JP4260627B2 - 薬物動態学に基づく細胞培養システムのためのデバイスおよび方法 - Google Patents

Description

（政府の権利に関する言及）
本発明は、少なくとも一部、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｅｒｏｎａｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｐａｃｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎからの助成番号ＮＡＧ８−１３７２の下で支援を受けた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

（発明の分野）
本発明の分野は、細胞培養デバイスおよびその使用方法である。

（発明の背景）
薬物動態学は、薬剤および他の生物学的に活性な化合物の、それらが体内に導入された時点から消滅するまでの動向の研究である。例えば、経口薬物についての一連の現象は、種々の粘膜表面からの吸収、血液流を通じた種々の組織への分散、肝臓および他の組織における生体内変換、標的部位での作用、および尿または胆汁における薬物または代謝物の排除を含み得る。薬物動態学は、生物学的系における化合物の代謝に取り組む合理的な手段を提供する。薬物動態学の等式およびモデルの概説については、例えば、ＰｏｕｌｉｎおよびＴｈｅｉｌ（２０００）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８９（１）：１６−３５；Ｓｌｏｂら（１９９７）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２７（３）：２６１−７２；Ｈａｄｄａｄら（１９９６）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ．８５（２）１１３−２６：Ｈｏａｎｇ（１９９５）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ．７９（１−３）：９９−１０６；Ｋｎａａｋら（１９９５）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ．７９（１−３）：８７−９８；ならびにＢａｌｌおよびＳｃｈｗａｒｔｚ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２４（４）：２６９−７６を参照のこと。

薬物、環境、栄養、消費者製品の安全性、および毒物学研究において研究者の直面する基本的な困難の１つは、代謝データの推定およびインビトロ細胞培養アッセイから動物への危険評価である。適切な薬物動態学原理の適用によりいくつかの結論が導かれ得るが、実質的な制限はなおも存在する。１つの関心は、現在のスクリーニングアッセイが、細胞を、それらの天然の設定でそれらの機能を複製しない条件下で使用することである。循環流、他の組織との相互作用、および生理学的応答と関連する他のパラメーターは、標準的な組織培養形式で見出されない。例えば、マクロ規模の細胞培養類似（ＣＣＡ）系において、細胞は、チャンバの底で培養される。これらの系は、非生理学的な高い液体 対 細胞の比を有し、そして非現実的な細胞型の比（例えば、肝臓細胞 対 肺細胞の比）を有する。マクロ規模のＣＣＡ系の変形型において、細胞は、マイクロキャリアビーズ上で培養される。これらの系は、生理学的条件と非常に類似するが、それらは予測研究について十分に正確な生理学的条件を模倣しないのでなおも不十分である。従って、得られるアッセイデータは、動物において見出される薬物または毒素の曝露パターンに基づいていない。

生物内では、濃度、時間、および代謝は相互作用し、薬物動態学的応答または毒物応答の強度および持続時間に影響する。例えば、肝臓機能のインビボでの存在は、薬物の代謝およびバイオアベイラビリティに強く影響を及ぼす。肝臓による活性薬物の排除は、生体内変換および排出により起こる。生体内変換反応としては、多くの化学的に多様な薬物を変換するチトクロムＰ４５０酵素により触媒される反応が挙げられる。第２生体内変換フェーズは、水溶性および腎臓を通じた迅速な排除を増加させるために、親水性基（例えば、グルタチオン、グルクロン酸、または硫酸塩）を付加し得る。

生体内変換は有益であり得るが、それはまた、望ましくない結果を有し得る。毒性は、化合物と生物との間の複雑な相互作用から生じる。生体内変換プロセスの間に得られる代謝物は、親化合物よりも毒性であり得る。毒性スクリーニングについて大いに使用される単一細胞アッセイは、これらの複雑な細胞内効果および組織内効果を損なう。

結果的に、潜在的薬剤に対するヒト応答性の正確な予測は、困難であり、しばしば信頼できないものであり、そして常に高価なものである。ヒト応答を予測する従来方法は、代替物（代表的には、静的な均質のインビトロ細胞培養アッセイまたはインビボ動物研究のいずれか）を使用する。インビトロ細胞培養アッセイは、薬物候補がヒト内で供される複雑な環境を正確に模倣せず、従って、ヒトの危険を正確に予測し得ないため、制限された価値しか有さない。同様に、インビボ動物試験は、インビトロ細胞ベースのアッセイから観察され得ないこれらの複雑な細胞内効果および細胞外効果を考慮し得るが、インビボ動物研究は、極めて高価であり、大きな労働力を要し、時間を消費し、そしてしばしば結果は、ヒトの危険に関する場合、疑いのある関連性を有する。

Ｓｈｕｌｅｒらに対して発行された米国特許第５，６１２，１８８号は、複数コンパートメントの細胞培養システムを記載する。この培養システムは、大きなコンパートメント（例えば、培養チャンバ、センサ、およびポンプ）を使用し、多量の培養培地、細胞、試験化合物の使用を必要とする。この系は、使用するには非常に高価であり、そして使用するために大きな空間を必要とする。この系は、このように大規模であるので、生理学的パラメーターは、インビボ状態で見出されるパラメーターとは大きく異なる。このような大規模で生理学的に現実性のある条件を正確に生成するのは、不可能である。

より良好な、より迅速な、そしてより効果的な、インビボ毒性および臨床的薬物性能の予測を提供し得る微小規模のスクリーニングアッセイおよびデバイスの開発は、多くの分野において大きな目的であり、そしてこのことが、本発明において取り組まれる。このような微小規模のデバイスは、生理学的に現実性のあるパラメーターを正確に生成し、そして試験される望まれるインビボ系をより綿密にモデル化する。

（発明の要旨）
微小規模の細胞培養類似（ＣＣＡ）デバイスのためのデバイス、インビトロ細胞培養物、および方法が提供される。本発明のデバイスは、薬物動態学的パラメーター値がインビボで見出される値と類似する条件下で、細胞をインビトロで維持することを可能にする。目的の薬物動態学的パラメーターとしては、細胞間の相互作用、液体滞留時間、液体 対 細胞の比、器官の相対的な大きさ、細胞による代謝、剪断応力などが挙げられる。細胞の天然の状態を模倣する薬物動態学に基づく培養システムを提供することにより、スクリーニングおよび毒性アッセイの予測値およびインビボでの関連性が増強される。

微小規模培養デバイスは、別個であるが相互接続されたチャンバへと分離する流体網のチャネルを備える。この特定のチャンバのジオメトリは、細胞の相互作用、液体の流れ、および液体滞留のパラメーターを提供するよう設計され、これらのパラメーターは、インビボで対応する細胞、組織、または器官について見出されるパラメーターと相関する。流体工学は、循環系またはリンパ系の主要エレメントを正確に表現するよう設計される。１つの実施形態において、これらの要素は、チップ形式に統合される。これらのジオメトリのこの設計および確認は、生理学に基づく薬物動態学（ＰＢＰＫ）モデル（異なる組織を表す相互接続されたコンパートメントとして身体を表す数学的モデル）に基づく。

このデバイスは、各培養チャンバに対して、適切な細胞を接種され得る。例えば、肝臓薬物動態学的パラメーターを提供するよう設計されたチャンバは、肝細胞を接種され、そして脂肪組織薬物動態学を提供するよう設計されたチャンバに接種された脂肪細胞と液体接続され得る。この結果は、例えば、組織の大きさの比、組織 対 血液の体積比、モデル化される動物の薬物滞留時間を正確に表現する薬物動態学に基づく細胞培養システムである。

１つの実施形態において、系は、第１の微小規模培養デバイスおよび制御機器を備える。第１の微小規模培養デバイスは、培養培地との複数のインビボ相互作用を刺激するジオメトリを有する多くの微小規模チャンバを有する。ここで、各チャンバは、培養培地の流れのための入口および出口、ならびにこれらのチャンバと相互接続する微小流体チャネルを備える。制御機器は、第１の微小規模培養デバイスと接続され、そして第１の微小規模培養デバイスからデータを獲得し、そして、第１の微小規模培養デバイスの薬物動態学的パラメーターを制御するためのコンピューターを備える。

別の実施形態において、コンピューターは、マイクロプロセッサ、汎用メモリ、不揮発性保存エレメント、１つ以上のセンサを有する微小規模培養デバイスに対するインターフェースを備える入力／出力インターフェース、およびコンピューターソフトウェアを備える。コンピューターソフトウェアは、センサからのデータを分析して微小規模培養デバイスの多くのチャンバにおける生理学的現象を測定し、微小規模デバイスのチャンバにおける培養培地の液体の流速を調節し、微小規模培養デバイスのチャンバにおける生物学的反応または毒物学的反応を検出し、そして検出の際に、微小規模培養デバイスの１つ以上の薬物動態学的パラメーターを変更するよう、マイクロプロセッサ上で実行可能である。

本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の対象を含む。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、１つ以上のこのような化合物をいい、「細胞（ｔｈｅ ｃｅｌｌ）」は、特定の細胞ならびに当業者に公知の他のファミリーのメンバーおよびそれらの等価物を含む。

（実施形態の詳細な説明）
本発明者らは、微小規模の細胞培養類似（ＣＣＡ）系を開発した。このような微小規模ＣＣＡ系は、先行技術の微小規模系を上回る多くの利点を有する。この微小規模系は、より少量の試薬、より少数の細胞（培養細胞ではなく真性のプライマリー細胞の使用を可能にする）を使用し、より生理学的に現実的であり（例えば、滞留時間、器官比、剪断応力）であり、より低いデバイス費用を有し、そしてより小さいサイズである（複数の試験および統計学的分析に利用可能である）。さらに複数のバイオセンサが、同一チップ上に組み込まれ得る。

簡単に言うと、本発明のチップは、動物全体またはヒト全体の正確なインビトロ代替物を提供する。このことを達成するために、初期設計を、生理学に基づく薬物動態学（Ｐ‘ＢＰＫ）モデル（特定の器官に特異的な相互接続されたコンパートメントとして身体を表現する数学的モデル）を用いて作成した。ＰＢＰＫモデルおよび公開された経験的データから、長期にわたる広範な開発プログラムにより、既知の組織サイズの比、組織 対 血液の体積比、薬物滞留時間、および動物全体またはヒト全体の他の重要な生理学的パラメーターを正確に模倣する微小規模デバイスを生成した。本質的に、本発明のチップ技術は、動物全体またはヒト全体の微小規模モデルである（ヒトについては、約１／１００，０００倍）。

作動時には、このデバイスは、生存細胞を、異なる、相互接続された「器官」コンパートメントに分離することにより、再循環性多器官系を複製する（例えば、図１５を参照のこと）。流体工学は、循環系の主要エレメントおよび器官系の相互作用が正確に模倣されるように設計される。各器官コンパートメントは、対応する器官全体の主要機能（例えば、肝臓による生体異物代謝）を模倣するよう注意深く選択または操作された特定の細胞型を含む。この細胞型は、接着性または非接着性であり得、そして標準的な細胞培養株またはプライマリー組織に由来する。ヒト細胞は、ヒトの代替物または適切な場合、他の種由来の細胞のために使用される。

器官コンパートメントは、「血液代替物」として作用する再循環培養培地により接続される。培地中の試験試薬は分散され、そしてヒト身体または動物全体におけるのと同様に器官コンパートメント中の細胞と相互作用する。種々の細胞型に対するこれらの化合物および／またはそれらの代謝物の効果は、鍵となる生理学的現象（例えば、細胞死、細胞増殖、分化、免疫応答、または代謝経路またはシグナル伝達経路における摂動）を測定またはモニタリングすることにより検出される。さらに、薬物動態学的データは、薬物代謝についての培養培地のアリコートを収集および分析することにより決定され得る。

本発明の微小規模チップデバイスは、伝統的な細胞培養アッセイの費用およびスループットの利点、ならびにまた、動物モデル全体の高い情報含有量の両方を提供する。しかし、動物全体の試験とは異なり、このチップは安価であり、そして大部分が使い捨てである。このデバイスの低い流体容量（約５μｌ）は、微小流体デバイスに特徴的な、高い感度およびスループットを提供する。さらに、このデバイスの読み出しは、非常に融通性であり、そしてアッセイに非依存性である（ほとんど任意の細胞型またはアッセイが、改変なしで使用され得る）。光学的呼掛けおよび読み出し（例えば、蛍光、発光）に基づく多数の生物学的アッセイが利用可能であり、従って、リアルタイムのモニタリングを実行可能にする。あるいは、標準的な病理学的アッセイ、生化学的アッセイ、ゲノムアッセイまたはプロテオームアッセイが、直接利用され得る。なぜなら、このシステムは、伝統的なカバーガラス（２２ｍｍ×２２ｍｍ）または９６ウェルの形式と完全に適合可能に設計され得るからである。さらに、遺伝子操作された細胞が、専門的な最終使用者の適用のために使用され得る。さらに、さらなるコンパートメントおよびモジュールを包含するための「３Ｄ」チップが使用されて、胃腸管または血液脳関門の吸収を分析し得る。

伝統的なインビトロアッセイとは異なり、本発明のチップは、生物全体の複雑な複数組織（肝臓、肺、脂肪、循環系など）の生物学を、より綿密に模倣する。薬物候補が、より現実的な動物またはヒトの生理学的環境に曝露され、従って、代表的なインビトロアッセイより高く、より正確な情報内容（例えば、吸収、分布、生体蓄積、代謝、排出、効力および毒性）を提供する。これらの利点は、薬物リードの安全性および効力の予測、ならびに特に、高価な、時間を浪費する、非臨床試験または臨床試験に入る前のそれらの優先に直接影響を与える。この優先は、これらの試験に入る前の潜在的毒性または効力の欠如の迅速かつ直接的な評価を可能にすることによって、薬物開発のスループットを増加させ、毒物学的スクリーニングのために必要とされる動物の数を減少させ、非臨床研究の費用を減少させ、そして臨床試験の効率を増加させる。

これらは、本発明のチップ技術の利点のいくつかを実証する。要約すると、伝統的なインビトロ細胞培養アッセイ、動物研究、または臨床試験と比較した場合に、データの獲得が迅速である。このデータはまた、効果的であり、伝統的なインビトロアッセイからは利用可能ではない、高度に予測的な内容を提供する。チップのプラットフォームは、既存のアッセイ（標準的なカバーガラスまたは９６ウェルの形式のいずれかで）と完全に適合性であるように設計される。デバイス自体が、任意の動物種または複数の器官コンパートメントの組合せに対して構成可能である。個々のチップは、使い捨てであるように、費用効果的な価格にされる。さらに、このデバイスに低い容量は、潜在的な化合物をスクリーニングする際に、試薬の費用をさらに減少させる。

現在利用可能な技術とは異なり、本発明のチップシステムは、臨床段階においてのみでなく、臨床前試験を行うために必要とされる化合物の数をまた減少させることによって、成功率を大いに増加させる。その結果、製薬会社は：（１）開発プロセスの初期に、どの薬物候補がヒトに対して毒性である可能性を有するかを決定し得；（２）ヒトの応答を最良に予測する動物種をより良好に選択し得；そして（３）どの薬物候補が有効である可能性を有するかを決定し得る。従って、本発明のチップは、一般に、成功率を増加させ、そして市場向きの薬物の開発時間を減少させる。

（薬物速度論（ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃ）に基づく微小規模培養デバイス）
ＣＣＡデバイスのためのデバイス、インビトロ細胞培養、および方法が提供される。本発明の方法およびデバイスは、細胞が、生理学的に代表的な環境にインビトロで維持され、これによって、スクリーニングおよび毒性アッセイの推定値およびインビボでの妥当性を改善する手段を提供する。本発明の微小規模の薬物速度論（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ）培養デバイスは、各培養チャンバに対して適切な細胞を播種され、次いで、この培養系は、化合物のスクリーニング、毒性アッセイ、目的の細胞の開発のためのモデル、感染速度論のモデルなどのために使用され得る。入力変数（これは例えば、化合物、サンプル、遺伝子配列、病原体、細胞（例えば、幹細胞または前駆細胞）であり得る）が、樹立された培養系に添加される。種々の細胞出力が評価されて、入力変数に対する細胞の応答（培地のｐＨ、培地中のＯ_２およびＣＯ_２の濃度、タンパク質および他の細胞マーカーの発現、細胞の生存性、または培養培地への細胞産物の放出が挙げられる）を決定し得る。

培養基材（すなわちデバイス）の設計および構成は、本発明の独特の増殖条件を提供する。各デバイスは、１つ以上のチャンバを備え、これらのチャンバは、流体チャネルによって相互接続されている。各チャンバは、そのデバイスに存在する他のチャンバとは異なる幾何学的構造を有し得る。例えば、デバイスの１つの実施形態は、肺、肝臓、および他の組織を表すチャンバからなる（図１８Ａ）。この実施形態における肺チャンバは、液体容量比および液体滞留時間に対する現実的な細胞を達成するために、５μｍの高さの隆起を備える（図１８Ｂ）。この実施形態における肝臓チャンバは、液体容量比および液体滞留時間に対する現実的な細胞を達成するために、２０μｍの高さの柱を備える（図１８Ｃ）。このデバイスはまた、培養培地が循環し得るように、入口ポートおよび出口ポートを備える。

１つの実施形態において、この培養デバイスは、チップの形式である。すなわち、チャンバおよび流体チャネルが、製造されたマスターから作製または成形されており、その結果、このデバイスは、単一のユニットとしてか、または１つ以上のチャンバを別個のユニットに有するモジュラーシステムとしてかのいずれかで、形成される。一般に、チップ形式は、小規模で提供され、通常、１辺が約１０ｃｍ以下であるか、または１辺が約５ｃｍ以下でさえある。それはなお、１辺がほんの約２ｃｍであっても、それより小さくてもよい。別の例において、チップは、９６ウェル形式で収容され得、ここで、各チップは、０．９ｃｍ×０．９ｃｍ未満である。チャンバおよび流体チャネルは、これに対応して、大きさが微小規模である。

別の実施形態において、この培養デバイスは、一体型デバイスの形式であり、使い捨てのプラスチックのポリマーベースの構成要素として製造された複数の微小規模チップを収容する、卓上機器を備える。この機器は、個々のセルチップ、あるいは標準的な９６ウェル形式における１つの「チップ」（すなわち、８×１２の形式の９６個の個々のチップ）を収容するための凹部を有する、基部を備え得る。この機器の頂部は、閉じられる場合、チップを密封し、そして流体相互接続を提供する。この機器は、流体をチップに再循環させるための低容量ポンプ、および試験化合物の導入を提供するため、または化合物を９６ウェルプレートもしくは３８４ウェルプレートから直接引き出すための注入ループを備える小さな三方弁を供える。この機器を使用して、複数の化合物が、効力、毒性、および／または代謝産物生成について、同時に評価され得る。この機器はまた、十分に特徴付けられた生物マーカーを使用して、リアルタイムの生理学的モニタリングのための、チップ上蛍光検出を統合し得る。

このデバイスは、細胞および培養培地から信号を得るための機構を備え得る。異なるチャンバおよびチャネルからの信号が、リアルタイムでモニタリングされ得る。例えば、バイオセンサが、このデバイスに一体化され得るか、またはこのデバイスの外部に備えられ得、これは、その系における細胞の生理学的状態の、リアルタイムの読み出しを可能にする。

