ES2827526T3 - Cultivo de células - Google Patents

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Abstract

Aparato para proporcionar un flujo bidireccional del fluido, el aparato comprende: un aparato de cultivo (1) para cultivar células y/o un tejido o porción del mismo, y que comprende un cuerpo contenedor (10), el cuerpo contenedor comprende una pluralidad de cámaras (12) para contener un medio de cultivo de tejidos y al menos una vía de comunicación de fluidos (22) que se extiende entre al menos dos cámaras respectivas de la pluralidad de cámaras, un soporte del cuerpo contenedor (102); y al menos un elemento de accionamiento dispuesto para balancear un cuerpo contenedor, soportado a través del soporte para, de esta manera, subir y bajar repetidamente los extremos separados del cuerpo contenedor, en donde el aparato se configura para balancear repetidamente el cuerpo contenedor; caracterizado porque cada vía de comunicación de fluidos permite el flujo bidireccional del fluido entre dichas al menos dos cámaras, y en donde el aparato comprende, además, un elemento de plataforma soportado por el soporte del cuerpo contenedor, dicho elemento de plataforma se configura para retener el cuerpo contenedor en una ubicación fija durante el balanceo, y además en donde el elemento de accionamiento se configura para balancear el cuerpo contenedor a una velocidad de aproximadamente 1 a 20 minutos por movimiento de balanceo completo.

Description

DESCRIPCIÓN
Cultivo de células
Campo de la invención
Los aspectos de la presente invención se refieren a aparatos para usarse en técnicas de cultivo de células y de tejidos. Particularmente, aunque no exclusivamente, las modalidades de la presente invención se refieren a aparatos que contribuyen a proporcionar un ambiente dinámico al cultivo celular. También se describen en la presente descripción los métodos para cultivar células y/o tejidos, junto con métodos in vitro para probar la eficacia de fármacos, así como también otros temas.
Antecedentes de la invención
El cultivo de células y tejidos juega un papel considerable en la investigación de las ciencias de la vida, tanto básicas como aplicadas. Un dispositivo estándar usado en cultivos de células o de tejidos, o para realizar ensayos químicos o celulares, es la placa de pocillos múltiples. Las placas de pocillos múltiples están disponibles en una variedad de formatos. Para muchas aplicaciones generales del cultivo celular y la ingeniería de tejidos, los formatos de 6, 12, 24, 48 y 96 pocillos se usan con mayor frecuencia, aunque también se usan placas de mayor densidad, por ejemplo, 384, 1536 o superiores. Las placas de pocillos múltiples se usan en varios formatos de ensayos biológicos, ya que son muy adecuadas para analizar varias muestras simultáneamente. El equipo de laboratorio automatizado, tal como lectores de placas, aparatos de cribado de alto rendimiento y similares, se han desarrollado específicamente para ser usados en asociación con el formato de pocillos múltiples. Como resultado, la placa de pocillos múltiples se ha convertido en un formato estándar para ensayos biológicos.
Una desventaja de usar placas de pocillos múltiples convencionales es que la complejidad del ambiente fisiológico no se replica. Por ejemplo, los tejidos y los órganos del cuerpo son continuamente perfundidos in vivo por los sistemas sanguíneo y linfático. Esta perfusión permite la eliminación constante de los productos de desecho celular y el aporte de nuevos nutrientes. Típicamente, el cultivo de células estáticas no representa con precisión este sistema, incluso si los medios se eliminan y reemplazan regularmente. Además, las placas de pocillos múltiples conocidas no proporcionan ninguna forma de estímulo químico o físico dinámico, tales como gradientes de concentración, de flujo, de presión o de esfuerzo mecánico, a las células situadas en los pocillos. Como resultado, las pruebas in vitro mediante el uso de placas de pocillos múltiples convencionales, a menudo no representan ambientes in vivo.
Como resultado, existe un interés creciente en desarrollar sistemas de cultivo más dinámicos, que permitan alterar el ambiente que rodea a las células o los tejidos en cultivo durante el curso del experimento.
Se han diseñado varios biorreactores con el objetivo de representar con mayor precisión el ambiente in vivo. Estos biorreactores "dinámicos" están destinados para proporcionar modelos más precisos de enfermedades humanas en los que, por ejemplo, probar la eficacia y la toxicidad de las moléculas de fármaco candidatas.
Kirkstall Limited, Reino Unido, proporciona un ejemplo de un sistema de biorreactor que se basa en un mecanismo de bombeo. Este sistema utiliza una pluralidad de cámaras de cultivo celular "modulares", un circuito de control electrónico y una bomba peristáltica que bombea fluido, por ejemplo, medios de cultivo celular a través de una cámara.
El campo del desarrollo de fármacos es un ejemplo de un campo, en el que el desarrollo de sistemas dinámicos in vitro puede ser ventajoso. Los proyectos de desarrollo de fármacos suelen terminarse después de costosos ensayos clínicos en humanos, cuando son evidentes efectos secundarios inaceptables, toxicidad o falta de eficacia terapéutica. Es deseable el desarrollo de sistemas in vitro que predigan con precisión los fármacos que serán seguros y eficaces en el hombre, antes del inicio de los ensayos clínicos in vivo.
Un área terapéutica de interés es el desarrollo de compuestos anti-fibróticos para tratar trastornos fibróticos. Las actuales herramientas de investigación estándar de oro, que se usan para comprender la enfermedad fibrótica y probar moléculas candidatas anti-fibróticas, se limitan a cultivos 2D de células formadoras de cicatrices y a moléculas de fibrosis in vivo, en roedores. Estos enfoques tienen una serie de debilidades asociadas. En primer lugar, la fibrosis es un trastorno complejo que involucra múltiples tipos de células, muchas de las que carecen de sistemas de cultivo 2D. Además, los modelos pre­ clínicos en roedores no representan con precisión la enfermedad humana, ya que carecen de algunas de las características importantes de la patología clínica humana.
Idealmente, los cortes de órganos humanos, por ejemplo, los cortes de hígado, se usarían en sistemas de cultivo in vitro. Sin embargo, las técnicas que implican el uso de cortes de órganos están actualmente limitadas, debido a su tiempo de vida limitado en cultivo. El tiempo de vida puede extenderse mediante el uso de los sistemas de cultivo de células dinámicos existentes, los que utilizan mecanismos de bombeo complejos para generar movimiento de fluido en el sistema. Sin embargo, los sistemas existentes tienen limitaciones debido a su costo y al tiempo requerido para configurar y ejecutar el sistema. Adicionalmente, el número de cortes de órganos que pueden cultivarse simultáneamente es limitado.
El documento US 5422270A se refiere a una prueba de bandeja de una etapa para la liberación de mediadores solubles. El documento US 2003/017582 A1 se refiere a un dispositivo y a un método para monitorear la migración de leucocitos. El documento WO 03/078565 A1 se refiere a un dispositivo de prueba de quimiotaxis y de motilidad celular.
El documento WO 2011/161480 A1 se refiere a una placa de ensayo de pocillos múltiples.
El documento WO 2006/097749 A1 se refiere a dispositivos fluídicos para el cultivo de células y de embriones. El documento WO2003/083044 describe métodos de cultivo de células y de tejidos que implican el uso de una placa de micro-pocillos con inserciones de cultivo, que pueden colocarse en una plataforma de balanceo o en mezcladores de placa giratorios.
El documento WO2016/163315 se refiere a un sistema para propagar células. Los cultivos celulares no están conectados de forma fluida.
Es un objetivo de los aspectos de la presente invención mitigar, al menos parcialmente, los problemas asociados con la técnica anterior.
Es un objetivo de ciertas modalidades de la presente invención, proporcionar un sistema de biorreactor rentable que sea adecuado para cultivar células y/o tejidos, por ejemplo, cortes de tejido.
Es un objetivo de ciertas modalidades de la presente invención proporcionar un sistema y un método que, por ejemplo, reflejen con mayor precisión el ambiente in vivo de la enfermedad.
Es un objetivo de ciertas modalidades de la presente invención proporcionar un aparato que utilice un pequeño volumen de medios de cultivo celular.
Resumen de ciertas modalidades de la invención
En la presente descripción se describe un aparato para cultivar células y/o un tejido, que comprende:
un cuerpo contenedor que comprende una pluralidad de cámaras que contienen un medio de cultivo celular, en donde el cuerpo contenedor comprende al menos una vía de comunicación de fluidos que se extiende entre al menos dos cámaras respectivas de la pluralidad de cámaras, lo que permite, en cada vía de comunicación de fluidos, un flujo bidireccional del fluido entre al menos dos cámaras.
Este aparato también puede denominarse como un "aparato de cultivo" o una placa de pocillos múltiples. Por lo tanto, el aparato de cultivo descrito en la presente descripción puede incluir una placa de pocillos múltiples. El término "placa de pocillos múltiples" es conocido en la técnica y tales placas comprenden, típicamente, una pluralidad de cámaras o pocillos. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un aparato como se reivindicó en la reivindicación 1.
Por lo tanto, ciertas modalidades de la presente invención proporcionan un sistema de biorreactor rentable, de rendimiento medio o alto. Acertadamente, el sistema introduce un flujo bidireccional de medios de cultivo a través de cámaras de un aparato de placa sin la necesidad de una bomba. Acertadamente, los volúmenes de los medios necesarios para el sistema son pequeños, lo que puede ser ventajoso para el descubrimiento de fármacos.
El aparato proporcionado se configura para proporcionar un flujo bidireccional del fluido, y que incorpora un aparato que comprende:
un soporte del cuerpo contenedor; y
al menos, un elemento de accionamiento dispuesto para balancear un cuerpo contenedor, soportado a través del soporte para, de esta manera, subir y bajar repetidamente los extremos separados del cuerpo contenedor, y que puede denominarse "aparato de balanceo".
En ciertas modalidades, el cuerpo contenedor puede separarse del soporte del cuerpo contenedor y/o de al menos un elemento de accionamiento. Acertadamente, el cuerpo contenedor puede ubicarse adyacente a una superficie del soporte del cuerpo contenedor.
Acertadamente, las cámaras están dispuestas en un patrón regular. Acertadamente, las cámaras están configuradas para alojar un cultivo celular o tisular y un volumen predeterminado de medios de cultivo celular. Como se menciona en la presente descripción, el término "tejido" puede referirse a una porción de tejido, por ejemplo, un corte de órgano.
En una modalidad, cada cámara de dicha pluralidad de cámaras comprende un elemento base y al menos un elemento de pared lateral. Acertadamente, la vía de comunicación de fluidos comprende un canal de paso que se extiende entre un elemento base o un elemento de pared lateral, de una primera de la pluralidad de cámaras, hasta un elemento base o un elemento de pared lateral de otra de la pluralidad de cámaras.
Acertadamente, a vía de comunicación de fluidos comprende una ranura de paso que se extiende entre un elemento base o un elemento de pared lateral, de una primera de la pluralidad de cámaras, a un elemento base o un elemento de pared lateral de otra de la pluralidad de cámaras. En ciertas modalidades, la primera cámara se proporciona adyacente a la cámara adicional. En ciertas modalidades, la primera cámara y la cámara adicional están conectadas a través de la vía de comunicación de fluidos, a una o más cámaras adicionales, de la pluralidad de cámaras.
En ciertas modalidades, el cuerpo contenedor comprende una pluralidad de vías de comunicación de fluidos, que se extiende cada vía de comunicación de fluidos entre al menos dos cámaras de la pluralidad de cámaras.
Acertadamente, cada vía de comunicación de fluidos, de la pluralidad de vías de comunicación de fluidos, está sustancialmente paralela, y separada entre sí, de otras vías de comunicación de fluidos.
En ciertas modalidades, cada cámara de la pluralidad de cámaras se configura para alojar un elemento de inserción de cámara, configurado para soportar un elemento de andamio celular.
En ciertas modalidades, cada cámara de la pluralidad de cámaras comprende una abertura para recibir y/o retirar medios de cultivo de los tejidos y/o un elemento de inserción de cámara respectivo.
En ciertas modalidades, el aparato comprende además al menos un elemento de inserción de cámara generalmente cilíndrico, que comprende una pluralidad de pestañas que se extienden radialmente hacia afuera para soportar el elemento de inserción de cámara, dentro de una cámara respectiva de la pluralidad de cámaras. En una modalidad, el aparato de cultivo comprende una pluralidad de cámaras, lo que comprende en cada cámara un elemento de inserción.
