KR101270094B1

KR101270094B1 - Ｃｍｏｓ 기반 세포 이미징 분석 시스템

Info

Publication number: KR101270094B1
Application number: KR1020100048509A
Authority: KR
Inventors: 백승필; 서성규; 하운환
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2010-05-25
Publication date: 2013-05-31
Also published as: KR20110129078A

Abstract

본 발명은 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 렌즈프리 CMOS 센서, 상기 센서 상에 위치하는 세포를 고정화하기 위한 유리 기판 (세포칩), 상기 세포칩을 둘러싸고 있는 소형 인큐베이터, 및 상기 소형 인큐베이터 상에 위치한 광원장치를 포함하는 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템을 이용하여 세포의 상태를 대변하는 마커를 탐색함으로써 세포 분석 기술에 적용할 수 있다. 특히 세포 표면 마커를 인식하는 항체와 마이크로 입자를 결합한 이미징 입자를 이용함으로써 특정 세포의 판별을 용이하게 할 수 있다. 나아가, 분석대상이 염증세포인 경우 염증상태를 나타내는 마커를 이미징 분석함으로써 항염증제 스크리닝 기술에 적용할 수 있다.

Description

ＣＭＯＳ 기반 세포 이미징 분석 시스템 {Imaging analysis system based on CMOS}

본 발명은 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 렌즈프리 CMOS 센서, 상기 센서 상에 위치하는 세포를 고정화하기 위한 유리 기판 (세포칩), 상기 세포칩을 둘러싸고 있는 소형 인큐베이터, 및 상기 소형 인큐베이터 상에 위치한 광원장치를 포함하는 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에 관한 것이다.

염증반응은 패혈증, 당뇨병(type 2), 폐질환, 자기면역질환, 신경질환, 암, 관절염, 심혈관질환 등의 다양한 질환유발의 근본 원인으로서, 질환 특이적 항염증제 개발이 요구되고 있다. 이러한 항 염증제 개발을 위해서는 세포의 염증 상태를 신속하고 대량으로 관찰할 수 있는 세포분석 시스템이 필요하다.

제약 분야에서 가장 많은 부분을 차지하고 있는 것은 항염증제이다. 염증은 그것 자체의 증상으로도 위험하지만 암으로 발전할 가능성을 두고 있다는 점과, 현대 사회에서 흔히 접할 수 있는 발암제, 항생제 등으로 인해 암으로의 발전 가능성이 더 커지고 있다는 점이 더 위험하다. 이러한 점은 우리가 끊임없이 항염증제 개발에 힘을 쏟아야 하는 불가항력적인 이유가 되어 왔다. 항염증제를 개발하기 위해 현 기술 단계에서 흔히 행해지고 있는 방법에는 다음과 같은 것들이 있다.

1) 유전자칩 : 항염증제를 투여한 후, 염증상태에서 발현되는 유전자만 현저히 줄어드는 사실을 확인함.

2) 세포층 투과성 진단 : 단층으로 된 세포층이 염증작용을 일으키며 투과성이 증가함. 세포층 안쪽의 염색약이 투과성이 증가하여 바깥으로 흘러나오는 정도를 흡광도로 알 수 있음.

3) 세포 부착력 진단 : 백혈구에 형광물질을 코팅시킨 후 염증반응 여부에 따라 슬라이드에 붙는 정도를 흡광도로 측정함.

4) 세포 이동률 진단 : 내피세포를 통과하는 백혈구를 현미경으로 관찰함.

5) ELISA - VCAM(Vascular Cell Adhesion Molecule), ICAM(InterCellular Adhesion Molecule), E-Selectin 같은 부착 단백질의 발현량을 측정. 1차와 2차 항체를 연결시켜 발색시약의 흡광도를 측정함.

위에 나열한 방법들은 학술적으로는 의미가 있는 기법들이지만, 보다 간단하면서도 신속 대량화가 가능한 항염증제 선별 시스템이 필요하다. 본 발명에서는 항 염증제 선별의 대량화, 고속화에 적합한 경제적인 염증세포 분석용 이미징 시스템을 셀온어칩 제작 기술, 나노바이오 소자 중합 기술, 그리고 렌즈프리 이미징 기술을 통합하여 새롭게 개발하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 단순한 구성을 가지면서도 빠른 처리 속도와 함께 대량 측정이 가능한 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템을 제공하는 데 있다.

