CN116751678A - 一种细胞球培养器官芯片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及芯片设计及制作技术领域，提供了一种细胞球培养器官芯片及其制备方法，芯片包括第一芯片结构和第二芯片结构；第一芯片结构设置在第二芯片结构的上方；第一芯片结构设置有进药口、浓度分散结构和第一流道阵列；进药口与浓度分散结构的一端连接，浓度分散结构的另一端与第一流道阵列连通；第二芯片结构设置有第二流道阵列和细胞培养腔阵列；细胞培养腔阵列分布在第二流道阵列的第二流道内；第一流道阵列在第一芯片结构的位置与第二流道阵列在第二芯片结构的位置对应重合。基于本申请实施例通过在进药口和第一流道阵列间设置浓度分散结构，可以形成均匀的浓度梯度，在药物筛选过程中可以省去不同浓度药物的配制，可以实现高通量筛选。

Description

一种细胞球培养器官芯片及其制备方法
技术领域
本发明涉及芯片设计及制作技术领域，尤其涉及一种细胞球培养器官芯片及其制备方法。
背景技术
自2004年最早的器官芯片报道以来，经历十多年的研究，器官芯片已取得巨大的成功，其以前所未有的方式模拟和见证人体的多种生物学行为。在开发新药、毒性测试、干细胞研究和了解疾病机制等领域具有重要应用前景。然而，平面培养的细胞在模拟真正在体生理特性方面存在差异。直至2009年首个3D细胞培养系统——类器官的出现，其与体内的来源组织或器官高度相似，可以复制出已分化组织的复杂空间形态，并且能够表现出细胞与细胞，以及细胞与基质中间的相互作用。理想状态下，类器官与体内分化的组织具有相似的生理反应。类器官可以实现对药物的药效和毒性的有效检测。并且可直接使用人源细胞生成，从而可以避免因动物和人类细胞间的差异而导致的检测结果的不可靠性，也可以减少动物在临床试验中的使用。但现有类器官在药物筛选过程中存在很多不足，比如较难实现高通量筛选。
发明内容
本申请实施例提供了一种细胞球培养器官芯片及其制备方法，可以形成均匀的浓度梯度，在药物筛选过程中可以省去不同浓度药物的配制，可以实现高通量筛选。
本申请实施例提供了一种细胞球培养器官芯片，包括：第一芯片结构和第二芯片结构；
第一芯片结构设置在第二芯片结构的上方；
第一芯片结构设置有进药口、浓度分散结构和第一流道阵列；
进药口与浓度分散结构的一端连接，浓度分散结构的另一端与第一流道阵列连通；
第二芯片结构设置有第二流道阵列和细胞培养腔阵列；
细胞培养腔阵列分布在第二流道阵列的第二流道内；
第一流道阵列在第一芯片结构的位置与第二流道阵列在第二芯片结构的位置对应重合。
进一步地，第一芯片结构设置有多个第一进出样口组；
多个第一进出样口组中每个第一进出样口组包括第一进出样口和第二进出样口；
针对第一流道阵列中的任意一个第一流道，第一进出样口设置在任意一个第一流道的一端；
第二进出样口设置在任意一个第一流道的另一端；
第一进出样口和第二进出样口贯穿设置在第一芯片结构上。
进一步地，第二芯片结构设置有多个第二进出样口组；
多个第二进出样口组中每个第二进出样口组包括第三进出样口和第四进出样口；
第一进出样口组中的第一进出样口与第二进出样口组中的第三进出样口一一对应，第一进出样口组中的第二进出样口与第二进出样口组中的第四进出样口一一对应；
一一对应的第三进出样口在第二芯片结构上的位置与第一进出样口在第一芯片结构上的位置对应重合，一一对应的第四进出样口在第二芯片结构上的位置与第二进出样口在第二芯片结构上的位置对应重合；
针对第二流道阵列中的任意一个第二流道，第三进出样口与任意一个第二流道的一端连通，第三进出样口用于向第二流道注入或者导出待培养细胞悬液；
第四进出样口与第二流道的另一端连通，第四进出样口用于向第二流道注入或者导出培养液。
进一步地，第一流道阵列中的第一流道与第二流道阵列中的第二流道一一对应；
第一流道阵列中的第一流道间隔设置在第一芯片结构上；
第二流道阵列中的第二流道间隔设置在第二芯片结构上；
第一流道阵列中的多个第一流道之间阻隔，一一对应的第一流道与第二流道连通；
一一对应的第一流道在第一芯片结构上的位置与第二流道在第二芯片结构上的位置对应重合。
进一步地，浓度分散结构包括多个浓度分散层；
多个浓度分散层中浓度分散层与第一流道阵列中的第一流道一一对应；
一一对应的浓度分散层与第一流道连通；
多个浓度分散层中的每个浓度分散层流通的药品的浓度不同。
进一步地，第一进出样口的直径小于第二进出样口的直径；
第一进出样口的直径在区间[1.5mm,2.5mm]内；
