ES2287351T3 - Dispositivos y metodos para sistemas de cultivos de celulas basados en farmacocinetica. - Google Patents

Abstract

Un dispositivo de cultivo que comprende una cámara para contener células, en el que la cámara tiene, al menos, una dimensión transversal interna de entre 0, 1 µm y 500 µm, y en el que la cámara mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro que es comparable a, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vivo, y en el que la cámara comprende una entrada y una salida para el flujo del líquido.

Description

Dispositivos y métodos para sistemas de cultivos de células basados en farmacocinética.

El campo de la invención es dispositivos de cultivo de células y métodos de uso.

La farmacocinética es el estudio del destino de los fármacos y otros compuestos biológicamente activos desde el momento en el que se introducen en el cuerpo hasta que se eliminan. Por ejemplo, la secuencia de acontecimientos para un fármaco oral incluye la absorción a través de las distintas superficies mucosas, la distribución a través del torrente circulatorio a diferentes tejidos, la biotransformación en el hígado y otros tejidos, la acción en el sitio de destino, y la eliminación del fármaco o los metabolitos por la orina o la bilis. La farmacocinética proporciona un medio racional para acercarse al metabolismo de un compuesto en un sistema biológico. Para revisiones de las ecuaciones y los modelos farmacocinéticos, véase, por ejemplo, Poulin y Theil (2000) J. Pharm. Sci. 89 (1): 16-35; Slob et al., (1997) Crit. Rev. Toxicol. 27 (3): 261-72; Haddad et al. (1996) Toxicol Lett. 85 (2): 113-26; Hoang (1995) Toxicol. Lett. 79 (1-3) 99-106; Knaak et al. (1995) Toxicol. Lett. 79 (1-3) 87-98; y Ball y Schwartz (1994) Comput. Biol. Med. 24 (4): 269-76.

Uno de los principales retos a los que se enfrentan los investigadores en los estudios toxicológicos, de seguridad de los productos para el consumidor, medioambientales y nutricionales de los fármacos es la extrapolación a los animales de los datos metabólicos y la evaluación del riesgo a partir de análisis de cultivo de células in vitro. Aunque se pueden bosquejar algunas conclusiones con la aplicación de los principios farmacocinéticos adecuados, todavía existen limitaciones importantes. Una preocupación es que los análisis de detección actuales utilizan células en unas condiciones en las que no funcionan igual que en su ámbito natural. El flujo circulatorio, la interacción con otros tejidos y otros parámetros asociados a una respuesta fisiológica no se encuentran en los formatos estándares de cultivo de tejidos. Por ejemplo, en un sistema a macroescala análogo al cultivo de células (ACC), las células crecen en el fondo de las cámaras. Estos sistemas tienen unas proporciones elevadas no fisiológicas de líquido por célula, y tienen una proporción poco realista de tipos de células (por ejemplo, la proporción de células hepáticas por células del pulmón). En una forma variante del sistema a macroescala ACC, las células crecen sobre perlas microtransportadoras. Estos sistemas se parecen más a las condiciones fisiológicas, pero todavía son deficientes porque no imitan las condiciones fisiológicas con suficiente precisión para los estudios predictivos. Por lo tanto, los datos resultantes de los análisis no se basan en el patrón de la exposición al fármaco o la toxina que se encontraría en un animal.

Dentro de los seres vivos, la concentración, el tiempo y el metabolismo interaccionan para influir en la intensidad y la duración de una respuesta farmacológica o tóxica. Por ejemplo, in vivo, el funcionamiento del hígado afecta fuertemente el metabolismo y la biodisponibilidad del fármaco. La eliminación de un fármaco activo en el hígado se produce mediante la biotransformación y la excreción. Las reacciones de biotransformación incluyen reacciones catalizadas por las enzimas citocromo P450, que transforman muchos fármacos químicamente distintos. Una segunda fase de biotransformación puede añadir un grupo hidrófilo, como glutatión, ácido glucurónico o sulfato, para aumentar la solubilidad en el agua y la velocidad de eliminación a través de los riñones.

Mientras que la biotransformación puede ser beneficiosa, también puede tener consecuencias indeseables. La toxicidad es el resultado de una interacción compleja entre un compuesto y el organismo. Durante el procedimiento de biotransformación, el metabolito resultante puede ser más tóxico que el compuesto del que deriva. Los análisis con una sola célula utilizados en muchos casos para detectar la toxicidad pierden estos complejos efectos intercelulares y entre tejidos.

Por consiguiente, la predicción exacta del grado de respuesta de los humanos a los posibles fármacos es difícil, a menudo no fiable e invariablemente cara. Los métodos tradicionales utilizan sustitutos para predecir la respuesta de los humanos: normalmente, tanto análisis in vitro con cultivos celulares estáticos y homogéneos como estudios con animales in vivo. Los análisis con cultivos de células in vitro tienen un valor limitado porque no imitan con exactitud el complejo entorno al que está sometido un fármaco candidato dentro de un humano y, por lo tanto, no pueden predecir de manera exacta el riesgo para los humanos. De manera similar, mientras que en los animales in vivo las pruebas pueden explicar estos complejos efectos intercelulares y entre tejidos que no se observan en los análisis in vitro con células, los estudios con animales in vivo son muy caros, muy trabajosos, muy largos y, a menudo, los resultados son de dudosa relevancia cuando se correlacionan con el riesgo humano.

La patente de los EE. UU. n.º 5.612.188 expedida a Shuler et al. describe un sistema de cultivo de células multicompartimentado. Este sistema de cultivo utiliza componentes grandes, como cámaras de cultivo, sensores y bombas, que requieren la utilización de grandes cantidades de medios de cultivo, células y de compuestos a probar. Este sistema es muy caro y requiere una gran cantidad de espacio para hacerlo operativo. Como este sistema es a gran escala, los parámetros fisiológicos varían considerablemente de los encontrados en una situación in vivo. Es imposible generar de manera exacta unas condiciones realistas fisiológicamente a gran escala.

En "In vitro toxicology in the hepatocyte bioreactors-extracellular acidification rate (EAR) in a target cell line indicates hepato-activated transformation of substrates" de Koebe H. G. et al., en Toxicology, vol. 154, n.º 1-3, páginas 31-44, se describe una cámara de cultivo celular de 50 ml con perfusión y recirculación en la que se cultivan hepatocitos primarios de cerdos. La cámara está acoplada a tres cámaras de perfusión de un sistema de microfisiómetro.

La patente internacional WO 9311498SA describe un dispositivo con muchas cámaras de cultivo interconectadas, que cultiva diferentes tipos de células, con corrientes de líquido entre las cámaras controladas por una bomba o bombas para ajustar las velocidades de flujo a las velocidades de flujo fisiológicas del modelo.

El desarrollo de los análisis de detección a microescala y los dispositivos que pueden proporcionar una predicción mejor, más rápida y más eficaz de la toxicidad in vivo y de la actuación clínica del fármaco es de gran interés en numerosos ámbitos y se trata en la presente invención. Tal dispositivo a microescala produciría con exactitud parámetros realistas fisiológicamente y modelaría con más precisión el sistema deseado in vivo a comprobar.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo de cultivo que comprende una cámara que contiene células en el que la cámara tiene, al menos, una dimensión transversal interna entre 0,1 \mum y 500 \mum, y en el que la cámara mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor farmacocinético in vitro que es comparable, al menos, a un valor de parámetro farmacocinético encontrado in vivo, y en el que la cámara comprende una entrada y una salida para el flujo del líquido.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para formar un dispositivo de cultivo, comprendiendo el método la formación de una cámara para contener células en el que la cámara tiene, al menos, una dimensión transversal interna entre 0,1 \mu y 500 \mum, y en el que la cámara mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro que es comparable, al menos, a un valor de parámetro farmacocinético in vivo, y en el que la cámara comprende una entrada y una salida para el flujo del líquido.

Los dispositivos de la invención permiten que las células se mantengan in vitro, en condiciones cuyos valores de parámetros farmacocinéticos son similares a los encontrados in vivo. Los parámetros farmacocinéticos de interés incluyen las interacciones entre las células, el tiempo de permanencia del líquido, las proporciones de líquido por célula, el tamaño relativo de los órganos, la metabolización por las células, la tensión de corte y similares. Al proporcionar un sistema de cultivo basado en la farmacocinética que imita el estado natural de las células, se mejora el valor predictivo y la relevancia in vivo de los análisis de detección y de toxicidad.

En realizaciones preferidas, el dispositivo de cultivo a microescala comprende una red fluidica de canales separados en cámaras individuales pero interconectadas. La geometría específica de las cámaras está diseñada para proporcionar parámetros de interacciones celulares, de flujo de líquidos y de permanencia de los líquidos que se correlacionan con los encontrados para las células, tejidos u órganos correspondientes in vivo. La fluidica está diseñada para representar de manera precisa los elementos primarios de los sistemas circulatorios o linfáticos. En una realización, estos componentes se integran en el formato de chip. El diseño y la validación de estas geometrías está basada en un modelo farmacocinético basado en la fisiología (FCBF), un modelo matemático que representa el cuerpo a modo de compartimentos interconectados que representan tejidos diferentes.

Se puede inocular el dispositivo con las células adecuadas para cada cámara de cultivo. Por ejemplo, una cámara diseñada para proporcionar parámetros farmacocinéticos del hígado se inocula con hepatocitos, y puede estar en conexión a través de líquido con los adipocitos inoculados en una cámara diseñada para proporcionar la farmacocinética del tejido graso. El resultado es un sistema de cultivo de células basado en la farmacocinética que representa con exactitud, por ejemplo, la proporción del tamaño de los tejidos, la proporción de tejido por volemia y el tiempo de permanencia del fármaco del animal que se está modelando.

En una realización, un sistema incluye un primer dispositivo de cultivo a microescala y un instrumento de control. El primer dispositivo de cultivo a microescala tiene una serie de cámaras a microescala con geometrías que simulan numerosas interacciones in vivo con un medio de cultivo, en el que cada cámara incluye una entrada y una salida para que fluya el medio de cultivo, y un canal de microfluidica que interconecta las cámaras. El instrumento de control se acopla al primer dispositivo de cultivo a microescala, e incluye un ordenador para adquirir datos del primer dispositivo de cultivo a microescala y los parámetros farmacocinéticos de control del mismo.

En otra realización, un ordenador incluye un microprocesador, una memoria general, un elemento de almacenamiento no volátil, una interfaz de entrada/salida que incluye una interfaz para un dispositivo de cultivo a microescala que tiene uno o más sensores, y un programa informático. El programa informático es ejecutable en el microprocesador para analizar los datos de los sensores para medir acontecimientos fisiológicos en una serie de cámaras del dispositivo de cultivo a microescala, regular las velocidad de flujo de los líquidos de un medio de cultivo en las cámaras del dispositivo de cultivo a microescala, detectar reacciones biológicas o toxicológicas en las cámaras del dispositivo de cultivo a microescala y, en cuanto se produce la detección, cambiar uno o más parámetros farmacocinéticos del dispositivo de cultivo a microescala.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, las formas singulares "un" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo. Por ejemplo, "un compuesto" se refiere a uno o más de tales compuestos, mientras que "la célula" incluye una célula determinada así como otros miembros de la familia y sus equivalentes, como saben los expertos en la técnica.

A continuación, se describirán las realizaciones preferidas a modo de ejemplo solamente, y con referencia a los dibujos acompañantes en los que:

La figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema de acuerdo con la presente invención.

La figura 2 es una vista en perspectiva y simplificada de una realización del exterior del sistema de la presente invención.

La figura 3 es una vista esquemática detallada de otra realización del sistema de la presente invención.

La figura 4 es una vista esquemática de otra realización más del sistema de la presente invención.

Las figuras 5A hasta 5G muestran las etapas utilizadas para fabricar un chip de plástico. La figura 5A muestra el recubrimiento de un zócalo de silicio con un material fotoendurecible positivo. La figura 5B muestra la exposición del zócalo de silicio recubierto de sustancia fotoendurecible a los rayos UV a través de un fotomaterial. La figura 5C muestra el revelado del material fotoendurecible. La figura 5D muestra el silicio grabado. La figura 5E muestra la retirada del material fotoendurecible y la evaporación de oro. La figura 5F muestra la galvanoplastia del níquel. La figura 5G muestra la retirada del silicio y el realce del polímero.

La figura 6 es una vista esquemática de otra realización más del sistema de la presente invención.

La figura 7 es un esquema que detalla un ordenador asociado a los chips.

La figura 8 es un esquema que muestra más de un chip alojado dentro de una carcasa.

La figura 9 es un esquema de un sistema que incluye conjuntos de chips de diferentes carcasas.

La figura 10 es un esquema de otra realización más de un chip.

La figura 11 es una vista parcialmente isométrica de los componentes de un sistema.

La figura 12 es una vista isométrica de las etapas para fabricar el chip asociado al sistema mostrado en la figura 11.

La figura 13 es una vista isométrica de una parte elastomérica con una sola concavidad de una bomba asociada al sistema mostrado en la figura 11.

La figura 14 es una vista isométrica de una parte de una bomba elastomérica con varias concavidades.

La figura 15 es un diagrama esquemático de un chip de cuatro compartimentos.

Figura 16. Respuesta a la dosis del Tegafur. Se inocularon los chips con células HepG2-C3A en el compartimento para hígado y células del cáncer de colon HCT-116 en el compartimento de los tejidos de destino. Se trataron los chips con las concentraciones indicadas de Tegafur durante 24 horas. El primer gráfico (figura 16A) es un gráfico del porcentaje de células muertas frente a la concentración de Tegafur o de 5-FU después de 24 horas de recirculación en el chip. El segundo gráfico (figura 16B) es una respuesta a dosis similares utilizando un análisis de cultivo de células in vitro tradicional con células HCT-116 con una exposición de 48 horas. Se inocularon las células HCT-116 sobre cubreobjetos de vidrio tratados con poli-lisina y se expusieron al Tegafur o bien al 5-FU a las concentraciones indicadas. Después de una incubación de 48 horas, se trataron los cubreobjetos de vidrio tal y como se describió más arriba y se determinó el porcentaje de muerte celular.

La figura 17A describe un dispositivo de tres compartimentos de "primera generación". La figura 17B muestra una vista transversal del dispositivo.

La figura 18A describe un dispositivo de "segunda generación". La figura 18B describe resaltes de 5 \mum de alto en una cámara y la figura 18C muestra pilares de 20 \mum de alto en una cámara.

La figura 19 describe un dispositivo de "tercera generación".

La figura 20 es un diagrama de flujo de un modelo ACC FCBF de cinco compartimentos.

La figura 21 describe un prototipo de biochip humano que contiene compartimentos para pulmón, tejidos de destino y otros tejidos. Las dimensiones de los compartimentos y los canales son las siguientes:

Entrada: 1 mm x 1 mm

Hígado: 3,2 mm de ancho x 4 mm de largo

Tejidos de destino: 340 \mu\mum de ancho x 110 mm de largo

Salida: 1 mm x 1 mm

Canal que conecta el hígado con la conexión en Y: 440 \mu\mum de ancho

Canal desde la conexión en Y hasta el tejido de destino: 100 \mu\mum de ancho

La figura 22 describe un dibujo esquemático de un sistema de chip a microescala.

La figura 23 describe los niveles de expresión basales de CYP para HepG2, HepG2/C3A y el hígado humano. El error estándar se calcula con 3 determinaciones independientes.

La figura 24A describe las curvas de crecimiento de HepG2/C3A en EMEM, DMEM, McCoy y RPMI. La figura 24B describe las curvas de crecimiento de HCT-116 en EMEM, DMEM, McCoy y RPMI. El error estándar se calcula con 3 determinaciones independientes.

La figura 25 describe la determinación por RT-PCR de la expresión de las isoformas de CYP en HepG2/C3A en diferentes medios de crecimiento.

La figura 26 describe la determinación por RT-PCR de la expresión de las isoformas de CYP en HepG2/C3A cultivado en diferentes sustratos.

La figura 27 describe un prototipo de biochip humano.

La figura 28A es una vista de diagrama de bloques que ilustra un sistema para controlar un dispositivo de cultivos a microescala, de acuerdo con una realización de la presente invención. La figura 28B es una vista de diagrama de bloques que ilustra un sistema para controlar un dispositivo de cultivos a microescala, de acuerdo con otra realización de la presente invención.

La figura 29 es una vista de diagrama de flujo que ilustra un método informatizado para controlar dinámicamente un dispositivo de cultivos a microescala, de acuerdo con una realización de la presente invención.

La figura 30 es una vista de diagrama de bloques que ilustra un ordenador para controlar un dispositivo de cultivos a microescala, de acuerdo con una realización de la presente invención.

Los presentes inventores han desarrollado un sistema análogo al cultivo de células (ACC) a microescala. Tal sistema ACC a microescala tiene muchas ventajas sobre los anteriores sistemas a macroescala. Los sistemas a microescala utilizan cantidades más pequeñas de reactivos, menos células (lo que permite utilizar células primarias auténticas en vez de células cultivadas), son fisiológicamente más realistas (por ejemplo, tiempos de permanencia, proporciones de los órganos, las tensiones de corte), tienen un menor coste por dispositivo y tienen un tamaño más pequeño (se dispone de numerosas pruebas y análisis estadísticos). Además, se pueden incorporar varios biosensores sobre el mismo chip.

En términos más sencillos, el chip de la presente invención proporciona un sustituto in vitro preciso de un animal o humano entero. Para llevarlo a cabo, se realizó un diseño inicial utilizando un modelo farmacocinético basado en la fisiología (FCBF): un modelo matemático que representa el cuerpo como compartimentos interconectados específicos para un órgano determinado. A partir del modelo FCBF y de los datos empíricos publicados, un programa prolongado y amplio de desarrollo dio lugar a un dispositivo a microescala que imita de manera precisa la proporción del tamaño de los tejidos conocido, la proporción de tejido por volemia, el tiempo de permanencia del fármaco y otros parámetros fisiológicamente importantes de un animal o humano entero. En esencia, la tecnología del chip de la presente invención es un modelo a microescala de un animal o humano entero (\sim1/100.000 para el humano).

En funcionamiento, el dispositivo replica un sistema multiorgánico con recirculación al separar las células vivas en distintos compartimentos de "órgano" interconectados (véase, por ejemplo, la figura 15). Se diseñó la fluidica de tal manera que se imitan con exactitud los elementos primarios del aparato circulatorio y las interacciones de los sistemas de órganos. El compartimento de cada órgano contiene un determinado tipo de célula seleccionado o construido cuidadosamente para imitar la(s) función(ones) primaria(s) del correspondiente órgano entero (por ejemplo, el metabolismo xenobiótico del hígado). El tipo de célula puede ser adherente o no adherente y se puede obtener de estirpes de cultivos estándares de células o de tejido primario. Las células humanas se utilizan para imitar a un humano o se utilizan células de otras especies cuando sea conveniente.

Los compartimentos para los órganos se conectan mediante un medio de cultivo en recirculación que actúa como un "sustituto de la sangre". Los fármacos de prueba en el medio se distribuyen e interaccionan con las células en los compartimentos de los órganos de forma equivalente a como lo harían en el cuerpo humano o en el animal entero. Los efectos de estos compuestos y/o sus metabolitos en los diferentes tipos de células se detectan al medir o monitorizar acontecimientos fisiológicos clave como la muerte celular, la proliferación celular, la diferenciación, la respuesta inmunitaria, o las alteraciones en el metabolismo o las vías de transducción de señales. Además, se pueden determinar los datos farmacocinéticos recogiendo y analizando los metabolitos de los fármacos en alícuotas del medio de cultivo.

El dispositivo de chip a microescala de la presente invención ofrece tanto la ventaja del coste como del elevado rendimiento de los análisis tradicionales de cultivo de células, y también el gran contenido de información de los modelos de animales enteros. Sin embargo, a diferencia de las pruebas con animales enteros, el chip es barato y en buena parte desechable. El volumen de líquido pequeño (\sim5 \mul) del dispositivo proporciona la elevada sensibilidad y el elevado rendimiento característico de los dispositivos de microfluidica. Además, la lectura del dispositivo es muy flexible e independiente del análisis: se puede utilizar casi cualquier tipo de célula o análisis sin modificarlo. Se encuentran disponibles muchos análisis biológicos basados en la interrogación óptica y la lectura (por ejemplo, fluorescencia, luminiscencia), lo que hace que sea factible la monitorización en tiempo real. Alternativamente, se pueden utilizar de forma directa los análisis estándares de anatomopatología, bioquímicos, genómicos o proteómicos, ya que se puede diseñar el sistema para que sea totalmente compatible con el cubreobjetos de vidrio tradicional (22 mm x 22 mm) o el formato de 96 pocillos. Además, se pueden utilizar células modificadas genéticamente para aplicaciones especializadas para el usuario final. Además, se pueden utilizar chips 3D que abarquen compartimentos y módulos adicionales para analizar el tubo digestivo o la absorción a través de la barrera hematoencefálica.

A diferencia de los análisis in vitro tradicionales, el chip de la presente invención imita mejor la compleja biología multiorgánica (hígado, pulmón, tejido adiposo, aparato circulatorio, etc.) de todo el organismo. Los fármacos candidatos se exponen a un medio fisiológico animal o humano más realista, lo que proporciona un contenido informativo mayor y más exacto (por ejemplo, absorción, distribución, bioacumulación, metabolismo, excreción, eficacia y toxicidad) que los análisis in vitro típicos. Estos beneficios influyen directamente en las predicciones de seguridad y eficacia de los nuevos fármacos y, en particular, a su priorización antes de entrar en estudios clínicos o preclínicos caros y lentos. Esta priorización aumenta el rendimiento total del desarrollo del fármaco, reduce el número de animales necesarios para la detección toxicológica, reduce los costes de los estudios preclínicos y aumenta la eficacia de los estudios clínicos al permitir la evaluación rápida y directa de la posible toxicidad o la ausencia de eficacia antes de entrar en estos estudios.