특히, 항염증제 스크리닝을 위한 대용량 분석 시스템을 경제적으로 구성할 수 있는 CMOS 기반 염증세포 이미징 분석 시스템을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템을 이용한 세포 이미징 분석 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 렌즈프리 CMOS 센서; 상기 센서 상에 위치하는 세포를 고정화하기 위한 유리 기판 (세포칩); 상기 세포칩을 둘러싸고 있는 소형 인큐베이터; 및 상기 소형 인큐베이터 상에 위치한 광원장치를 포함하는 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템을 제공한다.

본 발명의 세포 이미징 분석 시스템은, 1) 적합한 세포 모델 및 세포 상태를 나타내는 마커의 선별, 2) 관찰 세포를 in vitro 상에서 안정적으로 배양 및 제어하는 기술, 3) 세포의 활성 상태를 대변하는 마커를 고감도의 광 신호로 전환하는 기술, 및 4) 광 신호를 모니터링 및 분석하여 세포 상태를 파악하는 기술 등 주요 네 가지의 기술 요소들을 통합적으로 구현하였다. 특히, 본 발명은 단순하면서도 관찰범위가 넓은 새로운 렌즈프리 CMOS형 이미징 기술을 중심으로 하여 고정화 세포칩 제작과 세포 인식 이미징 입자 개발 기술들을 개시하고 있다.

본 발명에서, ‘렌즈프리 CMOS 센서’는 CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 이미지 센서를 이용한 고체 촬상 소자를 말한다. CCD(Charge-Coupled Device) 이미지 센서와 동일하게 광다이오드를 사용하지만 제조 과정과 신호를 읽는 방법이 다르다. 본 발명은 기존의 현미경 시스템 비용의 상당부분을 차지하는 렌즈 부분을 없애고, 이미징용 CMOS 위에 바로 분석대상(세포)을 밀착시켜 관찰하는 시스템으로 구성이 간단하지만 관찰 범위가 넓고 및 분석 성능이 기존 현미경과 유사한게 특징이다.

본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에서, 상기 세포 칩은 유리 기판으로 이루어진 세포 칩이며, 유리 기판을 통해 고정화된 세포들이 렌즈프리 CMOS 센서로 촬영될 수 있다.

본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에서, 상기 소형 인큐베이터는 상기 세포 칩을 둘러싸서 고정화된 세포들을 배양할 수 있는 인큐베이터의 역할을 한다. 상기 소형 인큐베이터는 CO₂ 및 온도 제어가 가능한 것이 바람직하고, 이를 위해 CO₂ 주입구(in-line), CO₂ 및 온도 센서/히터 및 이와 연결된 제어기(controller)를 더 포함할 수 있다. 도 1을 참고하면, 상기 소형 인큐베이터는 외부에 온도/CO₂ 제어기(Temp/CO₂ controller)와 연결되어 있고 내부에 CO₂ 및 온도 센서/히터를 포함한다.

본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에서, 상기 소형 인큐베이터내의 세포칩은 세포를 포함하는 시료를 흘려보낼 수 있는 유체 채널(Fluid channel)과 연결된 것을 특징으로 한다. 상기 유체 채널은 인큐베이터 내로 들어가는 주입 채널과 인큐베이터로부터 나오는 배출 채널로 이루어진다. 상기 유체 채널은 세포를 포함하는 시료를 실시간 또는 연속적으로 공급하는 역할을 한다. 상기 시료에는 세포외에 배지 또는 이미징 입자를 포함할 수 있다.

본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에서, 상기 광원 장치는 인큐베이터 상의 상단을 통해 세포 칩과 CMOS 센서에 광을 조사할 수 있도록 인큐베이터 상에 일정간격을 두고 위치한다. 상기 광원 장치는 고휘도의 적색 LED, 청색 LED, 녹색 LED 및 이들의 조합일 수 있으나, 바람직하게는 파장이 짧은 청색(Blue) LED이다 (실시예 1 참조). 청색 LED를 광원으로 사용하면 관찰 대상의 회절 유발이 용이하고, CMOS상에 이미지가 더 선명하게 맺힐 수 있다.