Acertadamente, cada elemento de inserción de cámara respectivo comprende, además, un elemento de andamio celular. Acertadamente, el elemento de andamio celular comprende una pluralidad de poros, dicha pluralidad de poros tiene un diámetro promedio de entre aproximadamente 8 pm a aproximadamente 150 pm. En ciertas modalidades, el tamaño promedio de los poros puede ser, por ejemplo, 8 pm, 10 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm o 150 pm. En ciertas modalidades, los poros tienen un diámetro promedio de entre aproximadamente 8 pm a aproximadamente 100 pm. Acertadamente, los poros se proporcionan en una superficie inferior del elemento de andamio celular.
En ciertas modalidades, el elemento de andamio celular comprende una superficie interna, en donde la superficie interna está recubierta con una molécula biológica. La molécula biológica puede ser, por ejemplo, una proteína de andamio como, por ejemplo, colágeno.
En ciertas modalidades, el cuerpo contenedor comprende al menos doce cámaras, por ejemplo, 12, 24, 96 o más. En una modalidad, el cuerpo contenedor comprende 24 cámaras.
En ciertas modalidades, el cuerpo contenedor comprende un elemento de pared perimetral exterior. Acertadamente, el elemento de pared perimetral exterior comprende una porción del borde exterior rebajada. Acertadamente, el elemento de pared perimetral exterior es un elemento de pared perimetral exterior continuo. Acertadamente, el elemento de pared perimetral exterior continuo es plano. Es decir, en ciertas modalidades, el cuerpo contenedor no requiere conexión con una bomba o tubería y, por tanto, comprende una región de borde exterior que no comprende ningún elemento de entrada o de salida. Además, el cuerpo contenedor no contiene elementos configurados para la conexión, por ejemplo, con tubos.
Acertadamente, el cuerpo contenedor comprende una superficie inferior que comprende una región de borde rebajada que se configura para ubicarse con respecto a la porción de borde exterior rebajada de un cuerpo contenedor adicional, de manera que los cuerpos contenedores están ubicados en una relación anidada. En ciertas modalidades, una pluralidad de cuerpos contenedores puede ubicarse en una relación apilada verticalmente, por ejemplo, relación anidada.
Acertadamente, el cuerpo contenedor consiste, esencialmente, en la pluralidad de cámaras al menos una vía de comunicación de fluidos, un elemento de pared perimetral exterior, en donde cada una de dicha pluralidad de cámaras está conectada mediante una trama de material.
En ciertas modalidades, el cuerpo contenedor se compone de un material seleccionado de poliestireno, policarbonato, polietileno, polipropileno, PMMA, acetato de celulosa, Zeonex™, Zeonor™ y vidrio.
En ciertas modalidades, cada cámara respectiva de la pluralidad de cámaras tiene una profundidad de entre aproximadamente 16 mm y 19 mm, por ejemplo, 16 mm, 16,5 mm, 17 mm, 17,5 mm, 18 mm, 18,5 mm o 19 mm.
En una modalidad, el canal tiene un ancho de aproximadamente 1,5 mm a 3,5 mm, por ejemplo, aproximadamente 2 mm. En una modalidad, el canal tiene una longitud de entre aproximadamente 3 mm a aproximadamente 5 mm. En una modalidad, el canal tiene una longitud de aproximadamente 3,5 mm a aproximadamente 4 mm.
En ciertas modalidades, cada cámara puede tener una profundidad de entre aproximadamente 16 mm y 19 mm, por ejemplo, 16 mm, 16,5 mm, 17 mm, 17,5 mm, 18 mm, 18,5 mm o 19 mm. En una modalidad, la cámara tiene una profundidad de aproximadamente 18 mm. En una modalidad, la cámara tiene una profundidad de aproximadamente 16,5 mm.
En ciertas modalidades, el aparato de cultivo comprende, además, un elemento de tapa que se coloca de manera desmontable sobre el cuerpo contenedor, el elemento de tapa proporciona un recubrimiento sustancialmente plano que se extiende sobre la pluralidad de cámaras.
En ciertas modalidades, la pluralidad de cámaras se dispone en filas y columnas, en una relación ortogonal respectiva dentro del cuerpo contenedor.
En ciertas modalidades, el aparato de cultivo puede apilarse con relación a al menos otro aparato de cultivo.
Acertadamente, el soporte del cuerpo contenedor comprende un elemento de pivote alrededor del que se balancea el cuerpo contenedor.
El aparato de la invención comprende un elemento de plataforma soportado por el soporte del cuerpo contenedor, el elemento de plataforma es configurado para retener el cuerpo contenedor en una ubicación fija durante el balanceo. El elemento de plataforma se configura para soportar y/o retener una pluralidad de cuerpos contenedores en una ubicación fija durante el balanceo. Acertadamente, la pluralidad de cuerpos contenedores se retiene en un arreglo lado-a-lado, adyacente a una superficie superior del elemento de plataforma. En ciertas modalidades, el aparato comprende una pluralidad de cuerpos contenedores, en un arreglo apilado verticalmente.
El elemento de accionamiento del aparato de la invención se configura para balancear el cuerpo contenedor, a una velocidad de aproximadamente 1 minuto a 20 minutos por movimiento de balanceo completo.
En ciertas modalidades, el elemento de accionamiento comprende un actuador lineal. Acertadamente, el elemento de plataforma comprende una región de primer extremo y una región adicional de extremo separada de la primera región de extremo, y en donde el actuador lineal está ubicado, tanto en la región de primer extremo como en la región de extremo adicional.
En ciertas modalidades, el aparato comprende, además, un elemento base, en donde el elemento de base comprende una ranura en la que puede ubicarse el elemento de pivote.
En ciertas modalidades, ni el aparato de cultivo ni el aparato de balanceo comprenden una bomba para forzar el flujo del fluido entre las cámaras adyacentes.
También se describe en la presente descripción un aparato para balancear repetidamente un cuerpo contenedor, dicho cuerpo contenedor comprende una pluralidad de cámaras para contener medios de cultivo celular o tisular, en donde el cuerpo contenedor comprende al menos una vía de comunicación de fluidos que se extiende entre al menos dos cámaras respectivas de la pluralidad de cámaras, cada vía de comunicación de fluidos permite el flujo bidireccional del fluido entre dichas al menos dos cámaras, dicho aparato comprende:
un soporte del cuerpo contenedor; y
al menos un elemento de accionamiento dispuesto para balancear un cuerpo contenedor, soportado a través del soporte, para de esta manera, subir y bajar repetidamente los extremos separados del cuerpo contenedor.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método de cultivo in vitro de células y/o un tejido o porción del mismo, el método comprende:
a) proporcionar un aparato de cultivo de la invención; y
b) durante un período de tiempo predeterminado, aplicar un movimiento de balanceo al aparato de cultivo.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método de cultivo in vitro de células y/o un tejido o porción del mismo que comprende:
a) proporcionar un aparato de la invención; y
b) durante un período de tiempo predeterminado, aplicar un movimiento de balanceo al aparato de cultivo.
En ciertas modalidades, el método comprende, además, ubicar al menos una célula en al menos una cámara de la pluralidad de cámaras. Acertadamente, el método comprende, además, ubicar una porción de tejido que comprende al menos una célula en al menos una cámara de la pluralidad de cámaras.
En ciertas modalidades, el método comprende ubicar la porción de tejido mediante la ubicación de al menos un elemento de inserción de cámara que soporta la porción de tejido en al menos una cámara del cuerpo contenedor. Acertadamente, al menos una célula se proporciona en un cultivo celular.
En ciertas modalidades, el cultivo celular es soportado por un elemento de andamio celular, y el método comprende, además, ubicar el cultivo celular mediante la ubicación de al menos un elemento de inserción de cámara que aloja el elemento de andamio celular en al menos una cámara del cuerpo contenedor.
En ciertas modalidades, al menos una célula se selecciona de células eucariotas y células procariotas, por ejemplo, células vegetales, células de mamífero, células de levadura, células fúngicas y/o células bacterianas. Acertadamente, al menos una célula es una célula de mamífero seleccionada de células epiteliales, células tumorales, hepatocitos, células de fibroblastos, células madre, miocardiocitos, células renales, células pulmonares, células neuronales, adipocitos, células intestinales, células de la piel y células inmunitarias, tanto solas como en combinación.
Acertadamente, al menos una célula está comprendida dentro de una porción de tejido, por ejemplo, un corte de órgano. Acertadamente, la porción de tejido se obtiene de un tejido seleccionado de un pulmón, un hígado, un riñón, un corazón, un cerebro, piel, un páncreas. En ciertas modalidades, el cultivo celular y/o la porción de tejido comprenden una pluralidad de tipos de células.
En ciertas modalidades, al menos una cámara es una primera de la pluralidad de cámaras y además, en donde la primera cámara está conectada al menos a una cámara más de la pluralidad de cámaras a través de una vía de comunicación de fluidos que se extiende entre ellas, la vía de comunicación de fluidos permite el flujo bidireccional del fluido, entre la primera cámara y la cámara adicional.
Acertadamente, el elemento de inserción de la cámara comprende una superficie de base que comprende una pluralidad de poros. Acertadamente, la pluralidad de poros se configura para permitir el flujo bidireccional del medio de cultivo celular fluido a través de estos.
En ciertas modalidades, el método comprende:
proporcionar un medio de cultivo celular fluido a la primera y/o la cámara adicional y;
aplicar el movimiento de balanceo durante un período de tiempo predeterminado, de manera que el medio de cultivo celular fluido fluya repetidamente desde, al menos una cámara, a una más de la pluralidad de cámaras, y retorne otra vez.
Acertadamente, el método comprende proporcionar entre aproximadamente 0,5 ml a 5 ml, por ejemplo, 0,5 ml, 0,75 ml, 1 ml, 1,25 ml, 1,5 ml, 1,75 ml, 2 ml, 2,25 ml, 2,5 ml, 3 ml, 3,25 ml, 3,5 ml, 3,75 ml, 4 ml, 4,25 ml, 4,5 ml, 4,75 ml o 5 ml del medio de cultivo celular fluido por cámara, a la primera y/o la cámara adicional de la pluralidad de cámaras.
Acertadamente, el método comprende proporcionar entre aproximadamente 1,5 ml a 4 ml del medio de cultivo celular fluido por cámara, a la primera y/o la cámara adicional de la pluralidad de cámaras. En ciertas modalidades, la cantidad de fluido de medios de cultivo celular añadido a cada cámara será dependiente del tamaño de la cámara y/o del tamaño del poro proporcionado por una inserción de andamio celular.
En ciertas modalidades, el método comprende, además, localizar un cultivo celular, en donde el cultivo celular se siembra con al menos una célula, y un elemento de andamio celular en al menos dos cámaras de la pluralidad de cámaras, y en donde el cultivo celular ubicado en una primera cámara respectiva, se siembra con células del mismo o de diferente tipo celular al cultivo celular ubicado en una cámara respectiva adicional.
En ciertas modalidades, el método comprende;
ubicar un aparato de cultivo, como se describe en la presente descripción, para ser soportado por un elemento de plataforma de un aparato, de acuerdo con la invención;
proporcionar una fuerza impulsora al elemento de accionamiento; y
subir y bajar repetidamente los extremos separados del cuerpo contenedor, para aplicar un movimiento de balanceo al cuerpo contenedor.
En ciertas modalidades, el método comprende aplicar un movimiento de balanceo durante al menos 24 horas, por ejemplo, 48 horas, 72 horas o más.
Acertadamente, el método comprende, además, determinar la viabilidad u otro parámetro medible de la(s) célula(s) en el cultivo celular. Acertadamente, el o cada cultivo celular comprende hepatocitos, y además en donde la etapa de determinar la viabilidad celular u otro parámetro medible comprende medir la producción de albúmina por la(s) célula(s) del cultivo celular.
En ciertas modalidades, el método comprende ubicar una pluralidad de aparatos de cultivo para que sean soportados por el elemento de plataforma del aparato de balanceo. Acertadamente, el método comprende ubicar la pluralidad de aparatos de cultivo para ser soportados en un arreglo lado-a-lado, en una superficie superior del elemento de plataforma.
En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un método para probar in vitro la toxicidad hepática de un agente que comprende:
a) proporcionar un aparato de cultivo de acuerdo con la invención;
b) ubicar un cultivo celular o un tejido o una porción del mismo que comprende al menos un hepatocito y un elemento de andamio celular en al menos una cámara de la pluralidad de cámaras;
c) añadir al menos un agente a probar a dicha al menos una cámara;
d) durante un período de tiempo predeterminado, aplicar un movimiento de balanceo al aparato; y
e) monitorear al menos un efecto del agente sobre el hepatocito.
