またはコラーゲンのいずれかを用いて処置したシリコンの比較を実施した。一緒にすると、この結果は、EMEMが、HepG2/C3A細胞およびHCT116細胞の両方の増殖を支持すること、および、コラーゲンは、RT−PCRのCYP発現分析に基づく好ましい基質であることを示した。
【0181】
これらの条件を使用して、これらの細胞(HepG2/C3AおよびHCT116)の長期細胞生存度を、微小規模チップ系における連続操作下で研究した。肝臓コンパートメント中のヒトHepG2/C3A細胞および標的細胞コンパートメント中のHCT116結腸癌細胞を用いた3つのコンパートメント系を使用して、細胞が、144時間よりも長い間、連続操作下で生存し続けることを実証した。これらの実験において、細胞を適切なコンパートメント中に播種して、そして、EMEMを、144時間までの間、この系を介して再循環した。種々の時点(6時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間および144時間)にて、全生細胞または全死細胞を、LIVE/DEAD染色を使用して可視化した(データは示さず)。細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化して、同一の領域の蛍光画像を、適切なフィルタセットを使用して得た。生細胞は緑で蛍光発色する一方、死細胞は赤だった(データは示さず)。
【0182】
(実施例6)
(微小規模チップでの細胞傷害性の検出のためのアッセイ)
トリパンブルーは、生育不能細胞から生細胞を区別するために使用される、最も通常の染色である;生育不能細胞のみが色素を吸収して、青に見える。逆に、生存する、健康な細胞は、青色素を吸収することなく、円形で屈折して見える。微小規模チップにおける細胞生存度を決定するために、トリパンブルーを使用して、実験を実施した。トリパンブルー(方法の節を参照のこと)は、容易に使え、そして、可視化するために光学顕微鏡のみを必要とするが、生細胞は、時間をかけてトリパンブルーを吸収する(このことは、結果に影響し得る)。さらに、トリパンブルーは、細胞タンパク質よりも、血清タンパク質に対して高い親和性を有し、従って、背景は、血清含有培地を使用する場合、暗い。従って、死細胞から生細胞を区別する代替の方法を、研究した。
【0183】
LIVE/DEADアッセイを、ガラスのカバーガラス上で増殖した細胞を使用して最適化した(方法の節を参照のこと)。簡単に言えば、HepG2/C3A細胞を、ポリ−D−リジンで処理したガラスのカバーガラス上に播種して、そして、1μMのスタウロスポリンを用いて、および1μMのスタウロスポリンを用いないで、24時間処置した。スタウロスポリンは、広範なスペクトルを有するプロテインキナーゼインヒビターであり、種々の細胞型においてアポトーシスを誘導することが知られている(Smyth,P.G.,Berman,S.A.,およびBursztajn,S.(2002)、Markers of apoptosis:methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.Biotechniques,32,648−665)。カバーガラスを、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を使用して洗浄して、LIVE/DEAD試薬を添加して、室温で30分間、インキュベートした。このカバーガラスを除去して、可視化した(データは示さず)。スタウロスポリンが、HepG2/C3A細胞の細胞死を明らかに引き起こすことが見出された(データは示さず)。
【0184】
微小規模チップ系での細胞傷害性の検出のためのアッセイを、次いで最適化した。微小規模チップの細胞チップを、方法の節に記載するとおり、肝臓コンパートメント中のHepG2/C3A細胞および標的組織コンパートメント中のHCT116細胞を用いて播種した。細胞チップを、微小規模チップ系に充填して、上記のとおりに、1μMのスタウロスポリンを用いて、および1μMのスタウロスポリンを用いないで処理した。24時間のインキュベーション後、再循環培地をPBSに切り換えて、30分間この系に流して、次いで、LIVE/DEAD試薬を含むPBSに切り換えて、さらに30分間、この系に流した。この細胞チップを含むアクリル製ハウジングを、この系から取り除き、立体蛍光顕微鏡下に配置して、この細胞チップを、このハウジングの透明な頂点から可視化した(データは示さず)。細胞を蛍光顕微鏡下で可視化して、同じ領域の蛍光画像を、適切なフィルタセットを用いて得た。生細胞は緑の蛍光発色する一方、死細胞は、赤だった(データは示さず)。HCT116細胞の有意な細胞死は、非処置のコントロール細胞チップと比較して、処置の24時間後に、1μMのスタウロスポリンにより引き起こされた(データは示さず)。
【0185】
(実施例7)
(細胞死の発生の検出およびアポトーシスまたは壊死を区別するための、チップベースのアッセイ)
アポトーシスを検出するために、2つの異なるアッセイを調査した。第1のアッセイは、APOPTAGTM(Intergen Co.,MA)としてキット形態で入手可能である、免疫蛍光ベースの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼBrdUニック末端標識(TUNEL)技術である(方法の節を参照のこと)。このアッセイを、ガラスのカバーガラス上で増殖した細胞を使用して、最初に最適化した。簡単に言うと、HepG2/C3A細胞を、ポリ−D−リジンで処置したガラスのカバーガラス上に播種して、スタウロスポリンを用いておよびスタウロスポリンを用いないで、処置した。カバーガラスを、記載されるように処理した(方法の節を参照のこと)。種々のスタウロスポリン濃度および処置時間を試験して、この結果は、1μMのスタウロスポリンが、24時間のインキュベーション後に、非処置コントロールと比較して、有意なアポトーシスを引き起こすことを示した(データは示さず)。次に、微小規模チップ系でのアポトーシスの検出のためのアッセイを最適化して、APOPTAGTM法とLIVE/DEAD染色技術との比較を実施した。この微小規模細胞チップを、方法の節に記載されるように、肝臓コンパートメント中のHepG2/C3Aおよび標的細胞コンパートメント中のHCT116細胞を用いて播種した。細胞チップを、微小規模チップ系上に充填して、上記のとおりに、1μMのスタウロスポリンを用いて、および1μMのスタウロスポリンを用いないで処理した。24時間のインキュベーション後、再循環培地を、30分間PBSに切り換えた。この細胞チップの半分を、ハウジングから取り除き、APOPTAGTMアッセイを、上記のとおりに実施した。他方の細胞チップを、微小規模チップ系に残して、前記したとおりに、LIVE/DEAD染色技術に供した。細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化して、同一の領域の蛍光画像を、適切なフィルタセットを使用して得た。生細胞は、緑の蛍光発色する一方、死細胞は赤だった(データは示さず)。両技術ともに、非常に類似した結果を生じた(すなわち、1μMへの24時間の曝露により、非処置コントロールと比較して、HCT116細胞に対して、有意なアポトーシス(または細胞傷害性)を誘導した)(データは示さず)。
【0186】
アネキシンV−FITCを使用して、方法の節で記載したとおりに、微小規模チップ系でのアポトーシスを検出した。簡単に言うと、微小規模チップの細胞チップを、肝臓コンパートメント中のHepG2/C3Aおよび標的細胞コンパートメント中のHCT116細胞を用いて播種した。細胞チップを、微小規模チップ系上に充填して、上記のとおりに、1μMのスタウロスポリンを用いて、および1μMのスタウロスポリンを用いないで処理した。6時間のインキュベーション後、再循環培地をアネキシンV−FITCおよびヘキスト33342を含むPBSに切り換えて、この系に30分間流した。細胞チップを、アクリル製のハウジングから取り除き、蛍光顕微鏡下で可視化した。細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化して、同一の領域の蛍光画像を、適切なフィルタセットから得た。生細胞は、緑の蛍光発色する一方、死細胞は赤だった(データは示さず)。1μMのスタウロスポリンは、非処理コントロール細胞チップと比較して、6時間の処置後に有意なアポトーシスを引き起こした(データは示さず)。
【0187】
(実施例8)
(モデル毒薬としてのナフタレンの使用)
ナフタレンを使用して、毒物学を研究した。なぜならば、肝臓中での酵素的変換が、肺の毒性に必要であるからである。従って、ラット肺細胞株に対するナフタレンの効果を研究した。これらの実験は、三つのコンパートメント(肝臓、肺および他の組織)の、肝臓コンパートメント中のH4IIE細胞および肺コンパートメント中のラットL2細胞を用いたラットベースの微小規模チップを使用した。微小規模チップを、方法の節で記載したとおりに、実験のために加工および調製した。
【0188】
微小規模チップ系を、トリパンブルーを含有するPBSに切り換える前に、250μg/ml ナフタレンの存在下または250μg/ml ナフタレンの非存在下で20時間、操作した。このPBSの溶液を、細胞チップを介して、30分間再循環して、このチップを、光学顕微鏡下で可視化した(方法の節を参照のこと)。ナフタレンが、この細胞チップの肺コンパートメントにおいてラットL2細胞の有意な細胞死を引き起こす一方、ナフタレンの非存在下では細胞死は観察されなかった(データは示さず)。ナフタレンの含有に関わらずH4IIE細胞コンパートメントにおいて、または、H4IIE細胞の非存在下でのL2細胞コンパートメントにおいて、細胞死は観察されなかった(データは示さず)。
【0189】
これらの結果は、ナフタレンが、「肝臓」コンパートメントにおいて活性化されて、毒性代謝産物が、「肺」に循環して、細胞死を引き起こすことを実証する。これらの結果は、ベンチトップCCAデバイスで得られたデータと一致して、PBPKモデルから予想される(Sweeney,L.M.,Shuler,M.L.,Babish,J.G.,およびGhanem,A.(1995)。A cell culture analogue of rodent physiology:application of napthalene toxicology.Toxicol.in Vitro,9,307−316)。
【0190】
(実施例9)
(ヒト微小規模チッププロトタイプ)
肺、標的組織および他の組織についてのコンパートメントを含むヒトバイオチッププロトタイプを、調製した。これらのコンパートメントおよびチャネルの寸法は、以下のとおりであった:
入口:1mm×1mm
肝臓:幅3.2mm×長さ4mm
標的組織:2mm×2mm
他の組織:幅340μm×長さ110mm
出口:1mm×1mm
肝臓からY字型結合部に接続するチャネル:幅440μm
Y字型結合部から標的組織のチャネル:幅100μm。
ヒトバイオチッププロトタイプを、前記のように加工する。これらの器官コンパートメントの配置は、経口摂取される化合物(薬物)への曝露をまねるように企図される。化合物が、経口摂取される場合、この化合物は、小腸または大腸から血液に吸収される。ここから、この化合物は、門脈を介して肝臓に直接的に循環して、次いで、体中に分配される(図27)。従って、この設計によれば、肝臓は第1の器官コンパートメントであり、続いて、他の組織である、標的組織についてのコンパートメントおよびチャンバに分かれる。他の組織コンパートメントは、体内の血液の分布および滞留を表し、標的組織コンパートメントは、目的の治療標的(例えば、結腸腫瘍を表す結腸癌細胞)を表す。
【0191】
(結論)
本発明は、薬物速度論に基づく培養のデバイスおよびシステムを提供し、これらは、レシービング末端および出口末端を有する、第1の細胞培養チャンバ、および、レシービング末端および出口末端を有する第2の細胞培養チャンバ、ならびに、第1の細胞培養チャンバの出口末端を第2の細胞培養チャンバのレシービング末端に接続する導管を通常備える。好ましくは、このデバイスは、チップベースである(すなわち、このデバイスは、微小規模サイズである)。培養培地は、第1の細胞培養チャンバを通って、導管を通って、そして、第2の培養チャンバを通って循環し得る。この培養培地はまた、再循環ループ中の1つ以上の位置で、酸素付加され得る。
【0192】
このデバイスは、例えば、デバイスの一部からチップ外の位置にシグナルを伝達するための導波管を用いて、このデバイスの一部からチップ外の位置にシグナルを伝達するための機構を備え得る。複数の導波管(例えば、第1のチャンバからのシグナルを伝達する第1の導波管、および第2のチャンバからのシグナルを伝達する第2の導波管など)が存在し得る。
【0193】
1つの実施形態において、第1の細胞培養チャンバおよび第2の細胞培養チャンバの少なくとも1つは、三次元である。別の実施形態において、第1の細胞培養チャンバおよび第2の細胞培養チャンバの両方とも、三次元である。
【0194】
生存可能な状態に細胞を維持するためのデバイスはまた、流体循環機構を備え、これは、流動流体循環機構または流体を再循環する流体循環機構であり得る。細胞を生存可能な状態に維持するためのデバイスはまた、少なくとも第1のコンパートメントおよび第2のコンパートメントを接続する流路を備える。ある実施形態において、デバブラー(debubbler)は、流路中の気泡を除去する。このデバイスはさらに、ポンピング機構を備え得る。このポンピング機構は、基材上に位置し得る。
【0195】
少なくとも2つの細胞チャンバにおいて、少なくとも2つの型の細胞を生存可能な状態に維持するために基材をサイズ決めする方法が、提供される。この方法は、基材上に維持される細胞の型を決定する工程、および、この基材の物理学的特性を決定するために生理学に基づく薬物速度論モデルからの束縛を適用する工程を包含する。生理学に基づく薬物速度論モデルからの束縛を適用する工程は、基材上に形成されるべきチャンバの型を決定する工程を包含して、これはまた、少なくとも1つの細胞チャンバの幾何学を決定する工程、および、2つの細胞チャンバを相互接続する流路での幾何学を決定する工程を包含する。生理学に基づく薬物速度論モデルからの束縛を適用する工程はまた、流路のフロー媒体組成物を決定する工程を包含し得る。
【0196】
本明細書中に引用された全ての出版物および特許出願は、個々の出版物および特許出願のそれぞれが、参考として援用されることを詳細にかつ個々に示されるかのように、本明細書中で参考として援用される。
【0197】
上記の説明が、図解のためであり、制限されないことを意図されることが理解されるべきである。多くの他の実施形態が、上記の説明を総説する際に、当業者に理解される。本発明の範囲は、従って、権利を与えられる特許請求の範囲の等価物の完全な範囲と共に、添付のこのような特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0198】
【図1】図1は、本発明に従う系のブロック図である。
【図2】図2は、本発明の系の外観の1つの実施形態の簡素化した透視図である。
【図3】図3は、本発明の系の別の実施形態の詳細な概略図である。
【図4】図4は、本発明の系のさらに別の実施形態の概略図である。
【図5】図5A〜Gは、プラスチックからチップを製造するために使用される工程を示す。図5Aは、ポジティブフォトレジスト材料でシリコンウェハをコーティングする工程を示す。図5Bは、レジストコーティングシリコンウエハを、光材料を通してUV光に曝露する工程を示す。図5Cは、フォトレジスト材料を現像する工程を示す。図5Dは、シリコンをエッチングする工程を示す。図5Eは、フォトレジスト材料を剥ぎ取り、そして金を蒸着する工程を示す。図5Fは、ニッケルを電気メッキする工程を示す。図5Gは、シリコンを除去し、そしてポリマーをエンボス加工する工程を示す。