본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에서, 상기 세포는 세포외 기질 성분 (extra cellular matrix, ECM)을 도입한 유리 기판 상에 고정화될 수 있으며, 상기 세포외 기질 성분은 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen), 및 다양한 RGD (Arg-Gly-Asp) 함유 성분 등이며, 바람직하게는 피브로넥틴이다.

또한 상기 피브로넥틴 또는 콜라겐의 도입은 유리 기판에 APS(3-aminopropyltriethoxysilane)를 처리 한 후, DSG(Disuccinimidyl glutarate )와 같은 crosslinker를 이용하여 기판 위 아민기와 기질성분의 아민기를 공유결합 시킨다. 여기서 DSG는 양 끌 모두 아민기와 반응할 수 있는 기능기가 붙어 있는 시약으로 유리 기판 표면의 아민기와 기질성분의 아민기를 연결시키는 역할을 한다.

본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에서, 상기 세포 고정화를 위해 세포 특이적 항체를 이용할 수도 있으며, 상기와 같이 비특이적인 세포외 기질성분을 사용할 수도 있는데, 후자의 경우 세포 특이적 이미징 입자의 결합에 의해 목적 세포만을 특이적으로 관찰할 수 있다.

본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에서, 상기 세포는 세포 특이적 항체와 결합된 이미징 입자로 이미지 분석되는 것을 특징으로 한다. 상기 세포 특이적 항체와 결합된 이미징 입자, 즉 ‘항체-입자 중합형 이미징 입자’는 입자의 회절 현상에 의한 이미징으로부터 세포의 이미지 분석을 더욱 용이하게 할 수 있다. 본 발명에서는 세포 자체의 회절 이미지에 더하여 이미징 입자의 회절 이미지가 더해져서 목적 세포 이미지를 판별 분석을 할 수 있다.

본 발명에서, 상기‘이미징 입자’는 세포 특이적 마커에 인식 결합될 경우 세포 회절 이미지에 영향을 줄 수 있는 입자들로, 실리카, 폴리머, 금속 입자 등이 사용될 수 있으며 본 발명의 CMOS 이미징 분석 시스템에 의해 시각화될 수 있다.

본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에서, 상기 세포 특이적 항체는 이미징 입자상의 활성화된 카르복실(carboxyl)기와 결합된 것이 바람직하며, 상기 활성화된 카르복실기는 이미징 입자에 카르복실기를 화학처리로 도입하고 EDC(1-ethyl3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide)를 처리하여 카르복실기를 활성화할 수 있다.

또한, 상기 이미징 입자는 본 발명의 CMOS 이미징 분석 시스템에 의해 관찰될 수 있는 크기일 수 있으며 바람직하게는 0.5 내지 20 μm, 더욱 바람직하게는 10 μm의 실리카, 폴리머 또는 금속 입자이다.

본 발명의 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템에서, 상기 세포는 염증세포이고 상기 세포 특이적 항체는 염증세포 표면의 B2R (bradykinin B2 receptor) 또는 B1R (bradykinin B1 receptor) 마커를 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 염증세포의 이미지 분석을 위해 염증세포 특이적인 B2R 마커에 대한 항 B2R 항체를 이미징 입자와 중합시켜 이를 이미징 입자로 사용하였다 (실시예 3 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템을 이용한 세포 이미징 분석 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 이미지 분석 방법은, 상기 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템을 이용하여 세포의 상태를 대변하는 마커를 탐색함으로써 세포 분석 기술에 적용할 수 있다. 특히 세포 표면 마커를 인식하는 항체와 마이크로 입자를 결합한 이미징 입자를 이용함으로써 특정 세포의 판별을 용이하게 할 수 있다. 본 발명의 실시예에서와 같이, 분석대상이 염증세포인 경우 염증상태를 나타내는 B2R 마커를 이미징 분석함으로써 항염증제 스크리닝을 위한 염증세포 분석 방법에 적용될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템의 구성을 도면을 참고하여 자세히 설명한다.

