KR20150143860A - 표적 핵산의 신속한 다중화 적용 방법 - Google Patents

표적 핵산의 신속한 다중화 적용 방법 Download PDF

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KR20150143860A
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리차드 에프. 셀든
유진 탠
흥 씨. 람
하이디 에스. 기제
그레고리 제이. 켈로그
존 에이. 라이트
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네트바이오, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 표적 핵산으로부터 증폭된 핵산 생성물, 예를 들어, 완전한 STR 프로파일을 신속하게 발생시킬 수 있는 신속하고 다중화된 PCR 시스템을 기재한다. 이러한 시스템은, 예를 들어, 미세유체 바이오칩 및 맞춤형(custom built)의 열 순환기를 포함하며, 이 또한 본 발명에 기재되어 있다. 생성된 STR 프로파일은 신호 강도, 유전자좌 간 피크 높이 균형, 이형 피크 높이 비, 불완전한 비-주형 누클레오티드 첨가 및 스터터(stutter)에 대한 법의학적 가이드라인을 만족시킬 수 있다.

Description

표적 핵산의 신속한 다중화 적용 방법{METHODS FOR RAPID MULTIPLEXED AMPLIFICATION OF TARGET NUCLEIC ACIDS}
관련 출원의 참조 연계
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2007년 4월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 60/921,802호; 2007년 8월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 60/964,502호; 및 2008년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 61/028,073호의 출원일을 우선권으로 주장하며, 이들의 각각의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 본 출원은 또한 본 출원과 동일한 날에 출원된 첫번째 표제 "통합된 핵산 분석(INTEGRATED NUCLEIC ACID ANALYSIS)"(Attorney Docket No. 07-801-US) 및 두번째 표제 "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼(PLASTIC MICROFLUIDIC SEPARATION AND DETECTION PLATFORMS)"(Attorney Docket No. 07-865-US)의 2개의 미국 특허 출원의 전체내용을 참조로서 포함한다.
발명의 분야
본 발명은 핵산 샘플 내의 1개 이상의 유전자좌(loci)의 신속한 증폭을 위한 방법, 뿐만 아니라 이러한 방법을 수행하는데 유용한 열 순환기(thermal cycler) 및 시스템에 관한 것이다.
발명의 배경
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 시험관내에서 핵산 서열의 신속한 지수적 증폭을 촉진하는 효소 반응이다. 법의학에서, PCR은 단기 일렬 반복(Short Tandem Repeat, STR)으로 공지된 반복되는 DNA의 부류를 함유하는 인간 유전체의 작은 영역의 증폭을 기초로 하여 개체를 확인하는데 사용될 수 있다. 2 내지 10개의 염기쌍 범위의 제공된 STR 반복의 단위 길이, 및 STR들은 일반적으로 비-코딩 및 플랭킹(flanking) 서열 내에 해당되나, 이는 때때로 코딩 영역 내에 해당된다(Edwards et al., Am. J. Hum. Genet. 1991, 49, 746-756). 인간 유전체에는 각각 평균 6-10kb로 발생하고(Beckman and Weber, Genomics 1992, 12, 627-631), 고도로 다형태인(Edwards et al., Trans. Assoc. Am. Physicians 1989, 102, 185-194) 수십만개의 STR 유전자좌가 존재한다. STR 분석은 법의학 설비에서 주요 도구가 되고 있으며, 친자 확인, 대형 참사 시의 인간 확인, 및 통상적인 아동의 형결정(typing of children)을 포함하여 적용 추세가 증가하고 있다.
여러 시판되는 STR 키트가 높은 특이성을 갖는 요망되는 PCR 생성물을 합성하도록 개발되었으나, 현재의 STR 기술이 개선될 수 있는 유의한 분야가 존재한다. 가장 중요하게는, 시판되는 STR 형결정 키트를 이용하여 다중 PCR을 완료하기 위한 평균 시간은 대략 2.14시간으로; 이러한 분석의 시간 소모적이며 노동 집약적인 특성은 법의학 연구소에서의 업무 적체에 기여한다. 다수의 샘플을 동시에 처리하기 위한 자동화된 기계의 출현은 형결정 처리량에서의 현저하게 정체를 완화시키는데 도움이 되며, 분석되는 샘플 수의 증가는 상기 처리의 추가적인 가속화를 필요로 할 것이다. 또한, STR 분석의 민감도의 증가 뿐만 아니라 증폭된 생성물의 검출의 개선이 필요하다(Gill, Croat. Med. J. 2001, 42, 229-32). 현재 이용가능한 STR 키트는 9 내지 16개의 유전자좌를 함유하며, 검출될 수 있는 유전자좌의 수를 증가시키기 위한 작업이 당 분야에서 진행중이다. 당 분야에서의 STR 분석의 특정 적용은 4 또는 이 이상의 유전자좌를 이용하여 수행될 수 있다.