Éstos muestran algunas de las ventajas de la tecnología de chips de la presente invención. En resumen, la adquisición de los datos es rápida cuando se compara con los análisis tradicionales con cultivos de células in vitro, los estudios con animales o los estudios clínicos. Los datos también son robustos, lo que proporciona un contenido muy predictivo que no se obtiene con los análisis in vitro tradicionales. La plataforma del chip se diseña de tal manera que sea totalmente compatible con los análisis actuales, tanto en cubreobjetos de vidrio estándares como el formato de 96 pocillos. El propio dispositivo es configurable para cualquier especie animal o combinación de varios compartimentos con órganos. Los chips individuales son rentables a pesar de ser deseables. Por otra parte, el bajo volumen del dispositivo disminuye además los costes del reactivo a la hora de detectar los posibles compuestos.

A diferencia de las tecnologías disponibles actualmente, el sistema del chip de la presente memoria aumenta enormemente las tasas de éxito no sólo en la fase clínica sino también al reducir el número de compuestos para los que se necesita llevar a cabo las pruebas preclínicas. Por consiguiente, una compañía farmacéutica puede 1) determinar qué fármacos candidatos pueden ser tóxicos para los humanos en el procedimiento de desarrollo, 2) seleccionar mejor las especies animales que predicen mejor la respuesta humana y 3) determinar qué fármaco candidato puede ser eficaz. Así, el chip de la presente invención aumenta enormemente las tasas de éxito y disminuye el tiempo empleado en el desarrollo de los fármacos de interés comercial.

Dispositivo de cultivos a microescala basados en la farmacocinética

Se proporcionan dispositivos, cultivos de células in vitro y métodos para un dispositivo ACC. Los métodos y los dispositivos de esta memoria proporcionan unos medios por los cuales se mantienen las células in vitro en un medio fisiológicamente representativo, de tal modo que se mejora el valor predictivo y la relevancia in vivo de la detección y los análisis de toxicidad. Un dispositivo de cultivo farmacocinético a microescala de la presente invención se inocula con las células adecuadas en cada cámara de cultivo, cuyo sistema de cultivo se puede utilizar luego para la detección de compuestos, análisis de toxicidad, modelos para el desarrollo de las células de interés, modelos para la cinética de la infección y similares. Una variable de entrada, que puede ser por ejemplo un compuesto, muestra, secuencia genética, patógeno, célula (tal como una célula madre o célula precursora), se añade a un sistema de cultivo establecido. Se pueden evaluar varios resultados celulares para determinar la respuesta de las células a la variable de entrada, incluido el pH del medio, la concentración de O_{2} y de CO_{2} en el medio, la expresión de las proteínas y de otros marcadores celulares, la viabilidad celular, o la liberación de productos celulares en el medio de cultivo.

El diseño y la geometría del sustrato del cultivo, o dispositivo, aseguran que las condiciones de crecimiento de la invención sean únicas. Cada dispositivo comprende una o más cámaras, que están interconectadas mediante canales fluidicos. Cada cámara puede tener una configuración geométrica distinta de la(s) otra(s) cámara(s) presente(s) en el dispositivo. Por ejemplo, una realización del dispositivo consiste en cámaras que representan el pulmón, el hígado y otros órganos (figura 18A). La cámara del pulmón en esta realización contiene resaltes de 5 \mum de alto para conseguir una proporción de células por volumen de líquido y un tiempo de permanencia del líquido realistas (figura 18B). La cámara del hígado en esta realización contiene pilares de 20 \mum de alto para conseguir una proporción de células por volumen líquido y un tiempo de permanencia del líquido realistas (figura 18C). El dispositivo también comprende puertos de entrada y de salida de modo que el medio de cultivo pueda circular.

En una realización, el dispositivo de cultivo está en formato de chip, a saber, las cámaras y los canales fluidicos se fabrican y se moldean a partir de un modelo ya fabricado, de modo que el dispositivo se forma tanto como una sola unidad o como un sistema modular con una o más cámaras sobre unidades diferentes. Generalmente, el formato de chip se proporciona a pequeña escala, normalmente de no más de unos 10 cm de lado o, incluso, no más de unos 5 cm de lado. Incluso, puede ser de sólo unos 2 cm de lado o más pequeño. En otro ejemplo, se puede alojar el chip en un formato de 96 pocillos en el que los chips individuales son de menos de 0,9 cm x 0,9 cm. Las cámaras y los canales fluidicos tienen, por correspondencia, un tamaño a microescala.

En otra realización, el dispositivo de cultivo está en forma de un dispositivo integrado que consiste en un instrumento de sobremesa que aloja varios chips a microescala fabricados como componentes deseables a base de polímeros de plástico. El instrumento puede consistir en una base con concanvidades para alojar distintos chips de células o, alternativamente, un sólo "chip" con un formato de 96 pocillos estándar (es decir, 96 chips individuales con un formato 8 x 12). La tapa del instrumento, al cerrarse, sella los chips y proporciona las interconexiones de líquido. El instrumento contiene bombas de bajo volumen para hacer recircular el líquido hasta los chips, y válvulas pequeñas de 3 vías con circuitos de inyección por donde introducir los compuestos de prueba o, alternativamente, trae los compuestos directamente de una placa de 96 ó 384 pocillos. Con este instrumento se pueden evaluar la eficacia, la toxicidad y/o la producción de metabolitos de varios compuestos simultáneamente. El instrumento también puede integrar la detección de fluorescencia en el chip para la monitorización de la fisiología en tiempo real utilizando biomarcadores bien caracterizados.

El dispositivo puede incluir un mecanismo para obtener señales de las células y los medios de cultivo. Se pueden monitorizar las señales de varias cámaras y canales en tiempo real. Por ejemplo, los biosensores pueden estar integrados o ser externos al dispositivo, lo que permite una lectura en tiempo real del estado fisiológico de las células en el sistema.

La presente invención proporciona un sistema ideal para la detección de gran rendimiento para identificar la respuesta positiva o negativa a una gama de sustancias tales como, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, preparaciones de vacunas, sustancias químicas citotóxicas, mutágenos, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas, compuestos inhibidores, agentes quimioterápicos y un hospedador de otros compuestos o factores. La sustancia a probar puede ser tanto una sustancia producida de forma natural como sintética, y puede ser orgánica o inorgánica.

Por ejemplo, se puede medir la actividad de un compuesto citotóxico mediante su capacidad para dañar o matar las células en un cultivo. Esto se puede evaluar con facilidad mediante técnicas de tinción de la vida. El efecto de los factores de crecimiento/reguladores se puede evaluar analizando el contenido celular de la matriz, por ejemplo, mediante recuentos de células totales y recuentos diferenciales de células. Esto se puede llevar a cabo utilizando técnicas citológicas y/o histológicas estándares, incluido el uso de técnicas inmunocitoquímicas que emplean anticuerpos que definen los antígenos celulares específicos del tipo. Se puede evaluar el efecto de diferentes fármacos sobre las células normales cultivadas en el dispositivo. Por ejemplo, se pueden evaluar los fármacos que aumentan la formación de eritrocitos sobre cultivos de médula ósea. Se pueden evaluar fármacos que afectan el metabolismo del colesterol, por ejemplo, disminuyendo la producción de colesterol, en un sistema de hígado. Se pueden utilizar cultivos de células tumorales como sistemas de modelo para probar, por ejemplo, la eficacia de los fármacos antitumorales.

El dispositivo de la invención también se puede utilizar como sistemas de modelo para el estudio de situaciones fisiológicas o patológicas. Por ejemplo, en una realización específica de la invención, se puede utilizar un dispositivo como un modelo para la barrera hematoencefálica; tal sistema de modelo se puede utilizar para estudiar la penetración de las sustancias a través de la barrera hematoencefálica. En una realización adicional, y sin limitarse a ella, un dispositivo que contiene epitelio mucoso se puede utilizar como un sistema de modelo para estudiar la infección por el virus del herpes común o por el virus del papiloma; se puede utilizar tal sistema de modelo para probar la eficacia de medicamentos antivíricos.

El dispositivo de la presente invención también se puede utilizar para ayudar en el diagnóstico y el tratamiento de las neoplasias malignas y las enfermedades. Por ejemplo, se pueden tomar biopsias de cualquier tejido (por ejemplo, médula ósea, piel, hígado) de un paciente que se sospeche que tiene una neoplasia maligna. Se puede utilizar el cultivo del paciente in vitro para detectar los compuestos citotóxicos y/o farmacéuticos para identificar los que son más eficaces; es decir, los que matan las células malignas o las células enfermas, pero salvaguardan las células normales. Luego, se pueden utilizar estos fármacos para tratar terapéuticamente al paciente.

En otra realización más de la invención, el dispositivo se puede utilizar in vitro para producir productos biológicos con un gran rendimiento. Por ejemplo, una célula que produce de forma natural grandes cantidades de un determinado producto biológico (por ejemplo, un factor de crecimiento, un factor regulador, una hormona peptídica, un anticuerpo), o una célula hospedadora modificada genéticamente para producir un producto génico foráneo se puede amplificar por clonación utilizando el dispositivo in vitro. Si una célula transformada excreta el producto génico al medio nutritivo, se puede aislar el producto con facilidad a partir del medio agotado o acondicionado utilizando técnicas de separación estándares (por ejemplo, HPLC, cromatografía de columna, técnicas electroforéticas, por nombrar sólo unas cuantas). Se podría fabricar un "biorreactor" que aprovechara el método de flujo continuo para alimentar los cultivos in vitro. Esencialmente, a medida que los medios frescos pasen a través de los cultivos en el dispositivo, el producto génico se eliminará del cultivo junto con las células desprendidas del cultivo. Se puede aislar el producto génico (por ejemplo, mediante cromatografía en columna de HPLC, electroforesis) a partir del drenaje de los medios agotados o acondicionados.

La presente invención también proporciona un sistema para detectar o medir los efectos de distintos compuestos o situaciones medioambientales en un sistema biológico. Por ejemplo, se podrían imitar o cambiar las condiciones del aire o del agua en el dispositivo. Se podría probar el impacto de varias sustancias tóxicas conocidas o que se sospecha que son tóxicas. Además, la presente invención proporciona un sistema para detectar productos de consumo, como cosméticos, limpiadores o lociones. También proporciona un sistema para determinar la seguridad y/o eficacia de los alimentos medicinales, los complementos nutricionales o los aditivos alimentarios. La presente invención se podría utilizar también como un biorreactor en miniatura o una plataforma de producción celular para producir productos celulares en cantidad.

Los experimentos típicos de eficacia o toxicidad que utilizan el dispositivo de cultivos a microescala con formato de chip de la presente invención se completan en 24 a 48 horas o menos, dependiendo del diseño experimental. Sin embargo, se pueden realizar experimentos más largos para probar los efectos de la exposición crónica (por ejemplo, genotoxicidad, carcinogenia o enfermedades latentes).

La presente invención proporciona nuevos dispositivos, sistemas y métodos tal y como se expone en esta memoria. En general, toda la terminología técnica y científica utilizada dentro de la presente memoria tiene el mismo significado que el entendido por el experto en la técnica a la que pertenece está invención, a menos que se indique claramente de otra manera. Por motivos de claridad, se muestran más abajo las definiciones de ciertos términos utilizados en la presente memoria para describir la presente invención. Estas definiciones se aplican a la terminología tal y como se utiliza a lo largo de esta memoria, a menos que se indique de otra manera claramente.

Definición de la terminología

Sistema de cultivo basado en la farmacocinética: un sistema de cultivo de células in vitro, en el que se mantienen las células en situaciones que proporcionan unos valores de parámetros farmacocinéticos que sirven de modelo para los encontrados in vivo. Un dispositivo de cultivo farmacocinético comprende una red fluidica de canales separados en unas cámaras individuales pero interconectadas, donde la geometría específica de la cámara se diseña para que proporcione parámetros de interacciones celulares, flujo de líquido y permanencia del líquido que se correlacionan con los encontrados en el correspondiente sistema de células, tejidos u órganos in vivo. El dispositivo se inocula con células que son las adecuadas para las situaciones que se modelan, por ejemplo, hepatocitos en una cámara de cultivo que imita el hígado, células pulmonares en una cámara de cultivo que imita el pulmón y similares, para proporcionar el sistema de cultivo.

Los sistemas de cultivo de la invención aseguran, al menos, que un valor de parámetro farmacocinético es comparable a los valores obtenidos in vivo para el sistema de células, tejidos u órganos de interés, preferiblemente, al menos, los valores de dos parámetros, y se pueden asegurar valores de tres o más parámetros comparables. Los parámetros farmacocinéticos de interés incluyen, por ejemplo, interacciones entre las células, tiempo de permanencia del líquido, proporciones de líquido por célula, metabolización en las células o tensión de corte.

Por valores comparables se quiere decir que los valores reales no se desvían más del 25% de los valores teóricos. Por ejemplo, el valor calculado o teórico para el tiempo de permanencia del líquido en el compartimento del pulmón para una rata es de 2 segundos y el valor real medido en la cámara de cultivo de las células del pulmón de un dispositivo ACC de rata fue de 2,5 \pm 0,7 s.

El valor del parámetro farmacocinético se obtiene utilizando las ecuaciones de un modelo FCBF. Tales ecuaciones se han descrito en la técnica, por ejemplo, véase, Poulin y Theil (2000) J. Pharm. Sci. 89 (1): 16-35; Slob et al., (1997) Crit. Rev. Toxicol. 27 (3): 261-72; Haddad et al. (1996) Toxicol Lett. 85 (2): 113-26; Hoang (1995) Toxicol Lett. 79(1-3): 99-106; Knaak et al., (1995) Toxicol. Lett. 79 (1-3): 87-98; y Ball y Schwartz (1994) Comput. Biol. Med. 24(4): 269-76, incorporadas en la presente memoria mediante referencia. También se pueden obtener parámetros farmacocinéticos de la bibliografía publicada, por ejemplo, véase Buckpitt et al., (1984) J. Pharmacol. Exp. Ther. 231: 291-300; DelRaso (1993) Toxicol. Lett. 68: 91-99; Haies et al., (1981) Am. Rev. Respir. Dis. 123: 533-541.

Los parámetros fisiológicos específicos de interés incluyen el tiempo de permanencia del líquido en el tejido u órgano, la masa del tejido u órgano, la proporción de volumen de líquido por célula, la tensión de corte de las células, etc. Se pueden obtener empíricamente valores de parámetros fisiológicamente relevantes de acuerdo con los métodos convencionales, o se pueden obtener de los valores conocidos en la técnica y disponibles públicamente. Los valores de parámetros farmacocinéticos de interés se obtienen para un animal, normalmente, un mamífero, aunque también se pueden utilizar otros modelos de animales, por ejemplo, insectos, peces, reptiles o aves. Los mamíferos incluyen animales de laboratorio, por ejemplo, ratón, rata, conejo, o conejillo de indias, mamíferos de valor económico, por ejemplo, caballos, ovejas, cabras, vacas, perros o gatos; primates, incluidos monos, simios o humanos; y similares. Se pueden obtener diferentes valores y utilizarse para animales de diferentes edades, por ejemplo, fetal, neonatal, lactante, infantil, adulto o anciano; y para diferentes estados fisiológicos, por ejemplo, enfermo, después del contacto con un agente farmacéuticamente activo, después de la infección o en situaciones de alteración de la presión atmosférica.

La información relevante para los valores de los parámetros farmacocinéticos, así como las ecuaciones de equilibrio de masas aplicables a diferentes sustancias a modelar en el sistema, se proporciona opcionalmente en un componente de procesamiento de datos del sistema de cultivo, por ejemplo, las tablas de búsqueda en la memoria de uso general reservada para el almacenamiento, y similares. Estas ecuaciones representan modelos farmacocinéticos basados en la fisiología para diferentes sustancias biológicas/químicas en los sistemas.

Dispositivo de cultivo farmacocinético: el dispositivo de cultivo de la invención proporciona un sustrato para el crecimiento de las células. Cada dispositivo comprende, al menos, una cámara, normalmente al menos dos cámaras, y puede comprender tres o más cámaras, en el que las cámaras están interconectadas mediante canales fluidicos. Las cámaras pueden utilizar un solo sustrato o varios sustratos. Preferiblemente, cada cámara tiene una configuración geométrica distinta de las otras cámara(s) presentes en el dispositivo. El dispositivo contiene una tapa para sellar las cámaras y los canales, y comprende al menos un puerto de entrada y un puerto de salida que permite la recirculación del medio de cultivo. El dispositivo contiene un mecanismo para bombear el medio de cultivo a través del sistema. El medio de cultivo está diseñado para mantener la viabilidad de las células cultivadas. El dispositivo contiene un mecanismo mediante el cual se pueden introducir en el sistema los compuestos a comprobar.

En una realización de la invención, el dispositivo se fabrica a microescala como una sola unidad de no más de 2,5 cm en un lado que, preferiblemente, comprende al menos dos cámaras interconectadas. Los dos compartimentos de órganos están conectados por un canal de unos 50-150 \mum de ancho y unos 15-25 \mum de profundidad. Por ejemplo, una cámara puede representar el pulmón y comprender una matriz de canales paralelos interconectados, normalmente al menos unos 10 canales, preferiblemente al menos unos 20 canales. Tal canal puede tener las dimensiones microfluidicas típicas, por ejemplo, unos 30-50 \mum de ancho, 5-15 \mum de profundidad y 3-7 mm de largo. Otro compartimento puede representar el hígado, que comprende dos o más canales paralelos, normalmente de unos 50-150 \mum de ancho, 15-25 \mum de profundidad y 5-15 cm de largo en forma de serpentina.

Lo habitual es que el dispositivo incluya un mecanismo para obtener señales de las células y el medio de cultivo. Las señales de diferentes cámaras y canales se pueden monitorizar en tiempo real. Por ejemplo, los biosensores pueden estar integrados o estar en el exterior del dispositivo, lo que permite la lectura en tiempo real del estado fisiológico de las células en el sistema.

El dispositivo de cultivo farmacocinético de la presente invención se puede proporcionar como un chip o un sustrato. Además de mejorar la dinámica del líquido, tales microsistemas ahorran espacio, particularmente cuando se utilizan en sistemas muy paralelizados, y se pueden producir de forma barata. El dispositivo de cultivo se puede formar a partir de un polímero como, pero sin limitarse a él, el poliestireno, y desecharlo después de un uso, lo que elimina la necesidad de esterilizarlo. Como resultado, se puede producir el subsistema in vitro de forma barata y utilizarlo ampliamente. Además, se pueden cultivar las células de forma tridimensional, por ejemplo, en forma de tubo, lo que se acerca aún más al medio in vivo.

Para modelar la respuesta metabólica de un animal a cualquier agente en particular, un banco de matrices paralelas o multiplex que comprende varios (esto es, al menos dos) de los sistemas de cultivo de células, en el que cada sistema puede ser idéntico, o puede variar con los valores de los parámetros predeterminados o los fármacos y las concentraciones de entrada. La matriz puede comprender, al menos, unos 10, o incluso hasta 100 o más, sistemas. Ventajosamente, los sistemas de cultivo de células en microchips se pueden alojar dentro de una sola cámara, de modo que todos estos sistemas de cultivo de células se exponen a las mismas situaciones durante un análisis.

Alternativamente, se pueden interconectar muchos chips para formar un solo dispositivo, por ejemplo, para imitar las barreras gastrointestinales o la barrera hematoencefálica.

Células: las células a utilizar en los análisis de la invención pueden ser un organismo, un solo tipo de célula obtenido de un organismo, y puede ser una mezcla de tipos de células, como es típico de las situaciones in vivo. Las condiciones del cultivo pueden incluir, por ejemplo, temperatura, pH, presencia de factores, presencia de otros tipos de células y similares. Se pueden utilizar diferentes células animales, incluidos cualquiera de los animales para los que se pueden obtener valores de los parámetros farmacocinéticos, tal y como se describió previamente.

La invención es adecuada para su utilización con cualquier tipo de célula, incluidas células primarias, células madre, células precursoras, estirpes celulares normales, genéticamente modificadas, genéticamente alteradas, inmortalizadas y transformadas. La presente invención es adecuada para el uso con un tipo de células o de estirpe celular, o con combinaciones de diferentes tipos de células. Preferiblemente, las células cultivadas mantienen la capacidad para responder a los estímulos que desencadenan una respuesta en sus homólogos producidos de forma natural. Éstas se pueden obtener de cualquier origen, como células eucariotas o procariotas. Las células eucariotas pueden ser de naturaleza vegetal o animal, tales como humano, simios o roedores. Pueden ser de cualquier tipo de tejido (por ejemplo, corazón, estómago, riñón, intestino, pulmón, hígado, grasa, hueso, cartílago, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, médula ósea, músculo, cerebro, páncreas) y tipo de célula (por ejemplo, epitelial, endotelial, mesenquimatosa, adiposa, hematopoyética). Además, se puede utilizar una sección transversal de un tejido o un órgano. Por ejemplo, se podría utilizar una sección transversal de una arteria, vena, tubo digestivo, esófago o colon.