第二进出样口的直径在区间[3.5mm,4.5mm]内。
进一步地，细胞培养腔阵列中细胞培养腔为开口朝上的U型凹槽；
细胞培养腔的直径在区间[550μm,650μm]内；
细胞培养腔的深度在区间[550μm,650μm]内。
相应地，本申请实施例提供了一种细胞球培养器官芯片的制备方法，包括：
获取待处理芯片和模具；模具具有待制备流道阵列区域和设置在待制备流道阵列中每个待制备流道内的待注入凹槽；
对待处理芯片进行光刻处理，使得在待处理芯片上制备出进药口、浓度分散结构和第一流道阵列，得到第一芯片结构；
在模具内固化聚二甲基硅氧烷，得到第二芯片结构；第二芯片结构包括第二流道阵列和细胞培养腔阵列，细胞培养腔阵列分布在第二流道阵列的第二流道内；
对第一芯片结构和第二芯片结构进行键合处理，得到细胞球培养器官芯片。
进一步地，模具内固化聚二甲基硅氧烷，得到第二芯片结构，包括：
向模具内注入聚二甲基硅氧烷，静置至聚二甲基硅氧烷固化，得到待制备芯片结构；
在待制备芯片结构的待注入凹槽注入聚二甲基硅氧烷，去除多余的聚二甲基硅氧烷，利用表面张力，使得聚二甲基硅氧烷附着于待注入凹槽的侧壁和底部，形成U型凹槽，得到第二芯片结构。
进一步地，对待处理芯片进行光刻处理，使得在待处理芯片上制备出进药口、浓度分散结构和第一流道阵列，得到第一芯片结构之后，还包括：
将十三氟辛基三乙氧基烷滴在玻片上；
将玻片和第一芯片结构置于真空中进行真空处理，使得十三氟辛基三乙氧基烷附着于第一芯片结构的表面。
本申请实施例具有如下有益效果：
本申请实施例提供的一种数据处理方法、装置、电子设备及存储介质，包括第一芯片结构和第二芯片结构；第一芯片结构设置在第二芯片结构的上方；第一芯片结构设置有进药口、浓度分散结构和第一流道阵列；进药口与浓度分散结构的一端连接，浓度分散结构的另一端与第一流道阵列连通；第二芯片结构设置有第二流道阵列和细胞培养腔阵列；细胞培养腔阵列分布在第二流道阵列的第二流道内；第一流道阵列在第一芯片结构的位置与第二流道阵列在第二芯片结构的位置对应重合。基于本申请实施例通过在进药口和第一流道阵列间设置浓度分散结构，可以形成均匀的浓度梯度，在药物筛选过程中可以省去不同浓度药物的配制，可以实现高通量筛选。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1是本申请实施例提供的一种细胞球培养器官芯片的结构示意图；
图2是本申请实施例提供的一种浓度分散结构的效果验证图；
图3是本申请实施例提供的一种浓度分散结构的线性关系图；
图4是本申请实施例提供的一种注入待培养细胞悬液的示意图；
图5是本申请实施例提供的一种细胞球培养器官芯片的制备方法的流程示意图；
图6是本申请实施例提供的一种第一芯片结构的制备示意图；
图7是本申请实施例提供的一种第二芯片结构的制备示意图；
图8是本申请实施例提供的一种待注入凹槽处理前的截面示意图；
图9是本申请实施例提供的一种待注入凹槽处理后的截面示意图；
图10是本申请实施例提供的一种细胞培养7天明场图；
图11是本申请实施例提供的一种细胞球直径的分布图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施例作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一个实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
此处所称的“实施例”是指可包含于本申请至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本申请实施例的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”和“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”和“第三”等的特征可以明示或者隐含的包括一个或者更多个该特征。而且，术语“第一”、“第二”和“第三”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请实施例能够以除了在这里图示或描述以外的顺序实施。此外，术语“包括”、“具有”和“为”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