PCR은 또한 광범위한 임상 환경에서 적용될 수 있다. 예를 들어, PCR은 그룹 A 스트렙토코커스(Streptococci), 메티실린 내성의 S. 아우레우스(S. aureus), 및 반코마이신 내성의 엔테로코커스(Enterococci)에 의해 야기되는 감염과 같은 박테리아 감염을 진단하는데 이용될 수 있고, 이는 일반적으로 배양 기재 진단 기술보다 민감하다. 진균 감염이 유사하게 진단될 수 있다. PCR은 호흡기 바이러스(예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 및 인플루엔자 및 파라인플루엔자 바이러스), 비뇨생식 바이러스(예를들어, 단순 헤르페스 바이러스 및 형결정 인간 파필로마 바이러스), 수막염(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 및 엔테로바이러스), 및 간염(예를 들어, B형 및 C형 간염)을 진단하는데 사용될 수 있다. PCR은 또한 비정배수(aneuploidy)의 평가를 포함하는 착상전 유전 진단 뿐만 아니라 유전병의 진단에 유용하다. 종양학으로부터 류머티스학 및 혈액학으로부터 위장병학까지, PCR에 의해 영향을 받지 않는 의학 분야를 찾아보는 것이 어렵다.
PCR은 또한 가축 확인(인간 STR 형결정과 유사함), 가축 진단, 식품 안정성 평가, 농업 병원체의 검출 및 약물유전체학을 포함하는 다양한 비-임상 환경에 적용된다. 임상 및 환경 샘플에서 생물학적 무기 작용제의 확인이 중요성이 증가하는 적용 관심사이다. 각각의 증폭 순환 주기 후에 반응물에 존재하는 생성물의 양의 정량을 가능케 하는 PCR의 밀접한 친족인 실시간 PCR이 본질적으로 PCR 자체와 동일한 적용으로 사용된다(참조: Espy et al., Clinical Microbiology Reviews 2006, 19, 1656-256).
대부분의 시판되는 열 순환 기계는 이들이 PCR 용액 온도로부터 직접적으로 온도 피드백을 받고, PCR 용액 온도와 대립되는 블록 온도를 제어하는데 한계를 갖는다. 결과적으로, PCR의 성공에 중요한 용액의 온도 프로파일이 요망되는 프로파일과 총체적으로 상이하게 될 수 있다.
또한, PCR 속도 및 민감성 증가에 대한 문헌 대부분은 한번에 하나의 특정 유전자좌의 증폭("단일(singleplex) 분석")에 초점을 두며, 법의학 STR 형결정, 임상 진단 및 비-임상 적용에 필요한 다수의 유전자좌의 동시 증폭("다중(multiplex) 분석")에 대해서는 단지 제한된 성공이 보고되었다. 예를 들어, 통합된 가열기에 연결된 160 nL의 챔버가 Y-STR 분석에서 주형 DNA의 20 카피(copy)의 검출 한도로 80분 동안 함유된 4개의 STR을 증폭 및 분리시킬 수 있는 것이 밝혀졌다(Liu et al., Anal. Chem. 2007, 79, 1881-1889). 감소된 PCR 반응 부피로 인한 증가된 PCR 민감성이 또한 파워플렉스(PowerPlex®) 16 시스템에 대해 보고되었으나, 반응 속도를 증가시키기 위한 시도는 이루어지지 않았다(Schmidt et al., Int. J. Legal Med. 2006, 120, 42-48). 그러나, 당 분야에서 요구되는 현저하게 단축된 증폭 시간에 대한 보고는 없었다. 호프우드 등(Hopwood et al.)의 문헌[International Congress Series 1288 (2006) 639-641]에는 11개의 STR 프라이머 세트를 이용한 100 분의 증폭이 보고되어 있다. 임상 진단과 관련하여, 7개의 통상적인 호흡기 바이러스의 패널이 PCR 분석에서 나노칩 시스템을 이용하여 증폭되었고, 이는 97.5분을 필요로 하였다(Takahashi et al., J. Clin. Microbiol 2008, doi:10.1128/JCM.01947-07).