En ciertas modalidades, monitorear al menos un efecto del agente comprende monitorear efecto del agente sobre la proliferación y/o la diferenciación y/o la función del hepatocito, como medida de la toxicidad del agente.
Acertadamente, el hepatocito está comprendido en un corte de hígado. Las células hepatocitos pueden ser humanas o no humanas. Las células hepatocitos, por ejemplo, el corte de hígado, puede comprender células hepatocitos primarias. Alternativamente o adicionalmente, las células hepatocitos, por ejemplo, el corte de hígado, puede comprender células hepatocitos no primarias, por ejemplo, hepatocitos derivados de células madre o hepatocitos derivados de células progenitoras. Las células hepatocitos pueden derivarse recientemente de un paciente, o de un donante, o de donantes múltiples, o de una fuente crioconservada.
El método puede comprender adicionar medios de cultivo celular a la cámara. El método también puede comprender adicionar el agente al hepatocito colocado dentro de una cámara. Puede agregarse una combinación de agentes. El agente puede ser, por ejemplo, un candidato a fármaco.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para modelar in vitro la enfermedad tisular, que comprende:
a) proporcionar un aparato de cultivo de acuerdo con la invención;
b) ubicar una porción de tejido, lo que comprende la porción de tejido al menos una célula y un elemento de andamio celular en al menos una cámara de la pluralidad de cámaras;
c) durante un período de tiempo predeterminado, aplicar un movimiento de balanceo al aparato de cultivo; y
d) monitorear al menos una característica de la porción de tejido.
Acertadamente, la enfermedad es un cáncer. Acertadamente, la enfermedad es fibrosis. Acertadamente, la enfermedad del tejido es una enfermedad fibrótica, por ejemplo, fibrosis pulmonar, fibrosis renal o fibrosis hepática. Acertadamente, la enfermedad del tejido es una enfermedad del hígado.
Acertadamente, la porción de tejido es un corte de hígado, un corte de riñón y/o un corte de pulmón. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la activación de un tipo de célula dentro de la porción de tejido. Acertadamente, el método comprende determinar la activación de miofibroblastos hepáticos en una porción de tejido. Acertadamente, el método comprende identificar un marcador de miofibroblastos hepáticos. Acertadamente, el marcador es a-actina de músculo liso.
En ciertas modalidades, el método comprende determinar la expansión de un tipo de célula que está asociado con un estado de enfermedad. Acertadamente, el corte de tejido es una porción de hígado y el método comprende determinar la expansión de las células ductulares. Acertadamente, el método comprende una etapa de análisis histológico de la porción de tejido. En ciertas modalidades, el método comprende determinar la presencia o la ausencia de una célula inmunitaria en la porción de tejido. Acertadamente, la célula inmunitaria es una célula de Kupffer.
En ciertas modalidades, el método comprende ubicar la porción de tejido y el elemento de andamio del cultivo celular, mediante la ubicación de al menos un elemento de inserción de cámara que soporta un elemento de andamio de cultivo celular que sostiene una porción de tejido en dicha al menos una cámara del cuerpo contenedor.
En ciertas modalidades, el método comprende, además, añadir una o más células a la cámara. Acertadamente, una o más células son células inmunitarias. En ciertas modalidades, el método comprende añadir una o más células cancerosas a la cámara.
En ciertas modalidades, el método comprende ubicar el cultivo celular y el elemento de andamio de cultivo celular mediante la ubicación de al menos un elemento de inserción de cámara que soporta un elemento de andamio de cultivo celular que sostiene un cultivo celular en dicha al menos una cámara del cuerpo contenedor.
En ciertas modalidades, el método comprende, además:
añadir un medio de cultivo celular fluido a dicha al menos una cámara de la pluralidad de cámaras y;
aplicar el movimiento de balanceo durante un período de tiempo predeterminado, de manera que, el medio de cultivo celular fluido fluya repetidamente desde dicha cámara a otra de la pluralidad de cámaras, y retorne otra vez.
Acertadamente, el método comprende, además;
colocar un aparato de cultivo en un elemento de plataforma del aparato de acuerdo con la invención;
proporcionar una fuerza impulsora al elemento de accionamiento; y
subir y bajar repetidamente los extremos separados del cuerpo contenedor, para aplicar un movimiento de balanceo al cuerpo contenedor.
También se describe en la presente descripción un elemento de inserción para soportar una célula y/o una porción de tejido, en donde el elemento de inserción es generalmente cilindrico y comprende una pluralidad de pestañas que se extienden radialmente hacia afuera para soportar el elemento de inserción de la cámara, dentro de una cámara respectiva de un aparato, como se describe en la presente descripción, y en donde, además, el elemento de inserción de la cámara respectiva comprende además, un elemento de andamio celular que comprende una pluralidad de poros, dicha pluralidad de poros tiene un diámetro promedio de entre aproximadamente 8 pm a aproximadamente 150 pm.
Acertadamente, la pluralidad de poros tiene un diámetro promedio de aproximadamente 8 pm a aproximadamente 100 pm.
Ciertas modalidades de la presente invención pueden proporcionar un modelo in vitro de hígado. Los modelos in vitro de hígado son una herramienta importante en el desarrollo de fármacos y en la comprensión de la fisiopatología del hígado. Ciertas modalidades de la presente invención proporcionan un sistema que modela con mayor precisión la fibrosis de órganos, y que puede usarse para probar moléculas candidatas anti-fibróticas.
En ciertas modalidades, el aparato y el método son para modelar una enfermedad relacionada con el hígado. Muchas personas con cirrosis y otras enfermedades relacionadas con el hígado no experimentan síntomas en las primeras etapas de la enfermedad. Sin embargo, a medida que el tejido cicatricial reemplaza al tejido sano, las funciones del hígado comienzan a fallary una persona puede experimentar fatiga, agotamiento, pérdida de apetito, náuseas, debilidad y pérdida de peso. A medida que avanza la enfermedad, pueden desarrollarse complicaciones como resultado de la pérdida de las funciones hepáticas.
Como se usa en la presente, el término "enfermedad relacionada con el hígado" puede referirse a una o más enfermedades, afecciones o síntomas o susceptibilidad a enfermedades, afecciones o síntomas que involucran directa o indirectamente, el hígado, los conductos biliares, los conductos hepáticos, los conductos císticos, o la vesícula biliar, incluidos los siguientes: insuficiencia hepática aguda, síndrome de Alagille, enfermedad hepática alcohólica, deficiencia de alfa 1 -antitripsina, hepatitis autoinmune, atresia biliar, hepatitis crónica, cirrosis, enfermedad hepática colestásica, enfermedad quística del hígado, hígado graso, galactosemia, cálculos biliares, síndrome de Gilbert, hemocromatosis, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, cáncer de hígado, hepatitis neonatal, enfermedad del hígado graso no relacionada con el alcohol, esteatohepatitis no alcohólica, porfiria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, síndrome de Reye, sarcoidosis, esteatohepatitis, tirosinemia, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo I, hepatitis viral y/o enfermedad de Wilson.
En ciertas modalidades, el método es un método para modelar la enfermedad del hígado graso. La enfermedad del hígado graso puede ser una enfermedad del hígado graso no relacionada con el alcohol (NAFLD) o una enfermedad del hígado alcohólica, y puede caracterizarse por una acumulación inadecuada de grasa en el hígado de un sujeto. Con el tiempo, la acumulación de grasa puede provocar inflamación del hígado y fibrosis.
NAFLD puede provocar esteatohepatitis no alcohólica (NASH). Por lo tanto, en ciertas modalidades, el método es un método para modelar NASH y/o una progresión de NAFLD a NASH.
En ciertas modalidades, el método para modelar la enfermedad del hígado graso comprende añadir uno o más lípidos a la porción de tejido. Acertadamente, uno o más lípidos se seleccionan del ácido palmítico, el ácido oleico y el ácido linoleico, y sus combinaciones. Acertadamente, el lípido se conjuga con albúmina de suero bovino (BSA). Acertadamente, el método comprende cultivar la porción de tejido con uno o más lípidos, por hasta cuatro días, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 días.
En ciertas modalidades, el método comprende cultivar la porción de tejido con un factor estimulante de la fibrosis como, por ejemplo, factor de crecimiento transformante-p (tgfb), factor de crecimiento derivado de plaquetas-bb (pdgf-bb). Acertadamente, el método comprende la etapa de cultivar la porción de tejido con el factor estimulante de la fibrosis, por hasta 4 días, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 días.
En ciertas modalidades, el método comprende cultivar la porción de tejido con un mediador inflamatorio. Acertadamente, el mediador inflamatorio se selecciona de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), por ejemplo, lipopolisacárido (LPS) o poli IC, y patrones moleculares asociados al daño (DAMP), por ejemplo, células apoptóticas o dañadas. Acertadamente, la etapa de cultivar la porción de tejido con el mediador inflamatorio por hasta 4 días, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 días.
En ciertas modalidades, el método comprende cultivar la porción de tejido con un agente hepatotóxico, por ejemplo, acetaminofeno (que causa insuficiencia hepática) o ácidos biliares (que causan enfermedad biliar), por hasta 4 días, pero sin limitación.
En ciertas modalidades, pueden añadirse uno o más agentes estimulantes a la porción de tejido. Por ejemplo, el método puede comprender la adición de uno o más de un lípido, un agente inflamatorio y un agente estimulante fibrótico. El uno o más agentes estimulantes pueden ser como se describió en la presente descripción.
En ciertas modalidades, el método comprende mantener las porciones de tejido en condiciones normales de cultivo de tejido normóxico (21 % de oxígeno, 5 % de dióxido de carbono y 74 % de nitrógeno). En ciertas modalidades, por ejemplo, para imitar la lesión hipóxica que se produce durante la fibrosis tisular y el cáncer, las porciones de tejido pueden mantenerse tan bajas como 0,1 % de oxígeno (hipoxia).
Existentes modelos in vitro que utilizan cortes de órganos humanos en cultivo con un valor limitado, debido a una rápida pérdida de la función del órgano en cultivo. Por ejemplo, el cultivo de cortes de hígado en Transwells® tiene un tiempo de vida de 2 a 3 días, debido a la hipoxia y la degradación del tejido. Un ejemplo de un sistema de incubación dinámico para probar la citotoxicidad de ciertos compuestos se describe en Leeman y otros, Toxic. In Vitro, Vol. 9, No. 3, pp. 291-298. Sin embargo, este sistema no proporciona un flujo bidireccional entre cámaras adyacentes. Los resultados informados por Leeman y otros, sugieren que la viabilidad celular disminuye rápidamente después de 72 horas. Leeman y otros, también usaron una alta concentración de oxígeno (40 %) durante el cultivo.
Como resultado, los cortes de hígado tienen actualmente un valor limitado en el descubrimiento de fármacos. Por el contrario, con la técnica anterior, ciertas modalidades de la presente invención pueden ser adecuadas para extender el tiempo de vida de los cortes de hígado en cultivo y, por tanto, mejorar su utilidad en la prueba de moléculas de fármaco candidatas y en el modelado de enfermedades, por ejemplo, trastornos relacionados con el hígado, como se detalla anteriormente, que incluye, por ejemplo, la enfermedad fibrótica del hígado.
Además, ciertas modalidades de la presente invención pueden proporcionar un sistema de biorreactor rentable, de rendimiento pequeño o mediano, que representa con mayor precisión los ambientes in vivo que incluyen, por ejemplo, estados de enfermedad.
Además, ciertas modalidades de la presente invención pueden proporcionar un modelo dinámico 3D de enfermedad humana o animal, que puede usarse para probar moléculas candidatas. Ciertas modalidades de la presente invención proporcionan aparatos y sistemas de biorreactores que permiten mejorar la viabilidad de las células y/o los tejidos en cultivo.
Particularmente, ciertas modalidades permiten que la duración de la viabilidad celular, por ejemplo, la viabilidad de los hepatocitos, se extienda a 72 horas o más. Como resultado, el aparato, los sistemas y métodos descritos en la presente descripción, pueden usarse para mantener las células y los tejidos durante un período de tiempo suficiente para probar la eficacia del compuesto candidato y similares.
Descripción detallada de las modalidades de la invención
Las modalidades de la presente invención se describirán de aquí en adelante, solo a manera de ejemplo, con referencia a los dibujos acompañantes, en los que:
"CMR" se refiere a un sistema bidireccional, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención.
"CMR2" se refiere a un sistema bidireccional, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención.