细胞生物学、分子生物学等学科的发展，为药物筛选提供了新的方法，大量分子细胞水平的药物筛选模型不断出现并应用到药物研究和药物筛选实践中。分子细胞水平的药物筛选模型主要优势在于高通量样本筛选的实现，及一药物多筛的实现。尽管传统的二维细胞培养在生物医学研究中已使用了多年，并且具有重要的价值，但它们不能研究组织特异性、分化功能或准确地预测体内组织的某些功能和药物活检，而器官芯片和类器官技术的发展可实现利用多细胞的共培养及细胞的3D培养来模拟体内微环境，使细胞的生长环境接近生理环境的细胞功能特性，从而使药物筛选的结果更准确可靠。
类器官芯片这一微流控芯片平台，基于体外细胞培养，构建小型器官模型，并在适当的生长因子、力学条件处理下，将细胞分化并促进其自组织成器官特异型细胞类型、组织，能够重现器官结构、功能。从而可以用于研究人类生物学、病理学。类器官芯片是一种在具备相关生理学水平与微环境工程条件下于体外进行组织培养的微流控装置。这一装置因基于微流控芯片技术中可操控通道、多种泵、阀门、电路、传感器相集成的原则而被称为“芯片”。因涉及微环境来刺激、模拟器官功能而被称为“器官”。例如：模拟血管中的流体剪切力来培养血管细胞，模拟循环物理负荷拉伸来培养心肌细胞。在器官芯片模型中，随着类器官种类和体积的增加，其核心与新鲜培养基接触时远离了表面，使得简单的扩散过程无法为生长的细胞提供足够的氧气和营养，也限制了流体能及时的将细胞的代谢废物带走。这导致了只有与新鲜培养基相接触的细胞才能够生长良好。而随着器官芯片技术的不断进步，可以优化温度，pH值，并使营养物质、氧供应以及废物去除能够在受控的环境中进行。与动物模型相比，器官芯片模型可以按比例放大，以较低的陈本进行高通量测试，同时可以减少道德问题。总之，在器官芯片的设计中，通道的结构、流体带来的剪切力、细胞的种类、相关细胞生长因子以及细胞-细胞、细胞-组织之间的相互作用，这些均会对模型的仿生情况产生影响。因此，在器官芯片的构建中，应当通过工程力学、细胞生物学等方法从，将模型中关键的力学条件、环境因素等进行确定，从而进行控制，使能够从模型中获得正常的生物学响应，细胞、组织获得比传统体外模型更为真实的表达、更贴近人体的准确数据。
下面介绍本申请一种细胞球培养器官芯片的具体实施例，图1是本申请实施例提供的一种细胞球培养器官芯片的结构示意图。本说明书提供了如实施例或附图所示的组成结构，但基于常规或者无创造性的劳动可以包括更多或者更少的机构、模块或结构。实施例中列举的组成结构仅仅为众多组成结构中的一种方式，不代表唯一的组成结构，在实际执行时，可以按照实施例或者附图所示的组成结构执行。
具体如图1所示，该细胞球培养器官芯片可以包括第一芯片结构100和第二芯片结构200。第一芯片结构100可以设置在第二芯片结构200的上方。第一芯片结构100可以设置有进药口110、浓度分散结构120和第一流道阵列130。其中，进药口110可以与浓度分散结构120的一端连接，浓度分散结构120的另一端可以与第一流道阵列130连通。第二芯片结构200可以设置有第二流道阵列210和细胞培养腔阵列220，细胞培养腔阵列220可以分布在第二流道阵列210的第二流道内。第一流道阵列130在第一芯片结构100上的位置可以与第二流道阵列210在第二芯片结构200上的位置对应重合。
在一些可能的实施方式中，第一芯片结构100具有上表面和下表面，第二芯片结构200具有上表面和下表面。第一芯片结构100的上表面可以设置有进药口110、浓度分散结构120和第一流道阵列130。第二芯片结构200的上表面可以设置有第二流道阵列210和细胞培养腔阵列220。第一芯片结构100的下表面可以与第二芯片结构200的上表面键合。可选地，第一芯片结构100与第二芯片结构200之间可以利用等离子体Plasma进行键合，得到细胞球培养器官芯片。
实际应用中，由于细胞球培养器官芯片将使用三维培养细胞技术，因此细胞球培养器官芯片的材料需要毒性小、生物相容性好，透气性强，并且要求材料容易加工、具有一定的弹性，易于进行封接等特点。可选地，可以选择聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)，该材料具有毒性小、透气性好、光学性能良好、生物相容性强、造价低廉、容易加工等特点。为了满足实验需求，可以在第一芯片结构100上设置6个第一流道，构成第一流道阵列130，可以在第二芯片结构200上设置6个第二流道，构成第二流道阵列210。每个第二流道中可以设置96个细胞培养腔。可替换地，每个第二流道可以分布3排细胞培养腔，每排可以设置29个细胞培养腔。