【図6】図6は、本発明の系のさらに別の実施形態の概略図である。
【図7】図7は、チップに関連するコンピューターを詳述する概略図である。
【図8】図8は、ハウジング内に配置された1つより多いチップを示す概略図である。
【図9】図9は、異なるハウジングからのチップのセットを含む系の概略図である。
【図10】図10は、チップのさらに別の実施形態の概略図である。
【図11】図11は、系の等尺度の部分分解図である。
【図12】図12は、図11に示される系に関連するチップを製造するための工程の等尺度の図である。
【図13】図13は、図11に示される系に関連するポンプの単一の凹型エラストマー部分の等尺度の図である。
【図14】図14は、ポンプの複数の凹型エラストマー部分の等尺度の図である。
【図15】図15は、4コンパートメントチップの概略図である。
【図16】図16は、テガフール用量応答である。チップに、HepG2−C3A細胞(肝臓コンパートメント)およびHCT−116結腸癌細胞(標的組織コンパートメント)を接種した。このチップを、示される濃度のテガフールで24時間処理した。第1のグラフ(図16A)は、チップ上での再循環の24時間後のパーセント死亡細胞 対 テガフールまたは5−FU濃度のプロットである。第2のグラフ(図16B)は、48時間の曝露を用いたHCT116細胞による、従来のインビトロ細胞培養アッセイを用いた同様の用量応答である。HCT−116細胞を、ポリリジン処理ガラスのカバーガラス上に接種し、そして示される濃度のテガフールまたは5−FUのいずれかに曝した。48時間のインキュベーション後、カバーガラスを上記のように処理し、そして細胞死のパーセントを決定した。
【図17】図17Aは、「第1世代」の3コンパートメントデバイスを示す。図17Bは、このデバイスの断面図を示す。
【図18】図18Aは、「第2世代」のデバイスを示す。図18Bは、チャンバ中の5μmの高さの隆起を示す。図18Cは、チャンバ中の20μmの高さの柱を示す。
【図19】図19は、「第3世代」のデバイスを示す。
【図20】図20は、5コンパートメントPBPKモデルCCAについての流れ図である。
【図21】図21は、肺、標的組織、および他の組織についてのコンパートメントを含むヒトバイオチッププロトタイプを示す。このコンパートメントおよびチャネルの寸法は、以下の通りである: 入口:1mm×1mm 肝臓:幅3.2mm×長さ4mm 標的組織:幅2mm×長さ2mm 他の組織:幅340μμm×長さ110mm 出口:1mm×1mm 肝臓をY接続に接続するチャネル:幅440μμm Y接続から標的組織へのチャネル:幅100μμm。
【図22】図22は、微小規模チップ系の概略図である。
【図23】図23は、Hep G2、Hep G2/C3A、およびヒト肝臓の基底CYP発現レベルを示す。3つの別個の決定からの標準偏差を示す。
【図24】図24Aは、EMEM、DMEM、McCoy’s、およびRPMIにおけるHep G2/C3Aの増殖曲線を示す。図24Bは、EMEM、DMEM、McCoy’s、およびRPMIにおけるHCT116の増殖曲線を示す。3つの別個の決定からの標準偏差を示す。
【図25】図25は、異なる増殖培地条件下でのHep G2/C3AのCYPアイソフォームの発現のRT−PCR決定を示す。
【図26】図26は、異なる基材上でのHep G2/C3AのCYPアイソフォームの発現のRT−PCR決定を示す。
【図27】図27は、ヒトバイオチッププロトタイプを示す。
【図28】図28Aは、本発明の1つの実施形態に従う微小規模培養デバイスを制御するための系を示すブロック図である。図28Bは、本発明の別の実施形態に従う微小規模培養デバイスを制御するための系を示すブロック図である。
【図29】図29は、本発明の1つの実施形態に従う微小規模培養デバイスを動的に制御するためのコンピューター化された方法を示す流れ図である。
【図30】図30は、本発明の1つの実施形態に従う微小規模培養デバイスを制御するためのコンピューターを示すブロック図である。
Claims (178)
- 薬物動態学に基づく微小規模の培養デバイスであって、以下:
第一の微小規模チャンバであって、第一の型の細胞が、インビボの同じ型の細胞について得られる値に匹敵する少なくとも1つの薬物動態学的パラメーター値を提供する条件下で、該第一の型の細胞を含み、培養培地を流すための、第一の入口および第一の出口を備える、第一の微小規模チャンバ;
第二の微小規模チャンバであって、第二の型の細胞が、インビボの同じ型の細胞について得られる値に匹敵する少なくとも1つの薬物動態学的パラメーター値を提供する条件下で、該第二の型の細胞を含み、培養培地を流すための、第二の入口および第二の出口を備える、第二の微小規模チャンバ;ならびに、
該第一のチャンバおよび該第二のチャンバを相互接続している、マイクロ流体チャネル、
を備える、薬物動態学に基づく微小規模の培養デバイス。 - 請求項1に記載の培養デバイスであって、該デバイスは、1つ以上のさらなる微小規模チャンバをさらに備え、該1つ以上のさらなる微小規模チャンバは、さらなる型の細胞が、インビボの同じ型の細胞について得られる値に匹敵する少なくとも1つの薬物動態学的パラメーター値を提供する条件下で、該さらなる型の細胞を含み、ここで、該1つ以上のさらなる微小規模チャンバは、培養培地を流すための、入口および出口を備える、
培養デバイス。 - 培養培地をさらに含む、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記培養培地が、前記チャンバを通って流れる、請求項3に記載の培養デバイス。
- 前記培養培地が、前記チャンバを通って再循環して流れる、請求項3に記載の培養デバイス。
- ポンピング機構をさらに備える、請求項3に記載の培養デバイス。
- 前記ポンピング機構が、前記デバイス内に組み込まれている、請求項6に記載の培養デバイス。
- 前記ポンピング機構が、前記デバイスの外部にある、請求項6に記載の培養デバイス。
- 前記マイクロ流体チャネル内に配置されるデバブラーをさらに備える、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記デバイスの外部に配置されるデバブラーをさらに備える、請求項1に記載の培養デバイス。
- 請求項1に記載の培養デバイスであって、前記少なくとも1つの薬物動態学的パラメーターが、細胞間の相互作用、液体滞留時間、液体 対 細胞比、細胞による代謝、または剪断応力の測定値である、培養デバイス。
- 培養細胞からのシグナルを得るための少なくとも1つのセンサをさらに備える、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのセンサが、バイオセンサである、請求項12に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのセンサが、導波管を備える、請求項12に記載の培養デバイス。
- 前記デバイスが微細加工されている、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記デバイスが、微細加工されたマスターから製造される、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、細胞の三次元増殖を与える、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、複数の細胞を含む、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、組織生検を含む、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、組織の断面を含む、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記組織が、健康であるかまたは病変している、請求項19または20に記載の培養デバイス。
- 前記組織が、動脈、静脈、胃腸管、食道、または結腸である、請求項19または20に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、器官の断面を含む、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記器官が、健康であるかまたは病変している、請求項23に記載の培養デバイス。
- 前記器官が、心臓、脳、腎臓、肺、または筋肉である、請求項23に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、循環細胞または接着細胞を含む、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、真核生物細胞を含む、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記真核生物細胞が、植物細胞または動物細胞である、請求項27に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項28に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、原核生物細胞を含む、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、初代細胞である、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、幹細胞である、請求項1に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、遺伝学的に改変された細胞であるか、形質転換された細胞であるか、または不死化された細胞である、請求項1に記載の培養デバイス。
- 微小規模の培養デバイス内での細胞増殖の、薬物動態学的に基づく培養システムであって、該システムは、以下:
第一の細胞型を含む第一のチャンバであって、該第一の細胞型は、インビボの細胞について得られる値に匹敵する少なくとも1つの薬物動態学的パラメーター値を提供する条件下で維持される、第一のチャンバ;
該第一のチャンバと異なる幾何学の第二のチャンバであって、該第二のチャンバは、第二の細胞型を含み、該第二の細胞型は、インビボの細胞について得られる値に匹敵する少なくとも1つの薬物動態学的パラメーター値を提供する条件下で維持される、第二のチャンバ;ならびに、
培養培地の再循環のための、入口および出口、
を備えるシステムであって、ここで、
該第一のチャンバおよび該第二のチャンバは、流体チャネルによって相互接続されている、
培養システム。 - 複数の相互接続されたデバイスを備える、請求項35に記載の培養デバイス。
- 前記少なくとも1つの薬物動態学的パラメーターが、細胞間の相互作用、液体滞留時間、液体 対 細胞比、細胞による代謝、または剪断応力の測定値である、請求項35に記載の培養システム。
- 前記チャンバの各々が、インビボの目的の細胞について得られる値に匹敵する少なくとも2つの薬物動態学的パラメーター値を与える、請求項35に記載の培養システム。
- ポンピング機構をさらに備える、請求項35に記載の培養システム。
- マイクロ流体チャネル内に配置されるデバブラーをさらに備える、請求項35に記載の培養システム。
- 培養細胞からのシグナルを得るための少なくとも1つのセンサをさらに備える、請求項35に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのセンサが、バイオセンサである、請求項41に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのセンサが、導波管を備える、請求項41に記載の培養システム。
- 前記デバイスが、微細加工されている、請求項35に記載の培養システム。
- 前記デバイスが、微細加工されたマスターから製造される、請求項35に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、細胞の三次元増殖を与える、請求項35に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、複数の細胞を含む、請求項35に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、組織生検を含む、請求項35に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、組織の断面を含む、請求項35に記載の培養システム。
- 前記組織が、健康であるかまたは病変している、請求項48または49に記載の培養システム。
- 前記組織が、動脈、静脈、胃腸管、食道、または結腸である、請求項48または49に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、器官の断面を含む、請求項35に記載の培養システム。
- 前記器官が、健康であるかまたは病変している、請求項52に記載の培養システム。
- 前記器官が、心臓、脳、腎臓、または肺である、請求項48に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、循環細胞または接着細胞を含む、請求項35に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、真核生物細胞を含む、請求項35に記載の培養システム。
- 前記真核生物細胞が、植物細胞または動物細胞である、請求項56に記載の培養システム。
- 前記少なくとも1つのチャンバが、原核生物細胞を含む、請求項35に記載の培養システム。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項57に記載の培養システム。
- 前記細胞が、初代細胞である、請求項35に記載の培養システム。
- 前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項35に記載の培養システム。
- 前記細胞が、遺伝学的に改変された細胞であるか、形質転換された細胞であるか、または不死化された細胞である、請求項35に記載の培養システム。
- 前記細胞が、幹細胞である、請求項35に記載の培養システム。
- 細胞の薬物動態学に基づく培養システムに対する入力変数の影響を決定するための方法であって、該方法は、以下:
請求項35に記載の培養システムを入力変数と接触させる工程;および、
少なくとも1つの出力パラメーターをモニタリングする工程、
を包含する、方法。 - 前記少なくとも1つの出力パラメーターをモニタリングする工程が、前記デバイス内の少なくとも1つのセンサからの情報を得る工程を包含する、請求項64に記載の方法。
- 前記入力変数が、有機化合物である、請求項64に記載の方法。
- 前記入力変数が、無機化合物である、請求項64に記載の方法。
- 前記入力変数が、複合体サンプルである、請求項64に記載の方法。
- 前記入力変数が、製薬、環境性サンプル、栄養性サンプル、または消費者製品である、請求項64に記載の方法。
- 前記入力変数が、ウイルス、リポソーム、ナノ粒子、生分解性ポリマー、放射性標識粒子または放射性標識毒素、生体分子、毒素結合体化粒子または毒素結合体化生体分子である、請求項64に記載の方法。
- 前記入力変数が、安定化剤である、請求項64に記載の方法。