La Figura 1 ilustra un aparato de placa de pocillos múltiples, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención;
La Figura 2 es una vista superior de la cámara adyacente de un aparato de placa de pocillos múltiples, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención;
La Figura 3a es una representación esquemática del aparato de balanceo que sostiene un aparato de placa de pocillos múltiples, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención. Como se ilustra mediante las flechas, el intercambio de medios puede ocurrir a través de poros de inserción dentro de los pocillos del aparato de placa. Adicionalmente, el intercambio de medios puede ocurrir a través de un canal entre pozos.
La Figura 3b ilustra un aparato de balanceo ("CMR"), de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención;
Las Figura 4a y 4b ilustran un elemento de inserción de andamio celular para usarse en ciertas modalidades de la presente invención;
La Figura 5 es una representación esquemática del aparato de balanceo de la Figura 3;
La Figura 6 es un gráfico que ilustra una comparación de la producción de albúmina (ng/ml) mediante el uso de un aparato de 12 cámaras, como se describe en la presente descripción (denominado en la presente descripción como "CMR"), en comparación con la producción de albúmina con el uso de una inserción Transwell® estática (denominado como "inserción"), de cortes de hígado cortados con precisión. La viabilidad de las células se incrementa mediante el uso del aparato de modalidades de la invención. N=8. Las barras de la izquierda representan el uso del aparato de las modalidades de la presente invención, mientras que las barras de la derecha ilustran la inserción Transwell® estática. Los datos muestran que el aparato de ciertas modalidades mantiene la capacidad del corte para sintetizar y secretar albúmina por hasta 4 días, lo que sugiere una función hepática mejorada y una mayor longevidad del corte de tejido. Balancear la placa del biorreactor, promueve el intercambio de medios entre las dos cámaras conectadas por el canal. Cada cámara contiene una inserción, que sostiene el corte de tejido en un pozo interno. El balanceo no solo permite el intercambio de medios entre las dos cámaras, sino que también permite el intercambio de medios a través de los poros de la membrana de inserción del cultivo que separa los pocillos internos y externos. El último intercambio de medios genera un flujo alrededor/sobre el corte de tejido, lo que ayudará a la oxigenación y a la eliminación de metabolitos tóxicos, lo que a su vez probablemente aumente la viabilidad y la función (producción de albúmina) del tejido.
La Figura 7 es un gráfico que ilustra que la viabilidad celular y la capacidad de síntesis de albúmina, mediante el uso de un elemento de inserción del andamio celular, como se describe en la presente descripción, que tiene un promedio de tamaño de los poros de membrana de 3 pm, son de tamaño insuficiente para permitir el efectivo intercambio de medios a través del poro de inserción, entre el interior de la inserción y la cámara exterior, por lo que no mejoran la función de corte en comparación con inserciones estáticas. "CMR" se refiere al uso de aparatos de modalidades de la presente invención, mientras que "Ins" se refiere a una configuración estática (es decir, sin balanceo);
La Figura 8 es un gráfico que ilustra la producción de albúmina (ng/ml) de células cultivadas mediante el uso de un elemento de inserción de andamio celular, que tiene un promedio de tamaño de los poros de membrana de 8 pm. Las inserciones con poro de 8 pm permiten el efectivo intercambio de medios a través del poro de inserción, entre el interior de la inserción y la cámara exterior, por lo tanto, resulta en una mejora en la función del corte en comparación con inserciones estáticas.
Además, el balanceo de la placa del biorreactor CMR ("CMR") retiene la función hepática y la secreción de albúmina. La producción de albúmina se reduce significativamente en la placa del biorreactor estático ("CMR Estático"), en inserciones estáticas (Ins R), o en las inserciones de una placa estándar de 12 pocillos que se balancea ("Ins"). Esto sugiere que el intercambio de medios entre los dos pocillos de la cámara en la placa CMR, causado por el balanceo, es necesario para retener la secreción de albúmina.
La Figura 9 es un gráfico que ilustra la producción de albúmina de células cultivadas mediante el uso de un elemento de inserción de andamio celular que tiene un tamaño promedio de los poros de 100 pm. Las inserciones con poro de 100 pm, provistos en un aparato de ciertas modalidades (CMR), son de tamaño suficiente para permitir el efectivo intercambio de medios a través del poro de inserción, entre el interior de la inserción y la cámara exterior, por lo tanto resulta en una mejora en la función del corte en comparación con inserciones estáticas. Nuevamente, se requiere el intercambio de medios entre los dos pocillos de la cámara para retener la secreción de albúmina ("CMR"). Por el contrario, la producción de albúmina se reduce significativamente en la placa del biorreactor estático con poros de inserción de 100 pm (CMR Estático), en inserciones estáticas con poros de inserción de 100 pm ("Ins R") o en inserciones con poros de inserción de 100 pm, en una placa estándar de 12 pocillos que se balancea ("Ins").
La Figura 10 es un gráfico que ilustra el efecto del tamaño de los poros de inserción del andamio celular sobre la placa del biorreactor y la oscilación, para introducir un flujo bidireccional y un intercambio de medios sobre la secreción de albúmina (ng/ml). Conclusión: la producción de albúmina y la viabilidad de los tejidos se mejoran con el flujo bidireccional en las inserciones con tamaño de los poros entre 8 pm -100 pm. Las inserciones con poros de 3 pm no mejoran la función del corte, n=1.
La Figura 11 es un gráfico que compara el efecto del flujo unidireccional, mediante el uso de un sistema disponible de Kirkstall Limited, Reino Unido, ("Kirkstall") frente al flujo bidireccional (placa CMR que se balancea, "CMR") con inserciones de 3 pm, 8 pm o 100 pm, sobre la secreción de albúmina (ng/ml). Conclusión: el flujo bidireccional produce una secreción de albúmina estable durante más tiempo. El tamaño de los poros mínimo necesario para mejorar la función es requerido para mejorar la síntesis y la secreción de albúmina.
La Figura 12 es un gráfico que compara el efecto del flujo unidireccional, mediante el uso de un sistema de flujo unidireccional (uniflow, barras negras) frente al flujo bidireccional (placa CMR que se balancea, con poros de 8 pm), sobre la secreción de albúmina (ng/ml). El sistema de flujo unidireccional (uniflow) frente a CMR I, y los datos de la inserción estática, indican que cuando se proporciona un flujo bidireccional, la secreción de albúmina es estable durante más tiempo.
La Figura 13 es un gráfico que muestra la producción de albúmina (ng/ml) en la placa del biorreactor CMR con inserciones de 8 pm y balanceo, con volúmenes crecientes de medios de cultivo dentro de la cámara de 0,5 ml/pocillo (volumen total de la cámara 1 ml) a 4 ml/pocillo (volumen total de la cámara 8 ml). El intervalo de volumen de los medios, que mejora la función hepática y retiene la secreción de albúmina, es de aproximadamente 1,5 ml - 4 ml.
La Figura 14 es un gráfico que ilustra que el daño hepático cuantificado por la fuga de la enzima hepática aspartato aminotransferasa de hepatocitos dañados (unidades arbitrarias) se reduce en cortes cultivados en CMR, en comparación con las condiciones estáticas o las condiciones proporcionadas por un sistema de flujo unidireccional (uniflow). Balancear la placa del biorreactor CMR con inserciones de 8 pm ("CMR 8") mejora la viabilidad del corte en comparación con las condiciones estáticas ("CMR 8S"), o el sistema de flujo unidireccional (uniflow), lo que sugiere que el flujo bidireccional es importante para evitar la muerte del corte del hígado.
Como se indicó, las transaminasas séricas se reducen mediante el uso de la placa CMR, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención (8 |jm en comparación con inserciones estáticas (Ins 1.5) o sistema de flujo unidireccional (uniflow)). N=3. Las estadísticas son pruebas t no pareadas, en comparación con inserciones estáticas;
La Figura 15 es un gráfico que ilustra que el daño hepático cuantificado por la fuga de la enzima hepática aspartato aminotransferasa de hepatocitos dañados (unidades arbitrarias) se reduce en cortes cultivados con CMR en comparación con condiciones estáticas, cuando el volumen de medios del CMR está entre 1,5 ml - 2 ml. Los volúmenes de medios por debajo de 1,5 ml no evitan la muerte del tejido. Se usaron inserciones con poro de 8 jm . Conclusión: Las transaminasas séricas se reducen cuando los hepatocitos se cultivan mediante el uso de CMR (1,5 ml -2 ml de medios), lo que sugiere menos daño al corte. Las barras corren de izquierda a derecha como se etiqueta desde arriba a la parte inferior.
La Figura 16 es un gráfico que ilustra la producción de urea a partir de cortes de hígado cultivados en inserciones estáticas (Ins 1,5), un pocillo que tiene poros de 8 jm de una placa, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, y aquellos cultivados en un sistema de flujo unidireccional (uniflow). Conclusión: La función hepática mejora en cortes cultivados con CMR en comparación con condiciones estáticas.
La producción de urea (mg/dL) aumenta en CMR (8 jm ) en comparación con inserciones estáticas (Ins 1.5) o el sistema de flujo unidireccional (uniflow). n=2 (CMR e inserción estática) n=1 uniflow.
La Figura 17 es un gráfico que ilustra la producción de urea (mg/dl) en el CMR con pocillos que tienen inserciones con poro de 8 jm frente a inserciones estáticas, en un intervalo de medios de 0,5 ml - 4 ml. Los datos sugieren que un intervalo dinámico de 1,5 ml - 4 ml/pocillo, n=1, y volúmenes de medios entre 1,5 ml - 4 ml en una placa CMR con balanceo, preservan la síntesis y la secreción de urea. Las barras corren de izquierda a derecha como se etiqueta desde arriba a la parte inferior;
Figura 18: es un gráfico que ilustra el área de tejido teñida con a-actina de músculo liso (a-SMA), un marcador de miofibroblastos hepáticos en secciones histológicas de cortes de hígado en t-0 (corte posterior sin cultivo), o cultivado en la CMR (8 jm insertos de poros) (barras CMR), frente a inserciones estáticas (barras estáticas), en un intervalo de medios de 0,5 ml - 4 ml.
Los datos sugieren que los miofibroblastos hepáticos se activan el día 4 en CMR en volúmenes de medios de 1,5 ml - 4 ml, n=1.
La Figura 19 ilustra imágenes representativas de secciones histológicas de cortes de hígado en t-0 (corte posterior sin cultivo), o cultivados en CMR (inserciones con poro de 8 jm ) en 1,5 ml o 3 ml de medios, frente a inserciones estáticas y teñidos con a-actina de músculo liso (a-SMA), un marcador de miofibroblastos hepáticos. Esto sugiere que los miofibroblastos hepáticos se activan el día 4 en CMR, n=1. Esto puede usarse para modelar la enfermedad hepática y la fibrosis.
La Figura 20 es un gráfico que ilustra el área de tejido teñida con citoqueratina 19 (CK19), un marcador de células ductulares en cortes histológicos de cortes de hígado en t-0 (corte posterior sin cultivo), o cultivado en el CMR (inserciones con poro de 8 jm ) frente a inserciones estáticas, en un intervalo de medios de 0,5 ml a 4 ml. Los datos sugieren que puede ocurrir una expansión ductular el día 4 en >1,5 ml en la CMR, n=1. Esto puede usarse para modelar la enfermedad hepática y la fibrosis.
La Figura 21 es un gráfico que ilustra el área de tejido teñida con CD68, un marcador de células de Kupffer (macrófagos hepáticos) en secciones histológicas de cortes de hígado en t-0 (corte posterior sin cultivo), o cultivadas en el CMR (insertos de poros de 8 jm ) (barras azules) frente a inserciones estáticas (barras verdes), en un intervalo de medios de 0,5 ml a 4 ml. Los datos sugieren que los macrófagos se retienen en los cortes hasta el día 4 en CMR y en inserciones estáticas (estáticas), n=1. Esto puede usarse para modelar la enfermedad hepática y la fibrosis.
La Figura 22 muestra imágenes representativas de secciones histológicas de corte de hígado en t-0 (corte posterior sin cultivo, izquierda) o cultivadas en CMR (inserciones con poro de 8 jm ) en 1,5 ml de medios (derecha) y teñidas con CD68, un marcador de células de Kupffer (macrófagos del hígado). Conclusión: los macrófagos se retienen en los cortes hasta el día 4 en CMR.
La Figura 23 es un gráfico que ilustra la producción de albúmina (ng/ml), mediante el uso de una placa de cultivo celular estático y un aparato, de acuerdo con ciertas modalidades de la invención. Conclusión: La versión de placa CMR que comprende orificios de paso entre cámaras (CMR) y una modalidad que comprende ranuras entre cámaras (CMR III), funcionan igualmente bien y preservan la síntesis y la secreción de albúmina estable por hasta 7 días, n=1. Se usaron inserciones con poro de 8 jm .