Además, se pueden utilizar con esta invención células que se han alterado o modificado genéticamente para que contengan una secuencia de ácido nucleico "recombinante" no nativo (también llamado "exógeno"), o que se han modificado mediante tecnología antisentido para proporcionar una ganancia o pérdida de la función genética. Los métodos para generar células modificadas genéticamente se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, Current protocolos in molecular biology, Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 2000. Las células podrían estar completamente diferenciadas o sin diferenciar, como una célula madre. Las células de la presente invención podrían ser células cultivadas de diferentes individuos genéticamente distintos que pueden responder de forma diferente a los agentes biológicos y farmacológicos. La diversidad genética puede tener efectos indirectos y directos sobre la predisposición a la enfermedad. En un caso directo, incluso el cambio de un solo nucleótido, que dé lugar a un polimorfismo mononucletídico (los SNP, por sus siglas en inglés), puede alterar la secuencia de aminoácidos de una proteína y contribuir directamente a la enfermedad o a la predisposición a la enfermedad. Por ejemplo, algunos genotipos de la APO-lipoproteína E se han asociado al comienzo y la progresión de la enfermedad de Alzheimer en algunos individuos.

Cuando algunos polimorfismos se asocian a un fenotipo determinado de enfermedad, las células de los individuos identificados como portadores del polimorfismo pueden estudiarse en busca de anomalías de desarrollo, utilizando como control las células que no son portadoras. La presente invención proporciona un sistema experimental para estudiar las anomalías de desarrollo asociadas a determinadas presentaciones de enfermedades genéticas, ya que se pueden estudiar simultáneamente varios tipos de células diferentes y unirse a las células relacionadas. Por ejemplo, se pueden utilizar precursores neuronales, células neurogliales u otras células de origen nervioso en un dispositivo para caracterizar los efectos celulares de un compuesto en el sistema nervioso. También se pueden configurar los sistemas de forma que se puedan estudiar las células para identificar elementos genéticos que alteran la sensibilidad al fármaco, la respuesta a la quimiocina y la citocina, la respuesta a los factores de crecimiento, hormonas e inhibidores, así como las respuestas a los cambios en la expresión y/o funcionamiento del receptor. Esta información puede ser inestimable para diseñar métodos de tratamiento contra las enfermedades de origen genético o para las cuales hay una predisposición genética.

En una realización de la invención, las células están implicadas en la destoxificación y el metabolismo de compuestos farmacéuticamente activos, por ejemplo, células hepáticas incluidos los hepatocitos; células del riñón incluidas las células tubulares; células grasas incluidos los adipocitos que pueden retener compuestos orgánicos durante largos periodos de tiempo. Se pueden combinar estas células en un sistema de cultivo con células tales como las células de pulmón, que están implicadas en los procesos de respiración y oxigenación. También se pueden combinar estas células con células que son particularmente sensibles al daño de un agente de interés, por ejemplo, células epiteliales del intestino, células de la médula ósea y otras células normales que se dividen rápidamente, para estudiar los agentes que alteran la división celular. Las células nerviosas pueden estar presentes para monitorizar el efecto de un agente sobre la neurotoxicidad, y similares.

También son de interés las características de crecimiento de los tumores y la respuesta de los tejidos circundantes y el sistema inmunitario al crecimiento del tumor. Las enfermedades degenerativas, incluidos los tejidos afectados y las áreas circundantes, se pueden explotar para determinar la respuesta del tejido afectado y las interacciones con otras partes del cuerpo.

La terminología "medio" y "condición de cultivo" abarca células, medios, factores, tiempo y temperatura. Los medios también pueden incluir fármacos y otros compuestos, determinadas situaciones atmosféricas, pH, composición de sales, minerales, etc. El cultivo de las células se realiza normalmente en un medio estéril que imita las condiciones fisiológicas, por ejemplo, a 37ºC en un incubador que contiene una atmósfera húmeda con aire al 92-95%/CO_{2} al 5-8%. El cultivo de las células se puede llevar a cabo en mezclas de nutrientes que contienen líquidos biológicos sin definir, tales como suero de ternera fetal, o medios que están totalmente definidos o sin suero. En la técnica se conocen diferentes medios de cultivo y están disponibles comercialmente.

La terminología "condiciones fisiológicas", tal y como se utiliza en la presente memoria, se define para significar que las condiciones de cultivo de las células se monitorizan muy específicamente para imitar lo mejor posible las condiciones naturales del tejido para un determinado tipo de célula in vivo. Estas condiciones incluyen parámetros tales como el tiempo de permanencia del líquido (es decir, el tiempo que un líquido permanece en un órgano); proporción de célula por volemia, tensión de corte sobre las células, y tamaño del compartimento comparable al del órgano natural.

Análisis de detección: los fármacos, toxinas, células, patógenos, muestras, etc., de la presente memoria citados genéricamente como "variables de entrada" se criban en busca de actividad biológica añadiéndolos al sistema de cultivo basado en la farmacocinética y, luego, evaluando los cambios de las variables de salida de interés en las células cultivadas, por ejemplo, consumo de O_{2}, producción de CO_{2}, viabilidad celular o expresión de las proteínas de interés. Las variables de entrada normalmente se añaden en disolución, o en una forma fácilmente soluble, al medio de las células en cultivo. Las variables de entrada se pueden añadir utilizando un sistema de flujo directo o, alternativamente, añadiendo un bolo a una disolución que, de no ser así, permanecería estática. En un sistema de flujo directo se utilizan dos líquidos, de los que uno es una disolución fisiológicamente neutra y el otro es la misma disolución que contiene el compuesto a comprobar. El primer líquido se pasa sobre las células, seguido del segundo. En un método con una sola disolución, se añade un bolo de las variables de entrada a comprobar al volumen del medio que rodea las células. La composición total del medio de cultivo no debe cambiar significativamente con la adición del bolo, o entre las dos disoluciones en un método de flujo directo.

Las formulaciones de las variables de entrada preferidas no incluyen componentes adicionales, tales como conservantes, que tienen un efecto importante sobre la formulación global. Así, las formulaciones preferidas incluyen un agente biológicamente activo y un excipiente fisiológicamente aceptable, por ejemplo, agua, etanol o DMSO. Sin embargo, si un agente es líquido sin un excipiente, la formulación puede ser implemente el propio compuesto.

Las variables de entrada preferidas incluyen, pero sin limitarse a ellos, virus, partículas víricas, liposomas, nanopartículas, polímeros biodegradables, partículas radiomarcadas, biomoléculas radiomarcadas, partículas conjugadas con toxinas, biomoléculas conjugadas con toxinas y partículas o biomoléculas conjugadas con fármacos estabilizantes. Un "fármaco estabilizante" es un agente utilizado para estabilizar fármacos y proporcionar una liberación controlada. Tales agentes incluyen albúmina, polietilenglicol, poli(acetato de etileno-co-vinilo) y poli(lactido-co-glucólido).

Se pueden ejecutar numerosos análisis en paralelo con diferentes concentraciones de entrada para obtener una respuesta diferencial a distintas concentraciones. Como se conoce en la técnica, la determinación de la concentración eficaz de un agente normalmente utiliza un intervalo de concentraciones que son resultado de diluciones a 1:10, o de otra escala logarítmica. Además, se pueden redefinir las concentraciones con una segunda serie de diluciones, en caso necesario. Normalmente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a una concentración cero o por debajo del nivel de detección.

Las variables de entrada de interés abarcan varias clases químicas, aunque con frecuencia son moléculas orgánicas. Una realización preferida es la utilización de métodos de la invención para detectar la toxicidad en las muestras, por ejemplo, fármaco o muestras del medio. Los agentes candidatos pueden comprender grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente puentes de hidrógeno y, normalmente, incluyen al menos una amina, grupo carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente, al menos, dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos a menudo comprenden estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas, incluidos los péptidos, glúcidos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.

Están incluidos los fármacos farmacológicamente activos y las moléculas genéticamente activas. Los compuestos de interés incluyen antineoplásicos, antiinflamatorios, hormonas o antagonistas de hormonas, modificadores de los canales iónicos y agentes neuroactivos. Ejemplos de agentes farmacéuticos adecuados para esta invención son los descritos en The pharmacological basis of therapeutics, Goodman y Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, Nueva York (1996), novena edición, en las secciones: "Drugs acting at synaptic and neuroeffector junctional sites", "Drugs acting on the central nervous system", "Autocoids: drug therapy of inflammation", "Water, salts and ions", "Drugs affecting renal function and electrolyte metabolism", "Cardiovascular drugs", "Drugs affecting gastrointestinal function", "Drugs affecting uterine motility", "Chemotherapy of parasitic infections", "Chemotherapy of microbial diseases", "Chemotherapy of neoplastic diseases", "Drugs used for immmunosuppression", "Drugs acting on blood-forming organs", "Hormones and hormone antagonists", "Vitamins", "Dermatology" y "Toxicology", todas incorporadas en la presente memoria mediante referencia. También se incluyen toxinas, y agentes de guerra química, por ejemplo, véase Somani, S. M. (Ed.), Chemical warfare agents, Academic Press, Nueva York, 1992.

Los compuestos a probar incluyen todas las clases de moléculas descritas anteriormente y además pueden comprender muestras de contenido desconocido. Mientras que muchas muestras comprenderán compuestos en disolución, también se pueden analizar muestras sólidas que se disuelven en un disolvente adecuado. Las muestras de interés incluyen muestras medioambientales, por ejemplo, agua subterránea, agua del mar o desechos de la minería; muestras biológicas, por ejemplo, lisados preparados de muestras de cultivos o de cosechas; muestras de fabricación, por ejemplo, cinética durante la preparación de los productos farmacéuticos; así como colecciones de compuestos preparados para su análisis; y similares. Las muestras de interés incluyen compuestos en los que se evalúa su potencial valor terapéutico, por ejemplo, fármacos candidatos obtenidos de células vegetales o fúngicas.

La terminología "muestras" también incluye los líquidos descritos anteriormente a los que se han añadido componentes adicionales, por ejemplo, componentes que afectan la fuerza iónica, el pH o la concentración total de proteínas. Además, se pueden tratar las muestras para lograr, al menos, un fraccionamiento o una concentración parcial. Se pueden guardar las muestras biológicas si se tiene cuidado para reducir la degradación del compuesto, por ejemplo, en nitrógeno, congelado, o una combinación de los mismos. El volumen de la muestra utilizada es suficiente para permitir la detección mensurable, normalmente es suficiente con unos 0,1 \mul a 1 ml de una muestra biológica.

Los compuestos y los fármacos candidatos se obtienen de muy diversos orígenes, que incluyen colecciones de compuestos naturales o sintéticos. Por ejemplo, hay disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y directa de una gran variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluida la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos al azar. Alternativamente, se encuentran disponibles colecciones de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales o se producen con facilidad. Adicionalmente, las colecciones y los compuestos producidos de forma natural o sintética se modifican con facilidad mediante medios convencionales químicos, físicos y bioquímicos, y se pueden utilizar para producir colecciones combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas directas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación y amidación, para producir análogos estructurales.

Variables de salida: las variables de salida son elementos cuantificables de células, particularmente elementos que se pueden medir de manera exacta en un sistema de gran producción. Una salida puede ser cualquier componente celular o producto celular que incluye, por ejemplo, viabilidad, respiración, metabolismo, determinante de la superficie celular, receptor, proteína o modificación conformacional o postraduccional de la misma, lípido, glúcido, molécula orgánica o inorgánica, ARNm, ADN, o una porción derivada de tal componente celular. Mientras que muchas salidas proporcionarán una lectura cuantitativa, en algunos casos se obtendrá un resultado semicuantitativo o cualitativo. Las lecturas pueden incluir la determinación de un solo valor, o pueden incluir la media, el valor mediano o la varianza. De forma característica, se obtendrá un intervalo de valores de lectura para cada salida. Se espera variabilidad y se puede establecer un intervalo de valores para un conjunto de salidas a comprobar utilizando métodos estadísticos estándares.

Se pueden utilizar varios métodos para cuantificar la presencia de los marcadores seleccionados. Para medir la cantidad de una molécula que esté presente, un método conveniente es marcar la molécula con un resto detectable, que puede ser fluorescente, luminiscente, radiactivo o activo enzimáticamente. Los restos fluorescentes y luminiscentes se encuentran disponibles con facilidad para marcar virtualmente cualquier biomolécula, estructura o tipo de célula. Se pueden dirigir los restos inmunofluorescentes para que se unan no sólo a proteínas específicas, sino también a conformaciones, productos de escisión o modificaciones de sitios, como la fosforilación, específicos. Se pueden fabricar péptidos y proteínas individuales que emitan autofluorescencia, por ejemplo, expresándolos como quimeras con la proteína fluorescente verde dentro de las células [para una revisión, véase Jones et al., (1999), Trends Biotechnol. 17 (12): 477-81].

Las variables de salida se pueden medir mediante técnicas de inmunoanálisis tales como inmunohistoquímica, radioinmunoanálisis (RIA) o inmunoensayo enzimático (ELISA) y técnicas no enzimáticas relacionadas. Estas técnicas utilizan anticuerpos específicos como moléculas indicadoras que son particularmente útiles debido a su elevada especificidad de unión a una única diana molecular. El ELISA con células, o los métodos no enzimáticos relacionados, o los basados en la fluorescencia, permiten medir los parámetros de la superficie celular. Las lecturas de tales análisis pueden ser la fluorescencia media asociada a moléculas o citocinas particulares de la superficie celular detectadas por anticuerpos fluorescentes, o la media de la intensidad de la fluorescencia, la mediana de la intensidad de la fluorescencia, la varianza de la intensidad de la fluorescencia o alguna relación entre
éstas.

Análisis de datos: los resultados de los análisis de detección se pueden comparar con los resultados obtenidos de los compuestos de referencia, curvas de concentración, controles, etc. La comparación de los resultados se lleva a cabo mediante la utilización de protocolos de deducción adecuados, sistemas de IA, comparaciones estadísticas,
etc.

Se puede recopilar una base de datos con datos de salida de referencia. Estas bases de datos pueden incluir los resultados de fármacos o combinaciones de fármacos conocidos, así como referencias del análisis de las células tratadas en condiciones medioambientales en las que se eliminan o se alteran específicamente una o varias condiciones o parámetros medioambientales. Se puede generar una matriz de datos, en la que cada punto de la matriz de datos corresponde a una lectura de una variable de salida, en la que los datos para cada salida pueden proceder de determinaciones replicadas, por ejemplo, varias células individuales del mismo tipo.

La lectura puede ser un promedio, media, mediana o la varianza u otro valor derivado estadística o matemáticamente asociado a la medición. Se puede redefinir adicionalmente la información de lectura de salida mediante la comparación directa con la lectura de la referencia correspondiente. Los valores absolutos obtenidos para cada salida en condiciones idénticas mostrarán una variabilidad que es inherente a los sistemas biológicos vivos y también refleja la variabilidad celular individual así como la variabilidad inherente entre individuos.

Cultivos celulares y dispositivos de cultivos celulares

Los dispositivos de cultivos de la invención comprenden una red microfluidica de canales separados en una o más cámaras independientes pero interconectadas, preferiblemente integradas en un formato de chip. La geometría específica de la cámara se diseña para proporcionar parámetros de interacciones celulares, de flujo de líquido y de permanencia del líquido que se correlacionan con los encontrados para los correspondientes sistemas de células, tejidos u órganos in vivo.

Se pueden desarrollar geometrías de cámaras mejoradas repitiendo el procedimiento de probar valores de parámetros en respuesta a flujos de líquidos y cambios de las dimensiones, hasta obtener los valores elegidos. La mejora del sustrato incluye seleccionar el número de cámaras, seleccionar una geometría de cámara que proporciona la relación adecuada de célula por volumen, seleccionar un tamaño de cámara que proporciona la relación adecuada del tamaño del tejido u órgano, escoger las tasas óptimas del flujo del líquido que garantizan el tiempo correcto de permanencia del líquido y, luego, calcular la tensión de corte de las células sobre la base de estos valores. Si la tensión de corte de las células está por encima del máximo valor permisible, se seleccionan nuevos valores de parámetros y se repite el procedimiento. Otra realización de un dispositivo ACC incluye dónde se desarrollan las células dentro de tubos huecos en vez de en el fondo y en los lados de los canales o las cámaras. Se ha demostrado que las células que crecen en tal construcción tridimensional de tejido son más auténticas en relación con algunos tejidos in vivo [Griffith (1998) PhARMA Biol. Biotech. Conf., Coronado, CA, marzo 15-18].

Se consideran tres parámetros de diseño primarios al crear el dispositivo de cultivo tridimensional. El primero es el tiempo de permanencia en el que el líquido está en contacto con un determinado tejido o dentro de un pocillo. Los tiempos de permanencia se eligen para que reflejen la cantidad de tiempo en el que la sangre permanece en contacto con el tejido orgánico, representado por un pocillo, en un paso del aparato circulatorio. El segundo es el radio de los tubos en los que crecen las células. Por ejemplo, el radio de los tubos para replicar el hígado se encuentran dentro de un intervalo de 200 a 400 \mum Se debe destacar que si el radio de los tubos es demasiado grande, las células percibirán esencialmente una superficie plana y formarán una monocapa sobre el tubo.

El tercer parámetro es la proporción del flujo que llega a cada módulo. El ajuste de la geometría de los canales del flujo reparte el flujo desde las cámaras. Los canales o los tubos para cada módulo o cámara son normalmente de longitudes diferentes para equilibrar las caídas de presión y equilibrar el flujo. Después de que el líquido abandone los otros tejidos, se puede hacer recircular gracias a una bomba. Se calculó la tasa de flujo a través de los tubos a partir de las dimensiones del tubo y del tiempo de permanencia. Dada una tasa de flujo, se calculó la tensión de corte sobre las células para asegurar que el valor no superara el límite de tensión de corte de las células. El tiempo de permanencia tan corto requerido en el tejido pulmonar hace que sea imposible utilizar un enfoque de pocillo y tubo para este órgano. La tensión de corte es demasiado grande y, por lo tanto, la sección del tejido pulmonar permanece extendida con una monocapa de tejido pulmonar.

Dado que el sistema de la presente invención es interactivo (es decir, el ordenador no sólo siente sino que también controla las condiciones de la prueba), se pueden establecer dinámicamente las correcciones en el sistema y observarlas y documentarlas de manera adecuada para avisar a los investigadores de la dinámica de la prueba que se
ejecuta.

La reunión de datos por el ordenador consiste en la recolección de los datos necesarios para la monitorización continua en línea del vertido químico a analizar de cada compartimento. Se disponen los sensores, preferiblemente del tipo de flujo directo, en línea con la salida de cada compartimento para, así, detectar, analizar y proporcionar datos cuantitativos con respeto al vertido químico a analizar de cada compartimento.

Los microprocesadores también pueden servir para computar un modelo farmacocinético basado en la fisiología (FCBF) para un determinado producto químico a analizar. Estos cálculos pueden servir de base para establecer las tasas de flujo entre compartimentos y las tasas de excreción para el producto químico a analizar desde el sistema. Sin embargo, también pueden servir como una estimación teórica para el producto químico a analizar. Al terminar el experimento, las predicciones acerca de las concentraciones de los productos químicos y los metabolitos a analizar hechas por la determinación del modelo FCBF se pueden comparar con los datos de los sensores. La copia impresa de la salida compara el modelo FCBF con los resultados experimentales.

Se han construido y probado varios prototipos de sistemas ACC. La figura 17A representa un dispositivo de tres compartimentos de "primera generación". Las dimensiones fueron las siguientes: el zócalo era de 2 cm x 2 cm; la cámara para el pulmón tenía 20 canales (5 mm de largo), 40 \mum x 20 \mum (a x p); la cámara para el hígado tenía 2 canales (100 mm de largo), 100 \mum x 20 \mum (a x p). El primer paso en la utilización de este dispositivo es inyectar el líquido utilizando una jeringuilla a modo de bomba hasta que los canales estén llenos. Segundo, se utiliza una bomba peristáltica para hacer recircular el líquido. La figura 17B muestra una vista transversal del dispositivo, que muestra la fluidica del sistema. Se encontró que un elastómero de 400 \mum de grosor ofrecía un mejor cierre, y que el plexiglás y las puntas para cargar el gel son mucho menos frágiles que otros materiales. Este dispositivo tuvo problemas con una caída de la alta presión y las filtraciones se produjeron en las curvaturas de 90º.

Se realizaron estudios de adhesión celular utilizando este dispositivo de "primera generación". Se colocaron las células L2 en la cámara para el pulmón y las células H4IIE en la cámara para el hígado. Se adsorbió poli-D-lisina a la superficie de las cámaras para favorecer la adhesión de las células dentro de los canales. Por desgracia, las células se unieron fuera de los fosos, por lo que se probaron diferentes sustratos y se modificaron las superficies.

La figura 18A describe un dispositivo de "segunda generación". Las dimensiones eran las siguientes: el chip era de 2 cm x 2 cm; el grabado es de 20 \mum de profundidad; la cámara para el pulmón era de 2 mm x 2 mm (a x l); la cámara para el hígado era de 7,5 mm x 10 mm (a x l). La cámara para el pulmón contenía resaltes de 5 \mum de alto para aumentar la adhesión celular (figura 18B) y la cámara para el hígado contenía pilares de 20 \mum de alto para estimular la percolación (figura 18C).

La figura 19 describe un dispositivo de "tercera generación". Las dimensiones eran las siguientes: el chip era de 2 cm x 2 cm; la cámara para el pulmón era de 2 mm x 2 mm (a x l); la cámara para el hígado era de 3,7 mm x 3,8 mm (a x l); y la cámara del "otro tejido" era de 7 mm x 7 mm (a x l). El líquido se dividió desde la cámara del pulmón, yendo el 20% a la cámara del hígado y el 80% a la cámara del otro tejido. Las partes de las cámaras (líneas discontinuas) tienen una profundidad de 100 \mum para reducir las caídas de presión y otras partes (líneas continuas) tienen una profundidad de 20 \mum para dar unas proporciones de líquido por célula realistas.