- 前記安定化剤が、アルブミン、ポリエチレングリコール、ポリ(エチレン−co−酢酸ビニル)、またはポリ(ラクチド−co−グリコリド)である、請求項71に記載の方法。
- 薬物動態学に基づく微小規模の培養デバイスであって、以下:
細胞培養物を含む第一の微小規模チャンバであって、該細胞培養物は、生理学的条件下で第一の型の細胞を含み、ここで、該細胞培養物は、インビボの同じ型の細胞培養物について得られる値に匹敵する少なくとも1つの薬物動態学的パラメーター値を提供し、ここで、該第一のチャンバは、培養培地を流すための、第一の入口および第一の出口を備える、第一の微小規模チャンバ;ならびに、
該細胞培養物からのシグナルを得るための、センサ、
を備える、薬物動態学に基づく微小規模の培養デバイス。 - 前記細胞培養物が、少なくとも1つのさらなる型の細胞をさらに含む、請求項73に記載の培養デバイス。
- 請求項73に記載の培養デバイスであって、以下:
第二の微小規模チャンバであって、第二の型の細胞培養物が、インビボの同じ型の細胞について得られる値に匹敵する少なくとも1つの薬物動態学的パラメーター値を提供する条件下で、該第二の型の細胞培養物を含み、培養培地を流すための、第二の入口および第二の出口を備える、第二の微小規模チャンバ;
該細胞培養物からのシグナルを得るための、センサ;ならびに、
該第一のチャンバおよび該第二のチャンバを相互接続している、マイクロ流体チャネル、
をさらに備える、培養デバイス。 - 培養培地をさらに備える、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記培養培地が、前記チャンバを通って流れる、請求項76に記載の培養デバイス。
- 前記培養培地が、前記チャンバを通って再循環して流れる、請求項76に記載の培養デバイス。
- ポンピング機構をさらに備える、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記ポンピング機構が、前記デバイス内に組み込まれている、請求項79に記載の培養デバイス。
- 前記ポンピング機構が、前記デバイスの外部にある、請求項79に記載の培養デバイス。
- 前記マイクロ流体チャネル内に配置されるデバブラーをさらに備える、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記デバイスの外部に配置されるデバブラーをさらに備える、請求項73に記載の培養デバイス。
- 請求項73に記載の培養デバイスであって、前記少なくとも1つの薬物動態学的パラメーターが、細胞間の相互作用、液体滞留時間、液体 対 細胞比、細胞による代謝、または剪断応力の測定値である、培養デバイス。
- 前記センサが、バイオセンサである、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記センサが、導波管を備える、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記デバイスが微細加工されている、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記デバイスが、微細加工されたマスターから製造される、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記チャンバが、細胞の三次元増殖を与える、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記チャンバが、複数の細胞を含む、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記チャンバが、組織生検を含む、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記チャンバが、組織の断面を含む、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記組織が、健康であるかまたは病変している、請求項91または92に記載の培養デバイス。
- 前記組織が、動脈、静脈、胃腸管、食道、または結腸である、請求項91または92に記載の培養デバイス。
- 前記チャンバが、器官の断面を含む、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記器官が、健康であるかまたは病変している、請求項95に記載の培養デバイス。
- 前記器官が、心臓、脳、腎臓、肺、または筋肉である、請求項95に記載の培養デバイス。
- 前記チャンバが、循環細胞または接着細胞を含む、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記チャンバが、真核生物細胞を含む、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記真核生物細胞が、植物細胞または動物細胞である、請求項99に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項100に記載の培養デバイス。
- 前記チャンバが、原核生物細胞を含む、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、初代細胞である、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、幹細胞である、請求項73に記載の培養デバイス。
- 前記細胞が、遺伝学的に改変された細胞であるか、形質転換された細胞であるか、または不死化された細胞である、請求項73に記載の培養デバイス。
- 生物学的産物を生成するための方法であって、該方法は、培養培地、および該生物学的産物を生成する細胞を含む、請求項1または73に記載の培養デバイスを提供する工程を包含する、方法。
- 前記細胞が、外因性遺伝子産物を生成するように遺伝子操作された宿主細胞である、請求項107に記載の方法。
- 前記生物学的産物が、増殖因子、調節因子、ペプチドホルモン、または抗体である、請求項107に記載の方法。
- 標準的な単離技術を使用して、前記培養培地から前記生物学的産物を単離する工程をさらに包含する、請求項107に記載の方法。
- 前記単離技術が、HPLC、カラムクロマトグラフィー、または電気泳動である、請求項110に記載の方法。
- 微小規模の培養デバイスであって、以下:
培養培地との第一のインビボ相互作用を模倣する幾何学を有する第一の微小規模チャンバであって、前記培養培地を流すための、第一の入口および第一の出口を備える、第一の微小規模チャンバ;
培養培地との第二のインビボ相互作用を模倣する幾何学を有する第二の微小規模チャンバであって、該培養培地を流すための、第二の入口および第二の出口を備える、第二の微小規模チャンバ;ならびに、
該第一のチャンバおよび該第二のチャンバを相互接続している、マイクロ流体チャネル、
を備える、培養デバイス。 - 前記チャンバが、プラスチック材料から形成される、請求項112に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記プラスチック材料が、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリジメチルシロキサン、およびポリスルホンからなる群より選択される、請求項113に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記第一の入口に連結されたポンプをさらに備える、請求項112に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記ポンプが、ぜん動ポンプ、膜ポンプ、または微小電気機械ポンプからなる群より選択される、請求項115に記載の微小規模の培養デバイスのアレイ。
- 前記ポンプが、培養培地を再循環させるように前記第二の出口にも連結されている、請求項115に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記チャンバの幾何学が、生体の器官を表わす数学モデルに基づく、請求項112に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記モデルが、生理学に基づく薬物動態学的モデルである、請求項118に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記モデルが、少なくとも1つの既知の組織サイズ比、組織 対 血液容量比、および薬物滞留時間を模倣する、請求項119に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記チャンバ内の生理学的事象を測定するためのセンサをさらに備える、請求項112に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記生理学的事象が、細胞死、細胞増殖、分化、免疫応答、または代謝経路もしくはシグナル伝達経路における摂動である、請求項121に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記薬物動態学的データが、前記センサから誘導される、請求項121に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記センサが、前記デバイスと一体化しており、かつ前記システム内の細胞の生理学的状態の実時間読み出しを与える、請求項121に記載の微小規模の培養デバイス。
- 微小規模の培養デバイスであって、以下:
流路によって連絡された複数のチャンバであって、各チャンバは、生体の一部を模倣する幾何学を有する、複数のチャンバ;ならびに、
ポンプであって、該チャンバを通して培養培地を循環させ、該生体に対する化合物の影響を模倣するための、ポンプ、
を備える、培養デバイス。 - 前記ポンプが、前記チャンバを通して前記培養培地を再循環させるぜん動ポンプである、請求項125に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記チャンバが、前記培養培地の、肝臓、肺、低速灌流流体領域、脂肪、および高速灌流流体領域との相互作用を模倣する、請求項125に記載の微小規模の培養デバイス。
- 1つのチャンバが肺を模倣し、該チャンバが、平行な複数の交互に配置された支柱を有する、請求項125に記載の微小規模の培養デバイス。
- 1つのチャンバが肝臓を模倣し、該チャンバが、平行な複数の交互に配置された支柱を有する、請求項125に記載の微小規模の培養デバイス。
- コントローラをさらに備える、請求項125に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記コントローラが前記ポンプを制御して、前記生体が直面する滞留時間に匹敵するチャンバ内での培養培地の滞留時間を生じさせる、請求項130に記載の微小規模の培養デバイス。
- 請求項131に記載の微小規模の培養デバイスであって、該デバイスは、前記流路に沿って分配されたバルブをさらに備え、ここで、前記コントローラは、前記生体の模倣された部分と関連した薬物動態学的パラメーター値と一致させて該バルブを制御する、微小規模の培養デバイス。
- 前記チャンバが、基材上に形成され、そして前記コントローラが、該基材から分離されかつ該基材に電気的に連結されている、請求項130に記載の微小規模の培養デバイス。
- 前記コントローラによる使用のために、前記生体の模倣された部分と関連した薬物動態学的パラメーター値を有するルックアップテーブルをさらに備える、請求項130に記載の微小規模の培養デバイス。
- 微小規模の培養デバイスであって、以下:
肺模倣チャンバ;
ポンプ;
肺模倣チャンバ、低速灌流模倣チャンバ、高速灌流模倣チャンバおよび並列に連結される脂肪模倣チャンバのうちの、少なくとも2つ;ならびに、
該肺模倣チャンバ、該ポンプ、および該少なくとも2つのチャンバと直列に連結された、複数のマイクロ流体チャネル、
を備える、微小規模の培養デバイス。 - 微小規模の培養デバイスを形成する方法であって、該方法は、以下:
第一の微小規模チャンバを形成する工程であって、該第一のチャンバは、培養培地との第一のインビボ相互作用を模倣する幾何学を有し、ここで、該第一のチャンバは、該培養培地を流すための、第一の入口および第一の出口を備える、工程;
第二の微小規模チャンバを形成する工程であって、該第二のチャンバは、該培養培地との第二のインビボ相互作用を模倣する幾何学を有し、ここで、該第二のチャンバは、該培養培地を流すための、第二の入口および第二の出口を備える、工程;ならびに、
該第一のチャンバおよび該第二のチャンバを相互接続するマイクロ流体チャネルを形成する工程、
を包含する、方法。 - 前記チャンバが、エンボス加工、射出成形、またはスタンピングによって形成される、請求項136に記載の方法。
- 前記チャンバおよびチャネルの表面を重合化する工程をさらに包含する、請求項136に記載の方法。
- 前記チャンバおよびチャネルの表面上のポリマー材料が、流体の方向付け、細胞付着または細胞分離を促進させる、請求項138に記載の方法。
- 微小規模の培養デバイスのアレイであって、該アレイは、
該デバイスを取り囲むためのハウジング、
を備え、各デバイスは、以下:
第一の微小規模チャンバであって、該チャンバは、培養培地との第一のインビボ相互作用を模倣する幾何学を有し、ここで、該第一のチャンバは、該培養培地を流すための、第一の入口および第一の出口を備える、第1の微小規模チャンバ;ならびに、
該チャンバの入口および出口に連結する、チャネル、
を備える、
微小規模の培養デバイスのアレイ。 - 請求項140に記載の微小規模の培養デバイスのアレイであって、各デバイスは、第二の微小規模チャンバをさらに備え、該第二のチャンバは、培養培地との第二のインビボ相互作用を模倣する幾何学を有し、ここで、第第二のチャンバは、該チャンバに連結したチャネルを用いて該培養培地を流すための、第二の入口および第二の出口を備える、微小規模の培養デバイスのアレイ。
- 前記デバイスが並列に接続されるか、または生物学的関門を模倣するように多重化される、請求項140に記載の微小規模の培養デバイスのアレイ。
- 前記関門が、胃腸関門または血液脳関門である、請求項142に記載の微小規模の培養デバイスのアレイ。
- 前記デバイスの数が、約10よりも多い、請求項140に記載の微小規模の培養デバイスのアレイ。
- システムであって、以下:
第一の微小規模の培養デバイスであって、以下:
培養培地との複数のインビボ相互作用を模倣する幾何学を有する、複数の微小規模チャンバであって、ここで、各チャンバが、該培養培地を流すための、入口および出口を備える、複数の微小規模チャンバ;および、
該チャンバを相互接続する、マイクロ流体チャネル、
を有する、第一の微小規模の培養デバイス;ならびに、
該第一の微小規模の培養デバイスに連結した制御機器であって、該第一の微小規模の培養デバイスからのデータを獲得するため、および該第一の微小規模の培養デバイスの薬物動態学的パラメーターを制御するための、コンピューター、
を有する、制御機器、
を備える、システム。 - 前記第一の微小規模の培養デバイスが、コンピューター化されたチップ上に形成される、請求項145に記載のシステム。
- 前記第一の微小規模の培養デバイスが、前記チャンバ内の生理学的事象を測定するために前記制御機器に連結した1つ以上のセンサをさらに備える、請求項145に記載のシステム。
- 前記センサが、酸素、二酸化炭素、または前記培養培地のpHをモニタリングする1つ以上のバイオセンサを備える、請求項147に記載のシステム。