La Figura 24 es un gráfico que compara la producción de albúmina de cortes de hígado de 6 mm, cultivados en el CMR (12 pocillos) con inserciones de 8 jm , con CMR (24 pocillos) con inserciones de 8 jm . Los datos muestran que el sistema CMR de 24 pozos funciona tan bien como el sistema CMR de 12 pozos.
La Figura 25 es un gráfico que muestra la cuantificación de la producción de albúmina en cortes de hígado cortados con precisión (PCLS), cultivados tanto en CMR frente a los cultivos con inserciones Transwell estáticas (25A), como en CMR2 frente a los cultivos con inserciones Transwell estáticas (25B), por hasta 7 días, con cambios diarios de medios. De manera similar a CMR, el biorreactor CMR2 mantuvo la producción de albúmina, en comparación con los cortes cultivados con inserciones Transwell estáticas. Las barras corren de izquierda a derecha como se etiqueta desde arriba a la parte inferior.
La Figura 26 es un gráfico que muestra la producción de albúmina por PCLS cultivado en CMR2 y estimulado /- 3 ng/ml del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFb1), durante 48 h, después de un período de descanso de 24 h (Figura 26A). La Figura 26B muestra que el tratamiento de PCLS con 3 ng/ml de TGFb1, durante 48 h, indujo la expresión de los genes de fibrosis colágeno I, alfa-actina de músculo liso (aSMA) e inhibidor tisular de metaloproteasa 1 (TIMP1), en comparación con el control (sin tratar). Las barras corren de izquierda a derecha como se etiqueta desde arriba a la parte inferior.
La Figura 27 muestra la producción de albúmina por PCLS cultivada en CMR2 y estimulada /- grasa, grasa lipopolisacárido (LPS), o albúmina de suero bovino (BSA, vehículo), durante 48 h, después de un período de descanso de 24 h. El tratamiento con grasa o LPS no afectó la producción de albúmina.
La Figura 28 es una imagen que muestran que el tratamiento con grasa induce la acumulación de grasa y la deposición de colágeno en el PCLS.
Las Figuras 29A, 29B y 29C son vistas en perspectiva de un aparato, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención (referidas en la presente descripción como CMR2).
La Figura 30A y la Figura 30B representan varios componentes del aparato de la Figura 29.
La Figura 31 es un gráfico que muestra la expresión de los genes fibróticos pro-colágeno 1, alfa-actina del músculo liso (aSMA) e inhibidor tisular de metaloproteinasa 1 (TIMP1), en cortes de hígado cortados con precisión (PCLS), cultivados en CMR2 y estimulados /- factor de crecimiento transformante beta (TGFb) y /- factor de crecimiento derivado de plaquetas b (PDGF-bb), durante 72 h, después de un período de descanso de 24 h. El tratamiento con ambos estímulos induce la expresión de genes de fibrosis.
La Figura 32 es un gráfico que muestra la cuantificación de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en cortes de riñón cortados con precisión (PCKS), cultivados tanto en CMR, frente a cultivos con inserciones transwell estáticas, por hasta 5 días, con cambios de diarios de medios. El daño de PCKS determinado por la liberación de LDH se reduce en cortes cultivados en CMR, en comparación con cortes cultivados en inserciones Transwell® estáticas.
Definiciones
Si bien la terminología usada en esta solicitud es estándar dentro de la técnica, en la presente descripción se proporcionan definiciones de ciertos términos para asegurar la claridad y la definición del significado de las reivindicaciones. Las unidades, los prefijos y los símbolos pueden indicarse en su forma SI aceptada. Los intervalos numéricos citados en la presente descripción incluyen los números que definen el intervalo, e incluyen y apoyan cada número entero dentro del intervalo definido. Como se emplea en toda la descripción, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique de otra forma, tienen los siguientes significados:
Se apreciará que los términos "cámara" y "pocillo", como se usa en la presente, son intercambiables y son ilustrativos y no limitantes. La mención de un término no excluye la sustitución de los otros términos en la modalidad descrita. Como se usa en la presente, una cámara es un orificio en un cuerpo contenedor que típicamente comprende una base plana y una abertura superior. La cámara puede ser de forma cilíndrica, y tener una o más paredes laterales. En la presente descripción se proporcionan más detalles de cámaras ilustrativas.
Como se usa en la presente, el término "cultivo celular" o "cultivo" se refiere al mantenimiento, crecimiento, diferenciación y/o viabilidad continua de las células en un ambiente artificial, in vitro. Las células pueden estar comprendidas en un tejido o una porción del mismo, por ejemplo, un tejido o un corte de órgano. El cultivo celular puede ser un cultivo celular bidimensional o un cultivo celular tridimensional. En una modalidad, el corte del órgano puede ser, por ejemplo, un corte de hígado, un corte de riñón o un corte de pulmón.
Un "corte de órgano" o "corte de tejido" es un modelo in vitro que representa las características multicelulares, estructurales y funcionales del tejido in vivo. Los cortes de tejido pueden proporcionar un modelo para caracterizar los mecanismos de lesión inducida por fármacos, y para identificar biomarcadores de lesión de órganos, lo que puede ser un problema clínico significativo.
Ciertas modalidades de la presente invención pueden tener una utilidad particular para cultivar cortes de tejido que comprenden diferentes tipos de células, durante períodos de tiempo prolongados y, por tanto, pueden proporcionar un modelo in vitro de un ambiente in vivo de tejidos u órganos. Las diferencias regionales y los cambios en la morfología pueden evaluarse fácilmente mediante histología y tinciones especiales, similar al tejido obtenido de estudios in vivo.
El corte de tejido puede ser de cualquier tamaño adecuado. En ciertas modalidades, el corte de tejido tiene un diámetro de entre aproximadamente 4 mm y 10 mm. Acertadamente, el corte de tejido puede tener aproximadamente 6 mm de diámetro. Acertadamente, el corte de tejido es un corte de hígado o riñón que tiene un grosor de 200-300 pm y núcleos de entre aproximadamente 4 - 8 mm de diámetro. Acertadamente, el corte de tejido es un corte de pulmón que tiene un grosor de 200-500 pm y núcleos entre aproximadamente 4 -8 mm de diámetro.
En ciertas modalidades, los cortes de tejido hepático pueden ser un modelo beneficioso, ya que retienen la estructura del hígado, contienen todos los tipos de células encontrados en vivo, tienen buena correlación del metabolismo xenobiótico in vitro/in vivo y mantienen la actividad del citocromo específico de zona (lo que permite la toxicidad celular y zonal) y los mecanismos de toxicidad.
Un cultivo celular o tisular tridimensional puede diferenciarse de un cultivo celular o tisular bidimensional que típicamente se proporciona mediante una capa plana de células soportada por una superficie de base de una cámara o pocillo. Los cultivos celulares tridimensionales son redes celulares acertadas, en las que las células son redondas y están organizadas en tres dimensiones, un ambiente y una morfología celular, que son más similares a los encontrados in vivo. Un cultivo 3-D puede proporcionarse mediante un andamio.
Como se usa en la presente, los términos "andamio celular" y "andamio de tejido" se refieren a una estructura sólida porosa artificial tridimensional. Estas armazones sirven para imitar el microambiente real in vivo donde las células interactúan y se comportan, de acuerdo con las señales mecánicas obtenidas del ambiente 3D circundante. Una variedad de materiales de andamio se encuentran disponibles. Los materiales adecuados incluyen, por ejemplo, microfibras o nanofibras poliméricas, por ejemplo, nanofibras electrohiladas. Los polímeros adecuados incluyen, por ejemplo, poli(L-lactida) (PLLA) y poli(D, L-lactida) (PDLLA). El andamio puede fabricarse mediante el uso de técnicas convencionales tales como, por ejemplo, tecnología de procesamiento de silicio, micromecanizado, moldeo por inyección y técnicas de fabricación aditiva rápida.
Como se usa en la presente, las frases "medio", "medio de cultivo celular", "medio de cultivo de tejidos", "medio de cultivo" (plural "medios" en cada caso) y "formulación del medio" se refieren a una solución nutritiva adecuada para cultivar células o tejidos, por ejemplo, células de mamífero. Estas frases pueden usarse indistintamente. Las formulaciones de medios de cultivo celular se conocen bien en la técnica. Típicamente, un medio de cultivo celular está compuesto de una serie de ingredientes, y estos ingredientes varían de un medio a otro. Los medios de cultivo celular se componen típicamente de tampones, sales, carbohidratos, aminoácidos, vitaminas y trazas de elementos esenciales. La selección de los medios de cultivo celular dependerá de, por ejemplo, el tipo de célula y otros factores.
El medio de cultivo celular puede contener o no suero, peptona y/o proteínas. Varios medios de cultivo de tejidos, incluidos los medios de cultivo definidos y sin suero, están disponibles comercialmente, por ejemplo, puede usarse cualquiera o una combinación de los siguientes medios de cultivo celular: Medio RPMI-1640, Medio RPMI-1641, Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Medio Esencial Mínimo Eagle, Medio F-12K, Medio de Ham F12, Medio Dulbecco Modificado de Iscove, Medio 5A de McCoy, Medio Williams E, Medio L-15 de Leibovitz, y medios sin suero como EX-CELL™ 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kans.), entre otros. Los medios de cultivo celular pueden complementarse con concentraciones adicionales o aumentadas de componentes tales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, tampones, antibióticos, lípidos, oligoelementos y similares, en dependencia de los requisitos de las células a ser cultivadas y/o de los parámetros de cultivo celular deseados.
Acertadamente, los métodos de ciertas modalidades pueden ser para cultivar células de cualquier fuente, incluidas células eucariotas y células procariotas, por ejemplo, células vegetales, células de mamíferos, células de levadura, células fúngicas y/o células bacterianas. Acertadamente, el cultivo celular comprende células de mamífero seleccionadas de células epiteliales, células tumorales, hepatocitos, células de fibroblastos, células madre, miocardiocitos, células renales, células pulmonares, células neuronales, adipocitos, células intestinales, células cutáneas, células inmunitarias, tanto solas como en combinación.
En ciertas modalidades, las células de mamífero se seleccionan de células tumorales, células madre y células epiteliales primarias (por ejemplo, queratinocitos, células epiteliales cervicales, células epiteliales bronquiales, células epiteliales traqueales, células epiteliales renales y células epiteliales retinianas).
Acertadamente, las células de mamífero pueden ser humanas. Las células de mamífero pueden provenir de un individuo, por ejemplo, un paciente que padece un trastorno. En ciertas modalidades, las células (por ejemplo, en un corte de órgano) pueden aislarse de un paciente que padece, o corre el riesgo de, una enfermedad fibrótica. La enfermedad fibrótica puede ser, por ejemplo, una enfermedad fibrótica que afecta al hígado, los riñones o los pulmones. El paciente puede sufrir un trastorno que puede progresar a una enfermedad fibrótica.
En ciertas modalidades, las células pueden proceder de líneas celulares establecidas. En ciertas modalidades, las células pueden modificarse genéticamente. En ciertas modalidades, las células proceden de líneas celulares establecidas como, por ejemplo, células renales embrionarias 293, células epiteliales cervicales HeLa y células retinianas PER-C6, células MDBK (NBL-1), células CRFK, células MDCK, células CHO, células Chang, células Detroit 562, células HeLa 229, células HeLa S3, Huh7, Hep3b, A549, BEAS-2B, Calu-3, células Hep-2, células KB, células LS 180, células LS 174T, células NCI-H-548, células RPMI 2650, células SW-13, células T24, WI-28 VA13, células 2RA, células WISH, células BS-CI, células LLC-MK2 , células clon M-3, células 1-10, células RAG, células TCMK-1, células Y-1, células LLC-PK1, células PK(15), células GH.sub.1, células GH3 , células L2, células LLC-RC 256, células MH1C1, células XC, células MDOK, células VsW y TH-I, células B1 (o derivados de las mismas), células de fibroblastos de cualquier tejido u órgano (incluidos, pero no limitados a, corazón, hígado, riñón, colon, intestino, esófago, estómago, tejido neural (cerebro, médula espinal), pulmón, tejido vascular (arterias, venas y capilares), tejido linfoide (glándulas linfoides, adenoides, amígdalas, médula ósea y sangre), bazo, y fibroblastos y líneas celulares fibroblastoides (por ejemplo, células CHO, células TRG-2, células IMR-33, células Don, células GHK-21, células Dempsey, células Detroit 551, células Detroit 510, células Detroit 525, células Detroit 529, células Detroit 532, células Detroit 539, células Detroit 548, células Detroit 573, células HEL 299, células IMR-90, células MRC-5, células WI-38, células WI-26, células MiCl-i , células CHO, células CV-1, células COS-1, células COS-3, células COS-7, células Vero, células DBS-FrhL-2, células BALB/3T3, células F9, células SV-T2, células M-MSV-BALB/3T3, células K-BALB, células BLO-11, células NOR-10, células C.sub.3H/IOTI/2, células HSDM1C3 , células KLN2O5, células McCoy, células Mouse L, células cepa 2071 (Mouse L), células cepa L-M (Mouse L), células NCTC clones 2472 y 2555, células SCC-PSA1, células Swiss/3T3, células Indian muntjac, células SIRC, células Cii, y células Jensen, o derivadas de las mismas.