La figura 20 es un diagrama de flujo para un ACC de modelo FCBF de cinco compartimentos. Este dispositivo añade cámaras para adipocitos, una cámara para líquido perfundido lentamente y para líquido perfundido rápidamente. Se puede utilizar tal dispositivo para estudios de bioacumulación, estudios de citotoxicidad y actividades metabólicas. Se pueden desarrollar otros dispositivos con diferentes permutas. Por ejemplo, se puede añadir una bomba de diafragma con intercambio de gases, o un biosensor en línea, o una bomba microelectromecánica (MEM) o un biosensor y una interfaz electrónica. Se puede desarrollar un dispositivo que imite la administración oral de un fármaco. Alternativamente, se puede desarrollar un dispositivo para imitar la barrera hematoencefálica.

Fabricación

Normalmente, el dispositivo de cultivo de células comprende una agregación de elementos sueltos, por ejemplo, cámaras, canales, entradas o salidas que, cuando se acoplan o se ponen juntos, forman el dispositivo de cultivo de la invención. Preferiblemente, se proporcionan los elementos en un formato integrado "basado en un chip".

La fluidica de un dispositivo se escala de manera apropiada para el tamaño del dispositivo. En un formato basado en un chip, las conexiones fluidicas son "microfluidicas", de tal manera que un sistema contiene un elemento fluidico, como una vía, cámara o conducto que tiene, al menos, una dimensión transversal interna, por ejemplo, profundidad o anchura, entre unos 0,1 \mum y 500 \mum. En los dispositivos de la presente invención, los canales entre las cámaras normalmente incluyen, al menos, un canal a microescala.

Normalmente, los dispositivos microfluidicos comprenden una parte superior, una parte inferior y una parte interior, en los que la parte interior define sustancialmente los canales y las cámaras del dispositivo. En aspectos preferidos, la parte inferior comprenderá una sustrato sólido que es de estructura sustancialmente plana y que tiene, al menos, una superficie superior sustancialmente plana. Se pueden emplear numerosos materiales de sustrato como parte inferior. Normalmente, al estar los dispositivos microfabricados, los materiales de sustrato se seleccionarán por lo general según su compatibilidad con las técnicas de microfabricación conocidas, por ejemplo, fotolitografía, deposición de película fina, grabado químico húmedo, grabado con iones reactivos, grabado de silicio en profundidad con plasma acoplado inductivamente, ablación por láser, técnicas de abrasión con aire, moldeado por inyección, realce y otras
técnicas.

Los materiales de sustrato de la presente invención comprenden materiales poliméricos, por ejemplo, plásticos, como poliestireno, polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato, politetrafluoroetileno (TEFLON^{TM}), polivinilcloruro (PVC), polidimetilsiloxano (PDMS), polisulfona y similares. Tales sustratos se fabrican fácilmente a partir de modelos microfabricados, utilizando técnicas de moldeado bien conocidas, como moldeado por inyección, realce o estampación, o polimerizando el material precursor polimérico dentro del molde. Se prefieren tales materiales de sustrato poliméricos por su facilidad de fabricación, bajo coste y por ser desechables, así como por ser inertes a la mayoría de las condiciones de reacción extremas. Estos materiales poliméricos pueden incluir superficies tratadas, por ejemplo, superficies derivadas o recubiertas, para aumentar su utilidad en el sistema, por ejemplo, para proporcionar una mejora en la dirección del líquido, en la adhesión celular o en la segregación celular.

Normalmente, los canales y/o las cámaras de los dispositivos microfluidicos se fabrican en la superficie superior del sustrato, o la parte inferior, utilizando las técnicas de microfabricación descritas anteriormente, como surcos o hendiduras a microescala. Luego, la superficie inferior de la parte superior del dispositivo microfluidico, cuya parte superior normalmente comprende un segundo sustrato plano, se cubre y se une a la superficie del sustrato inferior, lo que sella los canales y/o las cámaras (la parte interior) del dispositivo en la interfaz de estos dos componentes. La unión de la parte superior a la parte inferior se puede realizar utilizando numerosos métodos conocidos, dependiendo de la naturaleza del material de sustrato. Por ejemplo, en el caso de sustratos de vidrio, se pueden utilizar técnicas de unión térmica que emplean temperaturas y presión elevadas para unir la parte superior del dispositivo a la parte inferior. Los sustratos poliméricos se pueden unir utilizando técnicas similares, excepto que las temperaturas utilizadas generalmente son inferiores para evitar la fusión excesiva del material de sustrato. También se pueden utilizar métodos alternativos para unir entre sí las partes poliméricas del dispositivo, incluidas las técnicas de soldadura acústica, o el uso de adhesivos, por ejemplo, adhesivos curables al UV y
similares.

Por lo general, el dispositivo comprenderá una bomba, tal como una bomba peristáltica de poco caudal. Un tubo flexible de pequeño calibre se uniría a la salida del dispositivo, pasando a través de la bomba peristáltica, y se uniría a la entrada del dispositivo, formando así un sistema de circuito cerrado. Generalmente, la bomba funciona a una velocidad de flujo del orden de 1 \mul/min. El sistema de la bomba puede ser cualquier dispositivo de bomba de líquidos, tal como un diafragma, y puede estar integrado en el dispositivo ACC (sistema basado en un chip) o ser un componente independiente tal y como se describió anteriormente.

El dispositivo puede estar conectado a un procesador o en interfaz con él, el cual guarda y/o analiza la señal de cada uno de los biosensores. A su vez, el procesador reenvía los datos a una memoria informática (bien el disco duro o la RAM) desde donde pueden ser utilizados por el programa informático para analizar, imprimir y/o visualizar los resultados adicionalmente.

Descripción de realizaciones ejemplares

En la siguiente descripción detallada de las realizaciones específicas se hace referencia a los dibujos acompañantes, que forman una parte de la presente memoria, y en los cuales se muestran, a modo de ilustración, realizaciones específicas con las que se puede poner en práctica la invención. Se debe entender que se pueden utilizar otras realizaciones y que se pueden realizar cambios estructurales sin apartarse del alcance de la presente invención.

La figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema in vitro de acuerdo con la presente invención. La cámara 102 que simula células del pulmón recibe el medio de cultivo oxigenado desde el dispositivo 103 de intercambio de gases. Tal medio oxigenado se obtiene al poner en contacto el medio de cultivo con gas oxigenado, por lo que el medio de cultivo absorbe el gas oxigenado y expulsa gas que contiene dióxido de carbono. El medio de cultivo que sale de la cámara 102 que simula células del pulmón es análogo a la sangre arterial 106 en los mamíferos. Luego, el medio de cultivo que contiene oxígeno que constituye la sangre arterial 106 se suministra a la cámara 108 que simula el hígado, a la cámara 110 que simula otro tejido, a la cámara 112 que simula grasa y a la cámara 114 que simula el riñón. El medio de cultivo que sale de la cámara 108 que simula el hígado, de la cámara 110 que simula otro tejido, de la cámara 112 que simula grasa y de la cámara 114 que simula el riñón es análogo a la sangre venosa 104 en los mamíferos. Tal y como se muestra en la figura 1, el medio de cultivo que corresponde a la sangre venosa 104 vuelve a la cámara 102 que simula las células del pulmón. El sistema de la presente invención también incluye la cámara 116 que simula el intestino y la cámara 118 que simula la cavidad peritoneal, las cuales constituyen sitios para la introducción de los compuestos a analizar. Como en los mamíferos, el líquido de desecho 115 es retirado por la cámara 114 que simula el riñón.

La figura 2 es una vista esquemática simplificada de una realización del sistema 200 de la presente invención. El sistema 200 incluye una cámara 210 para el cultivo de células de pulmón, una cámara 212 para el cultivo de hepatocitos, una cámara 213 para el cultivo de adipocitos, una cámara 214 para otros tejidos y una cámara 250 para el intercambio de gases. Las cámaras 210, 212, 213, 214 y 250 se forman en un sustrato de silicio que se cita habitualmente como chip 230. Se debe destacar que se pueden alojar o formar más de cuatro cámaras de cultivo de células en un solo chip 230. Una vía 240 de líquido conecta las cámaras 210, 212, 213, 214 y 250.

Las cámaras tienen una entrada 211 y una salida 215. La entrada 211 está ubicada en un extremo de la cámara 250 de intercambio de gases. La salida 215 está ubicada en un extremo de la cámara 212 de cultivo de hepatocitos. Las cámaras 210, 212, 213, 214 y 250 y la vía de líquido 240 están ubicadas sustancialmente entre la entrada 211 y la salida 215. El sistema incluye una bomba 260 para hacer circular el líquido en el sistema 200. Un microtubo 270 conecta la salida 215 y el lado entrante de la bomba 260. Un microtubo 271 conecta el lado saliente de la bomba 260 a la entrada 211. Las cámaras 210, 212, 213 y 214 para el cultivo de células, la cámara 250 para el intercambio de gases, la vía de líquido 240 y la bomba 260 forman el sistema 200. El sistema puede incluir más cámaras de cultivo de células. Una cámara de cultivo de células que se añade habitualmente es la que simula el
riñón.

La figura 3 es una vista esquemática de otra realización de la invención. En la figura 3 se proporcionan una vía 310 para la primera señal, una vía 320 para la segunda señal y una vía 330 para la tercera señal en el chip 230. Las señales para monitorizar diferentes aspectos de cada sistema 200 para el cultivo de células se pueden tomar del chip 230 y en ubicaciones específicas en el chip 230, y sacarlas por las salidas del chip 230. Un ejemplo: las vías de señales 310, 320, 330 en el chip 230 son guías de onda integradas en el interior. El chip 230, en tal realización, podría estar hecho de silicio, vidrio o polímero. Las guías de onda 310, 320 y 330 podrían llevar luz hasta el extremo del chip donde estaría ubicado un transductor 312, 322 y 332 para transformar la señal de luz en una señal eléctrica. Luego, se podrían monitorizar la fluorescencia, luminiscencia o absorción o todas estas propiedades de las células dentro del sistema 200 para interrogar y monitorizar las células dentro del sistema 200. La comprobación de la fluorescencia requiere una fuente de luz. La fuente de luz se utiliza para interrogar la molécula y el portador de la señal, tal como una guía de onda 310, 320, 330 o una fibra óptica que captura la señal y la saca del chip 230. El portador de señales 310, 320 y 330, dirigiría la luz a un fotodetector cerca del extremo de la parte que lleva la señal del chip 310, 320,
330.

La figura 4 es una vista esquemática de otra realización del sistema 200 de la presente invención. En esta realización, se colocan los biosensores 410, 420, 430, 440, 450 y 460 en el chip antes y después de cada una de las cámaras de cultivo de células del chip 230. Los biosensores 410, 420, 430, 440, 450, 460 monitorizan el oxígeno, el dióxido de carbono y/o el pH del medio. Estos sensores permiten monitorizar el sistema 200 y ajustar los niveles de gas cuando sea necesario para mantener un entorno saludable. Además, si se colocan justo antes y después de cada compartimento de células, los biosensores proporcionan información útil sobre el metabolismo y la viabilidad
celular.

Las figuras 5A a 5G muestran las etapas utilizadas para fabricar un chip 230 desechable a base de polímero. Un zócalo de silicio 20 se recubre por rotación con una delgada capa de sustancia fotoendurecible 21 (figura 5A). La sustancia fotoendurecible 21 se expone a luz UV 22 a través de una fotomáscara 23 que contiene las características deseadas (figura 5B). La sustancia fotoendurecible 21 expuesta al UV se revela en un disolvente adecuado, por lo que se queda expuesto el silicio 20 (figura 5C). Se graba el silicio 20 a la profundidad deseada utilizando un sistema de grabado con plasma acoplado por inducción (figura 5D). Se retira la sustancia fotoendurecible restante con un disolvente adecuado (figura 5E). Se deposita una delgada base de enchapado de oro (o Ti) 24 sobre el sustrato de silicio 20, lo que crea un molde para el procedimiento de galvanoplastia, tal y como se muestra en la figura 5E. Se sumerge la muestra en un baño de enchapado del tipo de sulfamato de níquel y se somete a galvanoplastia el níquel 25 sobre el molde de silicio 20 hasta que el grosor del níquel es suficiente, y el oro actúa como una capa conductora. El molde de níquel crece fuera de la capa de oro, y el oro se convierte en una parte del molde de níquel. Esto forma rasgos de Ni 25, tal y como se muestra en la figura 5F. La velocidad de enchapado, que es una función de la corriente de enchapado, el diámetro del molde y el grosor del molde, se calibran a unos 45 nm/min. Después de la fabricación, se examinan los rasgos 25 utilizando un microscopio para comprobar las dimensiones de los rasgos. Los rasgos resultantes 25 del níquel deben ser uniformes y tener la forma deseada. El molde de níquel 25 y el sustrato de polímero 26 se calientan justo por encima de la temperatura de transición de vitrificación del polímero. Se ponen en contacto el molde de níquel 25 y el polímero 26, y los rasgos del molde de níquel 25 se realzan en el sustrato de polímero 26. Se retira el molde de níquel 25, lo que produce un polímero 26 que contiene los mismos rasgos que el zócalo de silicio original 20 (figura 5G).

La figura 6 es una vista esquemática de una tercera realización del sistema 200 de la presente invención. En esta realización, los biosensores 600, 602 y 604 se colocan por la periferia del chip 230. Los biosensores 600, 602 y 604 se utilizan para monitorizar adicionalmente el estado de las células del sistema 200 creado en el chip 230. Ventajosamente, al colocar los biosensores 600, 602 y 604 por la periferia del chip 230, se podría hacer que el chip 230 fuera desechable al menor coste. En otras palabras, los biosensores 600, 602 y 604 no se tendrían que tirar con el chip 230. Se debe destacar que los biosensores 600, 602 y 604 también se pueden proporcionar a bordo del chip 230 desechable. Esta opción en particular no sería tan rentable ya que los biosensores 600, 602 y 604 también se eliminarían al desechar el chip 230. Es más rentable cuando se colocan los biosensores 600, 602 y 604 fuera del chip 230, ya que los biosensores 600, 602 y 604 se reutilizan en vez de ser desechados después de cada uso. Se conecta cada uno de los biosensores 600, 602 y 604 a las entradas de un ordenador 620.

La figura 7 es una vista esquemática que detalla adicionalmente el ordenador 620. El ordenador 620 monitoriza y regula las operaciones del sistema 200 de cada chip 230. El ordenador 620 incluye un microprocesador provisto de una interfaz de entrada/salida 700 y una memoria de registro interno/caché 702. Tal y como se muestra, el microprocesador 798 se comunica con el teclado 704 a través de la conexión 716, con la memoria de almacenamiento no volátil 706, con la memoria de uso general 708 y con las tablas de búsqueda 710 a través del conector 718, y con el registro de impresión o ploteo 712 y el visualizador 714 a través del conector 720.

La memoria de almacenamiento no volátil 706 puede estar en forma de una memoria escribible en CD, una memoria en cinta magnética, lector de disco o similares. Las tablas de búsqueda 710 pueden comprender físicamente una parte de memoria de uso general 708 que se reserva para el almacenamiento de un conjunto de ecuaciones de equilibrio de masas aplicables a varias sustancias que el sistema ha de modelar. Estas ecuaciones representan modelos farmacocinéticos basados en la fisiología para varias sustancias biológicas/químicas en los sistemas. La memoria de registro interno/caché 702 y la memoria de uso general 708 contienen un programa en el sistema en forma de una variedad de instrucciones informáticas y datos especiales para controlar de forma automática virtualmente cada función en el sistema 200 de cada chip 230. El ordenador también puede controlar y regular la bomba 260 asociada al sistema 200.

El flujo de líquido también se puede proporcionar como entradas al microprocesador 798 a través de la interfaz de entrada/salida 700 desde los medidores de flujo. Esto permite controlar con precisión las velocidades de flujo del líquido dentro del sistema ajustando las instrucciones informáticas que se transmiten a las bombas 260 a través de líneas de control de las bombas, respectivamente. Por ejemplo, las velocidades de flujo se pueden establecer a 9,5 \mul/min en el conducto 58, a 2,5 \mul/min a través del medidor de flujo 66, a 7 \mul/min a través del medidor de flujo 78, y a 2,5 \mul/min en el conducto 70. También se puede regular la temperatura del medio de cultivo en el contenedor 50 mediante el microprocesador 798, el cual recibe, a través de la interfaz de entrada/salida 700 y la línea indicadora de temperatura 728, las mediciones de la temperatura de la sonda de temperatura 792. En respuesta a estas señales, la bobina del calentador 790 la enciende y la apaga el microprocesador 798 a través de la interfaz de entrada/salida 700 y la línea de control de la bobina del calentador 730.

Las reacciones/cambios biológicos y toxicológicos en las cámaras de cultivo de células 210 y 212 las detectan los sensores 600, 602 y 604, respectivamente, y las comunican al microprocesador 798 a través de líneas de control así como de la interfaz de entrada/salida 700. Se pueden diseñar los sensores para que representen los resultados de las pruebas en términos de valores o intervalos específicos de longitudes de ondas para representar los resultados de las pruebas.

El microprocesador 798 también se puede adaptar con facilidad para que incluya un programa que ofrezca al investigador el control interactivo por medio del teclado 704. Esto permite, por ejemplo, dirigir el ordenador para que compruebe específicamente las condiciones de cualquiera de los compartimentos de cultivo en un momento determinado.

Otra opción proporcionada por la presente invención es la capacidad para recuperar los resultados de pruebas almacenados previamente para experimentos similares al recuperar la información de la memoria en CD/cinta 706. Así, se puede preprogramar la memoria 706 para que contenga datos históricos de la información publicada, datos recogidos de pruebas ejecutadas previamente realizadas con el sistema de la presente invención o datos derivados de cálculos teóricos. La provisión de la memoria en CD/cinta también permite que el sistema se utilice como una herramienta de investigación de la información. Puede, por ejemplo, obtener datos de investigación que pertenecen a una sustancia química de una prueba determinada, o a una estirpe de cultivo determinada, sobre la base de la información de selección introducida en el microprocesador 798 a través del teclado 704. Al incluir o desarrollar una gran colección de información en la memoria 706, los investigadores podrán configurar y planificar de manera más inteligente las ejecuciones de las pruebas.

La figura 8 es una vista esquemática que muestra que se puede alojar más de un chip 230 dentro de una única carcasa 800. La carcasa 800 puede ser una cámara medioambiental que mantiene las mismas condiciones para cada uno de los chips 230 dentro de la carcasa. La carcasa 800 incluye multitud de ubicaciones de chips 810, 812, 814 y 816. Las salidas de cada chip 230 o ubicaciones de chips 810, 812, 814 y 816 se introducen en un ordenador 620. Luego, el ordenador 620 es capaz de monitorizar los sistemas 200 desde muchos chips 230 en tiempo
real.

La figura 9 es una vista esquemática que muestra que una prueba puede incluir conjuntos de chips 230 en diferentes carcasas 800 y 900. Se pueden monitorizar las salidas de cada uno de los chips 230 en busca de cambios en el entorno, tales como cuando la temperatura está ligeramente elevada, o similares. Además, se contempla que cada uno de los chips en una carcasa pueda tener el mismo cultivo de células dentro o que los chips 230 en la carcasa 800 puedan tener chips interconectados entre sí para formar diferentes partes de un mamífero u órganos interdependientes dentro de una carcasa.

Los chips 230 descritos en relación a las figuras 2 a 4 y 6 a 9 utilizan cámaras de cultivo de células bidimensionales 210, 212, 213 y 214. Ya que las construcciones de cultivo de tejidos tridimensionales pueden ser más auténticas por su metabolismo, otro de los chip 1000 se centra en la inclusión de las construcciones tridimensionales. Lo siguiente describe la creación de un dispositivo análogo al cultivo de células (ACC) a microescala, el cual incorpora tejidos tridimensionales en un formato modular. El dispositivo ACC o el chip 1000 incorpora un método de flujo por encima para las cámaras de las células del pulmón y un método de flujo directo para otros órganos. Más adelante se discute adicionalmente el método del flujo directo para un diseño ACC.

La figura 10 muestra una vista esquemática y una pauta de flujo para un chip 1000. El chip 1000 incluye cuatro pocillos o módulos de tejido. El chip 1000 incluye un pocillo para el pulmón 1010, un pocillo para el hígado 1020, un pocillo para la grasa 1030 y un pocillo 1040 de perfusión lenta y un pocillo 1050 de perfusión rápida. Se utilizan los tubos para que circule un líquido a través del chip 1000. Una bomba 1060 mueve el líquido a través de los tubos. El pocillo del pulmón 1010 inicialmente recibe todo el flujo. Después del pocillo del pulmón 1010, el flujo se repartirá en cuatro módulos de tejido. El módulo del hígado recibirá el 25% del líquido, el módulo de la grasa el 9%, el módulo de perfusión lenta el 15% y la sección de perfusión rápida el 51%. Al ajustar la geometría de los canales del flujo se repartirá el flujo desde el pocillo del pulmón 1010. Los canales hacia cada módulo serán de diferente longitud para equilibrar las caídas de presión y equilibrar el flujo. Después de que el líquido abandone los otros tejidos, se hará recircular de vuelta al compartimento del pulmón a través de la bomba 1060. Cada uno de los pocillos o módulos de tejido 1020, 1030, 1040 y 1050 contiene tejido. Los tubos a microescala 1022, 1032, 1042 y 1052 contienen el tejido dentro de los pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. Tal y como se muestra en la figura 10, sólo hay un tubo a microescala 1022, 1032, 1042 y 1052 por pocillo 1020, 1030, 1040 y 1050. Se debe destacar que se pueden colocar muchos microtubos en un pocillo.