도 2를 참조하면, CMOS 센서 상에 분석대상이 되는 세포들이 고정화된 세포 칩 및 이를 둘러싸고 있는 소형 인큐베이터(mini incubator)가 위치하고, 소형 인큐베이터의 상부에 일정거리에 있는 광원장치가 위치한다.

도 3을 참조하면, 상기 소형 인큐베이터는 내부에 위치하는 세포 칩을 가로지르는 유체 채널을 포함하고 유체 채널을 통해 배지(culture medium)와 CO₂가 공급된다. 인큐베이터의 하부는 CMOS 센서가 센싱할 수 있도록 유리로 제작되고 상부는 LED 광이 통과할 수 있도록 유리로 제작된다. 또한 인큐베이터 상부에는 CO₂ 및 온도 센서와 히터가 위치한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 유전자칩, 세포층 투과성 진단, 세포 부착력 진단, 세포 이동률 진단, ELISA와 같은 종래 세포 분석 방법들은 임상진단용 보다는 연구적 메커니즘을 밝히는 용도로 주로 개발된 것 들이다. 즉, 학술적으로는 의미가 있는 기법들이지만 보다 빠른 처리 속도를 요구하는 제약산업의 세포 이미징 분석에는 많은 한계점이 존재한다. 특히 항염증제 개발 분야에 있어서는 더 많은 한계점이 있다. 우선 많은 단계를 거치며 오차가 생길 수 있고 실험 숙련도를 요구하며, 대량 동시 측정이 힘들다는 등의 문제점들이 있다. 이런 문제를 극복한 새로운 시스템으로 본 발명에서는 항 염증제 선별의 대량화, 고속화에 적합한 경제적인 염증 세포 분석 이미징 시스템을 셀온어칩 제작 기술, 나노바이오 소자 중합 기술, 그리고 렌즈프리 이미징 기술을 통합하여 새로운 세포 이미징 분석 시스템을 개발하였다.

도 1은 본 발명에 따른 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템의 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템의 개략적인 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템의 소형 인큐베이터 내 장착한 염증 세포 분석용 세포 칩을 설명하는 모식도이다.
도 4는 항체-이미징 입자를 적용하여 본 발명에 따른 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템으로 염증세포를 분석한 결과이다. 왼쪽: CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템의 이미징, 오른쪽: 광학 현미경을 이용한 비교 이미징.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 렌즈프리 CMOS 세포 이미징 분석 시스템

도 1에서 보는 바와 같이, 세포 이미징 분석 시스템으로는 새로운 렌즈프리 CMOS형 이미징 기술을 채택하였다. 본 발명의 CMOS 세포 이미징 분석 시스템은 기존의 현미경 시스템에서 비용의 상당부분을 차지하는 렌즈 부분을 없애고, 이미징용 CMOS(Compalementary Metal-Oxide Semiconductor)(model: uppy F-503B ASG, sensor: 1/2.5", resolution: 2594×1944) 위에 바로 분석대상(세포)을 밀착시켜 관찰하는 시스템으로, 구성이 간단하지만 관찰 범위가 넓고 분석 성능이 기존 현미경과 유사한 것이 특징이다. 구체적으로, 도 2 및 3에서 보는 바와 같이, 렌즈프리 CMOS 센서, 상기 센서 상에 위치하고 세포를 고정화하기 위한 유리 기판 (세포칩), 상기 세포칩을 둘러싸고 있으며 CO₂ 주입구(in-line), CO₂ 및 온도 센서/히터가 장착되고 시료를 흘려보낼 수 있는 유체 채널(Fluid channel)과 연결된 소형 인큐베이터, 상기 소형 인큐베이터 상에 위치한 청색(Blue) LED를 포함하는 CMOS 기반 세포 이미징 분석 시스템을 제작하였다. 사용된 청색 LED와 CMOS 센서의 스펙은 다음과 같다: Lens (GTECHSPEC Telecentric Backlight Illuminator), Blue LED Spot Light (470 nm Wave Length, 1/4 inch Fiber Bundle Diameter, 0.312 inch Outer Diameter, Input 24V/125A, 50000 hr Lifetime), CMOS sensor (model: uppy F-503B ASG, sensor: 1/2.5", resolution: 2594×1944, Pixel Size: 2.2μm x 2.2 μm, Video Output: FireWire (IEEE-1394a), Max. Frame Rate: 3.5 fps, Gain: 0-19.7 dB, Operating Temp: +5℃ to +45℃, Power: 8 - 36V DC/2W, Dimensions: 24 x 30 x 30 mm, Weight: 50 g.