En ciertas modalidades de la presente invención, el aparato y/o el método pueden comprender el uso y/o cultivo de tejidos o porciones de los mismos. El tejido puede ser, por ejemplo, un órgano o una porción del mismo. En una modalidad, la porción de tejido es un corte de un órgano. Acertadamente, el órgano puede ser, por ejemplo, un corazón, un riñón, un hígado, un pulmón, un páncreas, un estómago, un cerebro. En ciertas modalidades, los tejidos pueden ser, por ejemplo, tejido esquelético, tejido muscular, tejido conjuntivo, tejido nervioso, tejido epitelial y/o tejido mineralizado. En ciertas modalidades, la porción de tejido es un corte de hígado o un corte de riñón. Acertadamente, el corte de tejido puede comprender además, múltiples tipos de células que incluyen, por ejemplo, células inmunitarias. Acertadamente, el tejido es un órgano humano y la porción de tejido es un corte o sección del mismo.
También se describe en la presente descripción un método para probar la eficacia de una molécula terapéutica candidata. Una "molécula terapéutica candidata" y una "molécula candidata" pueden actuar como moduladores de la concentración de la molécula diana o de la función de la molécula diana en un sistema. Un "modulador" puede ser agonista (es decir, regular al alza) o antagonista (es decir, regular a la baja) la concentración de una molécula diana, parcial o completamente, en un sistema, al afectar funciones celulares como la replicación del ADN y/o el procesamiento del ADN (por ejemplo, metilación del ADN o reparación del ADN), transcripción del ARN y/o procesamiento del ARN (por ejemplo, eliminación de secuencias intrónicas y/o translocación del ARNm empalmado del núcleo), producción de polipéptidos (por ejemplo, traducción del polipéptido a partir de ARNm) y/o modificación post-traduccional del polipéptido (por ejemplo, glicosilación, fosforilación y proteólisis de pro-polipéptidos). Un modulador también puede ser agonista o antagonista de la función biológica de una molécula diana, parcial o completamente, donde la función puede incluir adoptar una cierta conformación estructural, interactuar con uno o más parejas de unión, unión de ligandos, catálisis (por ejemplo, fosforilación, desfosforilación, hidrólisis, metilación e isomerización) y un efecto sobre un evento celular.
En una modalidad, la molécula candidata puede ser un compuesto anti-fibrótico, como se describe en la presente descripción.
Respecto a las Figuras, en la Figura 1, por ejemplo, se ilustran ciertas modalidades del aparato de acuerdo con la presente invención.
Como se muestra en la Figura 1, se ilustra un aparato 1, de acuerdo con ciertas modalidades. El aparato 1 es, acertadamente, un aparato de placa de pocillos múltiples como se detalla en la presente descripción. La placa de pocillos múltiples 1 comprende un cuerpo contenedor 10 que incluye una pluralidad de 12 cámaras. El cuerpo contenedor es rectangular y tiene una superficie plana inferior (no mostrada).
En una modalidad, el aparato es una placa de pocillos múltiples. Acertadamente, el aparato comprende una huella definida por las normas de la Sociedad de Ciencias Biomoleculares (por ejemplo, Normas ANSI SLAS-1 a 4). La placa de pocillos múltiples puede fabricarse mediante el uso de técnicas conocidas que incluyen, por ejemplo, fabricación rápida de prototipos, moldeo o similares.
Las cámaras también pueden denominarse "pocillos". En la modalidad ilustrada, cada cámara es cilíndrica. Se contemplan otras formas de cámara, por ejemplo, cuboidal, y están dentro del alcance de ciertas modalidades de la invención. Las cámaras pueden disponerse para recibir y/o eliminar medios de cultivo celular. Adicionalmente, las cámaras pueden configurarse para recibir y/o soportar un elemento de inserción, como se describe con más detalle a continuación.
Cada cámara 12 comprende una base plana inferior 20, como se muestra en la Figura 2. La base plana inferior, en ciertas modalidades, puede estar alternativamente definida por una base (no mostrada) del cuerpo contenedor. Cada cámara comprende además una abertura superior 14 que se extiende a través de una superficie superior 18 del cuerpo contenedor. Acertadamente, la abertura superior está dimensionada para permitir que los medios de cultivo celular se añadan a la cámara y/o se retiren de la misma. Por lo tanto, la siembra de células/tejidos, la adición de agentes, la extracción de muestras, la adición y eliminación de medios pueden realizarse a través de la abertura de la cámara. La adición de componentes puede ser a través de pipeta o robótica, por ejemplo.
En ciertas modalidades, cada cámara tiene una profundidad de entre aproximadamente 15 mm y 20 mm, por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mm. Otras profundidades pueden ser útiles en ciertas modalidades.
La cámara 12 comprende además una pared lateral 16 que se extiende entre la superficie inferior y la abertura superior. El elemento de pared no solo puede definir porciones de las paredes, sino que también puede actuar para separar al menos una parte de una cámara de al menos una porción de una cámara adyacente.
En dependencia de la aplicación del aparato, la base y las paredes laterales de cada cámara pueden estar formadas de un material transparente, translúcido u opaco. Los materiales adecuados incluyen, por ejemplo, Zeonex™, Zeonor™, poliestireno, policarbonato, polietileno, polipropileno, PMMA, acetato de celulosa y vidrio.
Las cámaras pueden proporcionarse en cualquier cantidad y en cualquier arreglo. Acertadamente, las cámaras están dispuestas uniformemente en el cuerpo contenedor, es decir, las cámaras están dispuestas en filas y en columnas. El aparato puede ser, por ejemplo, una placa de 12 pocillos, una placa de 24 pocillos, una placa de 48 pocillos o una placa de 96 pocillos. El cuerpo contenedor puede formarse con cualquier dimensión, incluidas, por ejemplo, dimensiones estándar para su uso con equipamiento de laboratorio robótico.
Como se muestra en la Figura 1, un par de cámaras adyacentes 12a y 12b están conectadas con fluidos mediante un pasaje de paso 22. El pasaje de paso 22 proporciona una vía de comunicación de fluidos entre el interior de una primera cámara 12a y el interior de una segunda cámara 12b. La vía de comunicación de fluidos es acertadamente un pasaje de paso y puede ser, por ejemplo, una hendidura de paso, como se muestra en la Figura 1, que tiene una altura que se extiende entre la superficie superior 18 del cuerpo contenedor, hasta quedar adyacente y plana con las bases planas inferiores de las respectivas cámaras.
En una modalidad alternativa, el pasaje de paso 22 puede ser una hendidura de paso que tiene una altura que se extiende solo en parte de la distancia entre la superficie superior del cuerpo contenedor y las bases planas inferiores de las respectivas cámaras.
En ciertas modalidades, la hendidura de paso tiene aproximadamente 2 mm de ancho y aproximadamente 4 mm de longitud. En otras modalidades, la hendidura de paso tiene aproximadamente 2 mm de ancho y aproximadamente 3,5 mm de longitud. Se prevén otras dimensiones de la hendidura de paso.
En otra modalidad más, el pasaje de paso 22 es un orificio de paso que se proporciona, entre la pared lateral 16a de la primera cámara 12a y la pared lateral 16b de la segunda cámara 12b. El orificio de paso puede proporcionarse en una porción inferior de las respectivas paredes laterales.
El pasaje de paso debe tener un tamaño que permita el movimiento del fluido entre las respectivas cámaras adyacentes. Tal fluido incluye, por ejemplo, medios de cultivo celular líquidos. Los medios de cultivo celular pueden comprender una pluralidad de componentes que incluyen, por ejemplo, componentes secretados por células y/o tejidos proporcionados dentro de una o ambas cámaras. Por tanto, el pasaje de paso permite un intercambio de medios de cultivo celular, y de componentes comprendidos en el mismo, entre cámaras del aparato de placa de pocillos múltiples.
En la modalidad ilustrada, se proporciona un pasaje de paso entre dos cámaras adyacentes. Se debe entender que, en ciertas modalidades, puede proporcionarse un pasaje de paso entre tres o más cámaras. Acertadamente, el pasaje de paso comprende una pluralidad de ranuras de paso y/u orificios de paso, que proveen una primera ranura u orificio entre una pared lateral o base de una primera cámara y una segunda cámara adyacente, y se proporcionan más ranuras y/u orificios entre la primera o la segunda cámara y la cámara adicional adyacente, y opcionalmente entre las cámaras adicionales adyacentes. En tales modalidades, el pasaje de paso se proporciona en una dirección lineal, sin ángulo entre la pluralidad de cámaras.
El cuerpo contenedor comprende, además, una pared del perímetro exterior 24. La pared del perímetro exterior puede comprender una porción 26 de borde exterior rebajada, que proporciona una superficie 28. La superficie plana inferior del cuerpo contenedor puede comprender una región de borde rebajada (no mostrada) que se configura para descansar y ubicarse en la superficie 28 de la porción de borde exterior rebajada de un cuerpo contenedor adicional, de manera que los cuerpos contenedores estén ubicados en una relación anidada. En ciertas modalidades, una pluralidad de cuerpos contenedores puede estar ubicados en una relación anidada vertical.
En ciertas modalidades, el aparato comprende además uno o más elementos de inserción 30, que están configurados para soportar una o más células. En ciertas modalidades, el elemento de inserción puede ser un Transwell® disponible en Corning, EE.UU. Las células pueden ser en forma de una porción de tejido, por ejemplo, un corte de tejido. El elemento de inserción puede proporcionar un andamio celular 3D. Como se muestra en la Figura 4, el elemento de inserción 30 tiene una porción de cuerpo 32 que es generalmente de forma cilíndrica. El elemento de inserción está dimensionado para encajar dentro de una cámara. El elemento de inserción comprende además una pluralidad de pestañas 34a, 34b, 34c que se extienden radialmente hacia afuera, cuando el elemento de inserción se coloca en una cámara, contactan y descansan sobre la superficie superior del cuerpo contenedor para soportar el elemento de inserción dentro de la cámara.
Acertadamente, cuando está soportado por las pestañas que descansan sobre la superficie superior, el elemento de inserción se coloca dentro de la cámara de manera que no contacte con una pared lateral o con la base de la cámara. Como resultado, cuando la cámara está rellena de fluido, por ejemplo, medios de cultivo celular, el elemento de inserción está al menos parcialmente rodeado por el fluido. En otras modalidades, el elemento de inserción puede contactar con la base de la cámara, por ejemplo. El elemento de inserción puede comprender una membrana de superficie inferior 40 con poros.
Acertadamente, los poros tienen un diámetro promedio de entre aproximadamente 8 pm a aproximadamente 150 pm, en una modalidad, los poros tienen un diámetro promedio de aproximadamente 8 pm. El elemento de inserción puede recubrirse con un material de matriz, por ejemplo, colágeno o similar.
En uso, la superficie superior del cuerpo contenedor puede estar recubierta por una tapa extraíble común (no mostrada). La tapa puede quitarse para agregar o eliminar componentes en las cámaras, tales como insertos de células, armazones de células, medios de cultivo de células y similares.
Respecto a las Figuras 3 y 5, se ilustra un aparato de balanceo 100 de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención.
La Figura 3a representa un aparato para proporcionar un flujo bidireccional del fluido, y que incluye un aparato de balanceo que sostiene un aparato de placa de pocillos múltiples, de acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención. Como se ilustra mediante las flechas, el intercambio de medios puede ocurrir a través de poros de inserción dentro de los pocillos del aparato de placa. Además, el intercambio de medios bidireccional puede ocurrir a través de un canal entre pocillos. En la Figura 3, se ilustra un corte de tejido en las cámaras.