STR 형결정, 임상 진단 및 생물학적 무기 작용제 검출에 의한 법의학 인간 확인과 같은 다수의 PCR(및 실시간 PCR) 적용은 매우 시간에 민감하며, 이의 다수의 적용은 다중 환경에서 최적으로 수행된다. 또한, 다수의 이러한 적용은 제한적인 샘플이 이용가능한 환경(예를 들어, 임상 또는 환경 샘플로부터의 적은 수의 병원체, 또는 법의학 샘플로부터의 적은 수의 인간 세포)에서 사용되며, 반응의 민감성이 중요하다.
*특히, 호스먼 등(Horsman et al.)의 문헌[J.Forensic Sci., 2007, 52, 784-799) Id. at 792]에는 논제에 대한 대량의 문헌에 의해 입증되는 바와 같이 PCR이 분석 마이크로칩 연구원 사이에서 공통으로 추구되고 있는 것이 언급되어 있다. 그러나, 법의학 DNA 분석에 대해, 다수의 개발 방법이 존재한다. 단일 장치에서의 시판되는 법의학 STR 키트 또는 추가로 다중 STR 증폭을 이용한 광범위한 작업은 밝혀지지 않았다. 그러나, 충분히 발전된 마이크로칩 PCR은 확실히 법의학 분야에서 현저한 시간 및 비용 절감을 제공할 것이다. 따라서, 광범위한 적용에 대해 핵산 샘플 내의 다수의 유전자좌의 동시 증폭을 성공적으로 제공하는 신속하고 민감한 방법이 당 분야에 필요하다.
발명의 개요
본 발명의 기계, 바이오칩, 방법 및 시스템은 적어도 부분적으로는 용액의 실제 온도를 기초로 하여 열 순환기의 모니터링 및 제어를 통해 PCR 용액을 신속하고, 제어가능하고, 재현가능하게 가열하거나 냉각하는 능력을 제공한다. 본원에 기재된 본 발명의 기계, 바이오칩, 방법 및 시스템은 시판되는 열 순환기에 존재하지 않는 써모센서(thermosensor)의 특정한 통합을 통해 과열 또는 언더히팅(under-heating)을 회피하기 위해 바이오칩 내의 용액의 반응 온도를 모니터하고/하거나 정확하게 제어하는 능력을 제공한다. 반응 용액을 상기 온도로 신속하게 가열하고 냉각시키는 능력은 램핑(ramping) 및 세틀링(settling) 시간을 최소화시키고, 요망되는 온도에서 인큐베이션 시간이 전체 단계 시간을 좌우하도록 한다. 추가로, 본원에 제공된 본 발명의 기계, 바이오칩, 방법 및 시스템은 반응 용액의 온도를 신속하게 변경시키고 평형화시키는 능력을 제공함으로써 증폭 반응이 진행되는 속도를 크게 증가시킨다.
17분만큼 짧은 신속한 다중 PCR 증폭 시간이 본 발명의 기계, 바이오칩, 방법 및 시스템을 이용하여 달성된다. 본 발명의 교시내용에 기초하여 추가적인 시간 감소가 가능하다. 또한, 본 발명의 신속한 PCR 방법은 광범위한 동적 구역에 걸쳐 효과적이고, 극도로 민감하고, 광범위한 시판되는 효소 및 시약과 양립된다. 법의학 적용을 위해, 본 발명의 기계, 바이오칩, 방법 및 시스템은 STR 분석을 위한 해석(interpretation) 가이드라인을 만족시키는 완전한 프로파일을 생성시키는데 필요한 시간을 현저하게 감소시킬 수 있다.
첫번째 양태에서, 본 발명은 온도 제어 엘리먼트(TCE)를 포함하는 열 순환기를 제공하며, 상기 TCE의 제 1 표면은 용액을 함유하는 샘플 챔버 및 써모센서를 함유하는 센싱 챔버를 수용하도록 적합하고, 상기 써모센서는 샘플을 요망되는 온도로 설정하거나 유지시키기 위해 TCE에 피드백을 제공한다. 두번째 양태에서, 본 발명은 TCE의 제 1 표면의 온도를 모니터하도록 위치된 제 2의 써모센서를 추가로 포함하는 열 순환기를 제공한다.