En funcionamiento, hay dos métodos que permiten incorporar tejidos tridimensionales en un dispositivo ACC o en un chip 1000. Los dos métodos implican el flujo del medio inoculado a través de tubos a microescala de poliestireno o de vidrio. Las células a analizar se adhieren en el interior de los tubos y se agregan en tejidos tridimensionales. Los tubos se recogen, se atan y se colocan en los pocillos del chip 1000. Cada pocillo se convierte en un módulo de órgano por el que el fármaco acuoso fluirá para entrar en contacto con el tejido.

El primer método para permitir la incorporación de tejidos tridimensionales implica una estrategia de reactor de flujo directo. Se forman aberturas en un zócalo de silicio y, luego, el medio canalizado se pasa a través de las aberturas. El silicio sobre la superficie interior de las aberturas proporcionó un armazón para las células y se agregaron en tejidos tridimensionales. Para aplicar esta técnica a un ACC 1000 de polímero, los tubos de polímero se pueden tratar bien con una proteína de adhesión o bien las células se cultivan en un medio al que se ha añadido suero. Tanto el suero como la proteína de adhesión permiten que las células se adhieran a la superficie interior del tubo.

El segundo método implica cultivar las células en un reactor de microgravedad HARV. Al organizar estructuralmente los tubos en el centro del reactor en rotación, o al introducir tubos que flotan libremente en el medio de cultivo, las células forman agregados tridimensionales en algunos de los tubos. Debido a la pronunciada actividad de las células que proliferan en microgravedad, estas construcciones de tejido tienen un mejor funcionamiento en comparación con los tejidos bidimensionales o al tejido formado en el método anterior. Los tubos con tejido en su interior se pueden separar según el peso o la densidad y se pueden colocar en el dispositivo.

La figura 11 es una vista parcialmente isométrica de un dispositivo análogo al cultivo de células 1100 que incorpora el chip 1000. El chip 1000 incluye un área de cultivo para las células de pulmón 1010 y una multitud de pocillos que están conectados al área 1010 para el cultivo de las células de pulmón. Los pocillos incluyen un pocillo para el tejido de hígado 1020, un pocillo para el tejido adiposo 1030, un pocillo de perfusión lenta 1040 y un pocillo de perfusión rápida 1050. Los tubos a microescala que contienen los diferentes tejidos encajan dentro de los pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. Cada pocillo incluye una salida a un fondo elastomérico 1110 que está unido al chip 1000. El elastómero 1110 forma parte de una bomba. Un accionador 1120 presiona contra el elastómero para producir un bombeo que mueve el líquido del sistema 1100 o que hace circular el líquido del sistema 1100 desde los pocillos, de vuelta al módulo para el tejido de pulmón 1010 a través de una línea de retorno 1130. Se coloca una capa de vidrio sobre la tapa del chip para cubrir el módulo del tejido de pulmón 1010 y los distintos pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. Se debe destacar que los canales 1021, 1031, 1041 y 1051 están dimensionados para producir determinadas velocidades de flujo a través de los distintos pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. En vez de ajustar la longitud y la anchura de los distintos canales 1021, 1031, 1041 y 1051, se contempla que se puedan colocar otros restrictores del flujo a lo largo del canal para proporcionar variabilidad en las velocidades de flujo a los distintos pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. La tapa de vidrio 1140 se puede sustituir por una membrana que se flexiona, y se pueden añadir válvulas de bola con émbolo de manera que se pueden regular los flujos en los canales 1021, 1031, 1041 y 1051 por algo más que las dimensiones del canal.

Se puede fabricar el chip 1100 con silicio pero es más rentable fabricarlo de poliestireno o de algún otro plástico adecuado. Primero, se da forma a cada chip de silicio mediante los medios convencionales. Luego, se forma un molde de níquel a partir del silicio. Dicho de otro modo, se fabrica el chip 1000 mediante la réplica, moldeando el poliestireno y el elastómero de silicona sobre los moldes de silicio y de níquel. Por supuesto, la primera etapa en la fabricación de un chip de polímero es producir el chip en un zócalo de silicio. Inicialmente, se coloca una capa de sustancia fotoendurecible 1210 sobre un zócalo de silicio 1200. Se coloca una máscara sobre la sustancia fotoendurecible 1210. La máscara contiene la estructura de un área de cultivo del tejido de pulmón 1010. La máscara permite que la luz UV pase a la sustancia fotoendurecible para exponer sólo la parte que corresponde a la zona de pulmón 1010. Luego, se revela la sustancia fotoendurecible para producir una abertura 1211, que corresponde a la zona de cultivo del tejido de pulmón 1010. Después, el zócalo de silicio con la sustancia fotoendurecible se graba para producir la abertura del pulmón 1010 dentro del zócalo de silicio 1200. Luego, se retira la sustancia fotoendurecible 1210 del zócalo de silicio 1200, lo que deja el zócalo de silicio con el pocillo del pulmón 1010. A continuación, se coloca otra capa de sustancia fotoendurecible 1220 sobre el zócalo 1200. Se coloca una máscara sobre el zócalo. La máscara permite la exposición de los distintos pocillos o los canales de líquido, incluidos el 1021, 1031, 1041 y 1051, que se utilizan para conectar el pocillo de pulmón 1010 con los distintos pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. La máscara expone la sustancia fotoendurecible en el área del canal del líquido. Luego se revela la sustancia fotoendurecible para retirar la sustancia fotoendurecible expuesta que corresponde a los canales de flujo del líquido. Después, el área expuesta se graba a una profundidad deseada. A continuación, se retira la sustancia fotoendurecible 1220 restante, lo que deja un zócalo de silicio 1200 con un pocillo de pulmón 1010 y otros pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. La siguiente etapa es aplicar otra tercera capa de sustancia fotoendurecible 1230. Se coloca una máscara sobre la sustancia fotoendurecible y la máscara tiene aberturas que corresponden a los distintos pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. Se enmascara la sustancia fotoendurecible y se expone a luz UV para producir las aberturas que corresponden a los distintos pocillos. Se revela la sustancia fotoendurecible, lo que deja las áreas de silicio expuestas para los pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. Luego, el chip y la sustancia fotoendurecible 1230 se graban para producir los pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. Las aberturas que corresponden a los módulos de tejido 1020, 1030, 1040 y 1050 se graban con plasma a una profundidad de unos 750 \mum. Después, se graban húmedas las aberturas otros 250 \mum con KOH para formar un extremo afilado. El KOH grabará el silicio a lo largo de su plano cristalográfico en un ángulo de 54,7º. A continuación, se retira la sustancia fotoendurecible y se ha formado un zócalo de silicio a partir del cual se puede fabricar el molde de
níquel.

El níquel se galvanoplastia sobre el chip de silicio para crear un molde de níquel 1250. Luego, se utiliza el molde de níquel para echar o realzar el sustrato de polímero 1000. Para el moldeado de la réplica, se funde el polímero o se solubiliza en un disolvente adecuado y se vierte sobre el molde de níquel 1250 y se solidifica en la misma forma que tiene el chip de silicio inicial. Para el realce, véase la figura 5. Luego, se monta el chip de polímero 1000 sobre una concavidad del elastómero de silicona 1110. Se autosellan el polímero y la silicona, por lo que las capas formarán una sola unidad. Se coloca un accionador neumático 1120 por debajo del chip para bombear el líquido recogido de los distintos módulos de tejido 1020, 1030, 1040 y 1050. Cada segundo, la depresión se llenará con 0,032 \mul de líquido. Luego, el accionador empujará la silicona y hará que el líquido se escape a través de los microtubos de vuelta al compartimento del pulmón 1010. La concavidad elastomérica 1110 y el accionador 1120 forman la bomba 260 (mostrada en la figura 12). Después, se sella el polimetilmetacrilato recubierto con elastómero (PLEXIGLÁS^{TM}) 1140 en la parte superior del zócalo o del chip 1000.

Para equilibrar el tirón de presión creado a medida que la silicona se llena de líquido, se retira el polimetilmetacrilato (PLEXIGLAS^{TM}) sobre el compartimento de las células de pulmón 1010 y se reemplaza por una membrana de silicona. Esta membrana sube y baja en respuesta a la acción de la bomba de silicona y mantiene la presión equilibrada en el dispositivo. Los distintos tubos a microescala se colocan en los pocillos antes de colocar el polimetilmetacrilato recubierto de elastómero (PLEXIGLAS^{TM}) sobre el chip 1000. Una máquina para manejar los microtubos incluye un brazo adhesivo que se baja y recoge una cantidad específica de tubos cargados de tejido. La máquina transporta los tubos al dispositivo y empaqueta al máximo los tubos en los respectivos pocillos de los módulos 1020, 1030, 1040 y 1050. El elevado empaquetamiento permite que la fuerza de fricción mantenga los tubos en su sitio aunque se esté agitando el dispositivo análogo al cultivo de células. Esto minimiza la filtración del flujo del líquido alrededor de los tubos en los respectivos pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. Incluso con un estrecho ajuste, aproximadamente del 5 al 10% del flujo de líquido sortea los tubos y fluye directamente hasta la base de silicona o la concavidad del elastómero 1110.

La figura 13 muestra la concavidad del elastómero. La concavidad del elastómero es un pedazo de elastómero de silicona con una abertura esencialmente rectangular en ella. La abertura rectangular actúa como un depósito de líquido para los líquidos que vienen de los pocillos 1020, 1030, 1040 y 1050. La concavidad del elastómero 1110 tiene una abertura en un lado citada mediante el número de referencia 1300. La línea de retorno 1130 tiene un extremo que se une a la abertura 1300 en la concavidad de elastómero 1110 y otro extremo que se une al pocillo de pulmón 1010 del chip 1000.

En otra realización más, se reemplaza la concavidad del elastómero 1110 por una bomba de elastómero de silicona 1400, que se muestra en la figura 14. La bomba de elastómero de silicona 1400 está diseñada para reproducir de manera más exacta el flujo del aparato circulatorio en el chip 1000 y a lo largo del sistema representado mediante el número de referencia 1100. La bomba 1400 incluye una primera cámara pulmonar 1410 y una segunda cámara de sistema 1412, que son accionadas mediante los accionadores individuales 1420 y 1422. Con las numerosas cámaras 1410 y 1412, se crea una pauta de bombeo más realista fisiológicamente con la base elastomérica con numerosas depresiones en la parte inferior del chip 1000. Al crear las numerosas cámaras 1410 y 1412 en la depresión de elastómero de silicona 1400 teniendo accionadores que empujan sobre la sección de la base a unos intervalos de tiempo específicos, se replica la acción de bombeo de un corazón.

La figura 28A es una vista de diagrama de bloques que ilustra un sistema para controlar un dispositivo de cultivo a microescala, de acuerdo con una realización de la presente invención. En esta realización, el sistema 2800 incluye un primer dispositivo de cultivo a microescala 2806 acoplado a un instrumento de control 2802. El primer dispositivo de cultivo a microescala 2806 incluye una serie de cámaras a microescala (2808, 2810, 2812 y 2814) con geometrías que estimulan una serie de interacciones in vivo con un medio de cultivo, en el que cada cámara incluye una entrada y una salida para el flujo del medio de cultivo, y un canal microfluidico que interconecta las cámaras. El instrumento de control 2802 incluye un ordenador 2804 para adquirir datos del primer dispositivo de cultivo a microescala 2806 y los parámetros farmacocinéticos de control de éste.

En otra realización, el primer dispositivo de cultivo a microescala 2806 está formado en un chip informatizado. Además, el primer dispositivo de cultivo a microescala 2806 incluye uno o más sensores acoplados al instrumento de control 2802 para medir acontecimientos fisiológicos en las cámaras. Los sensores incluyen uno o más biosensores que monitorizan el oxígeno, el dióxido de carbono o el pH del medio de cultivo. El instrumento de control 2802 mantiene el primer dispositivo de cultivo a microescala 2806, y sella una tapa del primer dispositivo de cultivo a microescala 2806 para establecer el canal microfluidico. El instrumento de control 2802 proporciona las interconexiones microfluidicas, por lo que el microfluido entra y sale del dispositivo. En otra implementación, el ordenador 2804 controla un parámetro farmacocinético seleccionado del grupo que consiste en un grupo de velocidad de bombeo, temperatura, duración del experimento y frecuencia de la adquisición de datos del primer dispositivo de cultivo a microescala 2806. En una implementación, el ordenador 2804 proporciona una pantalla de ajuste de modo que un operador puede también especificar manualmente la velocidad de bombeo, la temperatura del dispositivo, la duración del experimento y la frecuencia de la adquisición de datos (por ejemplo, cada quince minutos). En otra implementación, el ordenador 2804 controla un parámetro farmacocinético seleccionado del grupo que consiste en velocidad de flujo, geometría de la cámara y número de células en el primer dispositivo de cultivo a microescala 2806. En esta implementación, el sistema 2800 proporciona respuestas más rápidas y más sensibles en comparación con los estudios con los animales enteros y los estudios de cultivo de tejido tradicionales. Al controlar los parámetros, el sistema 2800 ya no está basado en la fisiología. En otra implementación, el ordenador 2804 además controla una o más bombas en el primer dispositivo de cultivo a microescala 2806 para crear tiempos de permanencia del medio de cultivo en las cámaras (2808, 2810, 2812 y 2814) comparables a los encontrados en el cuerpo vivo. En otra implementación, el ordenador 2804 además controla una o más válvulas distribuidas a lo largo del canal microfluidico de un modo que es coherente con un valor de parámetro farmacocinético asociado a una parte simulada de un cuerpo
vivo.

En otra realización, el sistema 2800 incluye además un segundo dispositivo de cultivo a microescala que tiene una serie de cámaras a microescala con geometrías que simulan una serie de interacciones in vivo con un medio de cultivo, en el que cada cámara incluye una entrada y una salida para el flujo del medio de cultivo, y un canal microfluidico que interconecta las cámaras. El instrumento de control 2802 se acopla al segundo dispositivo de cultivo a
microescala.

La figura 28B es una vista de diagrama de bloques que ilustra otra realización de un sistema para controlar un dispositivo de cultivo a microescala. En esta realización, el sistema 2816 incluye el primer dispositivo de cultivo a microescala 2806 acoplado a un instrumento de control 2818. El instrumento de control 2818 incluye el ordenador 2804, una bomba 2820 para controlar la circulación del microfluido en el canal microfluidico del primer dispositivo de cultivo a microescala 2806, un elemento calentador 2822 para controlar la temperatura del primer dispositivo de cultivo a microescala 2806, una fuente de luz 2824 y un fotodetector 2826 para detectar emisiones fluorescentes de los compartimentos de células dentro del primer dispositivo de cultivo a microescala 2806. En una implementación, el ordenador 2804 graba los datos de la intensidad fluorescente utilizando un instrumento de medición de un tipo que se selecciona entre el grupo que consiste en colorimétrico, fluorimétrico, luminiscente y radiométrico. En otra implementación, el elemento calentador 2822 mantiene el dispositivo de cultivo a microescala 2806 a una temperatura de 37ºC.

La figura 29 es una vista en diagrama de flujo que ilustra un método informatizado para controlar dinámicamente un dispositivo de cultivo a microescala, de acuerdo con una realización de la presente invención. En esta realización, el método informatizado 2900 incluye los bloques 2902, 2904, 2906 y 2908. El bloque 2902 incluye el análisis de los datos de una serie de sensores que miden acontecimientos fisiológicos en una serie de cámaras del dispositivo de cultivo a microescala. El bloque 2904 incluye la regulación de las velocidades de flujo del líquido de un medio de cultivo en las cámaras del dispositivo de cultivo a microescala. El bloque 2906 incluye la detección de reacciones biológicas o toxicológicas en las cámaras del dispositivo de cultivo a microescala. Después de tal detección, el bloque 2908 incluye el cambio de uno o más parámetros farmacocinéticos del dispositivo de cultivo a
microescala.

En una realización, el bloque 2906 (es decir, la detección) incluye detectar un cambio de dimensión en un compartimento de células del dispositivo de cultivo a microescala. En una implementación, el bloque 2908 (es decir, el cambio) incluye cambiar un parámetro farmacocinético seleccionado del grupo que consiste en interacciones entre las células, tiempo de residencia del líquido, proporciones de líquido por célula, metabolización por las células y tensión de corte en el dispositivo de cultivo a microescala. En otra implementación, el bloque 2908 incluye cambiar un parámetro farmacocinético seleccionado entre un grupo que consiste en velocidad de flujo, geometría de la cámara y número de células en el dispositivo de cultivo a microescala.

En otra realización, el método informatizado 2900 además incluye optimizar la geometría de la cámara dentro del dispositivo de cultivo a microescala, en el que la optimización incluye seleccionar una cantidad de cámaras, elegir una geometría de cámara que ofrezca una proporción del tamaño del tejido u órgano adecuada, elegir una velocidad de flujo del líquido óptima que proporcione un tiempo de residencia del líquido adecuado y calcular una tensión de corte de las células.

En otra realización, el método informatizado 2900 además incluye regular una temperatura del medio de cultivo. En otra realización más, el método informatizado 2900 además incluye detectar las emisiones fluorescentes de un compartimento de células del dispositivo de cultivo a microescala.

En otra realización, un medio legible por ordenador incluye instrucciones ejecutables por un ordenador almacenadas en él para realizar las distintas realizaciones del método informatizado descrito anteriormente. En una implementación, el medio legible por ordenador incluye una memoria o un dispositivo de almacenamiento. En otra implementación, el medio legible por ordenador incluye una señal de datos informáticos incorporados en una onda portadora.

La figura 30 es una vista en diagrama de bloques que ilustra un ordenador para controlar un dispositivo de cultivo a microescala, de acuerdo con una realización de la presente invención. En esta realización, el ordenador 3000 incluye un microprocesador 3002, una memoria general 3004, un elemento de almacenamiento no volátil 3006, una interfaz de entrada/salida 3008 que incluye una interfaz para un dispositivo de cultivo a microescala que tiene uno o más sensores, y un programa informático. El programa informático es ejecutable sobre el microprocesador 3002 para regular las velocidades de flujo del líquido de un medio de cultivo en una serie de cámaras en el dispositivo de cultivo a microescala, detectar reacciones biológicas o toxicológicas en las cámaras del dispositivo de cultivo a microescala y, una vez realizada la detección, cambiar uno o más parámetros farmacocinéticos del dispositivo de cultivo a
microescala.

En una realización, el elemento de almacenamiento no volátil 3006 incluye datos históricos tomados de la información publicada, datos recogidos de pruebas ejecutadas previamente o datos derivados de cálculos teóricos. El programa informático regula las velocidades de flujo del líquido al transmitir órdenes a una o más bombas del dispositivo de cultivo a microescala mediante líneas de control de las bombas. En una implementación, el programa informático además es ejecutable en el microprocesador 3002 para regular una temperatura del medio de cultivo. El programa informático regula la temperatura al transmitir órdenes a una bobina del calentador del dispositivo de cultivo a microescala mediante líneas de control de la bobina del calentador.

En otra realización, el ordenador 3000 además incluye una memoria con tablas de búsqueda acoplada a la memoria general 3004 para almacenar un conjunto de ecuaciones de equilibrio de masas que presentan modelos farmacocinéticos basados en la fisiología para varias sustancias biológicas o químicas en el sistema, y una memoria caché acoplada al microprocesador 3002 para guardar el programa informático.

En otra realización, la interfaz de entrada/salida 3008 además incluye una interfaz de teclado, una interfaz de visualización y una interfaz para registrar en una impresora/ploteadora. En una implementación, el ordenador 3000 utiliza estas interfaces de entrada/salida para conectarse a los dispositivos periféricos de teclado, visualización y de impresora/ploteadora.

Datos experimentales

Los siguientes ejemplos se presentan para ofrecer a los expertos en la técnica una descripción detallada y una explicación completas de cómo fabricar y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que se considera como invención.

Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud en relación con los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones) pero surgen algunos errores y desviaciones. A menos que se indique de otro modo, partes son partes por peso, masa molecular es masa molecular media en masa, la temperatura está en grados Celsius; y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

Métodos

Los siguientes métodos se utilizan en el procedimiento experimental:

Cultivo de células. Se obtuvieron células de la American Type Culture Collection (Manassas, VA), y se propagaron en el medio de crecimiento completo recomendado en un incubador de cultivo de tejidos (O_{2} al 95%/CO_{2} al 5%). Para las células HepG2 y HepG2/C3A, el medio recomendado es el medio mínimo esencial de Eagle (con una disolución de sales equilibradas de Earle, L-glutamina a 2 mM, piruvato de sodio a 1,0 mM, aminoácidos no esenciales a 0,1 mM, bicarbonato de sodio a 1,5 g/l y suero bovino fetal al 10%) (EMEM). Se recomienda el medio 5a de McCoy con L-glutamina a 1,5 mM, bicarbonato de sodio a 1,5 g/l y suero bovino fetal al 10% para las
HCT116.

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Curvas de crecimiento. Se determinaron las curvas de crecimiento sembrando las células a una densidad inicial baja en placas de 35 mm. Cada día se desprendieron las células con tripsina-EDTA y se determinó un número de células contando visualmente las células con un hemocitómetro. Las determinaciones se hicieron por triplicado.