本発明は、ある種の物質（例えば、薬学的組成物、ワクチン調製物、細胞傷害性化学物質、突然変異原、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、阻害性化合物、化学療法剤、および他の化合物または因子の宿主）に対する陽性または陰性の応答を同定するための、ハイスループットのスクリーニングのための理想的なシステムを提供する。試験される物質は、天然に存在する物質または合成物質のいずれかであり得、そして有機物または無機物であり得る。

例えば、細胞傷害性化合物の活性は、培養物中の細胞に損傷を与えるかまたは殺傷する能力によって、測定され得る。これは、生体染色技術によって、容易に評価され得る。増殖因子／調節因子の影響は、例えば、全細胞計数、および差示的細胞計数により、マトリックスの細胞含有量を分析することによって、評価され得る。これは、標準的な細胞学的技術および／または組織学的技術（型特異的細胞抗原を規定する抗体を使用する、免疫細胞化学的技術の使用が挙げられる）を使用して、達成され得る。このデバイスにおいて培養される正常な細胞に対する、種々の薬物の効果が、評価され得る。例えば、赤血球形成を増加させる薬物は、骨髄培養物について試験され得る。コレステロール代謝に影響を与える（例えば、コレステロール生成を低下させることによって）薬物は、肝臓系に対して試験され得る。腫瘍細胞の培養物は、例えば、抗腫瘍剤の効力を試験するためのモデル系として、使用され得る。

本発明のデバイスは、生理学的条件または病理学的条件の研究のためのモデル系として、使用され得る。例えば、本発明の特定の実施形態において、デバイスは、血液脳関門に対するモデルとして使用され得る；このようなモデル系を使用して、血液脳関門を通る物質の貫通を研究し得る。さらなる実施形態において、そして限定としてではなく、粘膜上皮を含むデバイスは、ヘルペスウイルスまたはパピローマウイルスの感染を研究するためのモデル系として使用され得る；このようなモデル系を使用して、抗ウイルス薬剤の効力を試験し得る。

本発明のデバイスはまた、悪性疾患おび疾患の診断および処置を補助するために、使用され得る。例えば、任意の組織（例えば、骨髄、皮膚、肝臓）の生検が、悪性腫瘍に罹患すると疑われる患者から採取され得る。この患者の培養物をインビトロで使用して、細胞傷害性化合物および／または薬学的化合物をスクリーニングし、最も効力のあるもの（すなわち、悪性細胞または疾患細胞を殺傷するが正常細胞を残すもの）を同定し得る。次いで、これらの薬剤を治療的に使用して、患者を処置し得る。

本発明のなお別の実施形態において、このデバイスは、インビトロで使用されて、生物学的生成物を高収率で生成し得る。例えば、特定の生物学的産物（例えば、増殖因子、調節因子、ペプチドホルモン、抗体）を多量に天然に産生する細胞、または外来性の遺伝子産物を産生するように遺伝子操作された宿主細胞が、このデバイスをインビトロで使用して、クローン的に増殖され得る。形質転換された細胞が、遺伝子産物を栄養培地に排出する場合、この産物は、標準的な分離技術（例えば、２〜３の例を挙げれば、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、電気泳動技術）を使用して、使用済み培地または馴化培地から容易に単離され得る。培養物にインビトロで供給するための連続流方法を利用する、「バイオリアクタ」が、考案され得る。本質的に、新鮮な培地がこのデバイスにおける培養物を通り抜けるにつれて、遺伝子産物は、この培養物から放出された細胞と共に、この培養物から洗い流される。遺伝子産物は、使用済み培地または馴化培地の流出物から単離され得る（例えば、ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィー、電気泳動によって）。

本発明はまた、種々の環境的条件または化合物の、生物学的系に対する影響をスクリーニングまたは測定するためのシステムを提供する。例えば、空気または水の条件が、このデバイスにおいて、模倣または変化され得る。既知または疑わしい、異なる毒性物質の影響が、試験され得る。本発明は、さらに、消費者の製品（例えば、化粧品、クレンザー、またはローション）をスクリーニングするためのシステムを提供する。本発明はまた、栄養と薬効のある物質（ｎｕｔｒｉｃｅｕｔｉｃａｌ）、栄養補助剤、または食品添加物の安全性および／または効力を決定するためのシステムを提供する。本発明はまた、細胞産物を多量に産生するための、小型のバイオリアクタまたは細胞産生プラットフォームとして使用され得る。

本発明のチップ形式の微小規模培養デバイスを使用する、効力または毒性の代表的な実験は、実験の設計に依存して、２４〜４８時間以下で完了する。しかし、長期間の曝露の影響（例えば、遺伝子毒性、発癌性、または潜在性の疾患）を試験するためには、延長した実験が実施され得る。

本発明は、本明細書中に記載されるような、新規のデバイス、システムおよび方法を提供する。一般に、本明細書中において使用される全ての技術用語および科学用語は、明らかに他に示されない限り、本発明が属する分野の当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。明らかにするために、本発明を記載するために本明細書中において使用される特定の用語についての定義が、以下に列挙される。これらの定義は、明らかに他に示されない限り、用語が本明細書全体にわたって使用される場合に、これらの用語に適用される。

（用語の定義）
（薬物速度論に基づく培養系：） 細胞が、インビボにおいて見出される薬物速度論的パラメーター値をモデル化する薬物速度論的パラメーター値を提供する条件下に維持される、インビトロの細胞培養系。薬物速度論的培養デバイスは、不連続であるが相互接続されたチャネルに分離されたチャネルの流体ネットワークを備え、ここで、特定のチャンバ構成が、対応する細胞、組織または器官系に対してインビボで見出されるものに対応する細胞相互作用、流体流れ、および流体滞留パラメーターを提供するように設計される。このデバイスは、モデル化される条件に適切な細胞（例えば、肝臓に基づく培養チャンバにおける肝細胞、肺に基づく培養チャンバにおける肺細胞など）を播種されて、培養系を提供する。

本発明の培養系は、目的の細胞、組織、または器官系についてインビボで得られる値に匹敵する、少なくとも１つの薬物速度論的パラメーター値、好ましくは、少なくとも２つのパラメーター値を提供し、そして３つ以上の匹敵するパラメーター値を提供し得る。目的の薬物速度論的パラメーターとしては、例えば、細胞間の相互作用、液体の滞留時間、液体対細胞の比、細胞による代謝、またはせん断応力が挙げられる。

匹敵する値とは、実際の値が理論値から２５％より大きくは逸脱しないことを意味する。例えば、ラットについて肺のコンパートメントにおける液体の滞留時間についての計算値または理論値は、２秒間であり、そしてラットＣＣＡデバイスの肺細胞培養チャンバにおいて測定された実際の値は、２．５±０．７秒間であった。

薬物速度論的パラメーター値は、ＰＢＰＫモデルの式を使用することによって得られる。このような式は、当該分野において記載されており、例えば、ＰｏｕｌｉｎおよびＴｈｅｉｌ（２０００）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．８９（１）：１６−３５；Ｓｌｏｂら（１９９７）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２７（３）：２６１−７２；Ｈａｄｄａｄら（１９９６）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ．８５（２）：１１３−２６；Ｈｏａｎｇ（１９９５）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ．７９（１−３）：９９−１０６；Ｋｎａａｋら（１９９５）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｌｅｔｔ．７９（ｌ−３）：８７−９８；ならびにＢａｌｌおよびＳｃｈｗａｒｔｚ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２４（４）：２６９−７６（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。薬物速度論的パラメーターはまた、刊行された文献から得られ得、例えば、Ｂｕｃｋｐｉｔｔら、（１９８４）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ，２３１：２９１−３００；ＤｅｌＲａｓｏ（１９９３）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．６８：９１−９９；Ｈａｉｅｓら、（１９８１）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１２３：５３３−５４１を参照のこと。

目的の特定の生理学的パラメーターとしては、組織または器官の液体滞留時間、組織または器官の質量、液体対細胞の容量比、細胞のせん断応力などが挙げられる。生理学的に関連するパラメーター値は、従来の方法に従って経験的に得られ得るか、または当該分野において公知であり公共に利用可能な値から得られ得る。目的の薬物速度論的パラメーター値は、動物（通常、哺乳動物）から得られるが、他の動物モデル（例えば、昆虫、魚類、爬虫類または鳥類）もまた、用途を見出し得る。哺乳動物としては、実験室動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット）、経済的価値のある哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、イヌ、またはネコ）；霊長類（サル、類人猿、またはヒトが挙げられる）；などが挙げられる。異なる値が、異なる年齢（例えば、胎児、新生児、乳児、幼児、成人、または老人）の動物；および異なる生理学的状態（例えば、罹患、薬学的活性剤との接触後、感染後、または変化した大気圧の条件下）に対して得られ得、そして使用され得る。

薬物速度論的パラメーター値に関連する情報、およびシステムにおいてモデル化される種々の物質に対して適用可能な質量バランスは、必要に応じて、培養系のデータ処理構成要素（例えば、格納のために保存された汎用メモリにおけるルックアップ表など）に提供される。これらの式は、系における種々の生物学的物質／化学物質についての、生理学に基づく薬物速度論モデルを表す。

（薬物速度論的培養デバイス：） 本発明の培養デバイスは、細胞増殖のための基材を提供する。各デバイスは、少なくとも１つのチャンバ、通常は少なくとも２つのチャンバを備え、そして３つ以上のチャンバを備え得、ここで、これらのチャネルは、流体チャネルによって相互接続される。これらのチャンバは、単一の基材上または異なる基材上にあり得る。好ましくは、各チャンバは、そのデバイスに存在する他のチャンバから区別される幾何学的構造を有する。このデバイスは、これらのチャンバおよびチャネルを密封するためのカバーを備え、そして少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートを備え、これらは、培養培地の再循環を可能にする。このデバイスは、培養培地をこの系に通してポンピングするための機構を備える。この培養培地は、培養される細胞の生存性を維持するように設計される。このデバイスは、試験化合物がこのシステムに導入され得る機構を備える。

本発明の１つの実施形態において、このデバイスは、一辺が約２．５ｃｍ以下の単一のユニットとして、微小規模で作製され、好ましくは、相互接続された少なくとも２つのチャンバを備える。２つの器官コンパートメントが、約５０〜１５０μｍの幅および１５〜２５μｍの深さのチャネルによって、接続される。例えば、１つのチャンバは肺を表し得、平行チャネル（通常、少なくとも約１０個のチャネル、好ましくは、少なくとも約２０個のチャネル）の相互接続されたアレイを備える。このようなチャネルは、代表的な微小流体寸法（例えば、約３０〜５０μｍの幅、５〜１５μｍの深さ、および３〜７ｍｍの長さ）を有し得る。別のコンパートメントは、肺を表し得、蛇行した形状の２つ以上の平行なチャネル（通常、約５０〜１５０μｍの幅、１５〜２５μｍの深さ、および５〜１５ｃｍの長さ）を備える。

このデバイスは、通常、細胞および培養培地から信号を得るための機構を備える。異なるチャンバおよびチャネルからの信号が、リアルタイムでモニタリングされ得る。例えば、バイオセンサが、このデバイスに一体化されるかまたは外部に備えられ得、これは、その系における細胞の生理学的状態の、リアルタイムの読み出しを可能にする。

本発明の薬物速度論的培養デバイスは、チップまたは基材として提供され得る。流体力学を増強させることに加えて、このような微小なシステムは、空間を節約し（特に、高度に並行化されたシステムにおいて使用される場合）、そして安価に製造され得る。この培養デバイスは、ポリスチレンが挙げられるがこれに限定されないポリマーから形成され得、そして１回の使用の後に処分され得、滅菌の必要性を排除する。その結果、このインビトロサブシステムは、安価に製造され得、そして広範に使用され得る。さらに、細胞は、三次元の様式で増殖されて、例えば、チューブを形成し得、これは、インビボの環境をより綿密に複製する。

任意の特定の薬剤に対する動物の代謝応答をモデル化するために、並行アレイまたは複数アレイのバンクは、複数（すなわち、少なくとも２つ）の細胞培養系を備え、ここで、各システムは、同一であり得るか、または予め決定されたパラメーター値もしくは入力薬剤および濃度が異なり得る。このアレイは、少なくとも約１０個のシステムを備え得るか、または１００程度に多く、またはそれより多くのシステムでさえあり得る。好都合には、マイクロチップ上の細胞培養システムは、単一のチャンバ内に収容され得、その結果、アッセイ中の全ての細胞培養系が、アッセイの間、同じ条件に供される。

あるいは、複数のチップが相互接続されて、単一のデバイスを形成し得、例えば、胃腸管関門または血液脳関門を模倣し得る。

（細胞：） 本発明のアッセイにおいて使用するための細胞は、生物、生物由来の単一の細胞型であり得、そしてインビボの状況において代表的であるような、複数の細胞型の混合物であり得る。培養条件としては、例えば、温度、ｐＨ、因子の存在、他の細胞型の存在などが挙げられ得る。先に記載されたような、薬物速度論的パラメーター値が得られ得る動物のいずれかを含む、種々の動物細胞が使用され得る。

本発明は、任意の細胞型（初代細胞、幹細胞、前駆細胞、正常な細胞株、遺伝的に改変された細胞株、遺伝的に変更された細胞株、不死化細胞株、および形質転換された細胞株が挙げられる）と共に使用するために適切である。本発明は、単一の細胞型または細胞株、あるいは異なる細胞型の組合せと共に使用するために適切である。好ましくは、培養された細胞は、その天然に存在する対応物における応答を引き起こす刺激に応答する能力を維持する。これらは、真核生物細胞または原核生物細胞のような、全ての供給源に由来し得る。真核生物細胞は、本質的に植物または動物（例えば、ヒト、サル、またはげっ歯類）であり得る。これらは、任意の組織型（例えば、心臓、胃、腎臓、腸、肺、肝臓、脂肪、骨、軟骨、骨格筋、平滑筋、心筋、骨髄、筋肉、脳、膵臓）および細胞型（例えば、上皮、内皮、間葉、脂肪細胞、造血細胞）であり得る。さらに、組織または器官の断面が使用され得る。例えば、動脈、静脈、胃腸管、食道、または結腸の断面が使用され得る。

さらに、非ネイティブの「組換え」（「外因性」とも呼ばれる）核酸配列を含むように遺伝子的に変更または改変されたか、あるいは遺伝子機能の獲得または損失を提供するようにアンチセンス技術によって改変された細胞が、本発明において利用され得る。遺伝刺激に改変された細胞を作製するための方法は、当該分野で公知である（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０００を参照のこと）。これらの細胞は、末端分化細胞または未分化細胞（例えば、幹細胞）であり得る。本発明の細胞は、生物学的因子および薬学的因子に対して異なって応答し得る種々の遺伝的に多様な個体由来の培養細胞であり得る。遺伝的多様性は、疾患感受性に対する間接的影響および直接的影響を有し得る。直接的な場合において、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を生じる単一のヌクレオチド変化でさえ、タンパク質のアミノ酸配列を変更し得、そして疾患または疾患感受性に直接的に寄与し得る。例えば、特定のＡＰＯリポ蛋白Ｅ遺伝子型は、何人かの個体におけるアルツハイマー病の発症および進行と関連している。

特定の多型が、特定の疾患表現形と関連している場合、多型のキャリアとして同定された個体由来の細胞は、コントロールとしての非キャリア由来の細胞を使用して、発生異常について研究され得る。本発明は、特定の遺伝的疾患の症状に関連する発生異常を研究するための実験系を提供する。なぜなら、いくつかの異なる細胞型が、同時に研究され、そして関連の細胞と関連付けられるからである。例えば、ニューロン前駆体、グリア細胞、または神経由来の他の細胞が、神経系に対する化合物の細胞効果を特徴付けるためのデバイスにおいて使用され得る。また、システムは、細胞が遺伝的要素（これは、薬物感受性、ケモカイン応答およびサイトカイン応答、増殖因子、ホルモンおよびインヒビターに対する応答、ならびにレセプターの発現および／または機能における変化に対する応答に影響を及ぼす）を決定するために研究され得るように、構成され得る。この情報は、遺伝的原因の疾患のための処置方法、または遺伝的素因が存在する疾患のための処置方法の設計において貴重であり得る。

本発明の一実施形態において、細胞（例えば、肝細胞を含む肝臓細胞；細管細胞を含む腎臓細胞；有機化合物を長期間保持し得る脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）を含む脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ））は、薬学的に活性な化合物の無毒化および代謝に関与する。これらの細胞は、培養系において、呼吸および酸素付加プロセスに関与する細胞（例えば、肺細胞）と組み合わされ得る。これらの細胞はまた、目的の薬剤による損傷に対して特に感受性である細胞（例えば、腸上皮細胞、骨髄細胞、および細胞分裂に影響を及ぼす薬剤について、他の通常は迅速に分裂している細胞）と組み合わされ得る。ニューロン細胞は、神経毒性のための薬剤の効果などについてモニタリンスするために、存在し得る。

腫瘍の増殖特性、ならびに腫瘍増殖に対する周辺組織および免疫系の応答もまた、興味がもたれる。変性疾患（罹患組織および周辺領域を含む）は、罹患組織の応答および身体の他の部分との相互作用の両方を決定するために、使用され得る。

用語「環境」または「培養条件」は、細胞、培地、因子、時間および温度を包含する。環境としてはまた、薬物および他の化合物、特に、大気条件、ｐＨ、塩組成、無機質などが挙げられ得る。細胞培養は、代表的に、生理学的条件を模倣する滅菌条件（例えば、加湿した９２〜９５％空気／５〜８％ＣＯ_２大気を含むインキュベーター中、３７℃）において、実施される。細胞培養は、未規定の生物学的流体（例えば、ウシ胎児血清）を含む栄養分混合物中、または十分に規定された血清を含まない培地中で実施され得る。種々の培養培地が、当該分野で公知であり、そして市販されている。

用語「生理学的条件」は、本明細書中で使用される場合、細胞培養条件が、インビボにおける特定の細胞型についての天然の組織条件を可能な限り綿密に模倣するために、非常に詳細にモニタリングされることを意味するように、定義される。これらの条件としては、液体滞留時間（すなわち、液体が器官内に留まる時間）、細胞 対 血液容量の比、細胞に対する剪断応力、天然の器官に適合性のコンパートメントのサイズのようなパラメーターが挙げられる。

（スクリーニングアッセイ）
本明細書中で一般に「入力変数」と称される、薬物、毒素、細胞、病原体、サンプルなどは、薬物動態学に基づく細胞系に加え、そして目的の出力変数（例えば、Ｏ_２の消費、ＣＯ_２の生成、細胞生存度、または目的のタンパク質の発現）における変化についてこの培養細胞を評価することによって、生物学的活性についてスクリーニングされる。この入力変数は、代表的に、溶液形態または容易に可溶な形態で、培養物中の細胞の培地に加えられる。この入力変数は、フロースルーシステムを使用してか、あるいはボーラスを他の静的溶液に添加して、加えられ得る。フロースルーシステムにおいて、２つの流体が使用され、ここで一方は、生理学的に中性の溶液であり、そして他方は、加えられる試験化合物と同じ溶液である。第１の流体は、細胞を通過し、続いて、第２の細胞を通過する。単一溶液法において、試験入力変数のボーラスが、細胞を取り囲む容量の培地に加えられる。培養培地の全組成は、このボーラスの添加と共に、またはフロースルー方法における２つの溶液間で、有意に変化するべきではない。