두번째 양태에서, 본 발명은 부피를 갖는 바이오칩의 부분을 포함하는 1개 또는 다수의 반응 챔버를 포함하는 바이오칩을 포함하는 시스템을 제공하고, 여기서 각각의 반응 챔버는 미세유체(microfluidic) 입구 채널 및 미세유체 출구 채널을 추가로 포함하고, 각각의 반응 챔버는 바이오칩 기판의 접촉 표면으로부터 200 μm 미만에 존재하며; 상기 시스템은 온도 제어 엘리먼트(TCE)로서 이의 제 1 표면이 샘플을 함유하는 기판을 수용하도록 적합된 온도 제어 엘리먼트(TCE), 및 기판 내의 샘플의 온도를 측정하고, 샘플을 요망되는 온도로 설정하거나 유지시키기 위해 TCE에 피드백을 제공하도록 위치된 써모센서를 포함하는, 바이오칩 기판의 접촉 표면과 열 소통하는 열 순환기를 추가로 포함한다.
세번째 양태에서, 본 발명은 각각의 반응 챔버가 부피를 갖는 바이오칩의 부분을 포함하고, 미세유체 입구 채널 및 미세유체 출구 채널을 추가로 포함하고, 각각의 반응 챔버가 바이오칩 기판의 접촉 표면으로부터 100 μm 미만에 존재하는, 1개 또는 다수의 반응 챔버를 포함하는 바이오칩; 및 온도 제어 엘리먼트(TCE)로서 이의 제 1 표면이 샘플을 함유하는 기판을 수용하도록 적합된 온도 제어 엘리먼트(TCE), 및 기판 내의 샘플의 온도를 측정하고, 샘플을 요망되는 온도로 설정하거나 유지시키기 위해 TCE에 피드백을 제공하도록 위치된 써모센서를 포함하는, 바이오칩 기판의 접촉 표면과 열 소통하는 열 순환기를 포함하는 시스템을 제공한다.
네번째 양태에서, 본 발명은 각각의 반응 챔버가 (ⅰ) 증폭되는 하나 이상의 표적 핵산의 하나 이상의 카피를 포함하는 핵산 용액; (ⅱ) 하나 이상의 완충용액; (ⅲ) 하나 이상의 염; (ⅳ) 증폭되는 다수의 유전자좌의 각각에 해당하는 프라이머 세트; (ⅴ) 핵산 중합효소; 및 (vi) 누클레오티드를 포함하는 1개 또는 다수의 반응 챔버를 제공하는 단계, 및 약 4-150℃/초의 가열 및 냉각 속도로 소정의 수의 순환 주기 동안 변성 상태, 어닐링(annealing) 상태 및 신장(extension) 상태 사이에 각각의 반응 챔버 내의 핵산의 온도를 순차적으로 열 순환시켜 약 97분 이하 동안 각각의 반응 챔버에서 다수의 증폭된 유전자좌를 생성시키는 단계를 포함하는, 핵산 용액 중의 다수의 유전자좌를 동시에 증폭시키는 방법을 제공한다.
다섯번째 양태에서, 본 발명은 각각의 반응 챔버가 (ⅰ) 증폭되는 하나 이상의 표적 핵산의 하나 이상의 카피를 포함하는 핵산 용액; (ⅱ) 하나 이상의 완충용액; (ⅲ) 하나 이상의 염; (ⅳ) 증폭되는 다수의 유전자좌의 각각에 해당하는 프라이머 세트; (ⅴ) 핵산 중합효소; 및 (ⅵ) 누클레오티드를 포함하는 1개 또는 다수의 반응 챔버를 제공하는 단계; 및 약 4-150℃/초의 가열 및 냉각 속도로 소정의 수의 순환 주기 동안 각각의 반응 챔버 내의 핵산 용액의 온도를 순차적으로 열 순환시켜 약 97분 이하 동안 각각의 반응 챔버에서 다수의 증폭된 유전자좌를 생성시키는 단계를 포함하는, 핵산 용액 중의 다수의 유전자좌를 동시에 증폭시키는 방법을 제공한다.