在一些可能的实施方式中，进药口110的直径可以为2mm，第一流道阵列130中的第一流道的长度可以为2cm，宽度可以为3mm。第二流道阵列210中的第二流道的长度可以为2cm，宽度可以为3mm。也即是，第一芯片结构100设置的流道的尺寸可以与第二芯片结构200设置的流道的尺寸相同。
本申请实施例中，第一芯片结构100可以设置有多个第一进出样口组140。多个第一进出样口组140中每个第一进出样口组可以包括第一进出样口141和第二进出样口142。针对第一流道阵列130中的任意一个第一流道，第一进出样口141可以设置在该任意一个第一流道的一端，第二进出样口142可以设置在该任意一个第一流道的另一端。并且，第一进出样口141和第二进出样口142均可以贯穿设置在第一芯片结构100上。
在一些可能的实施方式中，第一进出样口141的直径可以小于第二进出样口142的直径，第一进出样口141的直径可以在区间[1.5mm,2.5mm]内，第二进出样口142的直径可以在区间[3.5mm,4.5mm]内。可选地，第一进出样口141的直径可以为2mm，第二进出样口142的直径可以为4mm。
本申请实施例中，第二芯片结构200可以设置有多个第二进出样口组230。多个第二进出样口组230中每个第二进出样口组可以包括第三进出样口231和第四进出样口232。第一进出样口组140中的第一进出样口141可以与第二进出样口组230中的第三进出样口231一一对应，第一进出样口组140中的第二进出样口142可以与第二进出样口组230中的第四进出样口232一一对应。一一对应的第三进出样口231在第二芯片结构200上的位置可以与第一进出样口141在第一芯片结构100上的位置对应重合，一一对应的第四进出样口232在第二芯片结构200上的位置可以与第二进出样口142在第一芯片结构100上的位置对应重合。针对第二流道阵列210中的任意一个第二流道，第三进出样口231可以与该任意一个第二流道的一端连通，第三进出样口231可以用于向第二流道注入待培养细胞悬液，第三进出样口231也可以用于从第二流道导出待培养细胞悬液。第四进出样口232可以与该任意一个第二流道的另一端连通，第四进出样口232可以用于向第二流道注入培养液，第四进出样口232也可以用于从第二流道中导出培养液。
在一些可能的实施方式中，第三进出样口231的直径可以小于第四进出样口232的直径，第三进出样口231的直径可以在区间[1.5mm,2.5mm]内，第四进出样口232的直径可以在区间[3.5mm,4.5mm]内。可选地，第三进出样口231的直径可以为2mm，第四进出样口232的直径可以为4mm。
在一些可能的实施方式中，细胞培养腔阵列220中的细胞培养腔可以为开口朝上的U型凹槽，细胞培养腔的直径可以在区间[550μm,650μm]内，细胞培养腔的深度可以在区间[550μm,650μm]内。可选地，细胞培养腔的开口直径可以为600μm，深度可以为600μm。
本申请实施例中，第一流道阵列130中的第一流道可以与第二流道阵列310中的第二流道一一对应。第一流道阵列130中的第一流道可以间隔设置在第一芯片结构100上，第二流道阵列310中的第二流道可以间隔设置在第二芯片结构200上。第一流道阵列130中的多个第一流道之间阻隔，第二流道阵列310中的多个第二流道之间阻隔，一一对应的第一流道与第二流道可以连通，一一对应的第一流道在第一芯片结构上的位置可以与第二流道在第二芯片结构上的位置对应重合。可选地，第一芯片结构上的6个流道可以相对独立、间隔分布在第一芯片结构上，第二芯片结构上的6个流道可以相对独立、间隔分布在第二芯片结构上。
本申请实施例中，浓度分散结构120可以包括多个浓度分散层，多个浓度分散层中的浓度分散层可以与第一流道阵列130中的第一流道一一对应，一一对应的浓度分散层可以与第一流道连通，多个浓度分散层中每个浓度分散层流通的药品的浓度不同。可选地，浓度分散结构120可以呈阶梯式分布，浓度分散结构120的高度可以为100μm。
图2是本申请实施例提供的一种浓度分散结构的效果验证图，图3是本申请实施例提供的一种浓度分散结构的线性关系图。与进药口110中一个进药口连接的注射泵可以注入缓冲液PBS溶液，与进药口110中另一个进药口连接的注射泵可以注入0.1％异硫氰酸荧光素FITC溶液，可以保持两个进药口连接管的长度相等，注射泵中液体的体积可以相等。打开注射泵，可以以30μL·min-1的速度向浓度分散结构120注入两种溶液，待溶液充满浓度分散结构120的全部浓度分散层后，可以对浓度分散层进行荧光显微镜拍照，并用图像处理软件Image J对荧光照片进行荧光定量分析，并绘制浓度分散层的浓度曲线图。由图3可知，多个浓度分散层中FITC的光密度可以形成一条直线，具有良好的线性关系，线性系数R2为0.9421。由此可知，细胞球培养器官芯片的浓度分散结构具有良好的分散性，可以形成均匀的浓度梯度，在药物筛选过程中可以省去不同浓度药物的配制，可以实现高通量筛选。