好ましい入力変数処方物は、全処方物対して有意な効果を有するさらなる成分（例えば、保存剤）を含まない。従って、好ましい処方物は、生物学的に活性な因子および薬学的に受容可能なキャリア（例えば、水、エタノールまたはＤＭＳＯ）を含む。しかし、因子が、賦形剤を含まない液体である場合、この処方物は、単に化合物自体であり得る。

好ましい入力変数としては、ウイルス、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、生分解性ポリマー、放射性標識粒子、放射性標識生体分子、毒素結合粒子、毒素結合生体分子、および安定化剤と結合した粒子または生体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「安定化剤」は、薬物を安定化し、そして制御された放出を提供するために使用される薬剤である。このような薬剤としては、アルブミン、ポリエチレングリコール、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が挙げられる。

複数のアッセイは、種々の濃度に対する差示的な応答を得るために、異なる入力変数濃度と並行して実施され得る。当該分野で公知のように、薬剤の有効濃度の決定は、代表的に、１：１０または他のｌｏｇスケールの希釈から得られる濃度範囲を使用する。この濃度は、必要な場合、第２連の希釈物を用いてさらに改良され得る。代表的に、これらの濃度の１つは、ネガティブコントロール（すなわち、０の濃度または検出レベル未満で）としてはたらく。

目的の入力変数は、多数の化学的クラスを含むが、しばしば、これらは有機分子である。好ましい実施形態は、サンプル（例えば、環境的サンプルまたは薬物）を毒性についてスクリーニングするための本発明の方法の使用である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み得、そして代表的に、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは、これらの化学的官能基の少なくとも２つを含む。この候補薬剤は、しばしば、上記の官能基の１つ以上で置換された、環状炭素、または複素環式構造および／あるいは芳香族構造または多芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）構造を含む。候補薬剤はまた、生体分子（ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログまたはそれらの組み合わせを含む）において見出される。

薬学的に活性な薬物および遺伝的に活性な分子が、含まれる。目的の化合物は、化学療法剤、抗炎症剤、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト、イオンチャネル調節因子、および神経活性化剤を含む。本発明に適切な薬学的因子の例は、以下に記載される因子である：「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９６），第９版、以下：Ｄｒｕｇｓ Ａｃｔｉｎｇ ａｔ Ｓｙｎａｐｔｉｃ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｔｅｓ；Ｄｒｕｇｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｕｔａｃｏｉｄｓ：Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；Ｗａｔｅｒ，Ｓａｌｔｓ ａｎｄ Ｉｏｎｓ；Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｒｅｎａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇｓ；Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｄｒｕｇｓ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｄｒｕｇｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ Ｂｌｏｏｄ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｏｒｇａｎｓ；Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ；Ｖｉｔａｍｉｎｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ；およびＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙの節（これらすべては本明細書中で参考として援用される）。毒素、ならびに生物戦因子および化学戦因子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｗａｒｆａｒｅ ａｇｅｎｔ）もまた含まれる（例えば、Ｓｏｍａｎｉ，Ｓ．Ｍ．（編）「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ａｇｅｎｔｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２を参照のこと）。

試験化合物は、上記の分子のクラスの全てを含み、そして未知の含有物のサンプルをさらに含み得る。多くのサンプルが、溶液中の化合物を含むが、適切な溶媒に溶解され得る固体サンプルもまた、アッセイされ得る。目的のサンプルとしては、環境的サンプル（例えば、地下水、海水、または採掘排液）；生物学的サンプル（例えば、作物から調製される溶解物または組織サンプル）；製造サンプル（例えば、薬剤の調製の間の時間経過）；ならびに分析のために調製される化合物のライブラリなどが挙げられる。目的のサンプルとしては、潜在的な治療的価値についてアッセイされる化合物（例えば、植物細胞または真菌細胞由来の薬物候補）が挙げられる。

用語「サンプル」はまた、さらなる成分（例えば、イオン強度、ｐＨ、または全タンパク質濃度に影響を与える成分）が添加された上記の流体を含む。さらに、このサンプルは、少なくとも部分的なコンパートメントまたは濃縮を達成するために、処理され得る。生物学的サンプルは、化合物の分解を減少するように注意がはらわれる場合、例えば、窒素下で、冷凍下で、またはそれらの組み合わせで貯蔵され得る。使用されるサンプルの容量は、測定可能な検出を可能にするのに充分であり、通常、約０．１μｌ〜１μｌの生物学的サンプルで、十分である。

化合物および候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含む種々の供給源から得られる。例えば、多数の手段が、種々の有機化合物および生体分子のランダム合成および指向された合成（ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む）のために利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリが、利用可能であるか、または容易に生成される。さらに、天然のライブラリおよび化合物または合成的に生成されるライブラリおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生化学的手段によって、容易に修飾され、そしてコンビナトリアルライブラリを生成するために使用され得る。公知の薬理学的因子が、構造的アナログを生成するために、指向されたかまたはランダムな化学修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化）に供される。

（出力変数）
出力変数は、細胞の定量化可能エレメント、特に、ハイスループット系において正確に測定され得るエレメントである。出力は、任意の細胞成分または細胞産物（例えば、生存度、呼吸、代謝、細胞表面決定因子、レセプター、タンパク質、またはそれらのコンフォメーション改変もしくは翻訳後改変、脂質、炭水化物、有機分子もしくは無機分子、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいはこのような細胞成分由来の部分を含む）であり得る。ほとんどの出力は、定量的読み出しを提供するが、いくつかの例において、半定量的結果または定性的結果が、得られる。読み出しは、単一の決定値を含み得るか、または平均値、中央値もしくは分散を含み得る。特徴的に、読み出し値の範囲は、各出力について得られる。可変性が予測され、そして１セットの試験出力についての値の範囲が、標準的な統計方法を使用して確立され得る。

種々の方法が、選択されたマーカーの存在を定量するために利用され得る。存在する分子の量の測定について、従来の方法は、検出可能部分（これは、蛍光性、発光性、放射性または酵素活性であり得る）で、分子を標識することである。蛍光性部分および発光性部分は、任意の生体分子、構造または細胞型を実質的に標識するために容易に利用可能である。免疫蛍光性部分は、特定のタンパク質だけではなく、特定のコンフォメーション、切断産物またはリン酸化のような部位修飾に結合するように指向され得る。個々のペプチドおよびタンパク質は、これらを、細胞内で、緑色蛍光タンパク質キメラとして発現することによって、自己蛍光対に操作され得る（総説については、Ｊｏｎｅｓら（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１２）：４７７−８１を参照のこと）。

出力変数は、イムノアッセイ技術（例えば、免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および関連の非酵素的技術）によって測定され得る。これらの技術は、単一の分子標的への結合に対する高程度の特異性に起因して特に有用であるレポーター分子として、特定の抗体を使用する。細胞ベースのＥＬＩＳＡまたは関連の非酵素的方法もしくは蛍光ベースの方法により、細胞表面パラメーターの測定が可能となる。このようなアッセイからの読み出しは、個々の蛍光抗体検出型細胞表面分子またはサイトカインに関連する平均蛍光または平均蛍光強度、中央蛍光強度、蛍光強度の分散、あるいはそれらの間のある関係である。

（データ分析）
スクリーニングアッセイの結果は、基準化合物、濃度曲線、コントロールなどから得られた結果と比較され得る。この結果の比較は、適切な演繹プロトコル、ＡＩシステム、統計比較などを使用することによって、達成される。

基準出力データのデータベースが、コンパイルされ得る。これらのデータベースは、既知の因子または因子の組み合わせからの結果、ならびに環境的条件下（ここで、単一または複数の環境的条件またはパラメーターが、除去されるかまたは特異的に変更される）で処理された細胞の分析からの基準を含み得る。データマトリクスが、作製され得、ここで、このデータマトリクスの各点は、出力変数からの読み出しに対応し、ここで、各出力についてのデータは、反復測定（例えば、同じ型の複数の個々の細胞）から導かれ得る。

この読み出しは、平均、中央値もしくは分散、または測定値に関連する他の統計的もしくは数学的に導かれた値であり得る。この出力読み出し情報は、対応する基準読み出しと直接比較することによって、さらに改良され得る。同一の条件下で、各出力について得られた絶対値は、生きた生物学的系に固有の可変性を示し、そしてまた、個々の細胞可変性および個体間で固有の可変性を示す。

（細胞培養物および細胞培養デバイス）
本発明の培養デバイスは、別個であるが相互接続された１つ以上のチャンバに分離された（好ましくは、チップ様式に一体化された）チャネルの微小流体ネットワークを備える。特定のチャンバの形状は、細胞相互作用、液体フロー、および液体対流パラメーター（これは対応する細胞、組織または器官系についてインビボで見出されるパラメーターと相関する）を提供するように、設計される。

最適化されたチャンバ形状は、選択された値が得られるまで、流体フローおよび寸法の変化に応答するパラメーター値を試験する手順を繰り返すことによって、開発され得る。基材の最適化は、チャンバの数を選択する工程、細胞 対 容量の適切な比を提供するチャンバ形状を選択する工程、組織サイズ 対 器官サイズの適切な比を提供するチャンバサイズを選択する工程、正確な液体滞留時間を提供する最適な流体の流速を選択する工程、次いで、これらの値に基づいて細胞剪断応力を計算する工程、を包含する。この細胞剪断応力が、最大許容値を越える場合、新たなパラメーター値が選択され、そしてこのプロセスが繰り返される。ＣＣＡデバイスの別の実施形態は、細胞が、チャネルまたはチャンバの底部および側面上ではなく、中空チューブ内で増殖する場合を包含する。このような三次元組織構築物において増殖する細胞は、特定のインビボ組織に関してより確実であることが実証されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ（１９９８）ＰｈＡＲＭＡ Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｃｏｎｆ．，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ，Ｍａｒｃｈ １５−１８）。

３つの主な設計パラメーターが、３−Ｄ培養デバイスの作製において考慮される。第１は、流体が特定の組織と接触しているか、ウェル内に存在する滞留時間である。この滞留時間は、血液が器官組織と接触している時間の量を示すように選択され、１回の循環系の通過における１ウェルあたりで表される。第２は、細胞が増殖するチューブの半径である。例えば、肝臓を複製するためのチューブの半径は、２００〜４００μｍの範囲内である。このチューブの半径が大きすぎる場合、細胞は本質的に平坦な表面を示し、そしてこのチューブ上に単層を形成することに注意しなければならない。

第３のパラメーターは、各モジュールに達するフローの割合である。フローチャネルの形状を調整することにより、このフローはチャンバから分配される。このチャネルまたはチューブから各モジュールまたはチャンバまでは、代表的に、圧力低下を平衡化しそしてフローを平均化するために、異なる長さである。流体が別の組織から出た後、この流体は、ポンプによって再循環され得る。このチューブを通る流速を、チューブの寸法および滞留時間から計算した。ある流速を仮定して、細胞にかかる剪断応力を計算して、この値が細胞の応力限界を超えないことを保証した。肺組織において必要な非常に短い滞留時間は、この器官についてのウェルおよびチューブのアプローチを不可能にする。この剪断応力は、高すぎ、従って、肺組織部分は、肺組織単層で満ちあふれたままである。

本発明のシステムは、相互作用的である（すなわち、コンピューターは、検出するだけではなく、試験における条件を制御する）ため、補正は、動的にこのシステムにおいて行われ、実行されている試験の動力学を研究員に知らせるために適切に記述および文書化され得る。

コンピューターによるデータ収集は、各コンパートメントからの試験化学排水の連続的なインラインモニタリングに必要なデータの収集を含む。センサ、好ましくは、フロースルータイプのセンサは、各コンパートメントからの流出と同調して配置され、従って、各コンパートメントからの試験化学排液に関する定量的データを検出、分析および提供する。

マイクロプロセッサはまた、特定の試験化学物質についての生理学ベースの薬物動態学（ＰＢＰＫ）モデルを計算するのに役立ち得る。これらの計算は、コンパートメント間の流速およびこのシステムからの試験化学物質の排出速度の設定のための基礎として働き得る。しかし、これらはまた、試験化学物質の理論的推定値として働き得る。この実験の終わりに，ＰＢＰＫ決定により行われる試験化学物質および代謝産物の濃度に関する予測は、センサデータと比較され得る。ハードコピー出力は、このＰＢＰＫモデルと実験結果とを比較する。

いくつかの原型ＣＣＡシステムが、構築されそして試験されている。図１７Ａは、「第１世代」３コンパートメントデバイスを示す。この寸法は、以下のとおりであった：ウェアは、２ｃｍ×２ｃｍであり；肺チャンバは、２０個のチャネル（長さ５ｍｍ、４０μｍ×２０μｍ（ｗ×ｄ））を有し；肝臓チャンバは、２つのチャネル（長さ１００ｍｍ、１００μｍ×２０μｍ（ｗ×ｄ））を有した。このデバイスの使用における第１の工程は、全てのチャネルが満たされるまで、シリンジポンプを使用して流体を注入することである。第２に、蠕動ポンプを使用して、この流体を再循環させる。図１７Ｂは、このデバイスの断面図を示し、このシステムのフルイディクスを例示する。４００μｍ厚のエラストマーが、良好な密閉を提供すること、およびプレキシガラスおよびゲル充填チップが、他の材料よりはるかに脆弱性が小さいことが見出された。このデバイスは、大きな圧力低下に伴う問題を有し、そして９０°に曲げられた際に漏出が生じた。

細胞接着研究を、この「第１世代」デバイスを使用して実施した。Ｌ２細胞を、肺チャンバ中に入れ、そしてＨ４ＩＩＥ細胞を、肝臓チャンバ中に入れた。ポリ−Ｄ−リジンを、このチャンバの表面に吸着させて、チャネル内の細胞の接着を促進した。残念ながら、細胞は、トレンチの外側に接着し、従って、異なる基材を試験し、そして表面を改変した。

図１８Ａは、「第２世代」デバイスを示す。この寸法は、以下のとおりであった：チップは、２ｃｍ×２ｃｍであり；エッチングは、深さ２０μｍであり；肺チャンバは、２ｍｍ×２ｍｍ（ｗ×ｌ）であり；肝臓チャンバは、７．５ｍｍ×１００ｍｍ（ｗ×ｌ）であった。この肺チャンバは、細胞接着を増大するために、５μｍの高さの縁部を備え（図１８Ｂ）、そして肝臓チャンバは、浸透をシミュレートするために２０μｍの高さのピラーを備えた（図１８Ｃ）。

図１９は、「第３世代」デバイスを示す。この寸法は、以下のとおりであった：チップは、２ｃｍ×２ｃｍであり；肺チャンバは、２ｍｍ×２ｍｍ（ｗ×ｌ）であり；肝臓チャンバは、３．７ｍｍ×３．８ｍｍ（ｗ×ｌ）であり；そして「他の組織」のチャンバは、７ｍｍ×７ｍｍ（ｗ×ｌ）であった。流体は、肺チャンバから、その２０％が肺チャンバに、そして８０％が他の組織のチャンバに、分配された。チャンバの部分（破線）は、圧力低下を減少するために、深さ１００μｍであり、そして他の部分（実線）は、現実的な液体−細胞の割合を提供するために、深さ２０μｍである。

図２０は、５個のコンパートメントＰＢＰＫモデルＣＣＡについてのフロー図である。このデバイスは、脂肪細胞のためのチャンバ、ゆっくり灌流する流体のためのチャンバおよび迅速に灌流する流体のためのチャンバを加える。このようなデバイスは、生物蓄積研究、細胞傷害性研究および代謝活性のために使用され得る。他のデバイスは、種々の順列で開発され得る。例えば、気体交換を備える膜ポンプ、または、オンラインバイオセンサー、またはミクロ電気機械（ＭＥＭ）ポンプ、またはバイオセンサおよび電子的インターフェースが添加され得る。デバイスは、薬物の傾向送達を模倣するように開発され得る。あるいは、デバイスは、血液−脳関門を模倣するように開発され得る。

（製造）
細胞培養デバイスは、代表的に、適切に一緒に嵌合するかまたは結合する場合、本発明の培養デバイスを形成する、別々の要素（例えば、チャンバ、チャネル、入り口、または出口）の集合を備える。好ましくは、この要素は、一体化された「チップベース」形式で提供される。

デバイスのフルイディクスは、デバイスのサイズについて適切なスケールにされる。チップベースの形式において、流体結合は、「マイクロ流体」であり、このようなシステムは、流体要素（例えば、通路、チャンバまたは導管）を含み、これは、少なくとも１つの内部断面寸法（例えば、０．１μｍと５００μｍとの間の深さまたは幅）を有する。本発明のデバイスにおいて、チャンバ間のチャネルは、代表的に、少なくとも１つの微小規模のチャネルを含む。

代表的に、マイクロ流体デバイスは、頂部部分、底部分、および内側部分を備え、ここで、この内側部分は、実質的に、デバイスのチャネルおよびチャンバを規定する。好ましい局面において、底部分は、固体基材を備え、この固体基材は、構造内において実質的に平坦であり、そして少なくとも１つの実質的に平坦な上面を有する。種々の基材材料は、底部分として使用され得る。代表的に、デバイスが微細加工されるので、基材材料は、一般的に、公知の微細加工技術（例えば、フォトリソグラフィー、薄膜堆積、湿式化学エッチング、反応性イオンエッチング、誘導結合プラズマディープシリコンエッチング、レーザーアブレーション、エアアブレーション技術、射出成型、エンボス加工、および他の技術）との適合性に基づいて選択される。

本発明の基材材料としては、ポリマー材料（例えば、プラスチック、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカルボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦＬＯＮ^ＴＭ）、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスルホンなど）が挙げられる。このような基材は、周知の成型技術（例えば、射出成型、エンボス加工またはスタンピング）を使用して、または鋳型内のポリマー前駆体材料を重合することによって、微細加工されたマスターから容易に製造される。このような重合基材材料は、製造の容易さ、低い費用および使い捨てできること、ならびに最も極端な反応条件に対する一般的な不活性さのために好ましい。これらのポリマー材料は、処理された表面、例えば、誘導体化されたかまたはコーティングされた表面を含み得、そのシステムにおけるそれらの有用性を向上する（例えば、向上した流体方向、細胞付着または細胞分離を提供する）。

マイクロ流体デバイスのチャネルおよび／またはチャンバは、代表的に、基材の上面、または底部分に、上記微細加工技術を使用して、微小規模の溝またはクボミ（ｉｎｄｅｎｔａｔｉｏｎ）として作製される。次いで、マイクロ流体デバイスの上部分の下面（上部分は代表的に第２の平坦な基材を含む）は、底基材の表面上に重ねられそして結合され、デバイスのチャネルおよび／またはチャンバ（内部部分）を、これらの２つの構成要素のインターフェースにおいてシールする。上部分の底部分への結合は、基材材料の性質に依存して、種々の公知の方法を使用して実行され得る。例えば、ガラス基材の場合、高い温度および圧力を使用して、デバイスの上部分を底部分に結合する熱結合技術が使用され得る。ポリマー基材は、使用される温度が、基材材料の過剰な融解を妨げるために一般的により低いことを除いて、類似の技術を使用して結合され得る。代替の方法はまた、デバイスのポリマー部分を一緒に結合するために使用され得、これには、音響溶接技術、または接着剤の使用（例えば、ＵＶ硬化性接着剤など）が挙げられる。