- 前記制御機器が、前記第一の微小規模の培養デバイスを保持し、かつ該第一の微小規模の培養デバイスの上部をシールして、前記マイクロ流体チャネルを固定する、請求項145に記載のシステム。
- 請求項145に記載のシステムであって、ここで、前記制御機器が、以下:
前記第一の微小規模の培養デバイスのマイクロ流体チャネル内のマイクロ流体の循環を制御するための、ポンプ;
該第一の微小規模の培養デバイスの温度を制御するための、加熱要素;
光源;および、
該第一の微小規模の培養デバイス内の細胞コンパートメントからの蛍光発光を検出するための、光検出器、
をさらに備える、システム。 - 前記コンピューターが、蛍光強度についてのデータをさらに記録する、請求項150に記載のシステム。
- 前記コンピューターが、比色定量型、蛍光定量型、発光型、および放射測定型からなる群より選択される型の測定機器を使用して、蛍光強度についてのデータを記録する、請求項151に記載のシステム。
- 前記加熱要素が、前記第一の微小規模の培養デバイスを、37℃の温度にて維持する、請求項150に記載のシステム。
- 前記コンピューターが、前記第一の微小規模の培養デバイス内の、ポンプ速度、温度、実験装置の長さ、およびデータ獲得頻度からなる群より選択される薬物動態学的パラメーターを制御する、請求項145に記載のシステム。
- 前記コンピューターが、前記第一の微小規模の培養デバイス内の、流速、チャンバ幾何学、および細胞数からなる群より選択される薬物動態学的パラメーターを制御する、請求項145に記載のシステム。
- 前記コンピューターが、前記第一の微小規模の培養デバイス内の1つ以上のポンプをさらに制御し、前記生体が直面する滞留時間に匹敵するチャンバ内での培養培地の滞留時間を生じさせる、請求項145に記載のシステム。
- 前記コンピューターが、生体の模倣された部分と関連する薬物動態学的パラメーター値と一致する様式で、前記マイクロ流体チャネルに沿って分配された1つ以上のバルブをさらに制御する、請求項145に記載のシステム。
- 請求項145に記載のシステムであって、第二の微小規模の培養デバイスをさらに備え、該第二の微小規模の培養デバイスは、以下:
培養培地との複数のインビボ相互作用を模倣する幾何学を有する複数の微小規模チャンバであって、ここで、各チャンバが、該培養培地を流すための、入口および出口を備える、複数の微小規模チャンバ;および、
該チャンバを相互接続する、マイクロ流体チャネル、
を有し、ここで、
前記制御機器が、該第二の微小規模の培養デバイスに連結されている、
システム。 - 微小規模の培養デバイスを動力学的に制御するためのコンピューター化方法であって、該方法は、以下:
複数のセンサからのデータを分析して、該微小規模の培養デバイスの複数のチャンバ内の生理学的事象を測定する工程;
該微小規模の培養デバイスのチャンバ内の培養培地の流体の流速を調節する工程;
該微小規模の培養デバイスのチャンバ内の生物学的反応物または毒物学的反応物を検出する工程;および、
検出の際に、該微小規模の培養デバイスの1つ以上の薬物動態学的パラメーターを変化させる工程、
を包含する、方法。 - 前記検出工程が、前記微小規模の培養デバイスの細胞コンパートメントの寸法変化を検出する工程を包含する、請求項159に記載のコンピューター化方法。
- 前記変化させる工程が、前記微小規模の培養デバイス内の、細胞間の相互作用、液体滞留時間、液体 対 細胞比、細胞による代謝、または剪断応力からなる群より選択される薬物動態学的パラメーターを変化させる工程を包含する、請求項159に記載のコンピューター化方法。
- 前記変化させる工程が、前記微小規模の培養デバイス内の、流速、チャンバ幾何学、および細胞数からなる群より選択される薬物動態学的パラメーターを変化させる工程を包含する、請求項159に記載のコンピューター化方法。
- 請求項159に記載のコンピューター化方法であって、前記微小規模の培養デバイス内のチャンバ幾何学を最適化する工程をさらに包含し、ここで、該最適化工程が、以下:
多数のチャンバを選択する工程;
適切な組織サイズ比または器官サイズ比を提供するチャンバ幾何学を選択する工程;
適切な液体滞留時間を提供する最適な流体流れを選択する工程;および、
細胞の剪断応力を算出する工程、
を包含する、コンピューター化方法。 - 前記培養培地の温度を調節する工程をさらに包含する、請求項159に記載のコンピューター化方法。
- 前記微小規模の培養デバイスの細胞コンパートメントからの蛍光発光を検出する工程をさらに包含する、請求項159に記載のコンピューター方法。
- コンピューター読み取り可能な媒体であって、該媒体が、以下の工程を包含する方法を実行するために、該媒体に記憶される、コンピューターにより実行可能な指示を有する、コンピューター読み取り可能な媒体:
前記微小規模の培養デバイスの複数のチャンバ内の生理学的事象を測定するための複数のセンサからのデータを分析する工程;
該微小規模の培養デバイスのチャンバ内の培養培地の流体の流速を調節する工程;
該微小規模の培養デバイスのチャンバ内の生物学的反応物または毒物学的反応物を検出する工程;および、
検出の際に、該微小規模の培養デバイスのチャンバ内の1つ以上の薬物動態学的パラメーターを変化させる工程。 - 前記変化させる工程が、前記微小規模の培養デバイス内の、細胞間の相互作用、液体滞留時間、液体 対 細胞比、細胞による代謝、および剪断応力からなる群より選択される薬物動態学的パラメーターを変化させる工程を包含する、請求項166に記載のコンピューター読み取り可能な媒体。
- 前記変化させる工程が、前記微小規模の培養デバイス内の、流速、チャンバ幾何学、および細胞数からなる群より選択される薬物動態学的パラメーターを変化させる工程を包含する、請求項166に記載のコンピューター読み取り可能な媒体。
- 請求項166に記載のコンピューター読み取り可能な媒体であって、前記微小規模の培養デバイス内のチャンバ幾何学を最適化する工程をさらに包含し、ここで、該最適化工程が、以下:
多数のチャンバを選択する工程;
適切な組織サイズ比または器官サイズ比を提供するチャンバ幾何学を選択する工程;
適切な液体滞留時間を提供する最適な流体流速を選択する工程;および、
細胞の剪断応力を算出する工程、
を包含する、コンピューター読み取り可能な媒体。 - 前記方法が、前記培養培地の温度を調節する工程をさらに包含する、請求項166に記載のコンピューター読み取り可能な媒体。
- 前記方法が、前記微小規模の培養デバイスの細胞コンパートメントからの蛍光発光を検出する工程をさらに包含する、請求項166に記載のコンピューター読み取り可能な媒体。
- コンピューターであって、以下:
マイクロプロセッサ;
汎用メモリ;
不揮発性記憶要素;
1つ以上のセンサを有する微小規模の培養デバイスに対するインターフェースを含む、入力/出力インターフェース;ならびに、
以下のこと:
前記微小規模の培養デバイスの複数のチャンバ内の生理学的事象を測定するためのセンサからのデータを分析すること、
該微小規模の培養デバイスのチャンバ内の培養培地の流体の流速を調節すること、
該微小規模の培養デバイスのチャンバ内の生物学的反応物または毒物学的反応物を検出すること、および、
検出の際に、該微小規模の培養デバイスの1つ以上の薬物動態学的パラメーターを変化させること、
が、該マイクロプロセッサにより実行可能な、コンピューターソフトウェア、
を備える、コンピューター。 - 前記不揮発性記憶要素が、公開情報から得られた履歴にしたデータ、以前の実行試験から収集されたデータ、または理論算出値から誘導されたデータを含む、請求項172に記載のコンピューター。
- 前記コンピューターソフトウェアが、ポンプ制御ラインを通して、コマンドを前記微小規模の培養デバイスの1つ以上のポンプに伝達することによって流体の流速を調節する、請求項172に記載のコンピューター。
- 前記コンピューターソフトウェアが、マイクロプロセッサにより、培養培地の温度を調節することがさらに実行可能である、請求項172に記載のコンピューター。
- 前記コンピューターソフトウェアが、ヒーターにしたコイル制御ラインを通して、コマンドを前記微小規模の培養デバイスのヒーターにしたコイルに伝達することによって温度を調節する、請求項175に記載のコンピューター。
- 請求項172に記載のコンピューターであって、以下:
一連の質量平衡式を記憶するための前記汎用メモリに連結されたルックアップテーブルメモリであって、該質量平衡式は、システム内の種々の生物学的基質または化学的基質について生理学に基づく薬物動態学的モデルを表す、ルックアップテーブル;および、
前記コンピューターソフトウェアを記憶するためのマイクロプロセッサに連結された、キャッシュメモリ、
をさらに備える、コンピューター。 - 請求項172に記載のコンピューターであって、ここで、前記入力/出力インターフェースが、以下:
キーボードインターフェース;
ディスプレイインターフェース;および、
プリンタ/プロッターレコーダーインターフェース、
をさらに備える、コンピューター。
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008539787A (ja) * | 2005-05-18 | 2008-11-20 | コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド | 生物学的な障壁を有する薬物動態学ベース培養システム |
JP2009505661A (ja) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | ヘパホープ インコーポレイテッド | ヒト組織を使用した薬剤試験および薬剤スクリーニングの新規で効果的なプロセス |
JP2009505662A (ja) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | ヘパホープ インコーポレイテッド | 化学療法感受性試験機 |
JP2015516154A (ja) * | 2012-04-18 | 2015-06-11 | ヘモシアー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーHemoShear, LLC | 病理学的状態または生理学的状態に対するInvitroモデル |
JP2015533083A (ja) * | 2012-09-29 | 2015-11-19 | ノーティス,インク. | インビトロで組織及び器官の機能単位を再現するためのマイクロ流体システム |
JP2015535688A (ja) * | 2012-09-28 | 2015-12-17 | ティスーゼ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングTissUse GmbH | 寿命及び恒常性が改善された多臓器チップ |
WO2018147032A1 (ja) * | 2017-02-09 | 2018-08-16 | 公立大学法人大阪府立大学 | 細胞培養用流体チップ、培養容器及び培養方法 |
JP2021153533A (ja) * | 2020-03-30 | 2021-10-07 | 株式会社安川電機 | 細胞製造装置、細胞製造方法、細胞製造装置用プログラム、および、細胞製造システム |
Families Citing this family (178)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7485454B1 (en) * | 2000-03-10 | 2009-02-03 | Bioprocessors Corp. | Microreactor |
US7326563B2 (en) * | 2000-11-08 | 2008-02-05 | Surface Logix, Inc. | Device and method for monitoring leukocyte migration |
AU2002303311B2 (en) * | 2001-04-10 | 2007-01-25 | Bioprocessors Corporation | Microfermentor device and cell based screening method |
US20040058437A1 (en) * | 2001-04-10 | 2004-03-25 | Rodgers Seth T. | Materials and reactor systems having humidity and gas control |
US20040058407A1 (en) * | 2001-04-10 | 2004-03-25 | Miller Scott E. | Reactor systems having a light-interacting component |
US20070037277A1 (en) * | 2001-04-25 | 2007-02-15 | Michael Shuler | Pharmacokinetic-based culture system with biological barriers |
US7288405B2 (en) * | 2001-04-25 | 2007-10-30 | Cornell Research Foundation, Inc. | Devices and methods for pharmacokinetic-based cell culture system |
US20070048727A1 (en) * | 2001-04-25 | 2007-03-01 | Michael Shuler | Biliary barrier |
DE10213809C1 (de) * | 2002-03-27 | 2003-12-04 | Innovacell Biotechnologie Gmbh | Zellträger und Verfahren zu dessen Herstellung |
US20050026134A1 (en) * | 2002-04-10 | 2005-02-03 | Bioprocessors Corp. | Systems and methods for control of pH and other reactor environment conditions |
US20050106714A1 (en) * | 2002-06-05 | 2005-05-19 | Zarur Andrey J. | Rotatable reactor systems and methods |
US20040171091A1 (en) * | 2003-02-27 | 2004-09-02 | Cell Work, Inc. | Standardized evaluation of therapeutic efficacy based on cellular biomarkers |
US20100022414A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-28 | Raindance Technologies, Inc. | Droplet Libraries |
GB0307403D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Selection by compartmentalised screening |
GB0307428D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Compartmentalised combinatorial chemistry |
US20060078893A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