Reacción en cadena de la polimerasa acoplada a la transcriptasa inversa (RT-PCR). Se cultivaron células sobre cubreobjetos de vidrio tratados con colágeno, MATRIGEL^{TM}, o poli-lisina según era lo apropiado. Las células HepG2/C3A cultivadas a una monocapa con confluencia de aproximadamente el 90% se desprendieron con tripsina-EDTA y se sedimentaron a unas 500 g durante 5 minutos. Se aisló el ARN y se purificó con el kit RNAEASY^{TM} de Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se compró el ARN total de hígado humano adulto a Ambion. La cantidad y la pureza (proporción 260/280 nm) del ARN aislado se midió en un espectrofotómetro BIOPHOTOMETER^{TM} (Eppendorf). Luego, se incubó el ARN aislado a 37ºC durante 25 minutos con 2 U de ADNasa I y, posteriormente, se inactivó con el reactivo de inactivación de ADNasa (Ambion).

La reacción de RT se realizó utilizando una mezcla de 5 \mug de ARN y cebadores de oligo dT a 10 \muM que se calentó a 72ºC durante 2 minutos y, luego, se mantuvo 2 minutos en hielo. Después se mezclaron DTT a 5 mM, una mezcla de dNTP a 600 \muM, 40 U de rRNasin y 200 U de SUPERCRIPT II^{TM} en el tampón de transcriptasa inversa y se incubaron a 42ºC durante 1 hora.

Se utilizaron 2,0 \mul de la primera cadena del ADNc en reacciones de PCR de 50 \mul utilizando cebadores específicos de la isoforma del citocromo P450 [Rodríguez-Antona, C., Jover, R., Gómez-Lechon, M.-J., y Castell, J.V. (2000) Quantitative RT-PCR measurement of human cytochrome P-450s: application to drug induction studies: Arch. Biochem. Biophys., 376: 109-116]. Las condiciones de la PCR fueron: 94ºC durante 4 minutos seguidos de 28 ciclos de 40 segundos a 94ºC, 45 segundos a 60ºC, 50 segundos a 72ºC, y una última extensión de 4 minutos a
72ºC.

Se separaron los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,2% y se visualizaron mediante tinción con SYBR Gold y se estudió la autenticidad comparándolos con los estándares de masa molecular adecuados. Para cuantificar el ADNc amplificado, 15 \mul de cada reacción de PCR se diluyeron con tampón de Tris-EDTA a 0,1x y se colorearon con PICOGREEN^{TM} (Molecular Probes) a una concentración final de 1:400. Se midió la fluorescencia con excitación a 480 nm y emisión a 520 nm. Los resultados se estandarizaron frente a la \beta-actina y se hicieron por triplicado a partir de, al menos, dos experimentos diferentes.

Análisis de viabilidad, muerte y apoptosis celular. Se determinó la viabilidad y la muerte celular utilizando la exclusión con azul de tripano o tinción LIVE/DEAD (Molecular Probes). El azul de tripano (GIBCO), que normalmente no llega al citoplasma, identifica las células que tienen las membranas alteradas mediante la tinción visible azul de las células muertas o que se están muriendo. Una dilución 1:1 de una disolución al 0,4% (p/v) de azul de tripano se añade al medio de cultivo en recirculación del dispositivo del chip al concluir el experimento. Se bombeó esta disolución a desechar a través del chip durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se retiró la carcasa de la bomba y se visualizó con un microscopio de reflexión (Micromaster, Fisher).

La tinción LIVE/DEAD es una tinción de dos componentes que consiste en el éster acetoximetílico (AM) de calceína y un homodímero de etidio. Las células vivas hidrolizan activamente el resto del éster de acetoximetilo del AM de calceína para producir la fluorescencia verde brillante de calceína. En cambio, las células que tienen alterada la integridad de la membrana permiten que el homodímero de etidio, que normalmente es impermeable a la membrana, tiña el núcleo de rojo fluorescente en las células muertas o que se están muriendo. La tinción nuclear permanente de las células, Hoechst 33342, actúa como una tinción general para todas las células. Junto con los equipos de filtros adecuados, las células vivas emiten fluorescencia verde, roja las células que se están muriendo o las muertas, y las células totales se cuantifican mediante una fluorescencia nuclear azul. Para los experimentos descritos en la presente memoria, se utilizó azul de tripano al 0,2% (p/v), el AM de calceína a 1:20.000, el yoduro de propidio a 1:5000 y Hoechst 33342 a 10 \mug/ml. Se visualizaron las células con un microscopio de estereofluorescencia M2Bio (Zeiss). Se repitieron todos los experimentos al menos tres veces y se hicieron mediciones por
triplicado.

La apoptosis, o muerte celular programada, se puede monitorizar utilizando numerosos métodos [Smyth, P. G., Berman, S. A., y Bursztajn, S. (2000). Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques, 32: 648-665]. Para diferenciar la apoptosis de la necrosis, se necesitan, por lo menos, dos indicadores diferentes de la apoptosis [Wronski, R., Golob, N y Gryger, E., (2002). Two-color, fluorescence-based microplate assay for apoptosis detection. Biotechniques, 32: 666-668]. Un método, la unión de la anexina V-FITC, se basa en la observación de que la anexina V se une estrechamente a la fosfatidilserina en presencia de calcio divalente [Williamson, P., Eijnde,. S. v.d. y Schlegel, R. A. (2001). Phosphatidylserine exposure and phagocytosis of apoptotic cells. En "Apoptosis", Coords. L. M. Schwartz y J. D. Ashwll (San Diego, Academic Press), pág. 339-364]. Normalmente, la fosfatidilserina está presente en la cara interna de las membranas intracelulares, pero se transporta rápidamente a la membrana celular al comienzo de la apoptosis. Las células apoptósicas expuestas a la anexina marcada con fluoróforo muestran una tinción diferente a la de la membrana. Con el chip a microescala, la marcación de la anexina V-FITC se visualizó directamente en el chip, lavando, primero, el sistema con PBS, y luego haciendo recircular la anexina V-FITC (10 \mug/ml en un tampón de unión de la anexina V, Clontech) durante 30 minutos. A continuación se visualizaron las células directamente utilizando un equipo de filtros
FITC.

A diferencia de la marcación con anexina V, el kit APOTGAG^{TM} (Intergen Co., MA) utiliza la desoxinucleotidil-transferasa terminal para marcar los extremos 3'-OH libres del ADN expuestos durante la degradación apoptósica del ADN y la visualización con inmunofluorescencia [Li, X., Traganos, F., Melamed, M. R. y Darynkiewicz, Z. (1995) Single-step procedure for labeling DNA strand breaks with fluorescein-or BODIPY-conjugated deoxynucleotides. detection of apoptosis and bromodeoxyuridine incorporation. Cytometry 20, 172-180]. Aunque este método es muy específico para la apoptosis, no se puede llevar a cabo el procedimiento en el chip debido a las etapas de fijación e incubación. Brevemente, se hicieron funcionar los chips a microescala en las condiciones experimentales especificadas, se retiraron los chips de células de sus unidades de alojamiento, se fijaron en paraformaldehído al 1% y se procesaron con el kit APOPTAG^{TM} y el protocolo del fabricante.

Fabricación del chip a microescala y métodos experimentales. Se fabricaron los chips a microescala de la siguiente forma: se diseñó una estructura utilizando un programa de diseño asistido por ordenador (CAD) (Cadence) y se creó una fotomáscara de cromo con un generador de estructuras ópticas GCA/Mann 3600F. Luego, se transfirió esta estructura de gran resolución a un zócalo de silicio (de 3 pulgadas de diámetro) que contenía una capa delgada (aproximadamente 1 \mum) de sustancia fotoendurecible positiva (Shipley 1813) mediante la exposición del zócalo a la luz UV a través de la fotomáscara mediante un alineador de contacto Karl Suss MA6. Después de la exposición, se reveló la sustancia fotoendurecible, lo que expuso el silicio a través de la capa fotoendurecible en la estructura definida. Se grabó el silicio expuesto a una profundidad especificada (de 20 a 100 \mum) con un sistema de grabado de silicio en profundidad PlasmaTherm SLR 770 ICP. Se quitó la sustancia fotoendurecible del zócalo con acetona. Los chips a microescala individuales de 22 mm^{2} se cortaron a cuadraditos a partir del zócalo, se lavaron en Nanostrip (Cyantek), se enjuagaron en agua destilada y se secaron en un horno de secado a
170ºC.

La superficie de silicio en los compartimentos de órgano se trató con colágeno para facilitar la adhesión celular. Unos 10 \mul de una disolución a 1 mg/ml de colágeno de tipo I se depositó sobre la superficie del chip a microescala y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se retiró la disolución de colágeno y se enjuagaron los compartimentos de órgano con un medio de cultivo de células. Se disociaron las células de las placas de cultivo de tejidos, se determinó el número de células y se ajustó la concentración de tal forma que hubiera una monocapa confluente de células en cada compartimento de células. Por ejemplo, para el chip a microescala descrito en la figura 2 (más arriba), 10 \mul de una suspensión a 2400 células/\mul de las células L2 se depositó en la cámara del pulmón del chip de células y 15 \mul de una suspensión a 3400 células/\mul de las células H4IIE se depositaron en la cámara del hígado. Se dejó que las células se adhirieran en un incubador de CO_{2} durante una noche. Una vez que las células estaban unidas, se montó el chip en carcasas de chip acrílicas. La tapa de las carcasas contiene interconexiones de líquido para aportar el medio de cultivo al chip. Los tubos de acero inoxidable se conectan a un tubo de bombeo de pequeño calibre y se introducen en un pequeño agujero en la parte superior de un tubo de microcentrífuga que contiene el medio de cultivo con o sin el compuesto a comprobar. El tubo de bombeo se conecta a la bomba peristáltica, cebada con esta solución, y se conecta a los puertos de entrada de la carcasa del chip. Una pequeña parte del tubo de bombeo con un tubo de acero inoxidable conectado a su extremo se conecta al puerto de salida y se introduce el tubo en un pequeño agujero en la parte superior del microtubo, lo que completa el circuito de recirculación del líquido. Se coloca el instrumento entero en un incubador de CO_{2} a 37ºC. Un diagrama esquemático de esta configuración se presenta en la figura
22.

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Ejemplo 1

Cálculos para un sistema que replica una rata

Al diseñar el chip 1000, se encajaron todas las cámaras necesarias sobre un chip de silicio no más grande de 2 cm x 2 cm. Este tamaño de chip es fácil de fabricar y es compatible con los tamaños del tubo de conexión y los dispositivos de bombeo que se pretenden utilizar para dirigir el flujo del líquido. También hubo otros factores diferentes importantes que limitaron el diseño del dispositivo descrito más abajo, junto con valores aceptables para cada variable. Esta realización del dispositivo consiste en un sistema de dos compartimentos, representando un compartimento el hígado de una rata y el otro compartimento el pulmón de una rata. El tamaño total del chip es de 2 cm x 2 cm y consiste en una matriz interconectada de 20 canales paralelos de 40 \mum de ancho, 10 \mum de profundo y 5 mm de largo que sirve de cámara del "pulmón" y dos canales paralelos de 100 \mum de profundo y 10 \mum de largo en forma de serpentina que sirve de cámara del "hígado". Los dos compartimentos de órgano se conectan mediante un canal de 100 \mum de ancho y 20 \mum de profundidad. Hay otras muchas geometrías, dimensiones, número de cámaras, etc., posibles. Se eligió este diseño como ejemplo.

TABLA 1 Variables limitadoras en el diseño del dispositivo

1

Cálculos de la muestra Cálculos del canal o la cámara

En estos cálculos se supone que hemos obtenido una velocidad de flujo a partir de una iteración previa mediante el método descrito anteriormente en relación con el chip 1000 para el sistema 1100.

De esta manera, Q = 8,05 x 10^{5} \mum^{3}/foso-segundo.

Luego, se calculó el tiempo de permanencia del líquido en un foso de la siguiente manera:

2

A continuación, se calculó el número de células en una "longitud de célula":

3

Luego, se calculó un volumen de longitud de célula para el canal/cámara,

V_{TCL} = (Diámetro célula) \cdot (Área transversal del foso)

V_{TCL} = (7,41 \mum) \cdot (400 \mum^{2})

V_{TCL} = 2960 \mum^{3}

También se determinó el volumen de longitud de célula.

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4

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El volumen de líquido de la longitud de célula es simplemente el volumen de de las células de la longitud de célula restado del volumen de longitud de célula del canal/cámara. La proporción del volumen de la longitud de célula de las células y el volumen de la longitud de célula del líquido da la proporción de volumen de líquido por célula para el sistema:

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5

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Se determinaron las tensiones de corte sobre las células por separado asociadas a una velocidad de flujo determinada. Partiendo del volumen de longitud de célula del líquido y el diámetro de la célula, se calculó un área de superficie media disponible para que el líquido fluyera por ella.

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6

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Luego, se calculó una velocidad lineal media del líquido en el canal.

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Suponiendo un flujo laminar, se utilizó la ley de Stokes para calcular el arrastre sobre una esfera para estimar la tensión de corte total experimentada por una sola célula,

8

Luego, se verificó el tiempo de permanencia real del líquido en un canal/cámara y se calculó para el número total de células en el canal/cámara,

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I.B. Cálculos de oxigenación de la membrana

Se determinó el área de la membrana de silicona a oxigenar de la siguiente manera:

Primero, cálculo aproximativo de la velocidad de captación de oxígeno (VCO) para las células:

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Luego, se calculó la presión parcial de oxígeno sobre el interior de la membrana para determinar si es suficiente para reoxigenar el medio del líquido. Esto se hizo utilizando una ecuación para el flujo de un gas a través de una membrana porosa, donde Q es la permeabilidad de la membrana. J representa el flujo de gas en las células y z es el grosor de la membrana:

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11

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Esta presión es suficiente para saturar el medio líquido con oxígeno en los 200 s que está en contacto con la membrana. Se determinó el área de la membrana de una manera iterativa, para maximizar la presión parcial del oxígeno interior.

Cálculos que guían el diseño Modelo de rata

12

(El área de galvanoplastia es la inversa de las densidades de saturación determinadas experimentalmente para las células L2 y las H4IIE).

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14

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17

Cálculos del tiempo de permanencia Tiempos de permanencia reales (destino) en los tejidos de rata

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Características reales de los órganos

19

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Conversión de las unidades

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Cálculos utilizando una estructura en forma de serpentina

22

23

Ejemplo 2

Un chip con compartimentos para 4 órganos

Se diseño un chip que consistía en cuatro compartimentos para órganos, un compartimento de "hígado" para representar un órgano responsable del metabolismo xenobiótico, un compartimento de "pulmón" para representar un tejido de diana, un compartimento de "grasa" para proporcionar un sitio para la bioacumulación de los compuestos hidrófobos y un compartimento de "otros tejidos" para ayudar a imitar la pauta circulatoria en los tejidos que no metabolizan ni acumulan (figura 15). Éstos y otros compartimentos de órganos (por ejemplo, riñón, corazón, colon y músculo) se pueden modularizar totalmente como archivos CAD y se pueden fabricar en cualquier configuración o combinación. El propio dispositivo se puede producir en una gran variedad de sustratos (por ejemplo, silicio, vidrio o plástico).

Una vez que se inocularon las células en los compartimentos adecuados, se montó el chip en un colector Lucite. Este colector mantiene cuatro chips y contenía una tapa transparente para que se puedan observar las células in situ. La tapa contenía interconexiones de líquido para proporcionar el medio de cultivo de células al chip. Se bombeó el medio de cultivo a través del chip utilizando una bomba peristáltica a una velocidad de flujo de 0,5 \mul/min. Se hizo recircular el medio de cultivo en un circuito cerrado que consistía en un depósito fluidico (volumen total de unos 15 a 50 \mul), un tubo de pequeño calibre y los compartimentos y los canales del chip.

Utilizando un sistema de tres compartimentos con las células HepG2-C3A humanas en el compartimento para el hígado y las células de cáncer de colon HT29 en el compartimento de tejidos de destino, se encontró que esas células permanecen viables en continuo funcionamiento durante más de 144 horas. Las células HepG2-C3A son estirpes celulares humanas de hígado bien caracterizadas que se sabe que expresan diferentes enzimas del metabolismo del hígado a unos niveles comparables a los de los hepatocitos humanos primarios nuevos. En estos experimentos, se inocularon las células en los compartimentos adecuados y se hizo recircular un medio de cultivo de células especialmente formulado a través del sistema durante 144 horas. En varios puntos del tiempo se cambió el medio de cultivo a PBS que contenía el reactivo fluorescente LIVE/DEAD (tinción fluorescente dual, [Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregón, EE.UU.]) durante 30 minutos. Se visualizaron las células con un microscopio fluorescente y se obtuvieron imágenes fluorescentes de campos idénticos utilizando los equipos de filtros adecuados. Las células vivas emitían fluorescencia verde mientras que las células muertas la emitían roja (datos no mostrados).

Ejemplo 3

Metabolización de los fármacos en el chip

Se estudió la metabolización de dos profármacos ampliamente utilizados, el tegafur y el sulfóxido de sulindac, utilizando un chip a microescala que comprende tres compartimentos: hígado, tejido de destino y otros tejidos. Los dos profármacos requieren la conversión a un metabolito activo por las enzimas presentes en el hígado, y tienen un efecto citotóxico sobre un órgano de destino. Para el profármaco sulfóxido de sulindac, sus propiedades antiinflamatorias y quimiopreventivas del cáncer se derivan de sus metabolitos sulfuro y sulfona, catalizados por la enzima sulfóxido reductasa del hígado. Se ha demostrado que el metabolito sulfuro (y un segundo metabolito sulfona) induce la apoptosis en algunas células cancerosas (por ejemplo, cáncer de colon).

Una posología de tratamiento adecuada requiere la administración de su profármaco, el tegafur [5-fluoro-1-(2-tetrahidrofuril)-2,4(1H,3H)-pirimidi-nediona] ya que el propio 5-FU es muy tóxico para las células normales. Sin embargo, a diferencia del sulindac, el tegafur se convierte a 5-FU en el hígado, principalmente por el citocromo P450 2A6.

Para probar la eficacia del sulindac, se inoculó el chip a microescala con células HepG2-C3A en el compartimento del hígado y células del cáncer de colon humanas HT29 en el compartimento del tejido de destino. Se añadieron 100 \mumol de sulindac (falta el fabricante) al medio en recirculación durante 24 horas y se trató el chip tal y como se describió anteriormente: las células vivas emitieron fluorescencia verde y las células muertas la emitieron roja (datos no mostrados). En ausencia de las células de hígado HepG2-C3A se observó una mínima muerte celular (similar al control de vehículo). Estos resultados demuestran que se puede metabolizar un fármaco en el compartimento del hígado y, en consecuencia, circular hasta un destino, donde sus metabolito(s) inducen un efecto biológico muy parecido a como si fuera en un animal vivo o humano.

Se probó el profármaco terapéutico contra el cáncer, el tegafur, en el sistema del chip a microescala. Para ser eficaz, el tegafur requiere la activación metabólica por las enzimas citocromo P450 presentes en el hígado para dar su forma activa, 5-fluorouracilo (5-FU) [Ikeda, K., Yoshisue, K., Matsushima, E., Nagayama, S., Kobayashi, K., Tyson, C. A., Chiba, K., y Kawaguchi, Y. (2000) Bioactivation of tegafur to 5-fluorouracil is catalyzed by cytochromoe P-450 2A6 in human liver microsomes in vitro. Clin. Cancer. Res., 6, 4409-4415; Komatsu, T., Yamazaki, H., Shimada, N., Nakajima, M., y Yokoi, T. (2000) Roles of cytochromes P450 1A2, 2A6, and 2C8 in 5-fluorouracil formation from tegafur, an anticancer prodrug, in human liver microsomes. Drug Met. Disp., 28, 1457-1463; Yamazaki, H., Komatsu, T., Takemoto, K., Shimada, N., Nakajima, M., y Yokoi, T (2001). Rat cytochrome P450 1A and 3A enzymes involved in bioactivation of tegafur to 5-fluorouracil and autoinduced by tegafur liver microsomes. Drug Met. Disp., 29, 794-797]. Una posología terapéutica adecuada requiere la administración de su profármaco, el tegafur, ya que el propio 5-FU es muy tóxico para las células normales. El 5-FU es actualmente el tratamiento adyuvante más eficaz para los pacientes con cáncer de colon [Hwang, P. M., Bunz, F., Yu, J., Rago, C., Chan, T. A., Murphy, M. P., Kelso, G. F., Smith, R. A. J., Kinzler, K. W. y Vogelstein, B (2001). Ferredoxin reductase affects p53-dependent, 5-fluorouracil-induced apoptosis in colorectal cancer cells. Nat. Med., 7, 1111-1117]. Al igual que la mayoría de los antineoplásicos, el 5-FU induce una notable apoptosis en las células sensibles debido a la generación de especies reactivas de oxígeno [Hwang, P. M., Bunz, F., Yu, J., Rago, C., Chan, T. A., Murphy, M. P., Kelso, G. F., Smith, R. A. J., Kinzler, K. W., y Vogelstein, B. (2001) Ferredoxin reductase affects p53-dependent, 5-fluorouracil-induced in colorectal cancer cells. Nat. Med., 7., 1111-1117].