デバイスは、一般的に、ポンプ（例えば、低い流速の蠕動ポンプ）を備える。小さな穴の可撓性チュービングがデバイスの出口に取り付けられ、蠕動ポンプを通り、デバイスの入り口に取り付けられ、従って、閉じたループシステムを形成する。ポンプは、一般的に、１μＬ／分のオーダーの流速で作動する。ポンプシステムは、任意の流体ポンプデバイス（例えば、ダイヤフラム）であり得、上記のように、ＣＣＡデバイス（チップベースのシステム）と一体化され得るか、または別の成分であり得る。

デバイスは、プロセッサに接続されるかまたはプロセッサとインターフェースを取られ得、このプロセッサは、各バイオセンサからの信号を保存および／または分析する。プロセッサは、次いで、データをコンピューターメモリー（ハードディスクまたはＲＡＭのいずれか）に送り、ここから、そのデータが、結果をさらに分析、印刷および／または表示するためのソフトウェアプログラムによって使用され得る。

（例示的実施形態の説明）
特定の実施形態の以下の詳細な説明において、添付の図面に対して参照がなされ、この図面は、特定の実施形態の一部を形成し、そして本発明が実行され得る特定の実施形態を例示として示す。他の実施形態が使用され得、構造的変化が、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。

図１は、本発明に従うインビトロシステムのブロック図である。肺細胞シミュレーティングチャンバ１０２は、気体交換デバイス１０３から酸素付加された細胞培地を受容する。このような酸素付加された培地は、細胞培地が酸素含有気体を吸収し、そして二酸化炭素含有気体を脱着するように、細胞培地を酸素含有気体と接触させることによって得られる。肺細胞シミュレーティングチャンバ１０２を出る細胞培地は、哺乳動物の動脈血１０６に類似する。動脈血１０６を構成する酸素含有培養培地を、次いで、肝臓シミュレーティングチャンバ１０８、他の組織シミュレーティングチャンバ１１０、脂肪シミュレーティングチャンバ１１２、および腎臓シミュレーティングチャンバ１１４に供給する。肝臓シミュレーティングチャンバ１０８、他の組織シミュレーティングチャンバ１１０、脂肪シミュレーティングチャンバ１１２、および腎臓シミュレーティングチャンバ１１４から出る培養培地は、哺乳動物の静脈血１０４と類似する。図１に示されるように、静脈血１０４に対応する培養培地は、肺細胞シミュレーティングチャンバ１０２に戻される。本発明のシステムはまた、腸シミュレーティングチャンバ１１６および腹腔シミュレーティングチャンバ１１８（これらの両方が、試験化合物の導入のための部位を構成する）を備える。哺乳動物におけるように、廃棄液体１１５は、腎臓シミュレーティングチャンバ１１４から取り除かれる。

図２は、本発明のシステム２００の１つの実施形態の単純化された概略図である。システム２００は、肺細胞培養チャンバ２１０、肝臓細胞培養チャンバ２１２、脂肪細胞培養チャンバ２１３、他の組織チャンバ２１４、および気体交換チャンバ２５０を備える。チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４および２５０は、一般的にチップ２３０と呼ばれるシリコンの基材上に形成される。４つより多くの細胞培養チャンバが単一のチップ２３０上に収容または形成され得ることが注目されるべきである。流路２４０は、チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４および２５０を接続する。

チャンバは、入り口２１１および出口２１５を有する。入り口２１１は、気体交換チャンバ２５０の一端に配置される。出口２１５は、肝臓細胞チャンバ２１２の一端に配置される。チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４および２５０ならびに流路２４０が、入り口２１１と出口２１５との間に実質的に配置される。システムは、システム２００内で流体を循環させるためのポンプ２６０を備える。マイクロチューブ２７０は、出口２１５とポンプ２６０の入り口側との間を接続する。マイクロチューブ２７１は、ポンプ２６０の出口側を入り口２１１と接続する。細胞培養チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４、気体交換チャンバ２５０、流路２４０、およびポンプ２６０は、システム２００を形成する。システムは、さらなる細胞培養チャンバを備え得る。追加される１つの共通細胞培養チャンバは、腎臓をシミュレーティングするものである。

図３は、本発明の別の実施形態の概略である。図３において、第１信号経路３１０、第２信号経路３２０、および第３信号経路３３０は、チップ２３０上に提供される。各細胞培養システム２００の種々の局面をモニターするための信号は、チップ２３０からチップ２３０の特定の位置において取られ得、そしてチップ２３０を離れる出力に移動し得る。１つの例として、チップ２３０上の信号経路３１０、３２０、３３０は、一体化された埋込式の導波管である。チップ２３０は、このような実施形態において、シリコン、ガラスまたはポリマーから作製され得る。導波管３１０、３２０、３３０は、光をチップの先端に保持し、ここで、変換器３１２、３２２、３３２は、光信号を電気信号に変換するために配置される。次いで、システム２００内の細胞は、蛍光、発光、もしくは吸収またはこれらの特性の全てについてモニターされて、システム２００内の細胞を問い合わせそしてモニターし得る。蛍光をチェックするには、光源を必要とする。光源は、分子を問い合わせるために使用され、そしてシグナルキャリア（例えば、導波管３１０、３２０、３３０）または光ファイバーは、信号をとらえ、その信号をチップ２３０から送り出す。信号キャリア３１０、３２０、３３０は、光を、チップの信号運搬部分３１０、３２０、３３０の端部近くの光検出器に向ける。

図４は、本発明のシステム２００の別の実施形態の概略図である。この実施形態において、バイオセンサ４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、および４６０は、チップ２３０の細胞培養チャンバの上流および下流のチップ上に位置付けられる。バイオセンサ４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０は、酸素、二酸化炭素、および／または培地のｐＨをモニターする。これらのセンサは、システム２００のモニタリングおよび健康な環境を維持するために必要とされるように、気体レベルの調節を可能にする。さらに、各細胞コンパートメントのすぐ上流および下流に位置付けられる場合、バイオセンサは、細胞代謝および生存性に対する有用な情報を提供する。

図５Ａ〜５Ｇは、ポリマーベースの使い捨て可能チップ２３０を作製するために使用される工程を示す。シリコンウェハ２０は、薄層のフォトレジスト２１でスピンコーティングされる（図５Ａ）。フォトレジスト２１は、所望の特徴を含むフォトマスク２３を通るＵＶ光２２に曝される（図５Ｂ）。ＵＶに曝されたフォトレジスト２１は、適切な溶液中で現像され、シリコン２０を曝す（図５Ｃ）。シリコン２０は、誘導結合プラズマエッチングシステムを使用して所望の深さまでエッチングされる（図５Ｄ）。残るフォトレジストは、適切な溶媒を用いて除去される（図５Ｅ）。非常に薄い金（またはＴｉ）プレートベース２４を、シリコン基材２０上に堆積させ、図５Ｅに示されるように、電気メッキプロセスのためのテンプレートを作製する。サンプルをニッケルスルファメート型メッキ浴中に浸し、そしてニッケル２５を、シリコンテンプレート２０の上に、ニッケルの厚みが十分であり、金が伝導層として作用するまで、電気メッキする。ニッケルマスターは、金層を離れて増加し、そして金は、ニッケルマスターの一部になる。これは、図５Ｆに示される、Ｎｉ特徴２５を形成する。メッキ速度（メッキ電流、テンプレート直径およびテンプレートの厚みの関数である）を、約４５ｎｍ／分で較正する。製造後、特徴２５は、特徴的寸法を確認するために、顕微鏡を使用して調べられる。得られるニッケル特徴２５は、均一でなければならず、そして所望の形状を有さなければならない。ニッケルマスター２５およびポリマー基材２６を、ポリマーのガラス転移温度のちょうど上まで加熱する。ニッケルマスター２５およびポリマー２６は、接触され、そしてニッケルマスター２５の特徴は、ポリマー基材２６にエンボス加工される。ニッケルマスター２５は除去され、従って、元のシリコンウェハ２０の同一の特徴を含むポリマー２６を生成する（図５Ｇ）。

図６は、本発明のシステム２００の第３の実施形態の概略図である。この実施形態において、バイオセンサ６００、６０２、６０４は、チップ２３０の周囲に位置付けられる。バイオセンサ６００、６０２、６０４は、チップ２３０上に作製されるシステム２００の細胞の状態をさらにモニターするために使用される。有利には、チップ２３０の周囲にバイオセンサ６００、６０２、６０４を位置付けることによって、チップ２３０は、最小量の費用で使い捨て可能にされ得る。言い換えると、バイオセンサ６００、６０２、６０４は、チップ２３０とともに廃棄される必要がない。バイオセンサ６００、６０２、６０４はまた、使い捨て可能チップ２３０を基板上に提供され得ることが注意されるべきである。この特定の選択は、費用効果的ではない。なぜなら、チップ２３０に配置するバイオセンサ６００、６０２、６０４もまた、バイオセンサ６００、６０２、６０４を廃棄するからである。バイオセンサ６００、６０２、６０４がチップ２３０と離れて位置付けられる場合、バイオセンサ６００、６０２、６０４がそれぞれの使用後に処分されるよりも、再使用されるので、より費用効果的である。バイオセンサ６００、６０２、６０４のそれぞれが、コンピューター６２０の入力に接続される。

図７は、コンピューター６２０をさらに詳細に示す概略である。コンピューター６２０は、各チップ２３０のシステム２００の操作をモニターしそして制御する。コンピューター６２０は、入力／出力インターフェース７００および内部レジスター／キャッシュメモリ７０２を備える。示されるように、マイクロプロセッサ７９８は、接続７１６を介してキーボード７０４に、コネクタ７１８を介して不揮発性記憶メモリ７０６、汎用メモリ７０８、およびルックアップテーブル７１０に、そしてコネクタ７２０を介してプリンタ／プロッターレコーダー７１２およびディスプレイ７１４にインターフェースをとる。

不揮発性記憶メモリ７０６は、ＣＤ書き込み型メモリ、磁気テープメモリー、ディスクドライブなどの形態であり得る。ルックアップテーブル７１０は、このシステムにおいてモデル化される種々の物質に適用可能な一組のマスバランス（ｍａｓｓ ｂａｌａｎｃｅ）式の保存のために蓄えられる汎用メモリ７０８の一部を物理的に備え得る。これらの式は、システムの種々の生物学的／化学的物質についての生理学に基づく薬物動態学的モデルを表す。内部レジスター／キャッシュメモリ７０２および汎用メモリ７０８は、各チップ２３０のシステム２００において実質的にすべての機能を自動的に制御するための複数のプログラム説明書および特別なデータの形態でシステムプログラムを備える。コンピューターはまた、システム２００に関連するポンプ２６０を制御および調節し得る。

流体フローもまた、フローメーターからの入力／出力インターフェース７００を介してマイクロプロセッサ７９８への入力として提供され得る。これは、プログラムコマンドの調節によりシステム内の流体の流速に対する正確な制御をい可能にし、このコマンドは、それぞれ、ポンプ制御ラインを介してポンプ２６０に伝達される。例えば、流速は、導管５８において９．５μＬ／分、フローメーター６６を通る２．５μＬ／分、フローメーター７８を通る７μＬ／分、および導管７０の２．５μＬ／分に設定され得る。レザバ５０内の培養培地の温度はまた、マイクロプロセッサ７９８によって、調節され、このプロセッサは、入力／出力インターフェース７００および温度指示ライン７２８を介して、温度プローブ７９２からの温度測定を受容する。これらの信号に応答して、ヒーターコイル７９０は、入力／出力インターフェース７００およびヒーターコイル性制御ライン７３０を介してマイクロプロセッサ７９８によってオンおよびオフにされる。

細胞培養チャンバ２１０および２１２における生物学的および毒物学的反応／変化は、それぞれ、センサ６００、６０２、および６０４によって検出され、そして制御ラインならびに入力／出力インターフェース７００を介してマイクロプロセッサ７９８と連絡する。センサは、試験結果を表す特定の値または範囲波長の点で、試験結果を表すために設計され得る。

マイクロプロセッサ７９８はまた、キーボード７０４を介して、研究者にインタラクティブな制御を提供するために、プログラムを備えるように非常に容易に適合され得る。これは、例えば、任意の所定の時間において、培養コンパートメントのいずれかの条件に対して特別にチェックするようにコンピューターを指示する。

本発明によって提供されるさらなる選択は、ＣＤ／テープメモリー７０６から情報を呼び戻すことによって類似の結果についての以前に保存された試験結果を呼び戻す能力である。このように、メモリ７０６は、公開された情報、本発明のシステムを用いて実行された以前の実行試験から集めたデータ、または理論的な計算から誘導されるデータからの履歴的データを保持するためにプログラムされ得る。ＣＤ／テープメモリーの準備によってまた、システムが、情報検索ツールとして使用され得る。例えば、キーボード７０４を介してマイクロプロセッサ７９８に入力される選択情報に基づいて、特定の試験化合物または特定の培養ラインに関する検索データを得ることができる。メモリ７０６内に大きなライブラリの情報を含むかまたは開発することによって、研究者は、試験実行をより知的に構成および計画し得る。

図８は、１つより多くのチップ２３０が単一のハウジング８００内に収容され得ることを示す概略である。ハウジング８００は、ハウジング内のチップ２３０それぞれについて同じ条件に維持する環境チャンバであり得る。ハウジング８００は、複数のチップ配置８１０、８１２、８１４、８１６を備える。各チップ２３０またはチップ配置８１０、８１２、８１４、８１６からの出力は、コンピューター６２０に対する入力である。次いで、コンピューター６２０は、リアルタイム内の複数のチップ２３０からシステム２００をモニターし得る。

図９は、試験が、異なるハウジング８００、９００内の１セットのチップ２３０を含み得ることを示す概略である。チップ２３０の出力は、環境における変化（例えば、温度がわずかに上昇した、など）をモニターし得る。１つのハウジング内のチップのそれぞれが小さな細胞培養物をその上に有するか、またはハウジング８００内のチップ２３０が、互いに相互接続されるチップを有し得、ハウジング内に哺乳動物の異なる部分または相互依存する期間を形成する。

図２〜４および６〜９に関して議論されるチップ２３０は、２次元の細胞培養チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４を使用する。３次元組織培養構築物がそれらの代謝においてより信頼があり得るので、なおべつのチップ１０００が、３次元構築物を包含することを取り組む。以下は、マイクロスケール細胞培養アナログデバイス（「ＣＣＡ」）の作製を記載し、これは、３次元組織をモジュラー形式で組み込む。ＣＣＡデバイスまたはチップ１０００は、肺細胞チャンバに対するフローオーバーアプローチ、および他の器官に対するフロースルーアプローチを組み込む。ＣＣＡ設計に対するフロースルーアプローチは、さらに以下に議論される。

図１０は、チップ１０００の概略およびフローレジメを示す。チップ１０００は、４つのウェルまたは組織モジュールを備える。チップ１０００は、肺ウェル１０１０、肝臓ウェル１０２０、脂肪ウェル１０３０、ならびにゆっくり灌流するウェル１０４０および迅速に還流するウェル１０５０を備える。チューブは、チップ１０００を通る流体を循環するために使用される。ポンプ１０６０は、チューブを通して流体を移動させる。肺ウェル１０１０は、最初にフローの全てを受容する。肺１０１０の後に、流体は、４つの組織モジュールに分配される。肝臓モジュールは、２５％のフローを得、脂肪モジュールは、９％、ゆっくり灌流するモジュールは、１５％、そして迅速に灌流するセクションは、５１％を得る。フローチャネルの形状を調整することは、肺ウェル１０１０からフローを分配する。各モジュールに対するチャネルは、圧力低下の平衡をとり、そしてフローのバランスを取るために異なる長さである。流体が他の組織を出た後、ポンプ１０６０を介して肺コンパートメント内に再循環して戻る。ウェルまたは組織モジュール１０２０、１０３０、１０４０、１０５０のそれぞれが組織を保持する。組織は、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、１０５０内の微小規模チューブ１０２２、１０３２、１０４２、１０５２に保持される。図１０に示されるように、１つのウェル１０２０、１０３０、１０４０、１０５０当たり１つのみの微小規模チューブ１０２２、１０３２、１０４２、１０５２が存在する。複数のマイクロチューブがウェル内に配置されることに注意するべきである。

操作において、３次元組織が、ＣＣＡデバイスまたはチップ１０００に組み込まれ得る２つの方法が存在する。両方の方法が、ポリスチレンまたはガラスの微小規模チューブを介して播種された培地のフローを含む。試験下の細胞は、チューブの内側に接着し、そして３次元組織に凝集する。チューブを収集し、束ね、そしてチップ１０００上のウェルに配置する。各ウェルは、水性薬剤が流れて、組織に接触する器官モジュールになる。

３次元組織の組み込みを可能にする第１の方法は、フロースルーリアクターストラテジーを含む。開口部がシリコンウェハに形成され、次いでチャネル培地が、開口を通る。開口部の内側表面のシリコンが、細胞のための足場を提供し、これらは、３次元組織に凝集する。この技術をポリマーＣＣＡ１０００に適用するために、ポリマーチューブは、接着タンパク質を用いて処理され得るか、または細胞が、血清付加培地で培養され得るかのいずれかである。血清および接着タンパク質の両方によって、細胞が、チューブの内側表面に固着し得る。

第２の方法は、細胞をＨＡＲＶミクロ重力リアクター中で培養する工程を包含する。回転するリアクターの中心にチューブの足場を設けることによって、または細胞培地内に浮動性のチューブを導入することによって、細胞は、チューブのいくつかに３次元凝集物を形成する。ミクロ重力内で増殖される細胞の高い活性に起因して、これらの組織構築物は、２次元組織または上記方法で形成される組織と比較して、優れた機能を有する。内側に組織を有するチューブは、重量または密度に従って分離され得、そしてデバイス上に配置され得る。

図１１は、チップ１０００を組み込む細胞培養アナログデバイス１１００の部分的に分解した等角図である。チップ１０００は、肺細胞培養領域１０１０およびこの肺細胞培養領域１０１０に接続された複数のウェルを備える。このウェルは、肝臓組織ウェル１０２０、脂肪組織ウェル１０３０、低速灌流ウェル（ｓｌｏｗｌｙ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｗｅｌｌ）１０４０、および高速灌流ウェル（ｒａｐｉｄｌｙ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｗｅｌｌ）１０５０を備える。種々の組織を含む微小規模のチューブは、ウェル１０２０、１０３０、１０４０および１０５０内に適合される。各ウェルは、チップ１０００に取り付けられたエラストマー底部１１１０への排出管（ｏｕｔｐｕｔ）を備える。エラストマー１１１０は、ポンプの一部である。アクチュエータ１１２０は、エラストマーに加圧して、ポンプ作用を生じ、システム１１００の流体を移動させるかまたはシステム１１００に流体をウェルから肺組織モジュール１０１０に戻すように、戻りライン１１３０を介して循環させる。ガラス層は、チップの頂部の上に置かれて、肺組織モジュール１０１０、および種々のウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０を覆う。チャネル１０２１、１０３１、１０４１、および１０５１は、種々のウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０を通って特定の流速を生じるような寸法にされることに注意すべきである。種々のチャネル１０２１、１０３１、１０４１、１０５１の長さおよび幅を合わせるよりむしろ、他のフローレストリクター（ｆｌｏｗ ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｒ）が、種々のウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０への流速内の変動性をもたらすために、チャネルに沿って配置され得ることが企図される。ガラストップ１１４０は、屈曲する膜と取り替えられ得、プランジャーボール型バルブが付加され得、その結果、チャネル１０２１、１０３１、１０４１、および１０５１中の流れは、チャネルの直径以外により調節され得る。