여섯번째 양태에서, 본 발명은 각각의 반응 챔버가 (ⅰ) 증폭되는 하나 이상의 표적 핵산의 하나 이상의 카피를 포함하는 핵산 용액; (ⅱ) 하나 이상의 완충용액; (ⅲ) 하나 이상의 염; (ⅳ) 증폭되는 5개 이상의 유전자좌에 해당하는 프라이머 세트; (ⅴ) 핵산 중합효소; 및 (ⅵ) 누클레오티드를 포함하는 1개 또는 다수의 반응 챔버를 제공하는 단계; 및 약 4-150℃/초의 가열 및 냉각 속도로 소정의 수의 순환 주기 동안 변성 상태, 어닐링 상태 및 신장 상태 사이로 각각의 반응 챔버 내의 핵산 용액의 온도를 순차적으로 열 순환시켜 각각의 반응 챔버에서 5개 이상의 증폭된 유전자좌를 생성시키는 단계를 포함하는, 핵산 용액 중의 5개 이상의 유전자좌를 동시에 증폭시키는 방법을 제공한다.
일곱번째 양태에서, 본 발명은 미세유체 소통하는 2개 이상의 반응 챔버를 포함하는 바이오칩을 포함하는 통합된 바이오칩 시스템을 제공하며, 여기서 제 1 반응 챔버는, 온도 제어 엘리먼트(TCE)로서 이의 제 1 표면이 샘플을 함유하는 기판을 수용하도록 적합된 온도 제어 엘리먼트(TCE), 및 기판 내의 샘플의 온도를 측정하고, 샘플을 요망되는 온도로 설정하거나 유지시키기 위해 TCE에 피드백을 제공하도록 위치된 써모센서를 포함하는 열 순환기와 열 소통하고, 바이오칩의 접촉 표면이 열 순환기의 제 1 표면과 열 소통하고; 제 2 반응 챔버는 제 1 반응 챔버와 유체 소통하고, 핵산 추출, 핵산 정제, PCR 전 핵산 정화(cleanup), PCR 후 정화, 서열분석 전 정화, 서열분석, 서열분석 후 정화, 핵산 분리, 핵산 검출, 역전사, 역전사 전 정화, 역전사 후 정화, 핵산 라이게이션, 핵산 하이브리드화 또는 정량화에 적합하고, 상기 제 1 반응 챔버는 바이오칩의 접촉 표면으로부터 200 μm 미만에 존재한다.
본 발명의 특정 바람직한 구체예는 하기의 특정한 바람직한 구체예 및 청구의 범위의 보다 상세한 기재로부터 명백해질 것이다.
도 1A는 본 발명의 열 순환기의 구체예의 사진이다.
도 1B는 도 1A에 도시된 열 순환기와 함께 사용하기 위한 16-레인(lane)의 미세유체 바이오칩의 구체예를 나타내는 사진이다.
도 2A는 본원에 기재된 표준 STR 순환 프로토콜의 1회 열 순환 주기(전체 순환 시간:145.1분)에 대한 블록(block) 및 반응 용액의 열 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 2B는 본원에 기재된 신속한 순환 프로토콜의 1회의 열 순환 주기(전체 순환 시간:19.56분)에 대한 블록 및 반응 용액의 온도 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 3은 신속한 순환 조건을 이용한 본 발명의 열 순환기에 대한 1회 열 순환 주기(전체 순환 시간:17.3분)에 대한 열 펌프 및 반응 용액의 온도 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 4A는 0.5 ng 주형 DNA를 이용한 본 발명에 따른 바이오칩 반응에서 생성된 STR 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 4B는 0.5 ng 주형 DNA를 이용한 본 발명에 따른 튜브 반응에서 생성된 STR 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 5A는 바이오칩 반응에서 신호 강도에 대한 DNA 주형 수준의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5B는 튜브 반응에서 신호 강도에 대한 DNA 주형 수준의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6A는 바이오칩 반응에서 이형(heterozygous) 피크 높이 비(PHR)에 대한 DNA 주형 수준의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6B는 튜브 반응에서 PHR에 대한 DNA 주형 수준의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7A는 바이오칩 반응에서 비-주형 누클레오티드 첨가(NTA)에 대한 DNA 주형 수준의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7B는 튜브 반응에서 NTA에 대한 DNA 주형 수준의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8A는 바이오칩 반응에서 스터터(stutter)에 대한 DNA 주형 수준의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8B는 튜브 반응에서 스터터에 대한 DNA 주형 수준의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9A는 1ng의 주형 DNA를 이용하여 코필러(COfiler™) 프라이머 세트로 생성된 바이오칩(상부) 및 튜브 반응(하부)에 대한 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 9B는 1ng의 주형 DNA를 이용하여 아이덴티필러(Identifiler™) 프라이머 세트로 생성된 바이오칩(상부) 및 튜브 반응(하부)에 대한 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 10은 실시예 5에 기재된 바와 같은 서열분석 반응의 구체예에 대한 프로파일을 나타내는 그래프이다.