图4是本申请实施例提供的一种注入待培养细胞悬液的示意图。可以利用20μL移液枪通过第一进出样口向第二流道缓慢匀速打入待培养细胞悬液，细胞由于重力原因，可以沉降至第二芯片结构底部的细胞培养腔阵列中，即第二芯片结构的U型凹槽内。重复上述步骤3次，可以在进样过程中保持细胞悬液流速稳定，确定细胞在流道中的沉降速度和每个U型凹槽中沉降的细胞数的均匀。
采用本申请实施例提供的细胞球培养器官芯片，通过在进药口和第一流道阵列间设置浓度分散结构，可以形成均匀的浓度梯度，在药物筛选过程中可以省去不同浓度药物的配制，可以同时检测不同浓度的药品对的效果，可以实现高通量筛选，可以提高药物检测的效率。
下面介绍本申请一种细胞球培养器官芯片的制备方法的具体实施例，图5是本申请实施例提供的一种细胞球培养器官芯片的制备方法的流程示意图。本说明书提供了如实施例或附图所示的方法步骤，但基于常规或者无创造性的劳动可以包括更多或者更少的步骤。实施例中列举的方法步骤仅仅为众多方法不厚中的一种方式，不代表唯一的方法步骤，在实际执行时，可以按照实施例或者附图所示的方法步骤执行。
具体如图5所示，细胞球培养器官芯片的制备方法可以包括：
S501：获取待处理芯片和模具；模具具有待制备流道阵列区域和设置在待制备流道阵列中每个待制备流道内的待注入凹槽。
本申请实施例中，可以将一硅片作为待处理芯片，并对该硅片进行预处理。具体地，在将硅片从硅片盒取出后，可以用氮气轻轻吹其表面，除去附着在硅片上表面的灰尘等物质。然后可以将硅片放置于等离子体清洗设备中进行清洗处理，除去硅片上表面附着的有机物，使得后续在硅片上涂覆的光刻胶可以很好地粘附在硅片上表面。
S503：对待处理芯片进行光刻处理，使得在待处理芯片上制备出进药口、浓度分散结构和第一流道阵列，得到第一芯片结构。
本申请实施例中，在对待处理芯片进行预处理之后，可以对待处理芯片进行匀胶处理。在进行匀胶之前，可以先将硬币大小的光刻胶倒在硅片中心，并手动旋转硅片，使得光刻胶尽量在硅片上铺开。然后可以对待处理芯片进行前烘、光刻、后烘、显影处理，使得在待处理芯片上形成进药口、浓度分散结构和第一流道阵列，得到第一芯片结构。
图6是本申请实施例提供的一种第一芯片结构的制备示意图。实际操作时，由于要求待处理芯片的通道高度在区间[100μm,150μm]内，因此可以设置匀胶机的参数为初转500rpm，15s后可以将匀胶机的后转设置为1000rpm，并保持30s。然后可以将硅片放于匀胶机转盘正中央，吸片，在按启动键的同时取型号为SU-8 3050的光刻胶加到硅片的中心处进行匀胶处理。在操作过程中要注意避免气泡的产生。结束后，可以小心去除气泡，并将硅片用培养皿盖子盖好铝箔遮光后放置过夜。然后可以将热烘板调节至水平，并将硅片转移至热烘板上，设置热烘板的温度为65℃，加热10分钟升温至95℃，继续加热30分钟，使得光刻胶中的有机溶剂挥发。进而可以关闭热烘板，使得硅片自然降温冷却至室温。在对待处理芯片进行前烘处理后，可以将冷却后的硅片固定在光刻平台上，并将掩模板覆盖对齐后，在300-350nm波长时，曝光一段时间，使曝光能量维持在区间150mJ·cm-2-250mJ·cm-2内。其中，曝光的时间可以由汞灯强度以及光刻胶厚度决定。具体计算公式如下：
其中，t可以表示曝光时间，单位为s，Δx可以表示光刻胶厚度，单位为μm，E可以为汞灯紫外光强，E可以由具体的光强测量仪器测得。
在对待处理芯片进行光刻处理后，可以对待处理芯片进行后烘处理，将紫外曝光的硅片放置在热烘板上，设置热烘板的温度为65℃，加热1分钟升温至95℃，继续加热10分钟，使得曝光部分的光刻胶进行交联反应，然后可以关闭热烘板，使得硅片自然降温冷却至室温。然后可以对待处理芯片进行显影处理，将显影液丙二醇甲醚醋酸脂PGMEA倒入玻璃皿内，并放入后烘处理的硅片，使得液面没过硅片上表面，轻轻晃动玻璃皿，使未曝光部分光刻胶溶解，清洗过程约10-25分钟。在清洗过程中需要不断观察清洗进展，待未曝光部分全部溶解后，可以用镊子夹出硅片，在此过程中不要触碰到有图案的部分。然后可以用氮气轻轻吹硅片上表面，去除硅片上表面残留的显影液。干燥后可以将硅片放入新鲜的PGMEA中再次清洗约10秒后取出，继续用氮气轻轻吹硅片上表面，并重复清洗和干燥步骤直至硅片上表面干燥且无残留光刻胶的印记为止。然后，可以翻转硅片，用新鲜的PGMEA冲洗硅片的下表面，并用氮气轻轻吹硅片下表面，重复清洗和干燥步骤直至硅片下表面干燥且无残留光刻胶的印记为止，得到第一芯片结构。然后可以在培养皿中心滴加一滴PGMEA，将第一芯片结构放入培养皿中，使得第一芯片结构与培养皿粘住。