チップ１１００は、ケイ素から作製され得るが、ポリスチレンまたはいくつかの他の適切なプラスチックからチップ１０００を作製するのが最も費用効率的である。各チップは、従来の手段によりケイ素中に最初に形成される。次いで、ニッケルマスター（ｎｉｃｋｅｌ ｍａｓｔｅｒ）は、ケイ素から形成される。言い換えると、チップ１０００は、ポリスチレンおよびシリコーンエラストマーをケイ素およびニッケルマスター上にレプリカ成形することにより製造される。当然のことながら、ポリマーチップの製造における第１の工程は、シリコンウェハ上にチップを作製することである。始めに、フォトレジスト１２１０の層をシリコンウェハ１２００の上に配置する。このフォトレジスト１２１０の上にマスクを配置する。このマスクは、肺組織培養領域１０１０のパターンを構成する。マスクにより、ＵＶ光を肺領域１０１０に対応する部分だけ露出するようにフォトレジストに通過させる。次いで、フォトレジストを、開口部１２１１を生成するように現像する。この開口部は、肺組織培養領域１０１０に対応する。次いで、フォトレジストを有するシリコンウェハは、エッチングされて、シリコンウェハ１２００内に肺の開口部１０１０が生成される。次いで、そのフォトレジスト１２１０は、シリコンウェハ１２００から除去され、肺のウェル１０１０を有するシリコンウェハが残る。次いで、フォトレジスト１２２０の別の層は、ウェハ１２００上に配置される。マスクは、ウェハ上に配置される。そのマスクにより、種々のウェルまたは流体チャネル（１０２１、１０３１、１０４１、および１０５１を含む）の露出が可能になり、これらのウェルまたは流体チャネルを使用して、肺のウェル１０１０を種々のウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０と接続する。そのマスクは、流体チャネルの領域におけるフォトレジストを露出する。次いで、フォトレジストが現像されて、流体流チャネルに対応する露出されたフォトレジストが除去される。次いで、この露出された領域が所望の深さにエッチングされる。その後、残りのフォトレジスト１２２０が除去され、肺のウェル１０１０および他のウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０を有するシリコンウェハ１２００が残る。次の工程は、第３の層のフォトレジスト１２３０をさらに適用することである。マスクは、フォトレジストの上に配置され、そのマスクは、種々のウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０に対応する開口部を有する。そのフォトレジストは、マスキングされ、ＵＶ光に露出されて、種々のウェルに対応する開口部が作製される。そのフォトレジストは現像され、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０についてのその露出されたシリコン領域が残る。次いで、チップおよびフォトレジスト１２３０がエッチングされて、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０が作製される。組織モジュール１０２０、１０３０、１０４０、１０５０に対応する開口部が、プラズマにより約７５０μｍの深さにエッチングされる。次いで、その開口部は、テーパー状端部を形成するようにＫＯＨにより、さらに２５０μｍ湿式エッチング（ｗｅｔ ｅｔｃｈ）される。ＫＯＨは、５４．７°の角度でシリコンの結晶学的平面に沿って、シリコンをエッチングする。次いで、フォトレジストが除去され、シリコンウェハが形成され、このシリコンウェハから、ニッケルマスターが作製され得る。

ニッケルは、シリコンチップ上に電気メッキされて、ニッケルマスター１２５０が作製される。次いで、このニッケルマスターを使用して、ポリマー基材１０００を鋳造またはエンボス加工し得る。レプリカ成形については、そのポリマーが溶融されるか、または適切な溶媒中に可溶化され、ニッケルマスター１２５０上に注がれ、始めのシリコンチップと同じ形状に固化される。エンボス加工については、図５を参照のこと。ポリマーチップ１０００は、次いで、シリコーンエラストマー上に１１１０を介して取り付けられる。ポリマーおよびシリコーンは、層が単一のユニットを形成するように、自己シールしている。空気アクチュエータ（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ ａｃｔｕａｔｏｒ）１１２０は、チップの下に置かれて、種々の組織モジュール１０２０、１０３０、１０４０、１０５０から回収された流体をポンピングする。刻々と、トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）が０．０３２μｌの流体で満たされる。次いで、アクチュエータは、シリコーン上に押し上げられ、コンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）１０１０に戻る微小チューブを介して流体を逃がす。エラストマートラフ１１１０およびアクチュエータ１１２０は、ポンプ２６０を形成する（図１２に示される）。次いで、そのエラストマーコーティングされたポリメチルメタクリレート（ＰＬＥＸＩＧＬＡＳ^ＴＭ）１１４０は、ウェハまたはチップ１０００の頂部にシールされる。

シリコーンが、液体で満たされるにつれて生成された圧力の力のバランスをとるために、肺細胞コンパートメント１０１０上のそのポリメチルメタクリレート（ＰＬＥＸＩＧＬＡＳ^ＴＭ）は除去され、シリコーン膜で置き換えられる。この膜は、シリコーンポンプの作用に応じて上下し、デバイス内の圧力のバランスを保つ。種々の微小規模のチューブは、エラストマーコーティングされたポリメチルメタクリレート（ＰＬＥＸＩＧＬＡＳ^ＴＭ）をチップ１０００の上に配置する前に、ウェルに配置される。微小チューブを取り扱うための機械は、特定の数の組織を負荷したチューブを降ろし、回収する接着アームを備える。その機械は、チューブをデバイスへと移送し、そのチューブを、それぞれのモジュールウェル１０２０、１０３０、１０４０、１０５０に緊密にパックする。緊密なパックは、摩擦力により、細胞培養アナログデバイスへの何らかの振動に関わらず、適切な位置にチューブを維持することを可能にする。このことにより、それぞれのウェル１０２０、１０３０、１０４０、１０５０におけるチューブの周りの流体流の漏れが最小になる。緊密にフィットさせても、約５〜１０％の流体流が チューブを取り囲み、シリコーン基材またはエラストマートラフ１１１０に直接流れる。

図１３は、エラストマートラフを示す。そのエラストマートラフは、本質的に矩形の開口部をそのトラフ中に有する、シリコーンエラストマーの部品である。この矩形の開口部は、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０からくる流体の流体リザーバとして働く。そのエラストマートラフ１１１０は、一方の側方に開口部を有し、参照番号１３００により指定されている。戻りライン１１３０は、エラストマートラフ１１１０における開口部１３００に取り付けられた一方の端部を、およびチップ１０００の肺のウェル１０１０に取り付けられた他方の端部を有する。

なお別の実施形態において、そのエラストマートラフ１１１０は、シリコーンエラストマーポンプ１４００と置き換えられ、これは、図１４に示される。そのシリコーンエラストマーポンプ１４００は、チップ１０００上に、および参照番号１１００により示されるシステム全体を通して循環システム流をより正確に再現するように設計される。そのポンプ１４００は、第１肺状チャンバ１４１０および第２システムチャンバ１４１２を備え、これらのチャンバは、別個のアクチュエータ１４２０および１４２２により作動される。複数のチャンバ１４１０および１４１２を用いると、より生理学的に現実的なポンピングパターンが、チップ１０００の底部に複数トラフエラストマー基材とともに作られる。特定の時間感覚で基材の部分を押し上げるアクチュエータを有することによりシリコーンエラストマートラフ１４００中に複数チャンバ１４１０および１４１２を作製することにより、心臓のポンピング活動がまねられる。

図２８Ａは、本発明の１つの実施形態に従って、微小規模培養デバイスを制御するためのシステムを例示するブロック図である。この実施形態において、システム２８００は、制御機器２８０２に接続された第１微小規模培養デバイス２８０６を備える。その第１微小規模培養デバイス２８０６は、培養培地との多くのインビボ相互作用を模倣する幾何学を有する多数の微小規模チャンバ（２８０８、２８１０、２８１２、および２８１４）を備える。ここで各チャンバは、培養培地の流れのための入り口および出口、ならびにそのチャンバと互いに連絡する微小流体チャネルを備える。制御機器２８０２は、第１微小規模培養デバイス２８０６からのデータを獲得し、その薬物動態パラメーターを制御するためのコンピューター２８０４を備える。

別の実施形態において、第１微小規模培養デバイス２８０６は、コンピューター化（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ）チップ上に形成される。その第１微小規模培養デバイス２８０６は、チャンバ中の生理学的事象を測定するために、制御機器２８０２に連結された１以上のセンサさらに備える。そのセンサは、酸素、二酸化炭素、または培養培地のｐＨをモニタリングする１以上のバイオセンサを備える。その制御機器２８０２は、第１微小規模培養デバイス２８０６を保持し、第１微小規模培養デバイス２８０６の頂部をシールして、微小流体チャネルを確立する。制御機器２８０２は、微小流体がデバイスの内外へと流れるように、微小流体の相互連絡を提供する。別の手段において、コンピューター２８０４は、第１微小規模培養デバイス２８０６のポンプ速度、温度、実験装置の長さ、およびデータ獲得の頻度からなる群より選択される薬物動態パラメーターを制御する。１つの手段において、コンピューター２８０４は、オペレータがまた、手動でポンプ速度、デバイス温度、実験装置の長さ、およびデータ獲得の頻度（例えば、１５分ごと）を特定するように、設定スクリーンを提供する。別の手段において、コンピューター２８０４は、第１微小規模培養デバイス２８０６における流速、チャンバ幾何学、および細胞数からなる群より選択される薬物動態パラメーターを制御する。この手段において、システム２８００は、完全な動物による研究および従来の組織培養研究と比較して、より迅速かつより感度の高い応答を提供する。パラメーターを制御することにより、システム２８００は、もはや生理学に基づかない。別の手段において、コンピューター２８０４は、第１微小規模培養デバイス２８０６における１以上のポンプをさらに制御して、生体で遭遇するものに匹敵するチャンバ（２８０８、２８１０、２８１２、および２８１４）中の培養培地滞留時間を生成する。別の手段において、コンピューター２８０４は、生体の模倣した部分と関連する薬物動態パラメーターと一致した様式で、微小流体チャネルに沿って分布した１以上のバルブをさらに制御する。

別の実施形態において、システム２８００は、培養培地との多くのインビボ相互作用を模倣する幾何学を有する多数の微小規模チャンバを有する第２微小規模培養デバイスをさらに備える。ここで、各チャンバは、培養培地の流れのための入り口および出口、ならびにそれらのチャンバと相互連絡する微小流体チャネルを備える。その制御機器２８０２は、第２微小規模培養デバイスに連結される。

図２８Ｂは、微小規模培養デバイスを制御するためのシステムの別の実施形態を例示するブロック図である。この実施形態において、システム２８１６は、制御機器２８１８に連結された第１微小規模培養デバイス２８０６を備える。その制御機器２８１８は、コンピューター２８０４、第１微小規模培養デバイス２８０６の微小流体チャネル中の微小流体の循環を制御するためポンプ２８２０、第１微小規模培養デバイス２８０６の温度を制御するための加熱要素２８２２、光源２８２４、および第１微小規模培養デバイス２８０６内の細胞コンパートメントからの蛍光放出を検出するための光検出器２８２６を備える。１つの手段において、コンピューター２８０４は、比色測定、蛍光測定、発光、および放射能測定からなる群より選択される型の測定機器を用いて、蛍光強度についてのデータを記録する。別の手段において、加熱要素２８２２は、第１微小規模培養デバイス２８０６を温度３７℃に維持する。

図２９は、本発明の１つの実施形態に従って、微小規模培養デバイスを動的に制御するためのコンピューター化方法を例示するフローチャートである。この実施形態において、そのコンピューターにより自動化された方法２９００は、ブロック２９０２、２９０４、２９０６、および２９０８を包含する。ブロック２９０２は、微小規模培養デバイスの多くのチャンバにおける生理学的事象を測定するために、多くのセンサからのデータを分析する工程を包含する。ブロック２９０４は、微小規模培養デバイスのチャンバ中の培養培地の流体流速を調節する工程を包含する。ブロック２９０６は、微小規模培養デバイスのチャンバ中の生物学的反応または毒物学的反応を検出する工程を包含する。このような検出の際、ブロック２９０８は、微小規模培養デバイスの１以上の薬物動態パラメーターを変更する工程を包含する。

１つの実施形態において、ブロック２９０６（すなわち、検出する工程）は、微小規模培養デバイスの細胞コンパートメントの寸法の変化を検出する工程を包含する。１つの手段において、ブロック２９０８（すなわち、変更する工程）は、細胞間の相互作用、液体滞留時間、液体 対 細胞比、細胞による代謝、および微小規模培養デバイスにおける剪断応力からなる群より選択される薬物動態パラメーターを変更する工程を包含する。別の手段において、ブロック２９０８は、微小規模培養デバイスにおける流速、チャンバ幾何学、および細胞数からなる群より選択される薬物動態パラメーターを変更する工程を包含する。

別の実施形態において、そのコンピューターにより自動化された方法２９００は、微小規模培養デバイス内のチャンバ幾何学を最適化する工程をさらに包含する。ここで、最適化する工程は、チャンバの量を選択する工程、適切な組織または器官のサイズ比を提供するチャンバ幾何学を選択する工程、適切な液体滞留時間を提供する最適な流体流速を選択する工程、および細胞剪断応力を算出する工程を包含する。

別の実施形態において、コンピューターにより自動化された方法２９００は、培養培地の温度を調節する工程をさらに包含する。なお別の実施形態において、コンピューターにより自動化された方法２９００は、微小規模培養デバイスの細胞コンパートメントからの蛍光の発光を検出する工程をさらに包含する。

別の実施形態において、コンピューター読み取り可能な媒体は、上記のコンピューターにより自動化された方法の種々の実施形態を行うためにその媒体に格納された、コンピューターにより実施可能な命令を含む。１つの手段において、そのコンピューター読み取り可能な媒体は、メモリデバイスまたは記憶デバイスを含み得る。別の手段において、そのコンピューター読み取り可能な媒体は、搬送波において具現化されるコンピューターデータシグナルを含む。

図３０は、本発明の１つの実施形態に従って、微小規模培養デバイスを制御するためのコンピューターを例示するブロック図である。この実施形態において、そのコンピューター３０００は、マイクロプロセッサ３００２、汎用メモリ３００４、不揮発性記憶要素３００６、１以上のセンサを有する微小規模培養デバイスに対するインターフェースを含む入力／出力インターフェース３００８、およびコンピューターソフトウェアを備える。そのコンピューターソフトウェアは、微小規模培養デバイスにおける多くのチャンバ中の培養培地の流体流速を調節するために、微小規模培養デバイスのチャンバ中の生物学的反応または毒物学的反応を検出するため、および検出の際に、微小規模培養デバイスの１以上の薬物動態パラメーターを変更するために、マイクロプロセッサ３００２上で実施可能である。

１つの実施形態において、不揮発性記憶要素３００６は、公開された情報から採られた履歴データ、以前に実施した試験から集められたデータ、または理論的計算から得られたデータを含む。そのコンピューターソフトウェアは、ポンプ制御ラインを通じて、微小規模培養デバイスの１以上のポンプに命令を送ることにより流体の流速を調節する。１つの手段において、そのコンピューターソフトウェアは、培養培地の温度を調節するために、マイクロプロセッサ３００２上でさらに実施可能である。そのコンピューターソフトウェアは、 ヒーターコイル制御ラインを通じて、微小規模培養デバイスのヒーターコイルに命令を送ることにより温度を調節する。

別の実施形態において、コンピューター３０００は、システム中の種々の生物学的物質または化学的物質についての、生理学に基づいた薬物動態モデルを表す、１セットの質量バランス式を記憶するために、汎用メモリ３００４に連結されたルックアップテーブルメモリをさらに備え、およびそのコンピューターソフトウェアを記憶するためのマイクロプロセッサ３００２に連結されたキャッシュメモリをさらに備え得る。

別の実施形態において、入力／出力インターフェース３００８はさらに、キーボードインターフェース、ディスプレイインターフェース、およびプリンタ／プロッターレコーダーインターフェースを備える。１つの手段において、そのコンピューター３０００は、これらの入力／出力インターフェースを使用して、キーボード、ディスプレイ、およびプリンタ／プロッターレコーダー周辺デバイスに接続する。

（実験）
以下の実施例は、本発明の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されるのであって、本発明としてみなされるものの範囲を限定することを意図するのではない。

使用される数字（例えば、量、温度、濃度）に関して正確性を期す努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が生じる。別段示されない限り、部は、重量部であり；分子量は、重量平均分子量であり；温度は摂氏であり；圧力は大気圧であるかまたは大気圧付近である。

（方法）
以下の方法を、実験プロセスにおいて使用した：
細胞培養。細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、組織培養インキュベーター（９５％ Ｏ_２／５％ ＣＯ_２）中で推奨される完全増殖培地中で増殖させた。ＨｅｐＧ２細胞およびＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞については、推奨される培地は、イーグル最小必須培地（アール平衡塩類溶液、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１．５ｇ／Ｌ 重炭酸ナトリウム、および１０％ ウシ胎仔血清を含有する）（ＥＭＥＭ）である。マッコイ５ａ培地（１．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ 重炭酸ナトリウムおよび１０％ウシ胎仔血清を含有する）は、ＨＣＴ１１６について推奨される。

増殖曲線。増殖曲線を、３５ｍｍディッシュに、最初は低密度でその細胞をプレートすることにより決定した。各日に、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、血球計算板を使用して細胞数を目視で数えることにより細胞数を決定した。三連で決定した。

逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）。細胞を、適切な場合、コラーゲン処理、ＭＡＴＲＩＧＥＬ^ＴＭ処理、またはポリリジン処理したスライドガラス上で培養した。約９０％コンフルエントの単層になるまで増殖させたＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａを、トリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、約５００ｇ、５分間でペレットにした。ＲＮＡを単離し、ＲＮＥＡＳＹ^ＴＭキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。成体ヒト肝臓総ＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎから購入した。単離したＲＮＡの量および純度（２６０／２８０ｎｍ比）を、ＢＩＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ^ＴＭ分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で測定した。次いで、単離したＲＮＡを、２ＵのＤＮａｓｅ Ｉとともに３７℃にて２５分間インキュベートし、続いて、ＤＮａｓｅ不活性化試薬（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して不活性化した。

ＲＴ反応を、５μｇ ＲＮＡ、１０μＭ オリゴｄＴプライマーの混合物を使用して行い、７２℃で２分間加熱し、続いて氷上に２分間おいた。次に、逆転写酵素緩衝液中に５ｍＭ ＤＴＴ、６００μＭ ｄＮＴＰミックス、４０Ｕ ｒＲＮａｓｉｎ、２００Ｕ ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩ^ＴＭを合わせ、４２℃で１時間インキュベートした。