Para medir los efectos citotóxicos del tegafur contra las células del cáncer de colon, se preparó el chip a microescala con las células HepG2-C3A en el compartimento del hígado y las células del cáncer de colon humanas HCT-116 en el compartimento del tejido de destino. Se añadió el tegafur al medio en recirculación a varias concentraciones durante 24 horas y se marcaron las células con Hoechst 33342, un colorante del ADN permeable a la membrana, y un homodímero de etidio, un colorante del ADN impermeable a la membrana (véase el apartado Métodos). Todas las células emiten fluorescencia azul, pero las células muertas estaban marcadas por el homodímero de etidio rojo fluorescente (datos no mostrados). El tegafur era citotóxico para las células HCT-116 de una manera dependiente de la dosis en este sistema de chip a microescala, mientras que fue ineficaz con el análisis de cultivo de células tradicional (figuras 16A y 16B). Además, mientras que el 5-FU desencadenó la muerte celular en el análisis de cultivo de células tradicional, no se observó citotoxicidad hasta después de 48 horas de exposición, en comparación a las 24 horas de exposición al tegafur con el chip a microescala.

Para demostrar que el compartimento del hígado era el responsable de la bioactivación del tegafur, se inocularon los chips a microescala solamente con las células HCT-116. No hubo células en el compartimento del hígado. Se añadió tegafur o 5-FU al medio de cultivo en recirculación durante 24 horas y se trató el chip tal y como se describió anteriormente (datos no mostrados). El tegafur no causó una muerte celular importante de las células HCT-116 en ausencia de un compartimento del hígado, mientras que el metabolito activo 5-FU causó una considerable muerte celular. Además, cuando las células del cáncer de colon HT-29 se sustituyen por las HCT-116, el tegafur se mostró ineficaz (datos no mostrados). Probablemente, esto se debió a la p53 mutante presente en las células HT-29, que es necesaria para la citotoxicidad del 5-FU. Juntos, estos experimentos demuestran que el tegafur, como el sulindac, se metabolizó a un fármaco activo en el compartimento del hígado, donde se puso en circulación hasta otro compartimento de órgano para eliminar las células cancerosas. Estos efectos eran distinguibles desde el punto de vista mecanicista con el chip: el sulindac era eficaz incluso en ausencia de una p53 activa, mientras que el tegafur no.

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Ejemplo 4

Cultivos de diferentes células en un solo compartimento de órgano

También es posible utilizar una mezcla de varios tipos de células en un solo compartimento de órgano. En un estudio se utiliza la estirpe celular de hepatocitos HepG2/C3A (de la ATCC) en el compartimento para el hígado. Se propagan las células en un medio 5A de McCoy con L-glutamina a 1,5 mM/bicarbonato de sodio a 1,5 g/l y suero bovino fetal al 10%. Para imitar mucho mejor un órgano in vivo, se puede utilizar una mezcla de hepatocitos y fibroblastos primarios a una proporción de 1 a 2 junto con macrófagos (células de Kupffer).

En otro ejemplo, se utiliza una mezcla de células o estirpes celulares derivadas de células epiteliales del pulmón para imitar lo mejor posible el tejido de pulmón. Esto incluye una mezcla de células epiteliales de tipo I, células epiteliales de tipo II (neumocitos granulares), fibroblastos, macrófagos y mastocitos.

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Ejemplo 5

Optimización de las condiciones del cultivo de tejidos en el sistema basado en un chip

Se desarrolló un medio de cultivo de tejidos compatible con dos estirpes celulares diferentes de cultivo de células de rata, H4IIE (una estirpe celular de hígado de rata) y L2 (una estirpe celular de pulmón de rata). Los experimentos preliminares indicaron que en una mezcla 1:1 de DMEM y medio F12K de Hams enriquecido con L-glutamina a 2 mM, piruvato de sodio a 1 mM y suero bovino fetal (SBF) al 10% mantenían la viabilidad de las células H4IIE y L2 hasta las 20 horas de funcionamiento continuo en un chip a microescala. Se utilizó esta formulación de los medios para todos los estudios del chip a microescala basados en una rata.

Se eligió la estirpe celular de hígado humano adecuada que imita de forma más real el funcionamiento del hígado humano. Adicionalmente, se determinó la formulación óptima del medio de cultivo de células para mantener las estirpes celulares humanas en un chip a microescala. Se examinaron los niveles de expresión basales de tres isoformas claves (1A2, 3A4 y 2D6) del citocromo P450 (CYP) en las estirpes celulares HepG2 y HepG2/C3A (un subclón de HepG2). Se examinaron CYP-1A2, 2D6 y 3A4 porque dan cuenta de la metabolización del 80 al 90% de todos los fármacos conocidos [Hodgson, J., (2001) ADMET- turning chemicals into drugs. Nat. Biotech., 19, 722-726]. El subclón C3A de la estirpe celular de hígado HepG2 se examinó ya que se ha descrito que esta estirpe celular es una estirpe celular muy seleccionada que muestra unas características "más similares al hígado", particularmente una expresión CYP mucho mayor en comparación con la estirpe parental [Kelly, J. H. (1994). Permanent human hepatocyte cell line and its use in a liver assist device (LAD). Patente de los EE. UU. n.º 5.290.684]. El análisis por RT-PCR confirmó que los niveles basales de CYP en las células HepG2/C3A eran significativamente mayores que los de las parentales HepG2, y comparables al hígado humano adulto (figura 23).

Se utilizaron células HepG2/C3A como un sustituto del hígado en los experimentos posteriores. Para seleccionar un medio común para utilizarlos durante los experimentos con el chip a microescala, se compararon los componentes de una serie de medios (DMEM, 5a de McCoy, RPMI 1640, MEM, F12, F12K, de Waymouth, CMRL, MEM y medio de Dulbecco modificado de Iscove). El análisis de las sales inorgánicas, la glucosa, la composición de aminoácidos y el contenido de vitaminas sugirió que EMEM, DMEM, 5a de McCoy y RPMI era los medios "comunes" más adecuados de los medios examinados. A continuación, después de varios pases, se dividieron las células y se subcultivaron en los siguientes medios:

El medio mínimo esencial de Eagle (EMEM) con la disolución de sales equilibradas de Earle, L-glutamina a 2 mM, piruvato de sodio a 1,0 mM, aminoácidos no esenciales a 0,1 mM, bicarbonato de sodio a 1,5 g/l y suero bovino fetal al 10%.

El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con L-glutamina a 4 mM, glucosa a 4,5 g/l, bicarbonato de sodio a 1,5 g/l y suero bovino fetal al 10%.

El medio 5a de McCoy (McCoy) con L-glutamina a 1,5 mM, bicarbonato de sodio a 1,5 g/l y suero bovino fetal al 10%.

El medio RPMI 1640 (RPMI) con L-glutamina a 2 mM, glucosa a 4,5 g/l, piruvato de sodio a 1,0 mM y bicarbonato de sodio a 1,5 g/l.

A continuación se determinaron las curvas de crecimiento para ambas estirpes celulares en cada medio tal y como se describió en el apartado de Métodos (figura 24). Se encontró que el DMEM no era adecuado para las células HepG2/C3A porque se observaron cambios importantes en la morfología y la adhesión celular después de unos 5 pases (no mostrado). De forma similar, se observó una reducción importante en la viabilidad y el crecimiento de HepG2/C3A y HCT116 después de 3 días en RPMI. Ambas estirpes celulares crecieron bien en McCoy y EMEM en comparación con su medio preferido.

Luego se investigaron por RT-PCR los niveles de expresión de estas formas del CYP en las células HepG2/C3A creciendo en EMEM o bien en McCoy (véase el apartado Métodos) (figura 25). Los resultados indicaban que EMEM era superior a McCoy a la hora de mantener la expresión de CYP y que era el medio preferido para HepG2/C3A. Se estudió el efecto de diferentes sustratos de crecimiento sobre la expresión del CYP (figura 26). Se realizó una comparación del silicio tratado bien con poli-D-lisina o bien con colágeno como el sustrato de adhesión frente a las células cultivadas en poliestireno tratado con un cultivo de tejidos estándar. Juntos, los resultados indicaron que EMEM mantuvo el crecimiento de las células HepG2/C3A y HCT116, y que el colágeno era el sustrato preferido a partir del análisis de expresión del CYP mediante RT-PCR.

Utilizando estas condiciones, se estudió la viabilidad celular a largo plazo de estas células, HepG2/C3A y HCT116, en funcionamiento continuo en el sistema de chip a microescala. Utilizando un sistema de tres compartimentos con las células humanas HepG2/C3A en el compartimento del hígado y las células del cáncer de colon HCT116 en el compartimento de los tejidos de destino, se demostró que las células siguen siendo viables en funcionamiento continuo durante más de 144 horas. En estos experimentos, se inocularon las células en los compartimentos adecuados y se hizo recircular el EMEM a través del sistema durante hasta 144 horas. En distintos momentos (6, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 horas), se visualizaron las células vivas o muertas totales con la tinción LIVE/DEAD (datos no mostrados). Se visualizaron las células con un microscopio de fluorescencia y se obtuvieron imágenes fluorescentes de los mismos campos con los equipos de filtros adecuados. Las células vivas emitían fluorescencia verde mientras que las células muertas la emitían roja (datos no mostrados).

Ejemplo 6

Análisis para la detección de la citotoxicidad en un chip a microescala

El azul de tripano es el colorante que se utiliza con más frecuencia para distinguir las células viables de las células inviables; sólo las células inviables absorben el colorante y aparecen de color azul. Y al contrario, las células vivas sanas aparecen redondas y refringentes sin absorber el colorante azul. Los experimentos se realizaron con azul de tripano para determinar la viabilidad celular en un chip a microescala. Aunque el azul de tripano (véase el apartado de Métodos) es fácil de utilizar y requiere sólo un microscopio de luz para su visualización, las células viables absorberán el azul de tripano con el tiempo, lo que puede alterar los resultados. Además, el azul de tripano tiene una mayor afinidad por las proteínas del suero que por las proteínas celulares, por lo que el fondo es oscuro cuando se utilizan medios que contienen suero. Por lo tanto, se estudiaron métodos alternativos para distinguir las células viables de las células muertas.

Se optimizó el análisis LIVE/DEAD (véase el apartado de Métodos) utilizando células cultivadas sobre cubreobjetos de vidrio. Brevemente, se inocularon las células HepG2/C3A en cubreobjetos de vidrio tratados con poli-D-lisina y se trataron con y sin estaurosporina a 1 \muM durante 24 horas. La estaurosporina es un inhibidor de amplio espectro de las proteína cinasas y se sabe que induce la apoptosis en distintos tipos de células [Smyth, P. G., Berman, S. A. y Bursztajn, S. (2002) Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell deathc from the nervous system. Biotechniques, 32, 648-665]. Se lavaron los cubreobjetos con una disolución tamponada de fosfato (PBS), se añadieron reactivos de LIVE/DEAD y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se retiraron los cubreobjetos y se visualizaron (datos sin mostrar). Se encontró que la estaurosporina causaba claramente la muerte celular de las células HepG2/C3A (datos no mostrados)].

Después se optimizó el análisis para la detección de la citotoxicidad sobre el chip a microescala. Se inocularon los chips de células del chip a microescala con células HepG2/C3A en el compartimento del hígado y células HCT116 en el compartimento de los tejidos de destino tal y como se describe en el apartado de Métodos. Se cargaron los chips de células sobre el sistema de chip a microescala y se trataron con y sin estaurosporina a 1 \muM, tal y como se describió anteriormente. Después de una incubación de 24 horas, se cambió el medio en recirculación a PBS, se dejó fluir a través del sistema durante 30 minutos, luego se cambió a PBS que contenía los reactivos LIVE/DEAD y se hizo fluir a través del sistema durante 30 minutos más. Se retiró del sistema la carcasa acrílica que contenía los chips de células, se colocaron en un microscopio de estereofluorescencia y se visualizó el chip de células a través de la tapa trasparente de la carcasa (datos no mostrados). Se visualizaron las células en un microscopio de fluorescencia y se obtuvieron imágenes fluorescentes de los mismos campos utilizando los equipos de filtros adecuados. Las células vivas emitieron fluorescencia verde mientras que las células muertas la emitían roja (datos no mostrados). La estaurosporina a 1 \muM causó una muerte celular importante de las células HCT116 después de un tratamiento de 24 horas en comparación con los chips de células de control sin tratar (datos no mostrados).

Ejemplo 7

Análisis con chips para detectar la aparición de la muerte celular y distinguir entre la apoptosis o la necrosis

Se investigaron dos análisis diferentes para detectar la apoptosis. El primer análisis fue la técnica de marcación del extremo libre por BrdU con la desoxinucleotidil-transferasa terminal (TUNEL) basada en la inmunofluorescencia, disponible en forma de kit como APOPTAG^{TM} (Intergen Co., MA) (véase el apartado de Métodos). Primero se optimizó el análisis utilizando células cultivadas sobre cubreobjetos de vidrio. Brevemente, se inocularon las células HepG2/C3A sobre cubreobjetos de vidrio tratados con poli-D-lisina y se trataron con y sin estaurosporina. Se procesaron los cubreobjetos tal y como se describió (véase el apartado de Métodos). Se probaron distintas concentraciones de estaurosporina y tiempos de tratamiento, y los resultados indicaron que la estaurosporina a 1 \muM causaba una apoptosis importante en comparación con los controles sin tratar después de una incubación de 24 horas (datos no mostrados). A continuación, se optimizó el análisis para la detección de la apoptosis en el sistema del chip a microescala y se realizó una comparación del método APOPTAG^{TM} con la técnica de tinción LIVE/DEAD. Se inocularon los chips de células a microescala con las células HepG2/C3A en el compartimento del hígado y con las células HCT116 en el compartimento de los tejidos de destino tal y como se describió en el apartado de Métodos. Se cargaron los chips de células en el sistema de chip a microescala y se trataron con y sin estaurosporina a 1 \muM tal y como se describió anteriormente. Después de una incubación de 24 horas, se cambió el medio en recirculación a PBS durante 30 minutos. Se retiraron la mitad de los chips de células de la carcasa y se realizó el análisis APOPTAG^{TM} tal y como se describió anteriormente. Se dejaron los otros chips de células en el sistema del chip a microescala y se sometieron a la técnica de tinción LIVE/DEAD, tal y como se describió previamente. Se visualizaron las células en un microscopio de fluorescencia y se obtuvieron imágenes fluorescentes de los mismos campos con los equipos de filtros adecuados. Las células vivas emitieron fluorescencia verde mientras que las células muertas la emitían roja (datos no mostrados). Ambas técnicas produjeron unos resultados muy similares, es decir, una exposición de 24 horas a la estaurosporina a 1 \muM indujo una apoptosis importante (o citotoxicidad) en las células HCT116 en comparación con los controles sin tratar (datos no mostrados).

Se utilizó la anexina V-FITC para detectar la apoptosis en el sistema del chip a microescala tal y como se describió en el apartado de Métodos. Brevemente, se inocularon los chips de células del chip a microescala con células HepG2/C3A en el compartimento del hígado y con células HCT116 en el compartimento de los tejidos de destino. Se cargaron los chips de células en el sistema del chip a microescala y se trataron con y sin estaurosporina a 1 \muM tal y como se describió anteriormente. Después de una incubación de 6 horas, se cambió el medio en recirculación a PBS que contenía anexina V-FITC y Hoechst 33341, y se dejó que fluyera por todo el sistema durante 30 minutos. Se retiraron los chips de células de la carcasa acrílica y se visualizaron en un microscopio de fluorescencia. Se visualizaron las células en un microscopio de fluorescencia y se obtuvieron imágenes fluorescentes de los mismos campos con los equipos de filtros adecuados. Las células vivas emitían fluorescencia verde, mientras que las células muertas la emitían roja (datos no mostrados). La estaurosporina a 1 \muM causó una apoptosis importante después de un tratamiento de 6 horas en comparación con los chips de células de control sin tratar (datos no mostrados).

Ejemplo 8

Uso del naftaleno como un intoxicante del modelo

Se utilizó el naftaleno para estudiar la toxicidad, ya que se necesita la conversión enzimática en el hígado para la toxicidad en el pulmón. Por lo tanto, se estudiaron los efectos del naftaleno sobre una estirpe celular de pulmón de rata. Estos experimentos utilizaron un chip a microescala de tres compartimentos (hígado, pulmón y otros tejidos) basado en la rata con células H4IIE en el compartimento del hígado y células L2 de rata en el compartimento del pulmón. Se fabricaron los chips a microescala y se prepararon para los experimentos tal y como se describió en el apartado de Métodos.

Se hizo funcionar el sistema de chip a microescala durante 20 horas en presencia o ausencia de naftaleno a 250 \mug/ml antes de cambiar al PBS que contenía el azul de tripano. Se hizo recircular esta disolución a través del chip de células durante 30 minutos y se visualizó el chip con un microscopio de luz (véase el apartado de Métodos). El naftaleno causó una muerte celular importante de las células L2 de rata en el compartimento del pulmón del chip de células mientras que no se observó muerte celular en ausencia del naftaleno (datos no mostrados). No se observó muerte celular en el compartimento de las células H4IIE con o sin naftaleno ni en el compartimento de las células L2 en ausencia de las células H4IIE (datos no mostrados).

Estos resultados demuestran que el naftaleno se activa en el compartimento del "hígado" y que los metabolitos tóxicos circulan hasta el "pulmón" y causan la muerte celular. Estos resultados son coherentes con los datos obtenidos con el dispositivo ACC de sobremesa y lo esperado a partir del modelo FCBF [Sweeney, L. M., Shuler, M. L., Babish, J. G., y Ghanem, A. (1995). A cell culture analogue of rodent physiology: application of napthalene toxicology. Toxicol. in vitro, 9, 307-316].

Ejemplo 9

Un prototipo de chip a microescala humano

Se preparó un prototipo de biochip humano que contenía compartimentos para el pulmón, tejidos de destino y otros tejidos. Las dimensiones de los compartimentos y los canales eran las siguientes:

Entrada: 1 mm x 1 mm

Hígado: 3,2 mm de ancho x 4 mm de largo

Tejidos de destino: 2 mm x 2 mm

Otros tejidos: 340 \mum de ancho x 110 mm de largo

Salida: 1 mm x 1 mm

Canal que conecta el hígado a la conexión en Y: 440 \mum de ancho

Canal desde la conexión en Y hasta el tejido de destino: 100 \mum de ancho

Se fabrica el prototipo de biochip humano tal y como se describió anteriormente. La colocación de los compartimentos para los órganos pretende simular la exposición a un compuesto (fármaco) que se ha ingerido por vía oral. Cuando se ingiere un compuesto por vía oral, éste se absorbe y pasa a la sangre desde el intestino delgado o el intestino grueso. Desde ahí, circula directamente hasta el hígado a través de la vena porta hepática y luego se distribuye por todo el cuerpo (figura 27). Por lo tanto, con este diseño, el hígado es el primer compartimento de órgano, seguido de una división para un compartimento para otros tejidos y una cámara para el tejido de destino. El compartimento de otros tejidos representa la distribución y el mantenimiento de la sangre en el cuerpo, representando el compartimento para el tejido de la diana terapéutica de interés (por ejemplo, células de cáncer de colon que representan un tumor de colon).

Conclusión

La invención proporciona un dispositivo y sistemas de cultivo basado en la farmacocinética que, normalmente, incluyen una primera cámara de cultivo celular que tiene un extremo receptor y un extremo de salida, y una segunda cámara de cultivo celular que tiene un extremo receptor y un extremo de salida, y un conducto que conecta el extremo de salida de la primera cámara del cultivo celular al extremo receptor de la segunda cámara de cultivo celular. Preferiblemente, el dispositivo está basado en un chip, es decir, es de tamaño a microescala. Se puede hacer circular un medio de cultivo a través de la primera cámara del cultivo celular, a través del conducto y a través de la segunda cámara de cultivo. También se puede oxigenar el medio de cultivo en uno o más puntos del circuito de recirculación.

El dispositivo puede incluir un mecanismo para comunicar señales desde partes del dispositivo hasta una posición fuera del chip, por ejemplo, con una guía de ondas para comunicar señales desde partes del dispositivo hasta una posición fuera del chip. Pueden aparecer muchas guías de ondas, por ejemplo, una primera guía de ondas que comunica señales desde la primera cámara y una segunda guía de ondas que comunica señales desde una segunda cámara, etc.

En una realización, al menos una entre la primera cámara de cultivo de células y de la segunda cámara de cultivo de células es tridimensional. En otra realización, tanto la primera cámara de cultivo de células como la segunda cámara de cultivo de células son tridimensionales.

El dispositivo para mantener las células en un estado viable también incluye un mecanismo de circulación de líquido, puede ser un mecanismo de circulación de líquido por medio de flujo o un mecanismo de circulación de líquido que hace recircular el líquido. El dispositivo para mantener las células en un estado viable también incluye una vía de líquido que conecta, al menos, el primer compartimento y el segundo compartimento. En una realización, un desburbujeador retira las burbujas de la vía del flujo. El dispositivo puede incluir, además, un mecanismo de bombeo. El mecanismo de bombeo puede estar ubicado en el sustrato.

Se proporciona un método para ajustar el tamaño de un sustrato para mantener, al menos, dos tipos de células en un estado viable en, al menos, dos cámaras de células. El método incluye las etapas de determinar el tipo de células a mantener en el sustrato y de aplicar las restricciones de un modelo farmacocinético basado en la fisiología para determinar las características físicas del sustrato. La etapa de aplicar las restricciones de un modelo farmacocinético basado en la fisiología incluye determinar el tipo de cámara a formar sobre el sustrato, que también puede incluir determinar la geometría de, al menos, una de las cámaras de células y determinar la geometría de una vía de flujo que interconecta dos cámaras de células. La etapa de aplicar las restricciones obtenidas a partir de un modelo farmacocinético basado en la fisiología también puede incluir la determinación de la composición de los medios de flujo de la vía de flujo.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta memoria se incorporan en la presente memoria mediante referencia como si para cada publicación o solicitud de patente por separado se indicara específicamente y por separado que se incorpora mediante referencia.