본 발명자들은 최적의 렌즈프리 CMOS형 세포 이미징 분석 기술을 개발하고자, 염증 모델 세포와 비슷한 크기의 지름 10-20 마이크로미터의 폴리머 입자를 모니터링하면서 여러 물리적 조건들을 파악하였다. 광원으로는 고휘도의 여러 LED(Light-emitting diode)를 테스트하여 회절 현상을 잘 일으키는 LED 파악한 후 최종적으로 파장이 짧은 청색 LED를 선택하였으며, 광원의 광량과 직진성을 조절하는 시스템을 도입하여 선명한 이미징을 얻을 수 있는 광원 장치를 구축하였다. 또한, 다양한 크기 및 화소의 CMOS를 적용하여 이미징 분석 범위를 파악하였으며, 광원과 CMOS 간의 거리 및 광 조사 범위를 비롯하여 CMOS의 데이터 축적 속도 및 감도에 따른 입자 이미징의 차이를 조사하여 최적의 10-20 마이크로미터 사이즈의 이미징을 대량으로 분석할 수 있는 조건을 수립하였다. 이렇게 최적화된 렌즈프리 CMOS 세포 이미징 분석 시스템을 중심으로 염증 세포 분석에 필요한 다음의 요소 기술들을 개발하였다.

실시예 2. 염증세포 모델 및 질환 마커 선정

염증 마커는 막 단백질로서 세포외 도메인(extracellular domain)이 존재하여 항원-항체 반응이 일어날 수 있어야 하고, 염증반응 유도에 의해 마커 발현이 조절되어야 하며, 다양한 조직에서 발현이 일어나야 한다. 이에 따라, 패혈증과 암, 관절염 및 심장질환 등에서 중요하게 관여하는 세포의 브래디키닌 수용체(Bradykinin receptor)의 발현 양상을 이용하여 세포의 염증 마커를 선정하였다. 브래디키닌 수용체는 통증 유발 및 염증반응 유도에 관여하는 것으로 조사되어 있다. 특히 B2R(bradykinin B2 receptor)은 다양한 염증반응 유도에 관여하며, 다이나민(dynamin)이 관여하는 엔도사이토시스(endocytosis) 기작에 의한 protein sorting이 이루어지는 것으로 보고되어 있다. A549 암세포에 녹농균 톡신(P. aeruginosa toxin)을 처리한 후 일정 시간 경과 후 세포 내부의 브래디키닌 수용체 mRNA 발현량을 RT-PCR로 확인한 결과, B1R(bradykinin B1 receptor) 및 B2R은 녹농균 감염에 의한 염증 유발에서 대조구에 비해 4-6배의 발현 증가를 보이는 것을 확인하였다.

전체적인 실험 과정은 다음과 같다. A549 세포를 디쉬(dish)에서 4×10⁵개/ml 농도까지 키운다. PBS 세척한 후 2시간 기아 상태(starvation) 과정을 거치고 4시간 톡신 처리(toxin treatment)를 한다. 기아 상태는 기회성 균주인 P. aeruginosa의 처리를 돕기 위한 단계로서 성장인자(growth factor)가 제거된 배지(media)를 이용한다. 이어 처리 단계에서 P. aeruginosa의 상등액 (200 μl)을 톡신으로 처리한다 (1차 염증반응). 4시간 처리가 끝나면 일부 샘플을 채취해서 트리졸(trizol) 처리 후 RT-PCR 실험을 통해 B2R mRNA 발현양을 알 수 있다. 한편, 연속 진단을 위해 남겨진 세포는 2시간의 rest time 후, 앞서 설명한 단계를 다시 한번 거치는 2차 염증반응 실험을 한다.