２．０μｌの第１鎖ｃＤＮＡを、シトクロムＰ４５０アイソフォーム特異的プライマー（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ａｎｔｏｎａ，Ｃ．，Ｊｏｖｅｒ，Ｒ．，Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎ，Ｍ．−Ｊ．，およびＣａｓｔｅｌｌ，Ｊ．Ｖ．（２０００）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｒｕｇ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３７６：１０９−１１６）を使用して、５０μｌのＰＣＲ反応系において使用した。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９４℃で４分、続いて、９４℃で４０秒、６０℃で４５秒、７２℃で５０秒を２８サイクル、および最後に７２℃にて４分間伸長。

ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル上での電気泳動により分離し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄでの染色により可視化し、信頼性を得るために、適切な分子量標準と比較した。増幅したｃＤＮＡを定量するために、１５μｌの各ＰＣＲ反応物を、０．１×Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、１：４００の終濃度にてＰＩＣＯＧＲＥＥＮ^ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。蛍光を、４８０ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光にて測定した。結果を、β−アクチンに対して標準化し、少なくとも２回の別個の実験から三連にて行った。

細胞生存度アッセイ、細胞死アッセイおよびアポトーシスアッセイ。細胞生存度および細胞死を、トリパンブルー排除またはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して決定した。トリパンブルー（ＧＩＢＣＯ）（通常は、細胞質から排除される）は、死細胞および死につつある細胞を可視的に青色に染色することにより、膜が傷つけられた細胞を同定する。トリパンブルーの０．４％（ｗ／ｖ）溶液の１：１希釈液を、実験の終わりにチップデバイスの再循環培養培地に添加する。この溶液を、チップを通してポンピングして、室温にて３０分間で廃棄した。ポンプからハウジングを除去し、反射顕微鏡（Ｍｉｃｒｏｍａｓｔｅｒ，Ｆｉｓｈｅｒ）下で可視化した。

ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色は、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭおよびエチジウムホモダイマーからなる２成分染色である。生細胞は、カルセインＡＭのアセトキシメチルエステル（ＡＭ）部分を活発に加水分解して、カルセインの明るい緑色蛍光を生じる。対照的に、膜の完全性が弱められた細胞は、通常は膜不透過性のエチジウムホモダイマーにより、死細胞または死につつある細胞の核が赤色蛍光に染色される。細胞透過性核色素であるＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、全ての細胞についての全体的な色素として作用する。適切なフィルタセットと組むと、生細胞は、緑色を発し、死につつある細胞または死細胞は赤色を発し、そして全ての細胞は、青色の核発光により定量される。本明細書中に記載される実験について、トリパンブルーは、０．２％（ｗ／ｖ）にて、カルセインＡＭは、１：２０，０００にて、ヨウ化プロピジウムは、１：５，０００にて、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は１０μｇ／ｍｌにて使用される。細胞を、Ｍ２Ｂｉｏ立体蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて可視化した。全ての実験を、少なくとも３回繰り返し、測定を三連で行った。

アポトーシス、すなわち、プログラム細胞死は、多くの方法（Ｓｍｙｔｈ，Ｐ．Ｇ．，Ｂｅｒｍａｎ，Ｓ．Ａ．，およびＢｕｒｓｚｔａｊｎ，Ｓ．（２０００）．Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：６４８−６６５）を用いてモニターされ得る。壊死とアポトーシスを区別するために、少なくとも２つの別々のアポトーシス指標が必要とされる（Ｗｒｏｎｓｋｉ，Ｒ．，Ｇｏｌｏｂ，Ｎ．，およびＧｒｙｇｅｒ，Ｅ．，（２００２）．Ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：６６６−６６８）。１つの方法（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合）は、アネキシンＶが２価のカルシウム存在下でホスファチジルセリンにしっかりと結合するという観察に依存する（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｐ．，Ｅｉｊｎｄｅ，Ｓ．ｖ．ｄ．，およびＳｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ．Ａ．（２００１）．Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ａｎｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｌ．Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，およびＪ．Ｄ．Ａｓｈｗｅｌｌ，編（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），３３９−３６４頁）。通常、ホスファチジルセリンは、細胞膜の内側リーフレット上に存在するが、アポトーシスの初期に細胞膜に移行する。発蛍光団標識アネキシンに曝露されたアポトーシス細胞は、特徴的な膜染色を呈する。微小規模チップを用いると、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ標識は、システムのＰＢＳを用いた最初の洗浄、次いで、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（アネキシンＶ結合緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中、１０ μｇ／ｍｌ）で３０分間の再循環により、チップ上で直接的に視覚化された。次いで、細胞は、ＦＩＴＣフィルタセットを用いて直接的に視覚化された。

アネキシンＶ標識とは対照的に、ＡＰＯＰＴＡＧ^ＴＭキット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ．ＭＡ）は、免疫蛍光を用いて、アポトーシス性ＤＮＡ分解および明視化（ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）の間に露出される遊離３’−ＯＨ ＤＮＡ末端を標識するために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用する（Ｌｉ，Ｘ．，Ｔｒａｇａｎｏｓ，Ｆ．，Ｍｅｌａｍｅｄ，Ｍ．Ｒ．，およびＤａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｚ．（１９９５）．Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｗｉｔｈ ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ−ｏｒ ＢＯＤＩＰＹ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｍｅｔｙ ２０，１７２−１８０）。この方法はアポトーシスに対して高度に特異的であるが、この手順は、固定工程およびインキュベーション工程に起因して、チップ上で実施することができない。簡単に言うと、微小規模チップは、特定の実験条件下（細胞チップを、そのハウジングユニットから取り出し、１％ホルムアルデヒドで固定し、そして製造業者のプロトコルを用いて、ＡＰＯＰＴＡＧ^ＴＭキットを使用して処理する）で実施された。

（微小規模チップの組立ておよび実験方法）
微小規模チップを、以下の通りに組立てた：コンピューター支援設計（ＣＡＤ）ソフトウェア（Ｃａｄｅｎｃｅ）を用いてパターンを設計し、ＧＣＡ／Ｍａｎｎ ３６００Ｆ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いて染色体フォトマスクを作製した。次いで、この高解像度パターンを、Ｋａｒｌ Ｓｕｓｓ ＭＡ６ Ｃｏｎｔａｃｔ Ａｌｉｇｎｅｒを用いてフォトマスクを介してＵＶ光にウェハを暴露することによって、ポジティブフォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ １８１３）の薄いコート（約１μｍ）を備えるシリコンウエハー（直径３インチ）に移した。暴露後、次いで、フォトレジストを現像し、規定したパターンにおいてフォトレジスト層を介してシリコンを暴露する。暴露したシリコンシリコンを、ＰｌａｓｍａＴｈｅｒｍ ＳＬＲ ７７０ ＩＣＰ Ｄｅｅｐ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｅｔｃｈ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、特定の深さ（２０〜１００μｍ）にエッチングした。フォトレジストを、アセトンを用いてウェハから剥した。個々の２２ｍｍ^２の微小規模チップを、ウェハから切り出し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｐ（Ｃｙａｎｔｅｋ）中で洗浄し、蒸留水でリンスし、そして１７０℃にて乾燥オーブンにおいて乾燥させた。

器官のコンパートメントにおけるシリコン表面を、細胞接着を容易にするためにコラーゲンで処理した。コラーゲンＩ型の１ｍｇ／ｍｌ（約１０μｌ）を微小規模チップの表面上に沈着させ、室温にて３０分間インキュベートした。コラーゲン溶液を除去し、そして器官コンパートメントを細胞培養培地でリンスした。細胞を組織培養皿から剥がし、細胞数を決定し、そして濃度を、各細胞コンパートメントにおいて細胞のコンフルエントな単層になるように調製した。例えば、図２（上記）に記載される微小規模チップについて、１０μｌのＬ２細胞の懸濁液（２，４００細胞／μｌ）を、細胞チップの肺チャンバ上に沈着させ、そして１５μｌのＨ４ＩＩＥ細胞の懸濁液（３，４００細胞／μｌ）を肝臓チャンバ上に沈着させた。細胞を、ＣＯ_２インキュベーターにおいて一晩で接着させた。一旦細胞が接着すると、チップをアクリルチップハウジング内に集めた。ハウジングの上部は、チップに細胞培養培地を提供するための流体相互連絡部を備える。ステンレス鋼製チューブを、ミクロボアポンプチュービングに接続し、そして培養培地（試験化合物を有するか、もしくは有さない）を含むミクロ遠心チューブの上端にある小さな穴に挿入する。ポンプチュービングを、蠕動ポンプに接続し、この溶液でプライムし、そしてチップハウジングの注入ポートに接続する。末端に接続されるステンレス鋼製チューブを備えるポンプチュービングの小さなセクションを、排出ポートに接続させ、そしてこのチューブをミクロチューブの上端にある小さな穴に挿入し、従って、再循環流体回路が完成する。機器全体を、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内に設置する。この設定の概略図を図２２に示す。

（実施例１）
（ラットを模倣するシステムついての計算）
チップの設計において、１０００個の必要な全チャンバを、２ｃｍ×２ｃｍ以内のシリコンチップ上に適合させた。チップのこのサイズは、製造が容易であり、かつ接続チュービングおよびポンプデバイス（流体の流れを方向付けるための使用が意図される）のサイズに適合可能である。各々の変数に対して受容可能な値とともに以下に列挙されるデバイスの設計を制限する、他のいくつかの要因もまた存在した。デバイスのこの１つの実施形態は、２つのコンパートメントシステムからなり、１つのコンパートメントはラットの肝臓を示し、そして１つのコンパートメントはラットの肺を示す。チップの全体のサイズは２ｃｍ×２ｃｍであり、そして「肺」チャンバとして機能するために２０個の平行チャネル（幅４０μｍ、深さ１０μｍおよび長さ５ｍｍ）、および「肝臓」チャンバとして機能するために２つの平行チャネル（幅１００μｍ、深さ２０μｍおよび長さ１０ｃｍのサーパタイン（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ））が相互連絡したアレイからなる。２つの器官コンパートメントは、チャネル（幅１００μｍおよび深さ２０μｍ）によって接続される。多くの他の可能な幾何学、寸法、チャンバの数などが存在する。この設計を１つの例として選択した。

（サンプルの計算）
（チャネルまたはチャンバの計算）
これらの計算は、本発明者らが、上記の方法によって、システム１１００のためのチップ１０００について以前の繰返しから得た流速を仮定する。

これにより、Ｑ＝８．０５×１０^５μｍ^３／トレンチ−秒。

次いで、トレンチでの液体滞留時間を、以下の様式によって計算した：

次に、「細胞−長（ｃｅｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）」における細胞数を計算した

Ｎ_長さ＝７細胞（各項目の端数は別々に切り捨てる）
次いで、チャネル／チャンバの細胞−長体積（ｃｅｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｖｏｌｕｍｅ）を計算した。

Ｖ_ＴＣＬ＝（細胞直径）（トレンチ断面積）
Ｖ_ＴＣＬ＝（７．４１μｍ）・（４００μｍ^２）
Ｖ_ＴＣＬ＝２９６０μｍ^３
細胞−長体積もまた、決定した。

液体の細胞−長体積（ｌｉｑｕｉｄ ｃｅｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｖｏｌｕｍｅ）は、単にチャネル／チャンバ細胞−長体積から、細胞の細胞−長体積を減算しただけである。細胞の細胞−長体積および液体細胞−長体積の比は、このシステムに対して液体対細胞体積の比を与える。

所定の流速に関する個々の細胞の剪断力を決定した。液体細胞−長体積および細胞直径に基づいて、液体が貫流するために利用可能な平均表面領域を計算した。

次いで、チャネル内の流体の平均線速度を決定した。

層流を仮定して、球上の抵抗を計算するためにストークスの法則を使用して、個々の細胞によって経験した全ての剪断力を見積もった。

次に、チャネル／チャンバにおける液体の実際の滞留時間を検証し、そしてチャネル／チャンバ内の全細胞数を計算した。

（Ｉ．Ｂ．膜酸化の計算）
酸化についてのシリコーン膜の領域を、以下の様式によって決定した：
第一に、細胞について、酸素取込み速度（ＯＵＲ）を見積もった：

次いで、これが液体培地を再酸化するために十分であるか否かを決定するために、膜の内側の酸素分圧を計算した。これは、多孔性膜を通るガスの流量についての方程式を使用して実行され、ここで、Ｑは膜の透過性である。Ｊは、細胞内のガスの流量を示し、そしてｚは、膜の厚みである。

この圧力は、膜との接触する２００秒において、液体培地を酸素で飽和するのに十分である。膜の領域を、内部酸素分圧を最大にするために反複様式で決定した。

（原則的な設計の見積もり）
（ラットモデル）

（滞留時間の見積もり）
（ラット組織における実際の（標的）滞留時間）

（実施例２）
（４つの器官コンパートメントチップ）
以下の４つの器官コンパートメントからなるように、チップを設計した−生体異物代謝を担う器官を示す「肝臓」コンパートメント、標的組織を示す「肺」コンパートメント、疎水性化合物の生体蓄積のための部位を提供する「脂肪」コンパートメント、および非代謝組織（非蓄積組織）における循環パターンの模倣を補助する「他の組織」コンパートメント（図１５）。これらの器官および他の器官のコンパートメント（例えば、腎臓、心臓、結腸または筋肉）は、ＣＡＤファイルとして十分にモジュール化され得、そして任意の形状または組み合わせにおいて作製され得る。このデバイス自体、任意の基材（例えば、シリコン、ガラスまたはプラスチック）において製造され得る。

一旦、細胞が適切なコンパートメントに播種されると、このチップを、Ｌｕｃｉｔｅマニホールドにおいて組み立てた。このマニホールドは４つのチップを保持し、そして細胞がインサイチュで観察され得るように、透明な上端を備える。上端は、チップに細胞培養培地を提供するための流体内部連絡を備えた。培養培地を、蠕動ポンプを用いて０．５μｌ／分の流速でチップを通してくみ上げた。培養培地を、流体のレザバ（全量、約１５〜５０μｌ）、ミクロボアチュービング、ならびにチップのコンパートメントおよびチャネルからなる選択したループにおいて再循環させた。

肝臓コンパートメントにおいてヒトＨｅｐＧ２−Ｃ３Ａ細胞および標的組織コンパートメントにおいてＨＴ２９結腸癌細胞を有する３コンパートメントシステムを使用して、１４４時間よりも長い連続操作下で、細胞が生存し続けることを見出した。ＨｅｐＧ２−Ｃ３Ａ細胞は、新鮮な初代肝細胞と匹敵するレベルで、種々の肝臓代謝酵素を発現することが既知の、十分に特徴付けられたヒト肝臓細胞株である。これらの実験において、細胞を適切なコンパートメントに播種し、そして特別に処方した細胞培養培地を、１４４時間までシステムを通して再循環させた。種々の経過時間で、培養培地を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ蛍光試薬（二重蛍光染色［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ］）を含むＰＢＳに３０分間置換した。細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化し、そして同一視野の蛍光画像を適切なフィルタセットを使用して得た。生存細胞は緑色蛍光を呈したが、死細胞は赤色蛍光を呈した（データは示さず）。

（実施例３）
（チップにおける薬物代謝）
２つの広範に使用されるプロドラッグ（テガフールおよびスリンダクスルホキシド）の代謝を、３つのコンパートメント（肝臓、標的組織、および他の組織）を含む微小規模チップを用いて研究した。両方のプロドラッグは、肝臓に存在する酵素による活性代謝物への転換を必要とし、そして標的器官に対する細胞傷害性効果を有する。プロドラッグのスリンダクスルホキシドについて、その抗炎症性および癌化学予防特性は、そのスルフィド代謝物およびスルホン代謝物に由来し、肝臓酵素スルホキシドレダクターゼによって触媒される。スルフィド代謝物（および第二のスルホン代謝物）は、特定の癌細胞（例えば、結腸癌）においてアポトーシスを誘導することが実証されている。

適切な処置レジメンは、５−ＦＵ自体は正常細胞に対してかなり毒性なので、プロドラッグのテガフール［５−フルオロ−１−（２−テトラヒドロフリル）−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン］の投与を必要とする。しかし、スリンダクとは違って、テガフールは、チトクロムＰ４５０ ２Ａ６によって最初に肝臓において５−ＦＵに転換される。

スリンダクの効果を試験するために、微小規模チップに、肝臓コンパートメントにＨｅｐＧ２−Ｃ３Ａ細胞を、そして標的組織コンパートメントにＨＴ２９ヒト結腸癌細胞を播種した。１００μモルのスリンダク（製造業者を必要とする）を、２４時間、再循環培地に添加し、そしてチップを上記の通り処理した−生存細胞は緑色蛍光を呈したが、死細胞は赤色蛍光を呈した（データは示さず）。ＨｅｐＧ２−Ｃ３Ａ肝細胞の非存在下では、最小レベルの細胞死（ビヒクルコントロールに類似する）を観察した。これらの結果は、薬物が、肝臓コンパートメントにおいて代謝され得、その結果、その代謝物が生存する動物およびヒトにおいて行うと同様な生物学的な効果を誘導する標的に循環されることを実証する。

癌治療プロドラッグテガフールを、微小規模チップシステムで試験した。有効性のために、テガフールは、肝臓に存在するチトクロム Ｐ４５０酵素による、代謝活性形態（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））への代謝活性化を必要とする（Ｉｋｅｄａ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｓｕｅ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｅ．，Ｎａｇａｙａｍａ，Ｓ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｔｙｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｃｈｉｂａ，Ｋ．，およびＫａｗａｇｕｃｈｉ，Ｙ．（２０００）．Ｂｉｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｇａｆｕｒ ｔｏ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｉｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ ２Ａ６ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６，４４０９−４４１５；Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｎ．，Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．，およびＹｏｋｏｉ，Ｔ．（２０００）．Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０ １Ａ２，２Ａ６，ａｎｄ ２Ｃ８ ｉｎ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｅｇａｆｕｒ，ａｎ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｄｒｕｇ，ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．，２８，１４５７−１４６３；Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｎ．，Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．，およびＹｏｋｏｉ，Ｔ．（２００１）．Ｒａｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ １Ａ ａｎｄ ３Ａ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂｉｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｇａｆｕｒ ｔｏ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ａｎｄ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｅｇａｆｕｒ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．，２９，７９４−７９７．Ａ ｐｒｏｐｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｇｉｍｅｎ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｐｒｏ−ｄｒｕｇ，ｔｅｇａｆｕｒ，ａｓ ５−ＦＵ ｉｔｓｅｌｆ ｉｓ ｖｅｒｙ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ．５−ＦＵ ｉｓ ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ（Ｈｗａｎｇ，Ｐ．Ｍ．，Ｂｕｎｚ，Ｆ．，Ｙｕ，Ｊ．，Ｒａｇｏ，Ｃ．，Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｋｅｌｓｏ，Ｇ．Ｆ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．Ｊ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（２００１）．Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｆｆｅｃｔｓ ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７，１１１１−１１１７．）Ｌｉｋｅ ｍｏｓｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ，５−ＦＵ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍａｒｋｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ（Ｈｗａｎｇ，Ｐ．Ｍ．，Ｂｕｎｚ，Ｆ．， Ｙｕ，Ｊ．，Ｒａｇｏ，Ｃ．，Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｐ．，Ｋｅｌｓｏ，Ｇ．Ｆ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．Ｊ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（２００１）．Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｆｆｅｃｔｓ ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７，１１１１−１１１７）。