Se debe entender que la descripción anterior pretende ser ilustrativa y no restrictiva. Otras muchas realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica después de revisar la descripción anterior. Por lo tanto, el alcance de la invención debe estar determinado con referencia a las reivindicaciones anexas, junto con todo el alcance de los equivalentes a los que tales reivindicaciones tienen derecho.

Claims (115)

1. Un dispositivo de cultivo que comprende una cámara para contener células, en el que la cámara tiene, al menos, una dimensión transversal interna de entre 0,1 \mum y 500 \mum, y en el que la cámara mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro que es comparable a, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vivo, y en el que la cámara comprende una entrada y una salida para el flujo del líquido.

2. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 1, que además comprende, al menos, una segunda cámara que contiene células, en el que la segunda cámara tiene, al menos, una dimensión transversal interna de entre 0,1 \mum y 500 \mum, y en el que la segunda cámara mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro que es comparable a, al menos, un valor de parámetro farmacocinético encontrado in vivo, en el que la segunda cámara comprende una segunda entrada y una segunda salida para el flujo del líquido y, al menos, un canal microfluidico que interconecta la primera y la segunda cámaras, en el que el canal microfluidico tiene, al menos, una dimensión transversal interna de entre 0,1 \mum y 500 \mum.

3. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 1, que además comprende, al menos, un canal microfluidico que se conecta a la cámara, en el que el canal microfluidico tiene, al menos, una dimensión transversal interna de entre 0,1 \mum y 500 \mum.

4. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 2, en el que la geometría de interconexión de las cámaras proporciona, al menos, un valor de parámetro farmacocinético.

5. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones dependientes de la reivindicación 1, en el que la cámara es un canal o un tubo.

6. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 1, en el que el flujo del líquido a través de la cámara proporciona, al menos, un valor de parámetro farmacocinético.

7. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 1, en el que la geometría de la cámara se basa en un modelo matemático.

8. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 4, en el que la geometría de interconexión de las cámaras se basa en un modelo matemático.

9. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las características del flujo del líquido se basan en un modelo matemático.

10. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el modelo matemático es un modelo farmacocinético basado en la fisiología ("FCBF").

11. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 7, en el que la geometría de la cámara además comprende, al menos, una entre el grupo que consiste en resaltes paralelos y pilares escalonados.

12. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 2, en el que la segunda cámara tiene una geometría diferente a la de la primera cámara.

13. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células se adhieren a una superficie interior de la cámara.

14. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una parte de la cámara se recubre para facilitar la adhesión de las células con, al menos, uno entre el grupo que consiste en una proteína de adhesión, colágeno, poli-lisina y MATRIGEL.

15. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una o más cámaras adicionales que contienen uno o más tipos adicionales de células en condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro comparable a, al menos, un valor farmacocinética obtenido in vivo, en el que una o más cámaras adicionales comprenden una entrada y una salida para el flujo del líquido.

16. El dispositivo del cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprenden al menos un sensor para obtener señales de las células cultivadas.

17. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 16, en el que al menos un sensor se selecciona, al menos, entre uno de un grupo que consiste en un biosensor y una guía de ondas.

18. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, en el que, al menos, un sensor es un biosensor que monitoriza, al menos, uno del grupo que consiste en oxígeno, dióxido de carbono y el pH del líquido.

19. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que, al menos, un sensor mide acontecimientos fisiológicos.

20. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 19, en el que los acontecimientos fisiológicos se seleccionan entre, al menos, uno del grupo que consiste en muerte celular, proliferación celular, diferenciación, respuesta inmunitaria o alteraciones en el metabolismo o las vías de transducción de la señal.

21. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que se obtienen datos farmacocinéticos desde, al menos, un sensor.

22. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que los sensores se integran con el dispositivo y proporcionan una lectura en tiempo real del estado fisiológico de las células.

23. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende el líquido.

24. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 23, en el que el líquido fluye a través de, al menos, una cámara.

25. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 23, en el que el líquido fluye en recirculación a través de, al menos, una cámara.

26. El sistema de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, al menos, un parámetro farmacocinético se selecciona entre, al menos, uno del grupo que consiste en proporción del tamaño del tejido, proporción tejido:volemia, tiempo de permanencia del fármaco, medición de las interacciones entre las células, tiempo de permanencia del líquido, proporciones de líquido por célula, metabolización por las células, tensión de corte, velocidad de flujo, geometría de las cámaras y el número de células en el dispositivo de cultivo.

27. El sistema de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada cámara mantiene las células en condiciones que proporcionan, al menos, dos valores de parámetros farmacocinéticos in vitro comparables a, al menos, dos valores de parámetros farmacocinéticos obtenidos in vivo.

28. El dispositivo de cultivo o sistema de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un mecanismo de bombeo.

29. El dispositivo de cultivo o sistema de la reivindicación 28, en el que el mecanismo de bombeo se selecciona entre, al menos, uno del grupo que consiste en una bomba integrada en el dispositivo, una bomba externa al dispositivo, una bomba peristáltica, una bomba de diafragma o una bomba microelectromecánica.

30. El dispositivo de cultivo o sistema de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un desburbujeador ubicado dentro del canal microfluidico.

31. El dispositivo de cultivo o sistema de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un desburbujeador ubicado fuera del dispositivo.

32. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dispositivo se fabrica a microescala.

33. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dispositivo se fabrica a partir de un molde fabricado a microescala.

34. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos una de las cámaras asegura el crecimiento tridimensional de las células.

35. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos una de las cámaras contiene numerosas células.

36. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células se seleccionan entre, al menos, una del grupo que consiste en tejido sano, tejido enfermo, una parte de una biopsia de tejido, una parte de tejido, una parte de una arteria, una parte de una vena, una parte de un tubo digestivo, una parte de un esófago, una parte de un colon, una parte de un órgano, una parte de un corazón, una parte de un cerebro, una parte de un riñón, una parte de un pulmón, una parte de un músculo, una célula eucariótica, una célula vegetal, una célula animal, una célula de mamífero, una célula procariótica, una célula primaria, una célula tumoral, una célula madre, una célula alterada genéticamente, una célula transformada y una célula inmortalizada.

37. El dispositivo de cultivo o sistema de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos una de las cámaras contiene células en circulación o adherentes.

38. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cámara se forma de un material que consiste en uno entre el grupo de un plástico o silicio.

39. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 38, en el que el material de plástico se selecciona entre, al menos, uno del grupo que consiste en poliestireno, polimetilmetacrilato, policarbonato, politetrafluoroetileno, polivinilcroluro, polidimetilsiloxano y polisulfona.

40. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende una bomba acoplada a la primera entrada.

41. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 2, que además comprende una bomba acoplada a la segunda salida y a la primera entrada.

42. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la geometría de la cámara mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro comparable a, al menos, un valor de parámetro farmacocinético encontrado in vivo asociado a la función de una parte de un cuerpo vivo, y una bomba para hacer circular el líquido.

43. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 2, en el que la geometría de interconexión de las cámaras mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro comparable a, al menos, un valor de parámetro farmacocinético encontrado in vivo, asociado al funcionamiento de una parte de un cuerpo vivo, y una bomba para hacer circular el líquido.

44. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, al menos, una cámara mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro comparable a, al menos, un valor de parámetro farmacocinético encontrado in vivo asociado a la interacción del líquido con, al menos, dos del grupo que consiste en hígado, pulmón, un área de líquido perfundido lentamente, grasa y un área de líquido perfundido rápidamente.

45. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un controlador.

46. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 45, en el que el controlador controla una bomba para crear tiempos de permanencia del líquido en, al menos, una cámara comparables a los encontrados en una o más partes del cuerpo vivo.

47. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 45 ó 46, que además comprende válvulas distribuidas a lo largo de, al menos, un pase de líquido, y en el que el controlador controla las válvulas para proporcionar valores de parámetros farmacocinéticos asociados al funcionamiento de, al menos, una parte del cuerpo
vivo.

48. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, en el que la cámara está formada sobre un sustrato.

49. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 48, en el que el controlador está acoplado electrónicamente al sustrato.

50. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 48, en el que el controlador está acoplado a uno o más sensores.

51. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 45 a 50, y que además comprende una tabla de búsqueda que tiene valores de parámetros farmacocinéticos asociados a, al menos, una parte del cuerpo vivo a utilizar por el controlador.

52. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 2, que comprende;

una bomba;

al menos dos cámaras seleccionadas del grupo que consiste en una cámara de hígado que mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro comparable a, al menos, un valor de parámetro farmacocinético encontrado in vivo asociado a un hígado, una cámara de perfusión lenta, una cámara perfusión rápida, y una cámara de grasa que mantiene las células en unas condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro comparable a, al menos, un valor de parámetro farmacocinético encontrado in vivo asociado al funcionamiento de la grasa; y

numerosos canales microfluidicos que se acoplan a la bomba y, al menos, las dos cámaras en serie o en paralelo.

53. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende una matriz de dispositivos de cultivo, en el que los dispositivos funcionan por separado y en paralelo el uno respecto al otro.

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54. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende una serie de dispositivos acoplados fluidicamente, en el que una salida fluidica de un primer dispositivo está conectada directa o indirectamente a, al menos, una entrada fluidica de uno, o más, segundo(s) dispositivo(s).

55. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 54, en el que las series de dispositivos acoplados fluidicamente además comprenden salidas fluidicas de uno o más segundo(s) dispositivo(s) a, al menos, una entrada fluidica de uno o más dispositivos adicionales.

56. El dispositivo de cultivo de las reivindicaciones 53 a 54, en el que los dispositivos están acoplados para simular barreras biológicas.

57. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 56, en el que las barreras biológicas son barreras gastrointestinales o la barrera hematoencefálica.

58. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 53 a 57, en el que el número de dispositivos es mayor que aproximadamente 10.

59. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende una carcasa para encerrar el dispositivo de cultivo.

60. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un instrumento de control acoplado al dispositivo de cultivo, teniendo el instrumento de control un ordenador para adquirir datos del dispositivo de cultivo y para controlar los parámetros farmacocinéticos del mismo.

61. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 60, en el que el dispositivo de cultivo está formado en un chip que además comprende un circuito electrónico.

62. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 60 ó 61, en el que el instrumento de control mantiene el dispositivo de cultivo, y sella una tapa del dispositivo de cultivo para establecer un canal microfluidico.

63. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 60 a 62, en el que el instrumento de control además comprende, al menos, uno entre el grupo que consiste en una bomba para controlar la circulación del líquido en el dispositivo de cultivo, un elemento calentador para controlar la temperatura del dispositivo de cultivo, una fuente de luz y un fotodetector para detectar las emisiones fluorescentes de las células que

\hbox{están dentro del dispositivo de
cultivo.}

64. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 63, en el que un ordenador además graba los datos de la intensidad fluorescente.

65. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 64, en el que el ordenador graba los datos de la intensidad fluorescente utilizando un instrumento medidor de un tipo que se selecciona entre, al menos, uno del grupo que consiste en colorimétrico, fluorimétrico, luminiscente y radiométrico.

66. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 63 a 65, en el que el elemento calentador mantiene el dispositivo de cultivo a una temperatura de 37ºC.

67. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 63 a 66, en el que el ordenador controla un parámetro farmacocinético seleccionado entre, al menos, uno del grupo que consiste en velocidad de bombeo, temperatura, duración del experimento y frecuencia de la adquisición de datos del dispositivo de cultivo.

68. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 63 a 67, en el que el ordenador controla un parámetro farmacocinético seleccionado entre, al menos, uno del grupo que consiste en velocidad del flujo, geometría de la cámara y número de células en el dispositivo de cultivo.

69. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 63 a 68, en el que el ordenador además controla una o más bombas del dispositivo de cultivo para proporcionar, al menos, un valor farmacocinético.

70. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 63 a 69, en el que el ordenador además controla una o más válvulas distribuidas a lo largo del canal microfluidico de una manera que es coherente con un valor de parámetro farmacocinético asociado a una parte de un organismo vivo.

71. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el líquido se selecciona entre, al menos, uno del grupo que consiste en un medio de cultivo, un líquido biológico, sangre, suero y plasma.

72. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un ordenador, comprendiendo el ordenador un microprocesador; una memoria general; un elemento de almacenamiento no volátil; una interfaz de entrada/salida que incluye una interfaz al dispositivo de cultivo a microescala que tiene uno o más sensores; y un programa informático ejecutable en el microprocesador para analizar los datos de los sensores para medir acontecimientos fisiológicos en varias cámaras del dispositivo de cultivo, regular las velocidades de flujo de un medio de cultivo en las cámaras del dispositivo de cultivo, detectar reacciones biológicas o toxicológicas en las cámaras del dispositivo de cultivo y, una vez realizada la detección, cambiar uno o más parámetros farmacocinéticos del dispositivo de cultivo a microescala.

73. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 72, en el que el ordenador cambia uno o más parámetros farmacocinéticos del dispositivo de cultivo en respuesta a los datos.

74. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 72, en el que el elemento de almacenamiento no volátil incluye datos históricos tomados de la información publicada, datos recogidos de pruebas ejecutadas anteriormente o datos obtenidos de cálculos teóricos.

75. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 72 a 74, en el que el programa informático regula las velocidades de flujo del líquido transmitiendo órdenes a una o más bombas del dispositivo de cultivo a través de las líneas de control de las bombas.

76. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 72 a 75, en el que el programa informático además es ejecutable en el microprocesador para regular una temperatura del líquido.

77. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 76, en el que el programa informático regula la temperatura transmitiendo órdenes a una bobina del calentador del dispositivo de cultivo a través de las líneas de control de la bobina del calentador.

78. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 72 a 77, y que además comprende, al menos, uno del grupo que consiste en una memoria de búsqueda para guardar un conjunto de ecuaciones de equilibrio de masas que representan modelos farmacocinéticos basados en la fisiología para varias sustancias biológicas o químicas en el sistema, y una memoria caché acoplada al microprocesador para guardar el programa informático.

79. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 72 a 78, en el que la interfaz de entrada/salida es, al menos, una del grupo que consiste en una interfaz del teclado, una interfaz de visualización y una interfaz registradora.

80. El dispositivo de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 79, en el que, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro no se desvía más del 25% de un valor teórico.

81. El dispositivo de cultivo de la reivindicación 26, en el que la tensión de corte es sustancialmente 8-14 dinas/cm^{2}.

82. Un método para formar un dispositivo de cultivo, comprendiendo el método la formación de una cámara para contener células, en el que la cámara tiene, al menos, una dimensión transversal interna entre 0,1 \mum y 500 \mum, y en el que la cámara mantiene las células en unas condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro que es comparable, al menos, a un valor de parámetro farmacocinético encontrado in vivo, y en el que la cámara comprende una entrada y una salida para el flujo del líquido.

83. El método de la reivindicación 82, que además comprende la formación de una segunda cámara que contiene células, en el que la segunda cámara tiene, al menos, una dimensión transversal interna entre 0,1 \mum y 500 \mum, y en el que la segunda cámara mantiene las células en las condiciones que proporcionan, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro que es comparable a, al menos, un valor de parámetro farmacocinético encontrado in vivo, en el que la segunda cámara comprende una segunda entrada y una segunda salida para el flujo del líquido, y que forma un canal microfluidico que interconecta la primera y la segunda cámaras, en el que el canal microfluidico tiene, al menos, una dimensión transversal interna entre 0,1 \mum y 500 \mum.

84. El método de la reivindicación 82, que además comprende la formación de, al menos, un canal microfluidico que se conecta a la cámara, en el que el canal microfluidico tiene, al menos una dimensión transversal interna entre 0,1 \mum y 500 \mum.

85. El método de la reivindicación 84, en el que la geometría de interconexión de las cámaras se estructura para proporcionar, al menos, un valor de parámetro farmacocinético.

86. El método de una cualquiera de las reivindicaciones dependientes de la reivindicación 82, en el que la cámara se estructura como un canal o un tubo.

87. El método de la reivindicación 82, en el que el flujo del líquido a través de la cámara proporciona, al menos, un valor de parámetro farmacocinético.

88. El método de la reivindicación 82, en el que la geometría de la cámara se estructura basándose en un modelo matemático.

89. El método de la reivindicación 85, en el que la geometría de interconexión de las cámaras se basa en un modelo matemático.

90. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 82 a 89, en el que el flujo del líquido se basa en un modelo matemático.

91. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 88 a 90, en el que el modelo matemático es un modelo farmacocinético basado en la fisiología ("FCBF").

92. El método de la reivindicación 82, que además comprende la formación dentro de la cámara de, al menos, uno del grupo que consiste en resaltes paralelos o pilares escalonados.

93. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende la adhesión de las células a una superficie interior de la cámara con, al menos, uno del grupo que consiste en una proteína de adhesión, colágeno, poli-lisina y MATRIGEL.

94. El método de la reivindicación 82, en el que la cámara se forma mediante realce, moldeado por inyección o estampación.

95. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 82 a 94, que además comprende polimerizar las superficies de la cámara.

96. El método de la reivindicación 95, en el que los materiales poliméricos en la superficie de la cámara o del canal proporcionan una mejora de la dirección del líquido, la adhesión celular o la disgregación celular.

97. El método de la reivindicación 82, que además comprende:

poner en contacto las células con una variable de entrada; y

monitorizar, al menos, un parámetro de salida.

98. El método de la reivindicación 97, en el que la etapa de monitorizar, al menos, un parámetro de salida comprende obtener información de, al menos, un sensor en el dispositivo.

99. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 97 ó 98, en el que la variable de entrada se selecciona entre, al menos, una del grupo que consiste en un compuesto orgánico, un compuesto inorgánico, una muestra compleja, un fármaco, una muestra medioambiental, una muestra nutricional, un producto de consumo, un virus, liposoma, nanopartícula, polímero biodegradable, partícula radiomarcada o toxina, biomolécula, partícula conjugada a una toxina y un agente estabilizador.

100. El método de la reivindicación 99, en el que el agente estabilizador se selecciona entre, al menos, uno del grupo que consiste en albúmina, polietilenglicol, poli(acetato de etileno-co-vinilo), o poli(lactido-co-glucólido).

101. El método de la reivindicación 82, que además comprende proporcionar células que generan un producto biológico.

102. El método de la reivindicación 101, en el que las células comprenden una célula hospedadora modificada genéticamente para producir un producto génico exógeno.

103. El método de la reivindicación 101, en el que el producto biológico es un factor de crecimiento, un factor regulador, una hormona peptídica o un anticuerpo.

104. El método de la reivindicación 101, que además comprende aislar el producto biológico del líquido utilizando una técnica de aislamiento estándar.

105. El método de la reivindicación 104, en el que la técnica de aislamiento es HPLC, cromatografía en columna o electroforesis.

106. El método de la reivindicación 82, que además comprende un método informatizado para controlar dinámicamente el dispositivo de cultivo, teniendo el método informatizado, al menos, uno entre el grupo que consiste en:

analizar los datos de múltiples sensores para medir los acontecimientos fisiológicos en múltiples cámaras del dispositivo de cultivo;

regular las velocidades de flujo del líquido de un líquido en las cámaras del dispositivo de cultivo; detectar reacciones biológicas o toxicológicas en las cámaras del dispositivo de cultivo; y

cambiar uno o más parámetros farmacocinéticos del dispositivo de cultivo.

\newpage

107. El método de la reivindicación 82, que además comprende un medio legible por ordenador que tiene instrucciones ejecutables por ordenador guardadas en éste para realizar un método, comprendiendo el método, al menos, uno del grupo que consiste en:

analizar los datos de múltiples sensores para medir los acontecimientos fisiológicos en numerosas cámaras del dispositivo de cultivo;

regular las velocidades de flujo del líquido de un líquido en las cámaras del dispositivo de cultivo;

detectar las reacciones biológicas o toxicológicas en las cámaras del dispositivo de cultivo; y

cambiar uno o más parámetros farmacocinéticos del dispositivo de cultivo.

108. El método de las reivindicaciones 106 ó 107, en el que la detección incluye detectar un cambio en la dimensión de la cámara.

109. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 106 a 108, en el que el cambio incluye cambiar un parámetro farmacocinético seleccionado entre, al menos, uno del grupo que consiste en interacciones entre las células, tiempo de permanencia del líquido, proporciones de líquido por célula, metabolización por las células y tensión de corte en el dispositivo de cultivo.

110. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 106 a 108, en el que el cambio comprende cambiar un parámetro farmacocinético seleccionado entre, al menos, uno del grupo que consiste en velocidad del flujo, geometría de la cámara y número de células en el dispositivo de cultivo.

111. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 106 a 110, en el que el método además comprende optimizar la geometría de la cámara dentro del dispositivo de cultivo, y en el que la optimización incluye, al menos, una del grupo que consiste en seleccionar una cantidad de cámaras, elegir una geometría de cámara que proporciona una proporción adecuada del tamaño de tejido u órgano, elegir una velocidad de flujo del líquido óptima que proporciona un tiempo de permanencia del líquido adecuado y calcular una tensión de corte en el dispositivo de cultivo.

112. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 106 a 111, en el que el método además comprende regular una temperatura del líquido.

113. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 106 a 112, en el que el método además comprende detectar las emisiones fluorescentes desde la cámara.

114. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 82 a 113, en el que, al menos, un valor de parámetro farmacocinético in vitro no se desvía más del 25% de un valor teórico.

115. El método de la reivindicación 111, en el que la tensión de corte es sustancialmente de 8-14 dinas/cm^{2}.