1차 염증반응 유도 후, 2차 염증반응 유도를 통해 B1R 및 B2R 발현을 조사해 본 결과, B1R에 비해 B2R이 발현에 있어 재 유도가 가능한 것으로 나타났다. 염증 유도에 따른 결과와 2차 감염에서의 추이를 봤을 때 B2R의 염증마커 선정은 적합한 것으로 생각된다. 또한 이러한 염증반응에 따른 B2R의 발현변화를 질환 마커로 응용하기 위해서는 대조구가 필요할 것으로 생각되어 선천성 면역반응 유도에 중요하게 관여하는 TLRs(Toll-like receptors)를 테스트 하였다. TLR1과 TLR6은 염증 유도에 있어서도 그 발현이 일정하게 유지되는 것을 확인되었다. 따라서 B2R을 염증 질환 마커로, TLR1을 일정하게 발현되는 대조구로 선정하였다.

실시예 3. 마커 인식용 항체 개발 및 이미징 입자 개발

B2R 및 TLR1 외부 노출 부분을 항원으로 하여 이를 각각 인식하는 항체를 개발하였다. 이를 렌즈프리 CMOS 이미징 시스템에 적합한 크기의 입자들을 선정하여 중합시켜 염증 세포 인식용 이미징 입자로 개발하였다.

구체적으로, 각각 100 nm, 500 nm, 1 μm, 10 μm, 20 μm로 크기가 다른 입자들(실리카, 폴리머 또는 금속 입자)을 CMOS 센서로 관찰하여 세포(약 20 μm)와 반응하는 입자들의 화상을 얻었으며, 이것을 Matlab과 imageJ(미국 국립보건원(NIH) 제공) 프로그램을 이용하여 반응 전, 후의 화상 차이가 뚜렷한 입자를 선별하였다. 조사된 바에 의하면, 입자 지름 500 nm 이상의 실리카, 폴리머(폴리스티렌), 금속 입자(Fe₃O₄/Fe₂O₃) 렌즈프리 CMOS 이미징 시스템에 의해서 관찰되며, 10 μm 입자가 가장 높은 해상도를 보였다. 5 또는 10 μm 입자에 B2R항체를 부착시켜 이미지용 입자를 개발하였다. 구입한 카르복실(carboxyl)기로 표면처리 된 폴리머 입자(폴리스티렌; Bang's Lab PC06N/5777 (5.01μm) 또는 PS07N/7082 (10.14μm))를 2 mM EDC(1-ethyl3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide)로 15분간 처리하여 입자 표면의 카르복실기(carboxyl group)를 활성화시켰다. 활성화된 카르복실기는 5 mM NHS(N-hydroxy succinimide)와 결합하여 2차 활성화물을 이루고 반응하고 남은 다량의 EDC는 20 mM 메르캅토에탄올(Mercaptoethanol)을 넣어 억제시켰다. 카르복실기가 활성화된 입자에 각각의 B2R, TLR1 항체를 1 mg/ml을 넣고 MES(2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid) 버퍼에서 2시간 반응시켰다. 20 mM 글리신(glycine)을 넣어 반응을 종결시킨 후 입자를 걸러내어 이미지용 입자로 사용하였다.

실시예 4. 소형 인큐베이터 통합 세포 고정화 칩 개발

장시간의 염증세포 반응을 파악하기 위해, CO₂ 및 온도 제어가 가능한 소형 인큐베이터 시스템을 고려하였고 이 장치에 적합한 염증세포 고정화 칩을 개발하였다. 인큐베이터의 재질은 알루미늄을 아노다이징(anodizing)한 부분과 마그네틱 스테인리스스틸(magnetic stainless steel) 부분으로 이루어져 있다. 인큐베이터의 핵심 기능은 세포를 지속적으로 배양하기 위해 상황에 맞춰 CO₂ 및 온도 제어를 하는 것이다. 온도 제어는 Ni/Cr 열선을 이용하여 열을 가하고 PID (proportionalintegralderivative) 제어를 이용해 전압을 조절하는 방식이다. CO₂는 10% 농도를 사용하고 1 mm 폴리머 튜브(polymer tube)를 통해 공급하며, 센서와의 연동은 인큐베이터를 거치고 나오는 가스를 감지하는 방식이고 NDIR(non Dispersion Infra RED) 센서를 사용한다.