結腸癌細胞に対するテガフールの細胞傷害性効果を測定するために、微小規模チップを、肝臓コンパートメント中のＨｅｐＧ２−Ｃ３Ａおよび標的組織コンパートメントのＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌細胞を用いて調製した。テガフールを、種々の濃度で２４時間再循環培地に添加して、細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（膜透過性ＤＮＡ色素）およびエチジウムホモダイマー（膜不透過性ＤＮＡ色素）を用いて標識した（方法の節を参照のこと）。全細胞が青の蛍光発色する一方、死細胞は、蛍光性の赤のエチジウムホモダイマーにより印付けられた（データは示さず）。テガフールは、この微小規模チップシステムにおいて、用量依存様式で、ＨＣＴ−１１６細胞に対して細胞傷害性であったが、これは、従来の細胞培養アッセイでは効果的でなかった（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。さらに、５−ＦＵは、従来の細胞培養アッセイにおいて細胞死を誘発したが、細胞傷害性は、微小規模チップを用いたテガフールへの２４時間の曝露と比較して、４８時間の曝露後まで観察されなかった。

肝臓コンパートメントがテガフールの生物活性化を引き起こすことを実証するために、微小規模チップを、ＨＣＴ−１１６細胞のみを用いて播種した。肝臓コンパートメントでは、細胞は存在しなかった。テガフールまたは５−ＦＵを、再循環培養培地に２４時間添加して、そして、このチップを、上記のように処置した（データは示さず）。テガフールは、肝臓コンパートメントの非存在下では、ＨＣＴ−１１６細胞の顕著な細胞死を引き起こさなかったが、活性代謝産物である５−ＦＵは、かなりの細胞死を引き起こした。さらに、ＨＴ−２９結腸癌細胞をＨＴＣ−１１６と置き換えた場合、テガフールは、有効でなかった（データは示さず）。これは、ＨＴ−２９細胞中に存在する変異体ｐ５３に起因するようであり、これが、５−ＦＵ細胞傷害性に必要である。一緒にすると、これらの実験によって、テガフールは、スリンダクと同様に、このテガフールが癌細胞を排除するために別の器官コンパートメントに循環される肝臓コンパートメントにおいて、活性薬物まで代謝されたことが実証される。これらの効果は、チップを用いて機械的に区別可能であった−スリンダクは、活性ｐ５３の非存在下でさえ効果的であったが、テガフールはそうではなかった。

（実施例４）
（単一器官コンパートメントにおける複数の細胞培養）
単一器官コンパートメント中で複数の細胞型の混合物を使用することもまた、可能である。１つの研究において、肝実質細胞の細胞株ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ（ＡＴＣＣから）を、肝臓コンパートメントにおいて使用する。この細胞を、１．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、および１０％ウシ胎仔血清を含む、マコイ５Ａ培地中で増殖させる。インビボ器官をより厳密に模倣するために、一次肝実質細胞および線維芽細胞の混合物を、マクロファージ（クッパー細胞）と共に、１：２の比率で使用し得る。

別の例において、肺上皮細胞由来の細胞または細胞株の混合物を、肺組織をより厳密に模倣するために使用する。これは、Ｉ型上皮細胞、ＩＩ型上皮細胞（顆粒様肺胞細胞）、線維芽細胞、マクロファージおよび肥胖細胞の混合物を含む。

（実施例５）
（チップベースの系における組織培養条件の最適化）
２つの異なるラット細胞培養株である、Ｈ４ＩＩＥ（ラット肝臓細胞株）およびＬ２（ラット肺細胞株）に適合する組織培養培地を、作り出した。予備実験は、ＤＭＥＭとＨａｍｓ Ｆ１２Ｋの１：１の混合物の培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した）が、微小規模チップにおいて、２０時間までの連続操作の間、Ｈ４ＩＩＥ細胞およびＬ２細胞の両方の生存度を維持することを示した。この培地処方を、全てのラットベースの微小規模チップ研究のために使用した。

ヒトの肝臓機能を現実的に模倣する適切なヒト肝臓細胞株を、選択した。さらに、微小規模チップでヒト細胞株を維持するのに最適な細胞培養培地処方を、決定した。ＨｅｐＧ２細胞株およびＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ（ＨｅｐＧ２のサブクローン）細胞株中での３つの重要なシトクロムであるＰ４５０（ＣＹＰ）アイソフォーム（１Ａ２、３Ａ４および２Ｄ６）の基底発現レベルを、試験した。ＣＹＰ−１Ａ２、ＣＹＰ−２Ｄ６およびＣＹＰ−３Ａ４を、試験した。なぜならば、これらは、全ての公知の薬物の８０〜９０％の代謝を占めるからである（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．，（２００１）ＡＤＭＥＴ−ｔｕｒｎｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉｎｔｏ ｄｒｕｇｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９，７２２−７２６）。ＨｅｐＧ２肝臓細胞株のＣ３Ａサブクローンを試験した。なぜならば、この細胞株は、より「肝臓様」の特徴（特に、親細胞株と比較して、はるかに高いＣＹＰ発現）を示す、高度に選択された細胞株であることが報告されているからである（Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｈ．（１９９４）．Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ａ ｌｉｖｅｒ ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅ（ＬＡＤ）。米国特許第５，２９０，６８４号）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞における基底のＣＹＰレベルが、ＨｅｐＧ２親株よりも有意に高く、そして、成体ヒト肝臓と比較し得ることを確認した（図２３）。

ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を、全ての続く実験において、肝臓代理として使用した。微小規模チップ実験の間に使用するための共通の培地を選択するために、多数の培地成分を、比較した（ＤＭＥＭ、マコイ５ａ、ＲＰＭＩ １６４０、ＭＥＭ、Ｆ１２、Ｆ１２Ｋ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ、ＣＭＲＬ、ＭＥＭおよびＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地）。無機塩、グルコース、アミノ酸組成、およびビタミン含量の分析は、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、マコイ５ａおよびＲＰＭＩが、試験された培地の、最も適切な「共通」培地であった。数継代後、次いで、細胞を分配して、以下の培地中でサブ培養した：
Ｅａｒｌｅ平衡塩類溶液、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、および１０％ ウシ胎仔血清を含む、Ｅａｇｌｅ最小必須培地（ＥＭＥＭ）。

４ｍＭ Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／Ｌ グルコース、１．５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、および１０％ウシ胎仔血清を含む、ダルベッコ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）。

１．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、および、１０％ ウシ胎仔血清を含む、マコイ５ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ）。

２ｍＭ Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／Ｌ グルコース、１．０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウムを含む、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ）。

各培地中の両方の細胞株についての増殖曲線を、次いで、方法の節で記載したように決定した（図２４）。ＤＭＥＭが、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞には不適切であることが見出された。なぜならば、約５継代後の細胞形態および細胞接着において顕著な変化が観察されたからである（示さず）。同様に、ＲＰＭＩにおける、３日後のＨｅｐＧ２／Ｃ３ＡおよびＨＣＴ１１６の生存度および増殖の顕著な減少に注目した。両方の細胞株は、それらの好ましい培地と比較して、ＭｃＣｏｙ’ｓおよびＥＭＥＭにおいて良好に増殖した。

次に、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＥＭＥＭか、または、ＭｃＣｏｙ’ｓのいずれかにおいてＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞が増殖する際の、これらのＣＹＰアイソフォームの発現レベルを調査した（方法の節参照）（図２５）。この結果は、ＥＭＥＭが、ＣＹＰ発現を維持するためにＭｃＣｏｙ’ｓより優れており、そして、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａのための好ましい培地であることを示した。ＣＹＰ発現に対する異なる増殖基質の効果を研究した（図２６）。標準的組織培養で処置したポリスチレンでの増殖した細胞に対して、付着基質としてポリ−Ｄ−リジンか、またはコラーゲンのいずれかを用いて処置したシリコンの比較を実施した。一緒にすると、この結果は、ＥＭＥＭが、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞およびＨＣＴ１１６細胞の両方の増殖を支持すること、および、コラーゲンは、ＲＴ−ＰＣＲのＣＹＰ発現分析に基づく好ましい基質であることを示した。

これらの条件を使用して、これらの細胞（ＨｅｐＧ２／Ｃ３ＡおよびＨＣＴ１１６）の長期細胞生存度を、微小規模チップ系における連続操作下で研究した。肝臓コンパートメント中のヒトＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞および標的細胞コンパートメント中のＨＣＴ１１６結腸癌細胞を用いた３つのコンパートメント系を使用して、細胞が、１４４時間よりも長い間、連続操作下で生存し続けることを実証した。これらの実験において、細胞を適切なコンパートメント中に播種して、そして、ＥＭＥＭを、１４４時間までの間、この系を介して再循環した。種々の時点（６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間および１４４時間）にて、全生細胞または全死細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を使用して可視化した（データは示さず）。細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化して、同一の領域の蛍光画像を、適切なフィルタセットを使用して得た。生細胞は緑で蛍光発色する一方、死細胞は赤だった（データは示さず）。

（実施例６）
（微小規模チップでの細胞傷害性の検出のためのアッセイ）
トリパンブルーは、生育不能細胞から生細胞を区別するために使用される、最も通常の染色である；生育不能細胞のみが色素を吸収して、青に見える。逆に、生存する、健康な細胞は、青色素を吸収することなく、円形で屈折して見える。微小規模チップにおける細胞生存度を決定するために、トリパンブルーを使用して、実験を実施した。トリパンブルー（方法の節を参照のこと）は、容易に使え、そして、可視化するために光学顕微鏡のみを必要とするが、生細胞は、時間をかけてトリパンブルーを吸収する（このことは、結果に影響し得る）。さらに、トリパンブルーは、細胞タンパク質よりも、血清タンパク質に対して高い親和性を有し、従って、背景は、血清含有培地を使用する場合、暗い。従って、死細胞から生細胞を区別する代替の方法を、研究した。

ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイを、ガラスのカバーガラス上で増殖した細胞を使用して最適化した（方法の節を参照のこと）。簡単に言えば、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を、ポリ−Ｄ−リジンで処理したガラスのカバーガラス上に播種して、そして、１μＭのスタウロスポリンを用いて、および１μＭのスタウロスポリンを用いないで、２４時間処置した。スタウロスポリンは、広範なスペクトルを有するプロテインキナーゼインヒビターであり、種々の細胞型においてアポトーシスを誘導することが知られている（Ｓｍｙｔｈ，Ｐ．Ｇ．，Ｂｅｒｍａｎ，Ｓ．Ａ．，およびＢｕｒｓｚｔａｊｎ，Ｓ．（２００２）、Ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２，６４８−６６５）。カバーガラスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して洗浄して、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬を添加して、室温で３０分間、インキュベートした。このカバーガラスを除去して、可視化した（データは示さず）。スタウロスポリンが、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の細胞死を明らかに引き起こすことが見出された（データは示さず）。

微小規模チップ系での細胞傷害性の検出のためのアッセイを、次いで最適化した。微小規模チップの細胞チップを、方法の節に記載するとおり、肝臓コンパートメント中のＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞および標的組織コンパートメント中のＨＣＴ１１６細胞を用いて播種した。細胞チップを、微小規模チップ系に充填して、上記のとおりに、１μＭのスタウロスポリンを用いて、および１μＭのスタウロスポリンを用いないで処理した。２４時間のインキュベーション後、再循環培地をＰＢＳに切り換えて、３０分間この系に流して、次いで、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬を含むＰＢＳに切り換えて、さらに３０分間、この系に流した。この細胞チップを含むアクリル製ハウジングを、この系から取り除き、立体蛍光顕微鏡下に配置して、この細胞チップを、このハウジングの透明な頂点から可視化した（データは示さず）。細胞を蛍光顕微鏡下で可視化して、同じ領域の蛍光画像を、適切なフィルタセットを用いて得た。生細胞は緑の蛍光発色する一方、死細胞は、赤だった（データは示さず）。ＨＣＴ１１６細胞の有意な細胞死は、非処置のコントロール細胞チップと比較して、処置の２４時間後に、１μＭのスタウロスポリンにより引き起こされた（データは示さず）。

（実施例７）
（細胞死の発生の検出およびアポトーシスまたは壊死を区別するための、チップベースのアッセイ）
アポトーシスを検出するために、２つの異なるアッセイを調査した。第１のアッセイは、ＡＰＯＰＴＡＧ^ＴＭ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ．，ＭＡ）としてキット形態で入手可能である、免疫蛍光ベースの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼＢｒｄＵニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）技術である（方法の節を参照のこと）。このアッセイを、ガラスのカバーガラス上で増殖した細胞を使用して、最初に最適化した。簡単に言うと、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を、ポリ−Ｄ−リジンで処置したガラスのカバーガラス上に播種して、スタウロスポリンを用いておよびスタウロスポリンを用いないで、処置した。カバーガラスを、記載されるように処理した（方法の節を参照のこと）。種々のスタウロスポリン濃度および処置時間を試験して、この結果は、１μＭのスタウロスポリンが、２４時間のインキュベーション後に、非処置コントロールと比較して、有意なアポトーシスを引き起こすことを示した（データは示さず）。次に、微小規模チップ系でのアポトーシスの検出のためのアッセイを最適化して、ＡＰＯＰＴＡＧ^ＴＭ法とＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色技術との比較を実施した。この微小規模細胞チップを、方法の節に記載されるように、肝臓コンパートメント中のＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａおよび標的細胞コンパートメント中のＨＣＴ１１６細胞を用いて播種した。細胞チップを、微小規模チップ系上に充填して、上記のとおりに、１μＭのスタウロスポリンを用いて、および１μＭのスタウロスポリンを用いないで処理した。２４時間のインキュベーション後、再循環培地を、３０分間ＰＢＳに切り換えた。この細胞チップの半分を、ハウジングから取り除き、ＡＰＯＰＴＡＧ^ＴＭアッセイを、上記のとおりに実施した。他方の細胞チップを、微小規模チップ系に残して、前記したとおりに、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色技術に供した。細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化して、同一の領域の蛍光画像を、適切なフィルタセットを使用して得た。生細胞は、緑の蛍光発色する一方、死細胞は赤だった（データは示さず）。両技術ともに、非常に類似した結果を生じた（すなわち、１μＭへの２４時間の曝露により、非処置コントロールと比較して、ＨＣＴ１１６細胞に対して、有意なアポトーシス（または細胞傷害性）を誘導した）（データは示さず）。

アネキシンＶ−ＦＩＴＣを使用して、方法の節で記載したとおりに、微小規模チップ系でのアポトーシスを検出した。簡単に言うと、微小規模チップの細胞チップを、肝臓コンパートメント中のＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａおよび標的細胞コンパートメント中のＨＣＴ１１６細胞を用いて播種した。細胞チップを、微小規模チップ系上に充填して、上記のとおりに、１μＭのスタウロスポリンを用いて、および１μＭのスタウロスポリンを用いないで処理した。６時間のインキュベーション後、再循環培地をアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヘキスト３３３４２を含むＰＢＳに切り換えて、この系に３０分間流した。細胞チップを、アクリル製のハウジングから取り除き、蛍光顕微鏡下で可視化した。細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化して、同一の領域の蛍光画像を、適切なフィルタセットから得た。生細胞は、緑の蛍光発色する一方、死細胞は赤だった（データは示さず）。１μＭのスタウロスポリンは、非処理コントロール細胞チップと比較して、６時間の処置後に有意なアポトーシスを引き起こした（データは示さず）。

（実施例８）
（モデル毒薬としてのナフタレンの使用）
ナフタレンを使用して、毒物学を研究した。なぜならば、肝臓中での酵素的変換が、肺の毒性に必要であるからである。従って、ラット肺細胞株に対するナフタレンの効果を研究した。これらの実験は、三つのコンパートメント（肝臓、肺および他の組織）の、肝臓コンパートメント中のＨ４ＩＩＥ細胞および肺コンパートメント中のラットＬ２細胞を用いたラットベースの微小規模チップを使用した。微小規模チップを、方法の節で記載したとおりに、実験のために加工および調製した。

微小規模チップ系を、トリパンブルーを含有するＰＢＳに切り換える前に、２５０μｇ／ｍｌ ナフタレンの存在下または２５０μｇ／ｍｌ ナフタレンの非存在下で２０時間、操作した。このＰＢＳの溶液を、細胞チップを介して、３０分間再循環して、このチップを、光学顕微鏡下で可視化した（方法の節を参照のこと）。ナフタレンが、この細胞チップの肺コンパートメントにおいてラットＬ２細胞の有意な細胞死を引き起こす一方、ナフタレンの非存在下では細胞死は観察されなかった（データは示さず）。ナフタレンの含有に関わらずＨ４ＩＩＥ細胞コンパートメントにおいて、または、Ｈ４ＩＩＥ細胞の非存在下でのＬ２細胞コンパートメントにおいて、細胞死は観察されなかった（データは示さず）。

これらの結果は、ナフタレンが、「肝臓」コンパートメントにおいて活性化されて、毒性代謝産物が、「肺」に循環して、細胞死を引き起こすことを実証する。これらの結果は、ベンチトップＣＣＡデバイスで得られたデータと一致して、ＰＢＰＫモデルから予想される（Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｌ．Ｍ．，Ｓｈｕｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｂａｂｉｓｈ，Ｊ．Ｇ．，およびＧｈａｎｅｍ，Ａ．（１９９５）。Ａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎａｌｏｇｕｅ ｏｆ ｒｏｄｅｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，９，３０７−３１６）。

（実施例９）
（ヒト微小規模チッププロトタイプ）
肺、標的組織および他の組織についてのコンパートメントを含むヒトバイオチッププロトタイプを、調製した。これらのコンパートメントおよびチャネルの寸法は、以下のとおりであった：
入口：１ｍｍ×１ｍｍ
肝臓：幅３．２ｍｍ×長さ４ｍｍ
標的組織：２ｍｍ×２ｍｍ
他の組織：幅３４０μｍ×長さ１１０ｍｍ
出口：１ｍｍ×１ｍｍ
肝臓からＹ字型結合部に接続するチャネル：幅４４０μｍ
Ｙ字型結合部から標的組織のチャネル：幅１００μｍ。
ヒトバイオチッププロトタイプを、前記のように加工する。これらの器官コンパートメントの配置は、経口摂取される化合物（薬物）への曝露をまねるように企図される。化合物が、経口摂取される場合、この化合物は、小腸または大腸から血液に吸収される。ここから、この化合物は、門脈を介して肝臓に直接的に循環して、次いで、体中に分配される（図２７）。従って、この設計によれば、肝臓は第１の器官コンパートメントであり、続いて、他の組織である、標的組織についてのコンパートメントおよびチャンバに分かれる。他の組織コンパートメントは、体内の血液の分布および滞留を表し、標的組織コンパートメントは、目的の治療標的（例えば、結腸腫瘍を表す結腸癌細胞）を表す。