WO2004101743A2 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-25 | Bellbrook Labs, Llc | Three dimensional cell cultures in a microscale fluid handling system |
EP1628748A2 (en) * | 2003-06-05 | 2006-03-01 | Bioprocessors Corporation | Reactor with memory component |
DE10326749B4 (de) * | 2003-06-13 | 2006-11-16 | Gerlach, Jörg, Dr.med. | Hybrides Kreislaufsystem |
US20050266393A1 (en) * | 2003-10-01 | 2005-12-01 | Baxter Gregory T | Circulating flow device for assays of cell cultures, cellular components and cell products |
US20060147903A1 (en) * | 2004-01-07 | 2006-07-06 | Li Albert P | In vitro organ modeling with cell culture tool |
US20050221339A1 (en) | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Medical Research Council Harvard University | Compartmentalised screening by microfluidic control |
WO2006032044A2 (en) | 2004-09-15 | 2006-03-23 | Microchip Biotechnologies, Inc. | Microfluidic devices |
US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
US8685638B2 (en) * | 2005-01-20 | 2014-04-01 | The Regents Of The University Of California | Cellular microarrays for screening differentiation factors |
US8921102B2 (en) | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US8603806B2 (en) * | 2005-11-02 | 2013-12-10 | The Ohio State Universtiy Research Foundation | Materials and methods for cell-based assays |
US20070172943A1 (en) * | 2005-11-07 | 2007-07-26 | Robert Freedman | Devices and methods for culturing, preserving, transporting, storing, reconstituting and assaying cellular materials |
EP3913375A1 (en) | 2006-01-11 | 2021-11-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors |
EP1979079A4 (en) | 2006-02-03 | 2012-11-28 | Integenx Inc | MICROFLUIDIC DEVICES |
WO2007124481A2 (en) * | 2006-04-21 | 2007-11-01 | Drexel University | Bioprinting three-dimensional structures onto microscale tissue analog devices for pharmacokinetic study and other uses |
US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
EP2481815B1 (en) | 2006-05-11 | 2016-01-27 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic devices |
US20080050739A1 (en) * | 2006-06-14 | 2008-02-28 | Roland Stoughton | Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats |
EP2589668A1 (en) | 2006-06-14 | 2013-05-08 | Verinata Health, Inc | Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags |
EP2029779A4 (en) | 2006-06-14 | 2010-01-20 | Living Microsystems Inc | HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS |
US8137912B2 (en) | 2006-06-14 | 2012-03-20 | The General Hospital Corporation | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
WO2008021123A1 (en) | 2006-08-07 | 2008-02-21 | President And Fellows Of Harvard College | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
US20080064088A1 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Michael Shuler | Devices and methods for pharmacokinetic-based cell culture system |
US20080138828A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-12 | Marshall University Research Corporation | Microgravity bioreactor systems for production of bioactive compounds and biological macromolecules |
EP2109666A4 (en) | 2007-02-05 | 2011-09-14 | Integenx Inc | MICROFLUIDIC AND NANOFLUIDIC DEVICES, SYSTEMS, AND APPLICATIONS |
WO2008097559A2 (en) | 2007-02-06 | 2008-08-14 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
US20080221847A1 (en) * | 2007-03-09 | 2008-09-11 | Frederique Fenetteau | Method of developing a pharmacokinetic profile of a xenobiotic disposition in a mammalian tissue |
US8343740B2 (en) * | 2007-03-29 | 2013-01-01 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | Micro-organ device |
KR20150143860A (ko) | 2007-04-04 | 2015-12-23 | 네트바이오, 인코포레이티드 | 표적 핵산의 신속한 다중화 적용 방법 |
WO2008130623A1 (en) | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
US8266791B2 (en) | 2007-09-19 | 2012-09-18 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Method of fabricating microfluidic structures for biomedical applications |
KR100936276B1 (ko) | 2007-10-25 | 2010-01-13 | 한국과학기술원 | 미세유체제어기술 기반으로 난관의 물리적 특징 및 생물적특징을 모방한 수정란 및 난자 배양 시스템 |
WO2009089512A2 (en) * | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Hurel Corporation | Immune system modeling devices and methods |
US20090253181A1 (en) | 2008-01-22 | 2009-10-08 | Microchip Biotechnologies, Inc. | Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system |
DE102008010436A1 (de) * | 2008-02-21 | 2009-09-03 | Berthold Technologies Gmbh & Co. Kg | Vorrichtung und Verfahren zur Messung von Lumineszenz und Fluoreszenz von transfizierten Zellen oder Organteilen |
US8936934B2 (en) * | 2008-04-01 | 2015-01-20 | University Of North Carolina At Charlotte | Bioreactor assembly and associated methods |
EP2274438A4 (en) * | 2008-04-08 | 2013-09-11 | Massachusetts Inst Technology | THREE-DIMENSIONAL MICROFLUIDIC PLATFORMS AND METHODS OF USING THE SAME |
US9921576B2 (en) * | 2008-05-05 | 2018-03-20 | Finesse Solutions, Inc. | Virtual transmitter for bioreactor automation system |
DE102008001969A1 (de) * | 2008-05-26 | 2009-12-03 | Hilti Aktiengesellschaft | Handgeführtes elektrisch betriebenes Eintreibgerät |
ES2672201T3 (es) | 2008-07-16 | 2018-06-13 | Children's Medical Center Corporation | Dispositivo de imitación de órganos con microcanales y métodos de uso |
PT2562268T (pt) | 2008-09-20 | 2017-03-29 | Univ Leland Stanford Junior | Diagnóstico não invasivo de aneuploidia fetal por sequenciação |
DE102008058068A1 (de) * | 2008-11-18 | 2010-05-20 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Vorrichtung und ein Verfahren zur Bereitstellung einer vorgebbaren Konzentration mindestens einer Komponente in einem flüssigen Medium |
TWI406939B (zh) * | 2008-12-11 | 2013-09-01 | Univ Chang Gung | A system and method for providing external stimuli for cell samples |
US8672532B2 (en) | 2008-12-31 | 2014-03-18 | Integenx Inc. | Microfluidic methods |
US10386360B2 (en) | 2009-03-13 | 2019-08-20 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Bio-microelectromechanical system transducer and associated methods |
US8528589B2 (en) | 2009-03-23 | 2013-09-10 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulation of microfluidic droplets |
KR20120030130A (ko) | 2009-06-02 | 2012-03-27 | 인터젠엑스 인크. | 다이아프램 밸브를 포함하는 유체 장치 |
EP3586945A3 (en) | 2009-06-05 | 2020-03-04 | IntegenX Inc. | Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system |
US9101117B2 (en) | 2009-06-10 | 2015-08-11 | Aarhus Universitet | SorCS1-like agent for use in the treatment of insulin resistance and diseases related thereto |
EP2443254A2 (en) | 2009-06-15 | 2012-04-25 | NetBio, Inc. | Improved methods for forensic dna quantitation |
US8748180B2 (en) | 2009-07-29 | 2014-06-10 | Cornell University | Microfluidic device for pharmacokinetic-pharmacodynamic study of drugs and uses thereof |