El aparato de balanceo puede denominarse, alternativamente, como un aparato de tipo "balancín". En la Figura 5 se muestra una representación esquemática del aparato de balanceo 100. El aparato de balanceo comprende un soporte del cuerpo contenedor 102, que soporta directa o indirectamente un cuerpo l0 de soporte. Apropiadamente, el soporte del cuerpo contenedor incluye un pivote o punto de apoyo fijo sobre el que se apoya una plataforma 104 móvil. La plataforma 104 incluye una superficie superior para soportar el cuerpo contenedor 10. La plataforma y el pivote fijo pueden formarse a partir de cualquier material adecuado, incluidos, por ejemplo, plástico, metal o madera. La plataforma comprende una región de primer extremo 106 y una región de segundo extremo 108 separadas del primer extremo.
El aparato de balanceo 100 puede configurarse para inclinarla plataforma 104, por ejemplo, al elevar y bajarlas regiones extremas separadas. Apropiadamente, la plataforma 104 se desvía hacia abajo en una de las regiones extremas espaciadas, por ejemplo, mediante un peso que se proporciona en la región extrema respectiva. El extremo ponderado está sesgado hacia abajo hasta una posición de reposo. Apropiadamente, el sesgo es un sesgo mínimo que es suficiente para superar el peso de la región del extremo opuesto.
El aparato 100 comprende además un elemento de accionamiento dispuesto para balancear el cuerpo contenedor, soportado a través del soporte para subir y bajar repetidamente los extremos primero y segundo separados del cuerpo contenedor. En una realización, el aparato de balanceo comprende un elemento de accionamiento que comprende un actuador lineal 110 dispuesto en la región de primer extremo 106. En una realización particular, se configura un actuador lineal para inclinar la plataforma y, por lo tanto, la placa de pocillos múltiples. Por tanto, en circunstancias normales, este extremo de la plataforma descansará más bajo. El actuador está dispuesto para dirigirse contra la base, de modo que cuando se acciona eleva el extremo de la plataforma y baja el otro extremo por separado.
En algunas modalidades, el actuador lineal proporciona el propio peso de carga y, por tanto, puede usarse para devolver la plataforma pasivamente a su posición de reposo con el primer extremo 106 abajo, de modo que el elemento de accionamiento solo necesita moverse activamente en una dirección.
En una modalidad particular, el actuador lineal está configurado para inclinar la plataforma, y por tanto la placa de pocillos múltiples, a una velocidad de entre aproximadamente 10 segundos y a aproximadamente 20 minutos, por ejemplo, aproximadamente 2 minutos por balance, es decir, aproximadamente dos minutos para el primer extremo del cuerpo contenedor debe moverse desde una primera posición, por ejemplo, una posición abajo, a una segunda posición, por ejemplo, una posición elevada.
El actuador lineal puede alimentarse por batería o por la red eléctrica, por ejemplo.
Se apreciará que la Figura 5 es solo una representación esquemática y el ángulo de inclinación de la plataforma puede ser menor que el que se muestra en la Figura 5. Por ejemplo, la plataforma puede tener un intervalo de inclinación de 0 grados a aproximadamente /- 20 grados o menos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 grados.
La acción de inclinación del aparato de balanceo permite el fluido, por ejemplo, medios de cultivo celular líquido fluyen desde una primera cámara, a través de la vía de comunicación de fluidos, a una segunda cámara y retornan otra vez. En ciertas modalidades, por ejemplo, cuando cada cámara tiene un diámetro de pozo de aproximadamente 20 mm, el balanceo del cuerpo contenedor permite que al fluido fluir entre cámaras adyacentes, a una velocidad de entre aproximadamente 15 a aproximadamente 20 pl/segundo a través del pasaje de paso. En ciertas modalidades, en todas las etapas del movimiento de balanceo, un cultivo celular o tisular proporcionado dentro de una cámara permanece cubierto, al menos parcialmente, por los medios de cultivo celular.
El balanceo no solo permite el intercambio de medios entre las dos cámaras, sino que también permite el intercambio de medios a través de los poros de la membrana de inserción del cultivo que separa los pocillos internos y externos. El último intercambio de medios genera un flujo alrededor/sobre un corte de tejido, lo que ayudará a la oxigenación y la eliminación de metabolitos tóxicos, que a su vez, probablemente aumente la viabilidad y la función del tejido.
La placa de pocillos múltiples y el aparato de balanceo, como se describió en la presente descripción, puede usarse en una variedad de métodos para proporcionar un ambiente de cultivo celular dinámico, que puede representar de manera más certera las condiciones in vivo y, por lo tanto, soportar mejor el crecimiento y el mantenimiento de células y/o de tejidos en cultivo.
Las Figuras 29 y 30 representan un aparato 1000 de acuerdo con ciertas modalidades de la invención. El aparato 1000 incluye un elemento de plataforma 1010 que se configura para soportar una pluralidad de aparatos de cultivo o de placas de pocillos múltiples, como se describió en la presente descripción. La plataforma puede comprender una pluralidad de regiones rebajadas 1020a, 1020b, 1020c, que cada una está dimensionada para ubicar una placa de pocillos múltiples. Se proporciona una región de reborde 1030 que se extiende sustancialmente alrededor de la periferia de la plataforma y separa cada región rebajada. La región de reborde actúa para evitar que el aparato de cultivo se deslice cuando se balancea el aparato. En algunas modalidades, pueden apilarse una pluralidad de placas de pocillos múltiples, como se muestra en la Figura 29.
El aparato 1000 comprende un elemento de pivote 1040 que se asienta en una ranura central 1050, que se proporciona en una porción de base 1060 del aparato. El actuador lineal 1070 mueve la plataforma hacia arriba y hacia abajo, alrededor del elemento de pivote 1040, para inclinar el aparato de cultivo hacia arriba y hacia abajo, como se describió anteriormente.
Ciertas modalidades de la presente invención se refieren a un método de cultivo de células y/o tejidos, como se describe más abajo en la presente descripción:
EJEMPLOS
Los hepatocitos a menudo presentan un desafío en el cultivo celular y se sabe que pierden rápidamente la expresión fenotípica in vitro debido a la ausencia de un microambiente adecuado. Los siguientes ejemplos se centraron en determinar si el aparato de ciertas modalidades de la presente invención podría usarse para prevenir o retrasar la pérdida de expresión fenotípica en los hepatocitos. Los términos "CMR", "CMR2" y "placas de cultivo de tejidos CMR", usados en la presente descripción, se refieren al aparato de placas de ciertas modalidades de la presente invención.
Aislamiento y cultivo de cortes de precisión
Se colocó tejido hepático en una placa de 10 cm que contiene Solución Salina Tamponada de Hanks (HBSS+, Lonza, BE10-508F). Se fabricaron núcleos de tejido hepático de cuatro a ocho mm, mediante el uso de un punzón de biopsia Stiefel. Después, los núcleos se transfirieron a un molde de metal y se sumergieron en agarosa de baja temperatura de gelificación a 2,5-3,0 % (Sigma, A9414), y luego se colocaron en hielo durante 2-5 minutos.
Una vez fraguado, los núcleos en agarosa se pegaron sobre una plataforma de montaje de vibrátomo y se sumergieron en la cámara de medios, en HBSS+ helado, antes de cortarlo en un micrótomo de cuchilla vibratoria, Leica VT1200 S, totalmente automatizado. Los núcleos de tejido hepático se cortaron a una velocidad de 0,3 m/s, y una amplitud de 2 mm y un grosor (tamaño de paso) de 250 pm. Pueden usarse cortes que tengan un grosor de entre 200-400 pm.
Los cortes se transfirieron a insertos con poro de 3 pm, 8 pm o 100 pm, proporcionados en placas de cultivo de tejidos estáticas (Griener) o CMR. Las placas de cultivo de tejido CMR de las modalidades de la invención comprenden tanto orificios entre pocillos adyacentes, como en prototipos rápidos del diseño CAD, que comprenden ranuras entre pocillos. Los pocillos contienen medios de cultivo de corte. Los cortes se cultivaron bajo condiciones estáticas, unidireccionales o de balanceo, a 37 °C, en 5 % de dióxido de carbono, en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada. Se usaron placas de cultivo de tejidos CMR, de doce o veinticuatro pocillos, como se indica.
Medios de cultivo de corte
Los medios de cultivo de corte comprenden los siguientes componentes:
• Medio Williams E (Sigma, W4128)
• 2 % de Suero Fetal Bovino inactivado por calor (Gibco)
• Penicilina-Estreptomicina (Sigma, P0781)
• L-glutamina (Sigma, G7513)
• Piruvato (Sigma, S8636)
• Mezcla de selenio de insulina/transferrina 0,5 pM (Gibco 51500-056)
• Dexametasona 0,1 pM (Sigma, D4902)
Ensayo de urea (Universal Biologicals Cambridge)
Se usaron 50 pl de los medios de cultivo de corte, a partir de cortes en cultivo estático o CMR, para cuantificar la liberación de urea mediante el uso del kit del ensayo de urea QuantiChromTM (número de catálogo DIUR-500), en base a las instrucciones del fabricante.
ELISA de Albúmina (laboratorios Bethyl)
Se retiraron 100 pl del medio de cultivo de corte, diluido 1:250, de los pocillos que comprenden cortes cultivados tanto en una placa de cultivo estática, como en un sistema unidireccional, o en el aparato de placa de cultivo CMR, que se balanceó mediante el uso de un aparato de balanceo, como se describió en la presente descripción. Los medios se usaron para cuantificar la liberación de albúmina, mediante el uso del sistema para la cuantificación de albúmina de rata por ELISA (número de catálogo E110-125) o el sistema para la cuantificación de albúmina humana por ELISA (número de catálogo E80-129), en base a las instrucciones del fabricante.
Kit de ensayo de citotoxicidad LDH (Pierce)
Se retiraron 50 pl de medio de los pocillos que comprende cortes cultivados tanto en una placa de cultivo estática, como en el aparato de placa de cultivo CMR, que se balanceó mediante el uso de un aparato de balanceo, como se describió en la presente descripción. El medio se usó para cuantificar la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), mediante el uso del kit de ensayo de citotoxicidad LDH (número de catálogo 88953), en base a las instrucciones del fabricante.
Aspartato aminotransferasa (AST)
Se enviaron 200 pl de los medios a partir de cortes, en cultivo estático o CMR, al departamento de patología clínica, enfermería Royal Victoria, Newcastle Upon Tyne. La AST se midió mediante el uso de un ensayo enzimático colorimétrico clínico.
Los resultados se muestran en las Figuras 6 a 28 y 31 a 32.
A través de toda la descripción y las reivindicaciones de esta descripción, las palabras "comprenden" y "contienen" y las variaciones de estas, significa "que incluyen, pero sin limitarse a", y no se pretende excluir (y no se excluyen) otras porciones, aditivos, componentes, enteros o etapas. A través de toda la descripción y las reivindicaciones de esta descripción, el singular abarca el plural, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, se entiende que la descripción contempla la pluralidad, así como también los singulares, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera.
Los elementos, los números enteros, las características o los grupos descritos junto con un aspecto, modalidad o ejemplo particular de la invención, deben entenderse que son aplicables a cualquier otro aspecto, modalidad o ejemplo descrito en la presente descripción, a menos que sean incompatibles con la misma. Todas las características descritas en esta descripción (que incluye cualquier reivindicación, resumen y dibujos adjuntos), y/o todas las etapas de cualquier método o proceso así descrito, pueden combinarse en cualquier combinación, excepto las combinaciones donde al menos algunas de las características y/o etapas sean mutuamente excluyentes. La invención no se restringe a ninguno de los detalles de ninguna de las modalidades anteriores. La invención se extiende a cualquier característica nueva, o a cualquier combinación nueva de las características descritas en esta descripción (que incluye cualquier reivindicación, resumen y dibujos adjuntos), o a cualquier característica nueva o a cualquier combinación nueva, de las etapas de cualquier método o proceso así descrito.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Aparato para proporcionar un flujo bidireccional del fluido, el aparato comprende:
    un aparato de cultivo (1) para cultivar células y/o un tejido o porción del mismo, y que comprende un cuerpo contenedor (10), el cuerpo contenedor comprende una pluralidad de cámaras (12) para contener un medio de cultivo de tejidos y al menos una vía de comunicación de fluidos (22) que se extiende entre al menos dos cámaras respectivas de la pluralidad de cámaras,
    un soporte del cuerpo contenedor (102); y
    al menos un elemento de accionamiento dispuesto para balancear un cuerpo contenedor, soportado a través del soporte para, de esta manera, subir y bajar repetidamente los extremos separados del cuerpo contenedor, en donde el aparato se configura para balancear repetidamente el cuerpo contenedor;
    caracterizado porque cada vía de comunicación de fluidos permite el flujo bidireccional del fluido entre dichas al menos dos cámaras, y en donde el aparato comprende, además, un elemento de plataforma soportado por el soporte del cuerpo contenedor, dicho elemento de plataforma se configura para retener el cuerpo contenedor en una ubicación fija durante el balanceo, y además en donde el elemento de accionamiento se configura para balancear el cuerpo contenedor a una velocidad de aproximadamente 1 a 20 minutos por movimiento de balanceo completo.
    Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cada cámara de dicha pluralidad de cámaras comprende un elemento base y al menos un elemento de pared lateral.
    Un aparato de acuerdo con la reivindicación 2, en donde:
    (i) la vía de comunicación de fluidos comprende un canal de paso que se extiende entre un elemento base o elemento de pared lateral, de una primera de la pluralidad de cámaras, a un elemento base o un elemento de pared lateral, de otra más de la pluralidad de cámaras,
    (ii) la vía de comunicación de fluidos comprende una ranura de paso que se extiende entre un elemento base o un elemento de pared lateral, de una primera de la pluralidad de cámaras, hasta un elemento base o un elemento de pared lateral, de otra de la pluralidad de cámaras; y/o
    (iii) la primera cámara se proporciona adyacente a la cámara adicional.
    Aparato de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende, además, una o más de las siguientes características:
    (i) el cuerpo contenedor comprende una pluralidad de vías de comunicación de fluidos, cada vía de comunicación de fluidos se extiende entre, al menos dos cámaras de la pluralidad de cámaras, en donde opcionalmente cada vía de comunicación de fluidos de la pluralidad de vías de comunicación de fluidos está sustancialmente paralela y separada de otras vías de comunicación de fluidos entre sí;
    (ii) cada cámara de la pluralidad de cámaras comprende una abertura para recibir y/o retirar los medios de cultivo de tejidos y/o un elemento de inserción de cámara respectivo;
    (iii) cada cámara de la pluralidad de cámaras se configura para alojar un elemento de inserción de cámara configurado para soportar un elemento de andamio celular, que comprende además, opcionalmente, al menos un elemento de inserción de cámara generalmente cilíndrico, que comprende una pluralidad de pestañas que se extienden radialmente hacia afuera para soportar el elemento de inserción de cámara dentro de una cámara respectiva de la pluralidad de cámaras, en donde, opcionalmente, el elemento de inserción de cámara respectiva comprende además, un elemento de andamio celular, opcionalmente, en donde el elemento de andamio celular comprende una pluralidad de poros, dicha pluralidad de poros tiene un diámetro promedio de entre aproximadamente 8 pm a aproximadamente 150 pm, en donde opcionalmente la pluralidad de poros tiene un diámetro promedio de entre aproximadamente 8 pm y a aproximadamente 100 pm;
    (iv) el cuerpo contenedor comprende al menos doce cámaras, por ejemplo, al menos veinticuatro cámaras; (v) el aparato de cultivo puede separarse del soporte del cuerpo contenedor y de al menos un elemento de accionamiento;
    (vi) el cuerpo contenedor comprende un elemento de pared perimetral exterior, y además, en donde el elemento de la pared perimetral exterior comprende una porción escalonada hacia adentro, configurada para permitir que una pluralidad de cuerpos contenedores se apilen verticalmente, opcionalmente, donde el cuerpo contenedor consiste esencialmente en la pluralidad de cámaras, al menos una vía de comunicación de fluidos, un elemento de pared perimetral exterior, en donde cada una de dicha pluralidad de cámaras está conectada mediante una trama de material;
    (vii) el cuerpo contenedor está compuesto de un material seleccionado de Zeonex™, Zeonor™, poliestireno, policarbonato, polietileno, polipropileno, PMMA, acetato de celulosa y vidrio;
    (viii) cada cámara respectiva de la pluralidad de cámaras tiene una profundidad de entre aproximadamente 16 mm y 19 mm;
    (ix) el aparato de cultivo comprende, además, un elemento de tapa que se coloca de manera desmontable sobre el cuerpo contenedor, el elemento de tapa proporciona un recubrimiento sustancialmente plano que se extiende sobre la pluralidad de cámaras;
    (x) la pluralidad de cámaras se dispone en filas y columnas, en una relación ortogonal respectiva dentro del cuerpo contenedor;
    (xi) el soporte del cuerpo contenedor comprende un elemento de pivote alrededor del cual se balancea el cuerpo contenedor;
    (xii) el elemento de plataforma se configura para retener una pluralidad de cuerpos contenedores, cada uno en una ubicación fija durante el balanceo;
    (xiii) el elemento de accionamiento comprende un actuador lineal, en donde opcionalmente el elemento de plataforma comprende una región de primer extremo y una región de extremo adicional separada de la región de primer extremo, y en donde el actuador lineal está ubicado tanto en la región de primer extremo, como en la región de extremo adicional; y/o
    (xiv) en donde el soporte del cuerpo contenedor está compuesto por un material esterilizable en autoclave.
    5. Un método in vitro para el cultivo de células y/o un tejido o porción del mismo, que comprende:
    a) proporcionar un aparato, de acuerdo con cualquier reivindicación anterior; y
    b) durante un período de tiempo predeterminado, aplicar un movimiento de balanceo al aparato de cultivo.
    6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende, además:
    ubicar al menos una célula en al menos una cámara de la pluralidad de cámaras;
    opcionalmente, en donde al menos una célula se proporciona en un cultivo celular,
    opcionalmente, en donde el cultivo celular está soportado por un elemento de andamio celular, y el método comprende, además, ubicar el cultivo celular mediante la ubicación de al menos un elemento de inserción de cámara que aloja el elemento de andamio celular en dicha al menos una cámara del cuerpo contenedor, opcionalmente, en donde dicha al menos una célula se selecciona de células eucariotas y células procariotas, por ejemplo, células vegetales, células de mamíferos, células de levadura, células fúngicas y/o células bacterianas, opcionalmente, en donde dicha al menos una célula es una célula de mamífero seleccionada de células epiteliales, células tumorales, hepatocitos, células de fibroblastos, células madre, miocardiocitos, células renales, células pulmonares, células neuronales, adipocitos, células intestinales, células de la piel, células inmunitarias, tanto solas como en combinación.
    7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que es un método in vitro para modelar una enfermedad, el método comprende:
    a) proporcionar un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;
    b) ubicar una porción de tejido, dicha porción de tejido comprende dicha al menos una célula en al menos una cámara, de la pluralidad de cámaras; y
    c) durante un período de tiempo predeterminado, aplicar un movimiento de balanceo al aparato de cultivo.
    8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende, además:
    ubicar la porción de tejido mediante la ubicación de al menos un elemento de inserción de cámara que soporta la porción de tejido en dicha al menos una cámara del cuerpo contenedor,
    en donde, opcionalmente, la porción de tejido se obtiene de un tejido seleccionado de pulmón, hígado, corazón, cerebro, páncreas y opcionalmente, en donde la porción de tejido comprende múltiples tipos de células.
    9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde dicha al menos una cámara es una primera de la pluralidad de cámaras, y además en donde la primera cámara está conectada al menos a una cámara adicional de la pluralidad de cámaras a través de una vía de comunicación de fluidos, que se extiende entre ellas, la vía de comunicación de fluidos permite el flujo bidireccional del fluido entre dicha primera cámara y la cámara adicional,
    opcionalmente, en donde el método comprende, además:
    proporcionar un medio de cultivo celular fluido a dicha primera cámara y/o la adicional y;
    aplicar el movimiento de balanceo durante un período de tiempo predeterminado, de manera que el medio de cultivo celular fluido fluya repetidamente desde dicha al menos una cámara a otra de la pluralidad de cámaras y retorne otra vez,
    opcionalmente, en donde el método comprende proporcionar entre aproximadamente 0,5 y 5 ml del medio de cultivo celular fluido por cámara a dicha primera cámara y/o la adicional de la pluralidad de cámaras, en donde, opcionalmente, el método comprende proporcionar entre aproximadamente 1,5 y 4 ml del medio de cultivo celular fluido por cámara a dicha primera cámara y/o la adicional, de la pluralidad de cámaras.
    10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que comprende, además, ubicar al menos una célula en al menos dos cámaras de la pluralidad de cámaras, en donde al menos una célula ubicada en una primera cámara respectiva es del mismo tipo de célula o de un tipo de célula diferente, a al menos una célula ubicada en otra cámara respectiva,
    que comprende, opcionalmente, ubicar una porción de tejido que comprende dicha al menos una célula en al menos dos cámaras de la pluralidad de cámaras,
    que comprende, opcionalmente, proporcionar una fuerza impulsora al elemento de accionamiento de un aparato, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y subir y bajar repetidamente los extremos separados del cuerpo contenedor para aplicar un movimiento de balanceo al cuerpo contenedor,
    opcionalmente, que comprende aplicar un movimiento de balanceo durante al menos 24 horas, por ejemplo, 48 horas, 72 horas o más,
    opcionalmente, que comprende, además, determinar la viabilidad u otro parámetro medible de al menos una célula, opcionalmente, en donde al menos una célula comprende un hepatocito, y, además, en donde la etapa de determinar la viabilidad celular u otro parámetro medible comprende medir la producción de albúmina por la(s) célula(s), en donde, opcionalmente, el cultivo celular es un corte de hígado.
    11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, que es un método para modelar una enfermedad hepática,
    opcionalmente, que es un método para modelar la enfermedad del hígado graso y comprende, además, las etapas de:
    cultivar el corte de hígado, con uno o más lípidos, hasta aproximadamente cuatro días,
    opcionalmente, en donde uno o más lípidos se selecciona de ácido palmítico, ácido oleico y ácido linoleico conjugado con albúmina de suero bovino (BSA) y sus combinaciones,
    opcionalmente, que comprende, además, las etapas de:
    cultivar el corte de hígado con uno o más factores estimulantes de la fibrosis hasta aproximadamente cuatro días, en donde, opcionalmente, el uno o más factores estimulantes de la fibrosis se selecciona de factor de crecimiento transformante-p (tgfb), factor de crecimiento derivado de plaquetas-bb (pdgf-bb) y sus combinaciones, opcionalmente, que comprende, además, las etapas de:
    cultivar el corte de hígado con uno o más mediadores inflamatorios, hasta aproximadamente cuatro días en donde, opcionalmente, el mediador inflamatorio se selecciona de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), por ejemplo, lipopolisacárido (LPS) o poli IC, y patrones moleculares asociados al daño (DAMP), por ejemplo, células apoptóticas o dañadas,
    opcionalmente, que comprende, además, las etapas de:
    cultivar el corte de hígado con uno o más agentes hepatotóxicos hasta aproximadamente 4 días, en donde, opcionalmente, el agente hepatotóxico se selecciona de acetaminofeno, ácidos biliares y sus combinaciones.
    12. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que es un método para probar la toxicidad hepática in vitro de un agente, el método comprende:
    a) proporcionar un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;
    b) ubicar al menos un hepatocito y un elemento de andamio celular en al menos una cámara de la pluralidad de cámaras;
    c) añadir al menos un agente a probar a dicha al menos una cámara;
    d) durante un período de tiempo predeterminado, aplicar un movimiento de balanceo al aparato de cultivo; y e) monitorear al menos un efecto del agente sobre el hepatocito.
    13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde al menos un hepatocito está comprendido en un corte de hígado, el método comprende ubicar el corte de hígado en al menos una cámara, y en donde, opcionalmente, el corte de hígado comprende, además, una pluralidad de tipos de células,
    opcionalmente, en donde monitorear al menos un efecto del agente comprende monitorear el efecto del agente sobre la proliferación y/o la diferenciación y/o la función del hepatocito, como medida de la toxicidad del agente, que comprende, opcionalmente, ubicar al menos una célula y el elemento de andamio del cultivo celular mediante la ubicación de al menos un elemento de inserción de cámara que soporta un elemento de andamio de cultivo celular que sostiene al menos una célula en dicha al menos una cámara del cuerpo contenedor.
    14. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, que comprende, además:
    añadir un medio de cultivo celular fluido a dicha al menos una cámara de la pluralidad de cámaras y; aplicar el movimiento de balanceo durante un período de tiempo predeterminado, de manera que, el medio de cultivo celular fluido fluya repetidamente desde dicha cámara a otra de la pluralidad de cámaras, y retorne otra vez.
    15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que comprende;
    proporcionar una fuerza impulsora al elemento de accionamiento; y
    subir y bajar repetidamente los extremos separados del cuerpo contenedor, para aplicar un movimiento de balanceo al cuerpo contenedor.
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