在对待处理芯片进行显影处理后，可以对待处理进行坚膜和表面疏水处理。具体地，可以将显影处理后的硅片放置于热烘板上180℃烘烤2小时，使得胶膜中残留溶剂挥发。通过对待处理芯片进行坚膜处理，可以使得变性的光刻胶与硅片能够结合的更牢固，可以增强第一芯片结构的抗蚀能力。在对待处理芯片进行表面疏水处理的过程中，可以将一滴十三氟辛基硅烷滴在玻片上，并将玻片和硅片一同放入真空箱中，进而可以对真空箱进行抽真空处理并保持30分钟，使得十三氟辛基硅烷附着于第一芯片结构表面。然后可以在第一芯片结构上开设多个第一进出样口组，例如，可以在第一流道阵列中的任意一个第一流道的一端开设第一进出样口，在该第一流道的另一侧开设第二进出样口。第一进出样口的直径可以小于第二进出样口的直径，第一进出样口的直径可以在区间[1.5mm,2.5mm]内，第二进出样口的直径可以在区间[3.5mm,4.5mm]内。可选地，第一进出样口的直径可以为2mm，第二进出样口的直径可以为4mm。
S505：在模具内固化聚二甲基硅氧烷，得到第二芯片结构；第二芯片结构包括第二流道阵列和细胞培养腔阵列，细胞培养腔阵列分布在第二流道阵列的第二流道内。
本申请实施例中，可以将PDMS A液与PDMS B液按照比例10:1混合，并存储在干净的一次性杯子内。其中，PDMS B液的比例越高，待胶体凝固后的物质的机械强度越大。搅拌均匀后，可以放置于真空箱中进行抽真空处理，并保持30分钟去除气泡。去除气泡后倒入有硅片的培养皿中，并再次抽真空处理去除气泡。然后可以将培养皿放在热烘板上，设置热烘板的温度为65℃加热4小时，使得PDMS固化。
图7是本申请实施例提供的一种第二芯片结构的制备示意图。第二芯片结构可以由计算机辅助技术(Computer Aided Design,CAD)绘制好3D图形后，交送3D打印公司进行高精度3D打印，得到塑料打印模具。该模具可以具有待制备流道阵列区域和设置在待制备流道阵列中每个待制备流道内的待注入凹槽。然后可以将模具固定在培养皿中重复PDMS固化步骤。图8是本申请实施例提供的一种待注入凹槽处理前的截面示意图，图9是本申请实施例提供的一种待注入凹槽处理后的截面示意图。由于待注入凹槽壁上不光滑，不利于细胞球形成，因此可以在待注入凹槽部分滴加未固化的PDMS，并进行抽真空处理使未固化的PDMS进入待注入凹槽里，然后可以用盖玻片刮掉多余的PDMS，基于PDMS表面张力，部分PDMS将附着于待注入凹槽的侧壁及底部，形成U型凹槽，即细胞球培养腔阵列。然后可以在超净台中小心地用割刀将成凝为固态的PDMS胶按边框切割下来，并用干净的塑料薄膜包裹好，切割时注意不要划花硅片表面或损坏芯片内通道形状。然后使用打孔笔、打孔器按照设计尺寸大小进行打孔，打出第二进出样口组，得到第二芯片结构。具体地，可以在第二流道阵列中的任意一个第二流道的一端开设第三进出样口，在该第二流道的另一端开设第四进出样口。第三进出样口的直径可以小于第四进出样口的直径，第三进出样口的直径可以在区间[1.5mm,2.5mm]内，第四进出样口的直径可以在区间[3.5mm,4.5mm]内。可选地，第三进出样口的直径可以为2mm，第四进出样口的直径可以为4mm。第三进出样口可以与该任意一个第二流道的一端连通，第三进出样口可以用于向第二流道注入待培养细胞悬液，第三进出样口也可以用于从第二流道导出待培养细胞悬液。第四进出样口可以与该任意一个第二流道的另一端连通，第四进出样口可以用于向第二流道注入培养液，第四进出样口也可以用于从第二流道中导出培养液。
S507：对第一芯片结构和第二芯片结构进行键合处理，得到细胞球培养器官芯片。