US11285494B2 (en) | 2009-08-25 | 2022-03-29 | Nanoshell Company, Llc | Method and apparatus for continuous removal of sub-micron sized particles in a closed loop liquid flow system |
US10751464B2 (en) | 2009-08-25 | 2020-08-25 | Nanoshell Company, Llc | Therapeutic retrieval of targets in biological fluids |
US20110136162A1 (en) * | 2009-08-31 | 2011-06-09 | Drexel University | Compositions and Methods for Functionalized Patterning of Tissue Engineering Substrates Including Bioprinting Cell-Laden Constructs for Multicompartment Tissue Chambers |
US20110186165A1 (en) * | 2009-10-05 | 2011-08-04 | Borenstein Jeffrey T | Three-dimensional microfluidic platforms and methods of use and manufacture thereof |
US20110082563A1 (en) * | 2009-10-05 | 2011-04-07 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Microscale multiple-fluid-stream bioreactor for cell culture |
WO2011042564A1 (en) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Universite De Strasbourg | Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof |
US8481303B2 (en) | 2009-10-12 | 2013-07-09 | Corning Incorporated | Microfluidic device for cell culture |
US9404140B1 (en) | 2009-11-03 | 2016-08-02 | The University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Patterned cardiomyocyte culture on microelectrode array |
US8584703B2 (en) | 2009-12-01 | 2013-11-19 | Integenx Inc. | Device with diaphragm valve |
US8187979B2 (en) * | 2009-12-23 | 2012-05-29 | Varian Semiconductor Equipment Associates, Inc. | Workpiece patterning with plasma sheath modulation |
WO2011079176A2 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
US8239030B1 (en) | 2010-01-06 | 2012-08-07 | DJ Technologies | Transcranial stimulation device and method based on electrophysiological testing |
JPWO2011083768A1 (ja) * | 2010-01-08 | 2013-05-13 | 住友ベークライト株式会社 | 細胞凝集塊形成用培養容器 |
US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
JP5934657B2 (ja) | 2010-02-12 | 2016-06-15 | レインダンス テクノロジーズ, インコーポレイテッド | デジタル検体分析 |
US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
JP5881621B2 (ja) | 2010-03-02 | 2016-03-09 | ユニヴェルシテ テクノロジエ デ コンピエーニュ−ユテセ | 動的細胞培養のマルチリアクタボックス |
CN102234612B (zh) * | 2010-05-06 | 2014-01-29 | 同济大学 | 一种生物工程体外循环系统 |
KR101270094B1 (ko) * | 2010-05-25 | 2013-05-31 | 고려대학교 산학협력단 | Cmos 기반 세포 이미징 분석 시스템 |
US8512538B2 (en) | 2010-05-28 | 2013-08-20 | Integenx Inc. | Capillary electrophoresis device |
WO2012024658A2 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | IntegenX, Inc. | Integrated analysis system |
WO2012024657A1 (en) | 2010-08-20 | 2012-02-23 | IntegenX, Inc. | Microfluidic devices with mechanically-sealed diaphragm valves |
EP2622103B2 (en) | 2010-09-30 | 2022-11-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sandwich assays in droplets |
US10023832B2 (en) | 2013-07-16 | 2018-07-17 | Vanderbilt University | Interconnections of multiple perfused engineered tissue constructs and microbioreactors, multi-microformulators and applications of the same |
US8895291B2 (en) | 2010-10-08 | 2014-11-25 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions |
DE102011009854A1 (de) * | 2011-02-01 | 2012-08-02 | Erwin Quarder Systemtechnik Gmbh | Sensoreinrichtung zur Messung von Eigenschaften von Analyten |
EP3859011A1 (en) | 2011-02-11 | 2021-08-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
WO2012112804A1 (en) | 2011-02-18 | 2012-08-23 | Raindance Technoligies, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
KR102351944B1 (ko) | 2011-02-28 | 2022-01-18 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 세포 배양 시스템 |
EP3709018A1 (en) | 2011-06-02 | 2020-09-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic apparatus for identifying components of a chemical reaction |
US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
US20150136604A1 (en) | 2011-10-21 | 2015-05-21 | Integenx Inc. | Sample preparation, processing and analysis systems |
US10865440B2 (en) | 2011-10-21 | 2020-12-15 | IntegenX, Inc. | Sample preparation, processing and analysis systems |
WO2013058403A1 (ja) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | 国立大学法人京都大学 | 層流による多能性維持単一分散細胞培養法 |
US20140308688A1 (en) | 2011-12-08 | 2014-10-16 | Research Triangle Institute | Human emulated response with microfluidic enhanced systems |
WO2013086486A1 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | President And Fellows Of Harvard College | Integrated human organ-on-chip microphysiological systems |
WO2013116729A1 (en) * | 2012-02-02 | 2013-08-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Microfabricated 3d cell culture system |
DE102012101240A1 (de) | 2012-02-16 | 2013-08-22 | Technische Universität Ilmenau | Verfahren zur bestimmung der ansiedelbarkeit von biologischen zellen auf strukturen aus einem polymer sowie verfahren zur herstellung solcher strukturen |
US8940742B2 (en) | 2012-04-10 | 2015-01-27 | Infinity Pharmaceuticals, Inc. | Heterocyclic compounds and uses thereof |
US9528082B2 (en) | 2012-07-25 | 2016-12-27 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Modular platform for multi-tissue integrated cell culture |
WO2014028940A1 (en) * | 2012-08-17 | 2014-02-20 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Methods, systems and compositions for functional in vitro cellular models of mammalian systems |
US9518977B2 (en) | 2012-10-19 | 2016-12-13 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Microfluidic assay apparatus and methods of use |
GB201223495D0 (en) | 2012-12-30 | 2013-02-13 | Plummer Simon M | A Bioreactor |
WO2014120772A1 (en) | 2013-01-29 | 2014-08-07 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Modular platform for multi-tissue integrated cell culture |
EP2951281B1 (en) | 2013-01-30 | 2018-06-27 | University of Central Florida Research Foundation, Inc. | System and method for mimicking heart function |
WO2014127250A1 (en) * | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Cfd Research Corporation | Cell culture device with an array of microfluidic networks |
US20140274796A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Methods, Systems, and Compositions for In Vitro Concentric Cell Culture Analog Systems |
DE102013011768B4 (de) * | 2013-07-10 | 2015-07-23 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Zirkulationssystem sowie Verfahren zur Vitalversorgung von Zellkulturen in einem mikrofluidischen Netzwerk |
US9855554B2 (en) | 2013-07-22 | 2018-01-02 | President And Fellows Of Harvard College | Microfluidic cartridge assembly |
US9857370B2 (en) | 2013-07-22 | 2018-01-02 | National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc | Amplification of biological targets via on-chip culture for biosensing |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
EP3060654B1 (en) | 2013-10-21 | 2023-03-15 | Hemoshear, LLC | In vitro model for a tumor microenvironment |
US9617506B2 (en) | 2013-11-16 | 2017-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
CN114471756B (zh) | 2013-11-18 | 2024-04-16 | 尹特根埃克斯有限公司 | 用于样本分析的卡盒和仪器 |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