（結論）
本発明は、薬物速度論に基づく培養のデバイスおよびシステムを提供し、これらは、レシービング末端および出口末端を有する、第１の細胞培養チャンバ、および、レシービング末端および出口末端を有する第２の細胞培養チャンバ、ならびに、第１の細胞培養チャンバの出口末端を第２の細胞培養チャンバのレシービング末端に接続する導管を通常備える。好ましくは、このデバイスは、チップベースである（すなわち、このデバイスは、微小規模サイズである）。培養培地は、第１の細胞培養チャンバを通って、導管を通って、そして、第２の培養チャンバを通って循環し得る。この培養培地はまた、再循環ループ中の１つ以上の位置で、酸素付加され得る。

このデバイスは、例えば、デバイスの一部からチップ外の位置にシグナルを伝達するための導波管を用いて、このデバイスの一部からチップ外の位置にシグナルを伝達するための機構を備え得る。複数の導波管（例えば、第１のチャンバからのシグナルを伝達する第１の導波管、および第２のチャンバからのシグナルを伝達する第２の導波管など）が存在し得る。

１つの実施形態において、第１の細胞培養チャンバおよび第２の細胞培養チャンバの少なくとも１つは、三次元である。別の実施形態において、第１の細胞培養チャンバおよび第２の細胞培養チャンバの両方とも、三次元である。

生存可能な状態に細胞を維持するためのデバイスはまた、流体循環機構を備え、これは、流動流体循環機構または流体を再循環する流体循環機構であり得る。細胞を生存可能な状態に維持するためのデバイスはまた、少なくとも第１のコンパートメントおよび第２のコンパートメントを接続する流路を備える。ある実施形態において、デバブラー（ｄｅｂｕｂｂｌｅｒ）は、流路中の気泡を除去する。このデバイスはさらに、ポンピング機構を備え得る。このポンピング機構は、基材上に位置し得る。

少なくとも２つの細胞チャンバにおいて、少なくとも２つの型の細胞を生存可能な状態に維持するために基材をサイズ決めする方法が、提供される。この方法は、基材上に維持される細胞の型を決定する工程、および、この基材の物理学的特性を決定するために生理学に基づく薬物速度論モデルからの束縛を適用する工程を包含する。生理学に基づく薬物速度論モデルからの束縛を適用する工程は、基材上に形成されるべきチャンバの型を決定する工程を包含して、これはまた、少なくとも１つの細胞チャンバの幾何学を決定する工程、および、２つの細胞チャンバを相互接続する流路での幾何学を決定する工程を包含する。生理学に基づく薬物速度論モデルからの束縛を適用する工程はまた、流路のフロー媒体組成物を決定する工程を包含し得る。

本明細書中に引用された全ての出版物および特許出願は、個々の出版物および特許出願のそれぞれが、参考として援用されることを詳細にかつ個々に示されるかのように、本明細書中で参考として援用される。

上記の説明が、図解のためであり、制限されないことを意図されることが理解されるべきである。多くの他の実施形態が、上記の説明を総説する際に、当業者に理解される。本発明の範囲は、従って、権利を与えられる特許請求の範囲の等価物の完全な範囲と共に、添付のこのような特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。

図１は、本発明に従う系のブロック図である。 図２は、本発明の系の外観の１つの実施形態の簡素化した透視図である。 図３は、本発明の系の別の実施形態の詳細な概略図である。 図４は、本発明の系のさらに別の実施形態の概略図である。 図５Ａ〜Ｇは、プラスチックからチップを製造するために使用される工程を示す。図５Ａは、ポジティブフォトレジスト材料でシリコンウェハをコーティングする工程を示す。図５Ｂは、レジストコーティングシリコンウエハを、光材料を通してＵＶ光に曝露する工程を示す。図５Ｃは、フォトレジスト材料を現像する工程を示す。図５Ｄは、シリコンをエッチングする工程を示す。図５Ｅは、フォトレジスト材料を剥ぎ取り、そして金を蒸着する工程を示す。図５Ｆは、ニッケルを電気メッキする工程を示す。図５Ｇは、シリコンを除去し、そしてポリマーをエンボス加工する工程を示す。 図６は、本発明の系のさらに別の実施形態の概略図である。 図７は、チップに関連するコンピューターを詳述する概略図である。 図８は、ハウジング内に配置された１つより多いチップを示す概略図である。 図９は、異なるハウジングからのチップのセットを含む系の概略図である。 図１０は、チップのさらに別の実施形態の概略図である。 図１１は、系の等尺度の部分分解図である。 図１２は、図１１に示される系に関連するチップを製造するための工程の等尺度の図である。 図１３は、図１１に示される系に関連するポンプの単一の凹型エラストマー部分の等尺度の図である。 図１４は、ポンプの複数の凹型エラストマー部分の等尺度の図である。 図１５は、４コンパートメントチップの概略図である。 図１６は、テガフール用量応答である。チップに、ＨｅｐＧ２−Ｃ３Ａ細胞（肝臓コンパートメント）およびＨＣＴ−１１６結腸癌細胞（標的組織コンパートメント）を接種した。このチップを、示される濃度のテガフールで２４時間処理した。第１のグラフ（図１６Ａ）は、チップ上での再循環の２４時間後のパーセント死亡細胞 対 テガフールまたは５−ＦＵ濃度のプロットである。第２のグラフ（図１６Ｂ）は、４８時間の曝露を用いたＨＣＴ１１６細胞による、従来のインビトロ細胞培養アッセイを用いた同様の用量応答である。ＨＣＴ−１１６細胞を、ポリリジン処理ガラスのカバーガラス上に接種し、そして示される濃度のテガフールまたは５−ＦＵのいずれかに曝した。４８時間のインキュベーション後、カバーガラスを上記のように処理し、そして細胞死のパーセントを決定した。 図１７Ａは、「第１世代」の３コンパートメントデバイスを示す。図１７Ｂは、このデバイスの断面図を示す。 図１８Ａは、「第２世代」のデバイスを示す。図１８Ｂは、チャンバ中の５μｍの高さの隆起を示す。図１８Ｃは、チャンバ中の２０μｍの高さの柱を示す。 図１９は、「第３世代」のデバイスを示す。 図２０は、５コンパートメントＰＢＰＫモデルＣＣＡについての流れ図である。 図２１は、肺、標的組織、および他の組織についてのコンパートメントを含むヒトバイオチッププロトタイプを示す。このコンパートメントおよびチャネルの寸法は、以下の通りである： 入口：１ｍｍ×１ｍｍ 肝臓：幅３．２ｍｍ×長さ４ｍｍ 標的組織：幅２ｍｍ×長さ２ｍｍ 他の組織：幅３４０μμｍ×長さ１１０ｍｍ 出口：１ｍｍ×１ｍｍ 肝臓をＹ接続に接続するチャネル：幅４４０μμｍ Ｙ接続から標的組織へのチャネル：幅１００μμｍ。 図２２は、微小規模チップ系の概略図である。 図２３は、Ｈｅｐ Ｇ２、Ｈｅｐ Ｇ２／Ｃ３Ａ、およびヒト肝臓の基底ＣＹＰ発現レベルを示す。３つの別個の決定からの標準偏差を示す。 図２４Ａは、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、およびＲＰＭＩにおけるＨｅｐ Ｇ２／Ｃ３Ａの増殖曲線を示す。図２４Ｂは、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、およびＲＰＭＩにおけるＨＣＴ１１６の増殖曲線を示す。３つの別個の決定からの標準偏差を示す。 図２５は、異なる増殖培地条件下でのＨｅｐ Ｇ２／Ｃ３ＡのＣＹＰアイソフォームの発現のＲＴ−ＰＣＲ決定を示す。 図２６は、異なる基材上でのＨｅｐ Ｇ２／Ｃ３ＡのＣＹＰアイソフォームの発現のＲＴ−ＰＣＲ決定を示す。 図２７は、ヒトバイオチッププロトタイプを示す。 図２８Ａは、本発明の１つの実施形態に従う微小規模培養デバイスを制御するための系を示すブロック図である。図２８Ｂは、本発明の別の実施形態に従う微小規模培養デバイスを制御するための系を示すブロック図である。 図２９は、本発明の１つの実施形態に従う微小規模培養デバイスを動的に制御するためのコンピューター化された方法を示す流れ図である。 図３０は、本発明の１つの実施形態に従う微小規模培養デバイスを制御するためのコンピューターを示すブロック図である。

Claims (40)

1. 細胞物質を含むためのチャンバを備える培養デバイスであって、該チャンバは、０．１μｍと５００μｍとの間の少なくとも１つの内部断面寸法を有し、該チャンバは、インビボで見いだされる少なくとも１つの薬物動態学的パラメーターをモデル化する少なくとも１つの薬物動態学的パラメーター値をインビトロで提供する条件下で、該細胞物質を維持し、該チャンバは、流体の流れのための入り口および出口を備える、培養デバイス。
2. 請求項１に記載の培養デバイスであって、該デバイスは、細胞物質を含む少なくとも１つの第２のチャンバをさらに備え、該第２チャンバは、０．１μｍと５００μｍとの間の少なくとも１つの内部断面寸法を有し、インビトロで少なくとも１つの薬物動態学的パラメーター値を提供する条件下で、細胞物質を維持し、ここで、該第２のチャンバは、流体の流れのための、入口および出口を備える、培養デバイス。
3. 前記チャンバに接続する少なくとも１つの微小流体チャネルをさらに含む、請求項１に記載の培養デバイス。
4. 前記第１のチャンバおよび第２のチャンバを相互接続する少なくとも１つの微小流体チャネルをさらに含む、請求項２に記載の培養デバイス。
5. 前記チャンバの接続の幾何学は、少なくとも１つの薬物動態学的パラメーター値を提供する、請求項２に記載の培養デバイス。
6. 前記チャンバは、チャネルまたはチューブである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養デバイス。
7. 少なくとも１つのチャンバまたは前記１つ以上のチャンバを相互接続するチャネルを通る前記流体の流れは、前記少なくとも１つの薬物動態学的パラメーター値を提供する、請求項２に記載の培養デバイス。
8. 前記少なくとも１つのチャンバもしくはチャネルの幾何学または該チャンバと１つ以上のチャンバを相互接続するチャネルの相互作用の幾何学は、数学モデルに基づく、請求項２に記載の培養デバイス。
9. 前記流体流れの特徴は、数学モデルに基づく、請求項１〜８のいずれか１項に記載の培養デバイス。
10. インビトロデスクなくとも１つの薬物動態学的パラメーター値を提供する条件下で、細胞物質の同じ型または１つ以上のさらなる型を含む１つ以上のさらなるチャンバをさらに備える、請求項１〜９のいずれか１項に記載の培養デバイス。
11. 前記流体または前記細胞物質からのシグナルを得るための少なくとも１つのセンサをさらに備える、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の培養デバイスであって、前記少なくとも１つのセンサは、バイオセンサである、培養デバイス。
12. 前記少なくとも１つのセンサが、酸素、二酸化炭素、および流体のｐＨからなる群のうちの少なくとも１つをモニターするか、または細胞死、細胞増殖、分化、免疫応答、またえは代謝もしくはシグナル伝達系路における混乱を測定する、請求項１１に記載の培養デバイス。
13. 前記少なくとも１つのセンサはデバイスと一体化され、前記細胞物質の生理学的状態のリアルタイム読み取りを提供する、請求項１１または１２のいずれかに記載の培養デバイス。
14. 前記流体をさらに含み、該流体は、前記少なくとも１つのチャンバを通って流れるか、または何度も再循環される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の培養デバイス。
15. 前記少なくとも１つの薬物動態学的パラメーターは、相対的な組織の大きさの比、組織 対 血液の体積比、薬物滞留時間、細胞間の相互作用の測定値、液体滞留時間、液体 対細胞の比、細胞による代謝、剪断応力、流速、幾何学、および培養デバイス中の細胞数からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の培養デバイス。
16. 前記デバイスに一体化されたポンプおよび該デバイスの外部にあるポンプからなる群の少なくとも１つから選択されるポンプ機構をさらに備える、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の培養デバイス。
17. 前記細胞物質は、健康組織、病変組織、組織生検の一部、組織の一部、動脈の一部、静脈の一部、胃腸管の一部、食道の一部、結腸の一部、器官の一部、心臓の一部、脳の一部、腎臓の一部、肺の一部、筋肉の一部、真核生物細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、原核生物細胞、初代細胞、腫瘍細胞、幹細胞、遺伝学的に改変された細胞、形質転換された細胞、不死化された細胞からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の培養デバイス。
18. 前記チャンバのうちの少なくとも１つは、該少なくとも１つのチャンバを循環しているかまたは該少なくとも１つのチャンバの一部に接着しているかのいずれかである細胞物質を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の培養デバイス。
19. 前記チャンバは、ポリマー、ガラスおよびシリコンの群のうちの１つからなる物質から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の培養デバイス。
20. コントローラをさらに備え、該コントローラは流体流を制御して、少なくとも１つの薬物動態学的パラメーター値を提供する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の培養デバイス。
21. 前記コントローラは、前記培養デバイスと電気的に連結されているかまたは一体化されている、請求項２０に記載の培養デバイス。
22. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の培養デバイスであって、該デバイスは、以下：
    ポンプ；
    肝臓の機能と関連する、インビトロで少なくとも１つの薬物動態学的パラメーター値を提供する条件下で細胞物質を維持する肝臓チャンバ、ゆっくりと灌流されるチャンバ、急速に灌流されるチャンバ、および脂肪の機能と関連する、インビトロで少なくとも１つの薬物動態学的パラメーター値を提供するチャンバからなる群より選択される少なくとも２つのチャンバ；ならびに
    ポンプ、および連続してまたは平行に該少なくとも２つのチャンバと連結する、複数の微小流体チャネル、
    を備える、培養デバイス。
23. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の培養デバイスであって、培養デバイスのアレイをさらに備え、該デバイスは、互いから離れて作動するかまたは互いに並行して作動するかのいずれかであるか、あるいは流体的に連結された連続様式で作動し、第１のデバイスからの流体出口は、１以上の第２のデバイスに対して、少なくとも１つの流体入り口に直接的にまたは間接的に接続される、培養デバイス。
24. 前記デバイスは、生物学的関門を模倣する連結され、該生物学的関門は、胃腸関門、血液胆嚢関門または血液脳関門である、請求項２３に記載のデバイス。
25. 前記培養デバイスは、電子回路をさらに備えるチップ上に形成される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の培養デバイス。
26. 前記コントローラは、前記培養デバイス中の流体の循環を制御するポンプ、該培養デバイスの温度もしくは該培養デバイス中を循環する流体を制御する加熱要素、光源、該培養デバイス内の細胞物質からの蛍光発光を検出する光検出器、およびコンピューターからなる群のうちの少なくとも１つをさらに含み、該コンピューターは、メモリ、１以上のセンサを有する該培養デバイスに対するインターフェースを含む入力／出力インターフェース、およびセンサからのデータを記録および分析するコンピューターソフトウェアをさらに含む、請求項２０に記載の培養デバイス。
27. 前記流体は、培養培地、生物学的流体、血液、血清および血漿からなる群のうちの少なくとも１つより選択される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の培養デバイス。
28. 前記コンピューターは、前記データに応じて、前記培養デバイスの１以上の薬物動態学的パラメーター値を変更する、請求項２６に記載の培養デバイス。
29. 培養デバイスを形成する方法であって、該方法は、細胞物質を含むための少なくとも１つのチャンバを形成する工程を包含し、ここで該チャンバは、０．１μｍと５００μｍとの間の少なくとも１つの内部断面寸法を有し、該チャンバは、インビボで見いだされる少なくとも１つの薬物動態学的パラメーターをモデル化する少なくとも１つの薬物動態学的パラメーター値をインビトロで提供する条件下で、該細胞物質を維持し、該チャンバは、流体の流れのための入り口および出口を備える、方法。
30. １つ以上のチャンバに接続する少なくとも１つの微小流体チャネルを形成する工程をさらに包含し、ここで該微小流体チャネルは、０．１μｍと５００μｍとの間の少なくとも１つの内部断面寸法を有する、請求項２９に記載の培養デバイスを形成する方法。
31. 前記チャンバのうちの少なくとも１つの幾何学または該チャンバと前記チャネルの相互接続の幾何学は、前記少なくとも１つの薬物動態学的パラメーター値を提供する様に形成される、請求項２９に記載の方法。
32. 前記チャンバのうちの少なくとも１つの幾何学または該チャンバのうちの少なくとも１つと前記チャネルのうちの少なくとも１つとの相互接続の幾何学は、数学モデルに基づいて形成される、請求項２９に記載の方法。
33. 前記少なくとも１つのチャンバまたは該チャンバを相互接続する前記少なくとも１つのチャネルを通る流体の流れは、数学モデルに基づく、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記チャンバは、微細加工、微細加工されたマスターからの微細加工、エンボス加工、射出成形、重合またはスタンピングによって形成される、請求項２９に記載の方法。
35. 請求項２９に記載の方法であって、該方法はさらに以下の工程：
    前記細胞物質と入力変数とを接触させる工程；および
    少なくとも１つの出力パラメーターをモニターする工程、
    を包含する、方法。
36. 前記少なくとも１つの出力パラメーターをモニターする工程は、前記デバイスにおける少なくとも１つのセンサからの情報を得る工程を包含する、請求項３５に記載の方法。
37. 請求項３５または３６のいずれか１項に記載の方法であって、前記入力変数は、有機化合物、無機化合物、生物学的製品、複合体サンプル、製薬、環境性サンプル、栄養性サンプル、消費者製品、ウイルス、リポソーム、ナノ粒子、生分解性ポリマー、放射性標識粒子または放射性標識毒素、生体分子、毒素結合体化粒子および安定化剤からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、方法。
38. 前記培養デバイスを動力学的に制御するためのコンピューター化方法をさらに包含する請求項２９に記載の方法であって、該コンピューター化方法は、さらに以下：
    １つ以上のセンサからのデータを分析して、該培養デバイスの１つ以上のチャンバまたはチャネル内の生理学的事象を測定する工程；
    該培養デバイスのチャンバ内の流体の流体流速を調節する工程；
    該流体の温度を検出および調節する工程；
    該培養デバイスのチャンバ内の生物学的反応物または毒物学的反応物を検出する工程；および
    該培養デバイスの１つ以上の薬物動態学的パラメーターを変化させる工程、
    を包含する、方法。
39. コンピューター実行可能な指示を有して、方法を実行するコンピューター読み取り可能な媒体をさらに含む、請求項２９に記載の方法であって、該方法は、以下：
    複数のセンサからのデータを分析して、前記培養デバイスの複数のチャンバ内の生理学的事象を測定する工程；
    該培養デバイスのチャンバ内の流体の流体流速を調節する工程；
    該流体の温度を検出および調節する工程；
    該培養デバイスのチャンバ内の生物学的反応物または毒物学的反応物を検出する工程；および
    該培養デバイスの１つ以上の薬物動態学的パラメーターを変化させる工程、
    を包含する、方法。
40. 前記方法は、前記培養デバイス内のチャンバ幾何学を最適化する工程をさらに包含し、ここで該最適化する工程は、チャンバの数を選択する工程、適切な組織サイズ比もしくは器官サイズ比を提供するチャンバ幾何学を選択する工程、適切な液体滞在時間を提供する最適な流体流速を選択する工程、および該培養デバイス内の剪断応力を計算する工程からなる群のうちの少なくとも１つを包含する、請求項３８または３９のいずれか１項に記載の方法。

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