本申请实施例中，在进行键合操作前，可以用浓度为75％的乙醇对等离子体清洗设备的内腔进行清洗，清洗晾干后，将第一芯片结构和第二芯片结构具有图案的一面朝上，放置在等离子体清洗设备的内腔中。打开真空泵，关闭等离子体清洗设备的腔室门，转动三通阀阀门使腔室与泵相通，抽真空1min～2min。同时按下Power键，并将档位调至High。当在内腔内发现起辉(即腔内有灰色或紫红色光出现)后，计时1min。1min后将档位调回off，关闭Power键。旋转三通阀阀门，关闭真空泵并使腔室与大气相连，将第一芯片结构和第二芯片结构取出，将第一流道阵列和第二流道阵列对齐以及将第一进出样口组和第二进出样口组对齐后按压，两分钟后将0.5％聚醚F127滴入细胞球培养器官芯片一侧的孔中维持芯片的亲水性，并将芯片放入4℃冰箱过夜。
在实验过程中，为了使细胞在凹槽中成球生长而不贴壁生长，需要对细胞球培养器官芯片进行改性处理。在细胞球培养器官芯片键合完成后，可以向芯片的一侧的第一进出样口中滴加0.5％聚醚F127，基于重力作用，F127可以从一侧的第一进出样口流经第三进出样口，并流入第二流道，然后可以流经第四进出样口，从另一侧的第二进出样口流出。但受表面张力影响，细胞培养腔中的气体无法及时完全地排出。为了将气泡排出，可以将加满F127的芯片放入真空箱中抽真空，并保持30分钟，使得细胞培养腔中的气体完全排出。然后可以将芯片放入4℃冰箱过夜。第二天，可以吸出F127，加入赛默飞PBS溶液，并从第一进出样口和第二进出样口往外吸取PBS，直至第一进出样口和第二进出样口中的PBS基本吸干，在此过程中需要保持第二流道内充满PBS液体。然后可以从第二进出样口向第二流道加入培养液，同样在第一进出样口从第二流道中吸出60μL左右的培养液使得第二流道内的PBS液体被吸出，放置培养箱备用。
然后可以对细胞球培养器官芯片进行细胞接种处理，对人脐静脉内皮细胞HUVEC及人肝癌细胞HepaRG细胞悬液进行细胞计数，并将计数后的细胞按照1:3的比例混合，并调整细胞密度为。然后可以吹打细胞混合均匀，用20移液枪吸取混合好的细胞悬液，从直径较小的第一进出样口匀速打入第二流道阵列的6个第二流道内，6个第二流道均注入后，等待片刻，让细胞自然沉降至细胞培养腔的底部。重复3次打入20的细胞悬液，待细胞全部沉降后，可以将细胞培养器官芯片放入培养箱中。培养2小时后，从直径较大的第二进出样口中吸出培养液，并加入新的培养液。之后，每天更换一次新鲜的培养液，培养至8天后可以进行肝脏相关功能蛋白检测及药物毒性检测实验。
细胞悬液加入细胞球培养器官芯片后，细胞可以沉降在细胞培养腔聚集生长。培养3天左右，细胞可以形成紧密的细胞球，细胞球的尺寸随着细胞剧团的紧密缩8。图10是本申请实施例提供的一种细胞培养7天明场图，可见，在5-7天后细胞生长趋于稳定，大约维持在110。在细胞生长8天后，可以用显微镜进行大图拼接拍照，对6个流道进行全流道拍照并拼接照片，然后用显微镜自带软件对流道中的细胞球直径进行测量，并统计画图。图11是本申请实施例提供的一种细胞球直径的分布图，细胞可以在细胞培养腔中形成尺寸均一的细胞球，且细胞球的直径尺寸分布在120μm左右。很多文献证实当细胞球的直径大于200μm时，由于缺乏血管结构，细胞球中心部分细胞无法吸收到营养物质，因此会出现坏死的现象。所以细胞尺寸维持在110μm左右是较理想的状态。
需要说明的是：上述本申请实施例的先后顺序仅仅为了描述，不代表实施例的优劣，且上述本说明书对特定的实施例进行了描述，其他实施例也在所附权利要求书的范围内。在一些情况下，在权利要求书中记载的动作或者步骤可以按照不同的实施例中的顺序来执行并且能够实现预期的结果。另外，在附图中描绘的过程不一定要求示出特定顺序或者而连接顺序才能够实现期望的结果，在某些实施方式中，多任务并行处理也是可以的或者可能是有利的。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的均为与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置和电子设备的实施例而言，由于其基于相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细胞球培养器官芯片，其特征在于，包括：第一芯片结构和第二芯片结构；
所述第一芯片结构设置在所述第二芯片结构的上方；
所述第一芯片结构设置有进药口、浓度分散结构和第一流道阵列；
所述进药口与所述浓度分散结构的一端连接，所述浓度分散结构的另一端与所述第一流道阵列连通；
所述第二芯片结构设置有第二流道阵列和细胞培养腔阵列；
所述细胞培养腔阵列分布在所述第二流道阵列的第二流道内；
所述第一流道阵列在所述第一芯片结构的位置与所述第二流道阵列在所述第二芯片结构的位置对应重合。