US9957554B1 (en) | 2013-12-19 | 2018-05-01 | National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc | Microfluidic platform for multiplexed detection in single cells and methods thereof |
CN106459898A (zh) | 2013-12-20 | 2017-02-22 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 低剪切微流控装置及其使用方法和制造方法 |
WO2015103367A1 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Raindance Technologies, Inc. | System and method for detection of rna species |
JP2015169722A (ja) * | 2014-03-05 | 2015-09-28 | ソニー株式会社 | 撮像装置 |
US9631167B2 (en) * | 2014-03-21 | 2017-04-25 | Iontox, Llc | Dynamic multi organ plate |
EP3613841B1 (en) | 2014-03-25 | 2022-04-20 | Terumo BCT, Inc. | Passive replacement of media |
WO2015179098A1 (en) | 2014-05-21 | 2015-11-26 | Integenx Inc. | Fluidic cartridge with valve mechanism |
EP3169626A4 (en) | 2014-07-14 | 2018-04-04 | President and Fellows of Harvard College | Systems and methods for improved performance of fluidic and microfluidic systems |
US9995411B1 (en) | 2014-07-16 | 2018-06-12 | National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc | High-temperature, adhesive-based microvalves and uses thereof |
US10175219B2 (en) * | 2014-07-28 | 2019-01-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method to sort cells on the basis of radionuclide uptake |
US10935541B2 (en) | 2014-08-07 | 2021-03-02 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Devices and methods comprising neuromuscular junctions |
CN106715676A (zh) | 2014-09-26 | 2017-05-24 | 泰尔茂比司特公司 | 按计划供养 |
WO2016065073A1 (en) | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Integenx Inc. | Systems and methods for sample preparation, processing and analysis |
WO2016065004A1 (en) * | 2014-10-22 | 2016-04-28 | The General Hospital Corporation | Methods and devices to study metabolism |
US20170355950A1 (en) * | 2014-12-04 | 2017-12-14 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Systems for dissociation of biological tissues |
WO2016127009A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-11 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Actuated valve or pump for microfluidic devices |
DK3279310T3 (da) * | 2015-04-03 | 2021-08-02 | Aist | Celledyrkningsapparat og fremgangsmåde til celledyrkning |
WO2016182978A1 (en) * | 2015-05-14 | 2016-11-17 | Merck Sharp & Dohme Corp. | In vitro pharmacokinetic-pharmacodynamic device |
EP3313434A4 (en) * | 2015-06-29 | 2019-03-27 | Northeastern University | GENERATOR OF DENDRITIC CELLS |
WO2017004592A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-05 | Terumo Bct, Inc. | Cell growth with mechanical stimuli |
GB201512600D0 (en) * | 2015-07-17 | 2015-08-26 | Koniku Ltd | Cell culture, transport and investigation |
US10202569B2 (en) | 2015-07-24 | 2019-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Radial microfluidic devices and methods of use |
US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
US10988723B1 (en) | 2015-09-23 | 2021-04-27 | National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc | Modular assemblies and systems for cell cultures and methods thereof |
US11034929B2 (en) * | 2015-11-18 | 2021-06-15 | Thrive Bioscience, Inc. | Instrument resource scheduling |
EP3190172A3 (en) * | 2016-01-07 | 2017-08-30 | Vanderbilt University | Interconnections of multiple perfused engineered tissue constructs and microbioreactors, multi-microformulators and applications of the same |
WO2017181258A1 (en) * | 2016-04-21 | 2017-10-26 | Duane Hewitt | Continuous flow system |
US11965175B2 (en) | 2016-05-25 | 2024-04-23 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
US11685883B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-06-27 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems for coating a cell growth surface |
US11104874B2 (en) | 2016-06-07 | 2021-08-31 | Terumo Bct, Inc. | Coating a bioreactor |
SG10201606627QA (en) * | 2016-08-10 | 2018-03-28 | Agency Science Tech & Res | Microfluidic chip |
US11022605B2 (en) | 2016-08-26 | 2021-06-01 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Multi-component in vitro system to deduce cell signaling pathways by electronic stimulation patterns |
AU2017326179B2 (en) | 2016-09-13 | 2022-12-08 | President And Fellows Of Harvard College | Methods relating to intestinal organ-on-a-chip |
JP2020510417A (ja) | 2017-02-17 | 2020-04-09 | コニク インコーポレイテッド | 検出のためのシステム |
US11624046B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
US11702634B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-07-18 | Terumo Bct, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
US11946035B2 (en) | 2017-05-16 | 2024-04-02 | The Regents Of The University Of California | Microfluidic-enabled multiwell cell culture devices and systems for precision culture, control and monitoring of living cells |
JP2020531038A (ja) * | 2017-08-31 | 2020-11-05 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | インビトロ曝露のための細胞培養プレート、デバイスおよび方法 |
WO2019191685A1 (en) * | 2018-03-30 | 2019-10-03 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Workstation for automated control of an in vitro system |
CN110713921B (zh) * | 2018-07-13 | 2022-12-20 | 复旦大学 | 一套体外动态的药物代谢孵育系统 |
CN108918451B (zh) * | 2018-09-13 | 2024-02-13 | 上海健康医学院 | 一种细胞代谢实时检测及动态干预装置及测试干预方法 |
US20220025308A1 (en) * | 2018-10-17 | 2022-01-27 | Northwestern University | Tissue culture platform having multiple well chambers fluidically coupled via microfluidic channels and selector valves |
US10647954B1 (en) | 2018-11-15 | 2020-05-12 | Flaskworks, Llc | Dendritic cell generating apparatus and method |
US20210403853A1 (en) * | 2018-11-16 | 2021-12-30 | Cairn Biosciences, Inc. | Methods for dynamic evolution and monitoring of characteristics in living cells using a microfluidic-enabled multi-well cell culture devices and systems |
US20220093007A1 (en) * | 2019-01-15 | 2022-03-24 | Philip Morris Products S.A. | Perforated structure |
US11661332B2 (en) * | 2019-02-20 | 2023-05-30 | Invensense, Inc. | Stiction reduction system and method thereof |
WO2020252225A1 (en) | 2019-06-14 | 2020-12-17 | University Of Connecticut | Multigel tumor-on-a-chip system |
WO2021018365A1 (en) * | 2019-07-26 | 2021-02-04 | Swiss Medical Union Sa | Micro-bioreactor comprising an organ layer |
US11566217B2 (en) | 2019-08-13 | 2023-01-31 | Flaskworks, Llc | Duty cycle for cell culture systems |
WO2021080847A1 (en) | 2019-10-21 | 2021-04-29 | Flaskworks, Llc | Systems and methods for cell culturing |
US20210301238A1 (en) * | 2020-03-30 | 2021-09-30 | Javelin Biotech, Inc. | Microfluidic devices and methods of designing and using microfluidic devices |
US20220373462A1 (en) * | 2021-05-14 | 2022-11-24 | MBD Co., Ltd. | Measuring method of cell migration using the rate of cell invasion |
WO2024013100A1 (en) * | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Philip Morris Products S.A. | Distal airway and alveoli model |