PCR과 같은 신속한 다중 핵산 증폭을 달성하기 위해, 본 발명은 표적 핵산 샘플 내의 다수의 유전자좌를 증폭시키는데 사용될 수 있는 열 순환 기계, 반응 용기 및 반응 조건을 제공한다. 본원에 제공된 실시예에 의해 예시되는 바와 같이, 본 발명의 신속한 열 순환 방법은 본 발명의 열 순환기 및 본원에 기재된 방법을 이용하여 미세유체 바이오칩에서 수행될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 방법은 본원에 기재된 바이오칩 및 열 순환기를 이용하는 적용 및 이외의 적용에 있어서 신속한 다중 증폭을 가능하게 한다. 예를 들어, 통상적인 열 순환기에서의 얇은 벽(thin walled)의 튜브의 사용(예를 들어, 블록 기재 열 순환기 및 로슈 라이트사이클러(Roche LightCycler™) 및 온도 순환 PCR이 아닌 증폭 방법(예를 들어, 등온 PCR 또는 롤링 서클(rolling circle) 증폭)의 사용이 특히 고려된다.
본 발명에 의해 제공된 방법, 바이오칩 및 열 순환기는 표적 핵산 유전자좌 또는 유전자좌들을 함유하는 0.006 ng 이상의 인간 유전체 DNA의 양(대략 단일 핵 인간 세포에서의 DNA의 양)으로 존재하는 제공된 핵산 용액에서 100분 미만으로 다수의 유전자좌를 증폭시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 증폭은 90분 미만, 80분 미만, 70분 미만, 60분 미만, 50분 미만, 40분 미만, 30분 미만, 20분 미만, 17.7분 미만, 15분 미만, 10분 미만 또는 5분 미만으로 발생한다.
다른 구체예에서, 박테리아, 바이러스, 진균, 동물 또는 식물에서 유래된 유전체 내의 다수의 유전자좌는 표적 핵산 유전자좌 또는 유전자좌들의 하나 이상의 카피로부터 시작하여 증폭될 수 있다. 예를 들어, 분석되는 샘플은 다중 증폭 반응 전에 표적 핵산의 1000개 미만의 카피, 400개 미만의 카피, 200개 미만의 카피, 100개 미만의 카피, 50개 미만의 카피, 30개 미만의 카피, 10개 미만의 카피 또는 1개 이상의 카피를 포함할 수 있다. 또한, 표적 핵산 유전자좌가 유전체 내에 1개 이상의 카피로 존재하는 경우 DNA의 단일 유전체 당량 미만이 증폭에 사용될 수 있다. 일반적으로, 2개 이상 및 약 250개 이하의 유전자좌가 본원에 기재된 방법에 따라 샘플 내의 각각의 표적 핵산에서 동시에 증폭될 수 있다. 추가로, 2개 이상 및 약 250개 이하의 유전자좌가 본원에 기재된 방법에 따라 다수의 표적 핵산에서 동시에 증폭될 수 있다.