2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述第一芯片结构设置有多个第一进出样口组；
多个所述第一进出样口组中每个第一进出样口组包括第一进出样口和第二进出样口；
针对所述第一流道阵列中的任意一个第一流道，所述第一进出样口设置在所述任意一个第一流道的一端；
所述第二进出样口设置在所述任意一个第一流道的另一端；
所述第一进出样口和所述第二进出样口贯穿设置在所述第一芯片结构上。
3.根据权利要求2所述的芯片，其特征在于，所述第二芯片结构设置有多个第二进出样口组；
多个所述第二进出样口组中每个第二进出样口组包括第三进出样口和第四进出样口；
所述第一进出样口组中的第一进出样口与所述第二进出样口组中的第三进出样口一一对应，所述第一进出样口组中的第二进出样口与所述第二进出样口组中的第四进出样口一一对应；
一一对应的所述第三进出样口在所述第二芯片结构上的位置与所述第一进出样口在所述第一芯片结构上的位置对应重合，一一对应的所述第四进出样口在所述第二芯片结构上的位置与所述第二进出样口在所述第二芯片结构上的位置对应重合；
针对所述第二流道阵列中的任意一个第二流道，所述第三进出样口与所述任意一个第二流道的一端连通，所述第三进出样口用于向所述第二流道注入或者导出待培养细胞悬液；
所述第四进出样口与所述第二流道的另一端连通，所述第四进出样口用于向所述第二流道注入或者导出培养液。
4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述第一流道阵列中的第一流道与所述第二流道阵列中的第二流道一一对应；
所述第一流道阵列中的第一流道间隔设置在所述第一芯片结构上；
所述第二流道阵列中的第二流道间隔设置在所述第二芯片结构上；
所述第一流道阵列中的多个第一流道之间阻隔，一一对应的所述第一流道与所述第二流道连通；
一一对应的所述第一流道在所述第一芯片结构上的位置与所述第二流道在所述第二芯片结构上的位置对应重合。
5.根据权利要求4所述芯片，其特征在于，所述浓度分散结构包括多个浓度分散层；
多个所述浓度分散层中的浓度分散层与所述第一流道阵列中的第一流道一一对应；
一一对应的所述浓度分散层与所述第一流道连通；
多个所述浓度分散层中每个浓度分散层流通的药品的浓度不同。
6.根据权利要求2所述的芯片，其特征在于，所述第一进出样口的直径小于所述第二进出样口的直径；
所述第一进出样口的直径在区间[1.5mm,2.5mm]内；
所述第二进出样口的直径在区间[3.5mm,4.5mm]内。
7.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述细胞培养腔阵列中细胞培养腔为开口朝上的U型凹槽；
所述细胞培养腔的直径在区间[550μm,650μm]内；
所述细胞培养腔的深度在区间[550μm,650μm]内。
8.一种细胞球培养器官芯片的制备方法，其特征在于，包括：
获取待处理芯片和模具；所述模具具有待制备流道阵列区域和设置在所述待制备流道阵列中每个待制备流道内的待注入凹槽；
对所述待处理芯片进行光刻处理，使得在所述待处理芯片上制备出进药口、浓度分散结构和第一流道阵列，得到第一芯片结构；
在所述模具内固化聚二甲基硅氧烷，得到第二芯片结构；所述第二芯片结构包括第二流道阵列和细胞培养腔阵列，所述细胞培养腔阵列分布在所述第二流道阵列的第二流道内；
对所述第一芯片结构和所述第二芯片结构进行键合处理，得到细胞球培养器官芯片。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述模具内固化聚二甲基硅氧烷，得到第二芯片结构，包括：
向所述模具内注入聚二甲基硅氧烷，静置至所述聚二甲基硅氧烷固化，得到待制备芯片结构；
在所述待制备芯片结构的所述待注入凹槽注入聚二甲基硅氧烷，去除多余的所述聚二甲基硅氧烷，利用表面张力，使得所述聚二甲基硅氧烷附着于所述待注入凹槽的侧壁和底部，形成U型凹槽，得到所述第二芯片结构。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述对所述待处理芯片进行光刻处理，使得在所述待处理芯片上制备出进药口、浓度分散结构和第一流道阵列，得到第一芯片结构之后，还包括：
将十三氟辛基三乙氧基烷滴在玻片上；
将所述玻片和所述第一芯片结构置于真空中进行真空处理，使得所述十三氟辛基三乙氧基烷附着于所述第一芯片结构的表面。
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