CN116103152B (zh) * | 2023-04-13 | 2023-06-13 | 零壹人工智能科技研究院(南京)有限公司 | 一种用于药物测试的类器官芯片模型 |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3941662A (en) * | 1971-06-09 | 1976-03-02 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Apparatus for culturing cells |
US3948732A (en) * | 1973-05-31 | 1976-04-06 | Instrumentation Laboratory, Inc. | Cell culture assembly |
US4436824A (en) | 1981-06-09 | 1984-03-13 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Leukocyte migration through antigen containing agaroses for immunocompetence testing |
US5043260A (en) | 1987-11-02 | 1991-08-27 | Rhode Island Hospital | Perfusion device with hepatocytes |
DE68922390T2 (de) * | 1988-10-21 | 1995-10-05 | Molecular Devices Corp | Verfahren und apparat zur messung der effekte von zellwirksamen mitteln auf lebende zellen. |
WO1991004483A1 (en) | 1989-09-18 | 1991-04-04 | Biostar Medical Products, Inc. | Apparatus for detection of an immobilized analyte |
CA2081782C (en) * | 1990-05-16 | 2004-08-24 | James H. Kelly | Permanent human hepatocyte cell line and its use in a liver assist device (lad) |
JPH04152885A (ja) | 1990-10-15 | 1992-05-26 | Fujitsu Ltd | 細胞の培養方法および装置 |
US5612188A (en) * | 1991-11-25 | 1997-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Automated, multicompartmental cell culture system |
EP0620939A4 (en) | 1991-11-25 | 1996-05-29 | Cornell Res Foundation Inc | Automated multicompartmental cell culture system. |
US5726026A (en) * | 1992-05-01 | 1998-03-10 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale sample preparation device and systems for determination and processing of analytes |
US5486335A (en) * | 1992-05-01 | 1996-01-23 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Analysis based on flow restriction |
CA2134478C (en) | 1992-05-01 | 2001-12-18 | Peter Wilding | Microfabricated detection structures |
US5744366A (en) * | 1992-05-01 | 1998-04-28 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale devices and methods for analysis of motile cells |
US5498392A (en) * | 1992-05-01 | 1996-03-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale polynucleotide amplification device and method |
US5587128A (en) * | 1992-05-01 | 1996-12-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale polynucleotide amplification devices |
US5637469A (en) * | 1992-05-01 | 1997-06-10 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and apparatus for the detection of an analyte utilizing mesoscale flow systems |
US5900160A (en) * | 1993-10-04 | 1999-05-04 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of etching articles via microcontact printing |
US7008634B2 (en) | 1995-03-03 | 2006-03-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell growth substrates with tethered cell growth effector molecules |
US5820769A (en) * | 1995-05-24 | 1998-10-13 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for making magnetic storage having discrete elements with quantized magnetic moments |
CN1183121A (zh) | 1996-01-24 | 1998-05-27 | 松下电器产业株式会社 | 测定组织或细胞物理化学特性的方法、检测药品的方法及其装置 |
US6054277A (en) * | 1996-05-08 | 2000-04-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Integrated microchip genetic testing system |
US6133030A (en) * | 1997-05-14 | 2000-10-17 | The General Hospital Corporation | Co-cultivation of cells in a micropatterned configuration |
ATE227338T1 (de) * | 1998-03-18 | 2002-11-15 | Massachusetts Inst Technology | Vaskularisierte perfundierte anordnungen für mikrogewebe und mikroorgane |
AT407047B (de) | 1998-08-03 | 2000-11-27 | Pfaller Walter Dr | Zellkulturvorrichtung |
FR2786783B1 (fr) * | 1998-12-04 | 2002-12-06 | Rtm Rech S Et Tech Modernes | Poche comportant un textile poreux biocompatible pour l'expansion tridimensionnelle in vitro de cellules notamment a usage therapeutique |
AU5757100A (en) * | 1999-06-21 | 2001-01-09 | General Hospital Corporation, The | Methods and devices for cell culturing and organ assist systems |
US6653124B1 (en) * | 2000-11-10 | 2003-11-25 | Cytoplex Biosciences Inc. | Array-based microenvironment for cell culturing, cell monitoring and drug-target validation |
US20070037277A1 (en) * | 2001-04-25 | 2007-02-15 | Michael Shuler | Pharmacokinetic-based culture system with biological barriers |
US20070048727A1 (en) * | 2001-04-25 | 2007-03-01 | Michael Shuler | Biliary barrier |
US7288405B2 (en) * | 2001-04-25 | 2007-10-30 | Cornell Research Foundation, Inc. | Devices and methods for pharmacokinetic-based cell culture system |
US7704728B2 (en) | 2001-07-18 | 2010-04-27 | The University Of Michigan | Microfluidic gravity pump with constant flow rate |
US6630801B2 (en) | 2001-10-22 | 2003-10-07 | Lümileds USA | Method and apparatus for sensing the color point of an RGB LED white luminary using photodiodes |
US6948732B2 (en) * | 2002-11-25 | 2005-09-27 | Joseph Amacker | Convertible cargo rack |
US20080064088A1 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Michael Shuler | Devices and methods for pharmacokinetic-based cell culture system |
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2002
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2007
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-
2016
- 2016-02-26 US US15/055,385 patent/US9732316B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008539787A (ja) * | 2005-05-18 | 2008-11-20 | コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド | 生物学的な障壁を有する薬物動態学ベース培養システム |
JP2009505661A (ja) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | ヘパホープ インコーポレイテッド | ヒト組織を使用した薬剤試験および薬剤スクリーニングの新規で効果的なプロセス |
JP2009505662A (ja) * | 2005-08-24 | 2009-02-12 | ヘパホープ インコーポレイテッド | 化学療法感受性試験機 |
JP2020127412A (ja) * | 2012-04-18 | 2020-08-27 | ヘモシアー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーHemoShear, LLC | 病理学的状態または生理学的状態に対するIn vitroモデル |
JP2018183185A (ja) * | 2012-04-18 | 2018-11-22 | ヘモシアー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーHemoShear, LLC | 病理学的状態または生理学的状態に対するIn vitroモデル |
JP2015516154A (ja) * | 2012-04-18 | 2015-06-11 | ヘモシアー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーHemoShear, LLC | 病理学的状態または生理学的状態に対するInvitroモデル |
JP2015535688A (ja) * | 2012-09-28 | 2015-12-17 | ティスーゼ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングTissUse GmbH | 寿命及び恒常性が改善された多臓器チップ |
JP2015533083A (ja) * | 2012-09-29 | 2015-11-19 | ノーティス,インク. | インビトロで組織及び器官の機能単位を再現するためのマイクロ流体システム |
WO2018147032A1 (ja) * | 2017-02-09 | 2018-08-16 | 公立大学法人大阪府立大学 | 細胞培養用流体チップ、培養容器及び培養方法 |
JPWO2018147032A1 (ja) * | 2017-02-09 | 2019-11-21 | 公立大学法人大阪 | 細胞培養用流体チップ、培養容器及び培養方法 |
JP7055386B2 (ja) | 2017-02-09 | 2022-04-18 | 公立大学法人大阪 | 細胞培養用流体チップ、培養容器及び培養方法 |
US11884905B2 (en) | 2017-02-09 | 2024-01-30 | University Public Corporation Osaka | Fluidic chip for cell culture use, culture vessel, and culture method |
JP2021153533A (ja) * | 2020-03-30 | 2021-10-07 | 株式会社安川電機 | 細胞製造装置、細胞製造方法、細胞製造装置用プログラム、および、細胞製造システム |
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