본원에 이용된 표적 핵산은 임의의 핵산, 예를 들어, 인간 핵산, 박테리아 핵산 또는 바이러스 핵산일 수 있다. 표적 핵산 샘플은, 예를 들어, 하나 이상의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들어, 혈액, 소변, 정액, 임프액, 뇌척수액, 또는 양수, 또는 다른 생물학적 샘플, 예를 들어, 조직 배양 세포, 구강 면봉, 구강세척액, 대변, 조직 박편, 생검 흡출물, 및 고고학 샘플, 예를 들어, 뼈 또는 미이라화된 조직으로부터의 핵산 샘플일 수 있다. 표적 핵산은, 예를 들어, DNA, RNA, 또는 역전사에 적용된 RNA의 DNA 생성물일 수 있다. 표적 샘플은 진핵생물, 식물, 동물, 척추동물, 어류, 포유동물, 인간, 비-인간, 박테리아, 미생물, 바이러스, 생물학적 공급원, 혈청, 혈장, 혈액, 소변, 정액, 임파액, 뇌척수액, 양수, 생검, 바늘 흡출 생검, 암, 종양, 조직, 세포, 세포 용해질, 미정제 세포 용해질, 조직 용해질, 조직 배양 세포, 구강 면봉, 구강세척액, 대변, 미이라화된 조직, 법의학 공급원, 검시, 고고학 공급원, 감염, 원내 감염, 생성물 공급원, 약물 제조물, 생물학적 분자 생성물, 단백질 제조물, 지질 제조물, 탄수화물 제조물, 무생물 대상, 공기, 토양, 수액, 금속, 화석, 굴착된 물질, 및/또는 다른 지구상 또는 우주 물질 및 공급원을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 샘플은 또한 하나의 공급원 또는 다양한 공급원으로부터의 물질읜 혼합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 이용하여 상기 감염된 세포 또는 조직으로부터의 핵산이 증폭되는 경우 인간 핵산과 함께 감염성 박테리아 또는 바이러스의 핵산이 증폭될 수 있다. 유용한 표적 샘플의 유형은 진핵생물 샘플, 식물 샘플, 동물 샘플, 척추동물 샘플, 어류 샘플, 포유동물 샘플, 인간 샘플, 비-인간 샘플, 박테리아 샘플, 미생물 샘플, 바이러스 샘플, 생물학적 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 혈액 샘플, 소변 샘플, 정액 샘플, 임파액 샘플, 뇌척수액 샘플, 양수 샘플, 생검 샘플, 바늘 흡출 생검 샘플, 암 샘플, 종양 샘플, 조직 샘플, 세포 샘플, 세포 용해질 샘플, 미정제 세포 용해질 샘플, 조직 용해질 샘플, 조직 배양 세포 샘플, 구강 면봉 샘플, 구강세척액 샘플, 대변 샘플, 미이라화된 조직 샘플, 검시 샘플, 고고학 샘플, 감염 샘플, 원내 감염 샘플, 생성물 샘플, 약물 제조물 샘플, 생물학적 분자 생성물 샘플, 단백질 제조물 샘플, 지질 제조물 샘플, 탄수화물 제조물 샘플, 무생물 대상 샘플, 공기 샘플, 토양 샘플, 수액 샘플, 금속 샘플, 화석 샘플, 굴착 물질 샘플, 및/또는 다른 지구상 또는 우주 샘플을 포함한다. 법의학 샘플의 유형은 혈액, 건조된 혈액, 혈흔, 구강 면봉, 지문, 접촉 샘플(예를 들어, 음료수 유리의 입술에 대해 남겨진 상피 세포, 야구 모자의 내부 테두리, 또는 담배 꽁초), 츄잉 검, 위 내용물, 타액, 손톱 부스러기, 토양, 성폭행 샘플, 모발, 뼈, 피부 및 고형 조직을 포함한다. 환경 샘플의 유형은 여과되거나 여과되지 않은 공기 및 물, 토양, 및 표면, 외피 및 분말로부터의 면봉 샘플을 포함한다.
예를 들어, 본원의 방법은 분석이 법의학 해석에 적합한 데이터, 특히 법의학 해석 가이드라인을 충족시키는 데이터를 발생시키는 증폭된 핵산 샘플을 제공할 수 있다. 이러한 가이드라인은 신호 강도, 유전자좌 간 피크 높이 균형, 이형 피크 높이 비(PHR), 불완전한 비-주형 누클레오티드 첨가(NTA), 및 스터터를 포함한다(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods, Short Tandem Repeat (STR) Interpretation Guidelines. Forensic Science Communications, 2000, 2(3)).