렌즈프리 CMOS 이미징 시스템의 이미징 효율을 높이기 위해, 칩 밑면과 CMOS 센서간의 차이를 최소화 할 수 있는 밑면 두께를 조사하였으며, 최소 100 마이크로미터 두께의 측정용 칩 제작이 가능하였다. 개발된 칩 표면에 APS(3-aminopropyltriethoxysilane)를 처리하여 표면을 아민 기능화 한 후, DSG(Disuccinimidyl glutarate) crosslinker를 처리하여 활성화 시키고 세포외 기질 성분 (extra cellular matrix, ECM)으로 피브로넥틴(fibronectin) 또는 콜라겐(collagen)을 처리하였다. 개발된 칩 표면에 염증세포를 부착시킴으로써 최종적으로 염증세포 고정형 칩을 구성하였다. 앞서 개발된 소형 인큐베이터 시스템과 결합하여 장시간 안정적으로 염증 세포 상태를 관찰하는 시스템을 구성하였다 (도 2 참조).

실시예 5. 요소 기술 통합을 통한 염증 세포 판별

실시예 3에서 개발된 항체-입자 중합형 이미징 입자를 세포 칩 상에 존재하는 염증세포에 적용시키고, 이 결과를 렌즈프리 CMOS 이미징 시스템을 이용하여 모니터링 하였다. 도 3의 같이, 염증 세포인 경우 세포와 결합한 중합 소자의 중첩 회절 이미지(도 3의 왼쪽)가 보이는데 반해, 일반 세포인 경우 세포의 회절 이미지(도 3의 오른쪽) 만이 관찰 된다. 이렇게 중첩된 회절이미지 정도를 파악함으로써 염증세포의 유무와 분포를 분석할 수 있었다.

Claims

렌즈프리 CMOS 센서;
상기 센서 상에 위치하고, 염증세포 표면의 B2R(bradykinin B2 receptor) 또는 B1R(bradykinin B1 receptor) 마커를 특이적으로 인식하는 항체와 결합된 이미징 입자로 표면처리된 염증세포가 세포외 기질 성분 (extra cellular matrix, ECM)에 의해 고정화되어 있는 유리 기판 (세포칩);
상기 세포칩을 둘러싸고 있는 소형 인큐베이터; 및
상기 소형 인큐베이터 상에 위치한 청색(Blue) LED 광원장치를 포함하는 CMOS 기반 염증세포 이미징 분석 시스템:
상기 항체는 이미징 입자 상의 활성화된 카르복실(carboxyl)기와 결합되고, 이 때 활성화된 카르복실기는 이미징 입자에 카르복실기를 화학처리로 도입하고 EDC(1-ethyl3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide)를 처리하여 카르복실기를 활성화한 것을 특징으로 하고,
상기 세포외 기질 성분은 유리 기판에 APS(3-aminopropyltriethoxysilane)를 처리하여 표면을 아민 기능화한 후 DSG(Disuccinimidyl glutarate) crosslinker를 처리하여 활성화시키고 상기 DSG crosslinker에 결합된, 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen) 또는 RGD (Arg-Gly-Asp) 함유 성분인 것을 특징으로 한다.
제 1항에 있어서, 상기 소형 인큐베이터는 CO₂ 및 온도 제어가 가능한 것을 특징으로 하는 CMOS 기반 염증세포 이미징 분석 시스템.
제 2항에 있어서, 상기 소형 인큐베이터는 CO₂ 주입구(in-line), CO₂ 및 온도 센서/히터 및 이와 연결된 제어기(controller)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 CMOS 기반 염증세포 이미징 분석 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 소형 인큐베이터내의 세포칩은 세포를 포함하는 시료를 흘려보낼 수 있는 유체 채널(Fluid channel)과 연결된 것을 특징으로 하는 CMOS 기반 염증세포 이미징 분석 시스템.
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제 1항에 있어서, 상기 이미징 입자는 0.5 내지 20 μm의 실리카, 폴리머 또는 금속 입자인 것을 특징으로 하는 CMOS 기반 염증세포 이미징 분석 시스템.
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제 1항 내지 제 4항, 및 제 12항 중 어느 한 항에 따른 CMOS 기반 염증세포 이미징 분석 시스템을 이용한 염증세포 이미징 분석 방법.
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