본원에서 사용되는 구 "유체 소통"은 2개의 챔버, 구성요소 또는 영역 사이에 유체가 유동할 수 있도록 함께 연결된, 유체를 함유하는 2개의 챔버 또는 다른 구성요소 또는 영역을 의미한다. 따라서, "유체 소통"이 존재하는 2개의 챔버는, 예를 들어, 2개 챔버 사이에 유체가 자유롭게 유동할 수 있도록 2개 챔버 사이에 미세유체 채널에 의해 함께 연결될 수 있다. 이러한 미세유체 채널은 임의로 챔버 사이의 유체 소통을 차단하고/하거나 달리 제어하기 위해 폐쇄되거나 폐색될 수 있는 하나 이상의 밸브를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리(메틸 메타크릴레이트)" 또는 "PMMA"는 상표명 플렉시글라스(Plexiglas™), 리마크릴(Limacryl™), R-캐스트(R-Cast™), 퍼스펙스(Perspex™), 플라즈크릴(Plazcryl™), 아크릴렉스(Acrylex™), 아크릴라이트(ACrylite™), 아크릴플라스트(ACrylplast™), 알투글라스(Altuglas™), 폴리캐스트(Polycast™) 및 루사이트(Lucite™)로 시판되는 중합체, 뿐만 아니라 참조로서 본원에 각각 포함되는 미국 특허 제 5,561,208호, 제 5,462,995호 및 제 5,334,424호에 기재된 중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 메틸 메타크릴레이트의 합성 중합체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리카보네이트"는 탄산의 폴리에스테르 및 글리콜 또는 2가 페놀을 의미한다. 이러한 글리콜 또는 2가 페놀의 예는 상표명 칼리버(Calibre™), 마크롤론(Makrolon™), 판라이트(Panlite™), 마크로클리어(Makroclear™), 시롤론(Cyrolon™), 렉산(Lexan™) 및 투팍(Tuffak™)으로 시판되는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 p-크실렌 글리콜, 2,2-비스(4-옥시페닐)프로판, 비스(4-옥시페닐)메탄, 1,1-비스(4-옥시페닐)에탄, 1,1-비스(옥시페닐)부탄, 1,1-비스(옥시페닐)시클로헥산, 2,2-비스(옥시페닐)부탄, 및 이들의 혼합물이다.
본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 단일 및 이중 가닥의 DNA 및 RNA, 뿐만 아니라 변형된 염기, 당 및 백본을 함유하는 임의의 형태 및 모든 형태의 대안적 핵산을 포함한다. 따라서, 용어 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA(및 이의 부분적으로 단일 가닥이거나 부분적으로 이중 가닥일 수 있는 형태), cDNA, 앱타머(aptamer), 펩티드 핵산("PNA"), 2'-5' DNA(DNA의 A 형태와 매치되는 염기 간격을 갖는 짧아진 백본을 갖는 합성 물질; 2'-5' DNA는 보통 B 형태의 DNA와 하이브리드되지 않으나, RNA와는 용이하게 하이브리드됨), 및 잠금 핵산(locked nucleic acids, "LNA")을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 이해될 것이다. 핵산 유사체는 염기쌍 특성의 유사하거나 개선된 결합 및 하이브리드화를 갖는 천연 누클레오티드의 공지된 유사체를 포함한다. 퓨린 및 피리미딘의 "유사체" 형태는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 아지리디닐시토신, 4-아세틸시토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 의해 제공되는 DNA 백본 유사체는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 술파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카르바메이트, 모르폴리노 카르바메이트, 및 펩티드 핵산(PNA), 메틸포스포네이트 결합 또는 대안적 메틸포스포네이트 및 포스포디에스테르 결합(Strauss-Soukup, 1997, Biochemistry 36:8692-8698), 및 US6,664,057호에 논의된 바와 같은 벤질포스포네이트 결합을 포함한다; 참조[OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES, A PRACTICAL APPROACH, edited by F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992); Milligan, 1993, J. Med. Chem. 36: 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press)]. 본원의 핵산은 세포로부터 추출되거나, 당업자에게 공지된 임의의 수단에 따라 합성 제조될 수 있고; 예를 들어, 핵산은 화학적으로 합성되거나, 다른 공급원 중에서 cDNA 또는 mRNA로부터 전사되거나, 역전사될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "바이어(via)"는 물질의 상부 표면과 하부 표면 사이에서 유체 연결을 가능케 하는 고형 물질 내에 형성된 도통-홀(through-hole)을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자좌" 및 "유전자좌들"(복수)은 본원에 정의된 바와 같이 하나 이상의 핵산(예를 들어, 하나 이상의 염색체) 상의 하나 이상의 특정 위치를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "STR 유전자좌" 및 "STR 유전자좌들"은 표적 핵산의 제공된 유전자좌에서 2개 이상의 누클레오티드의 반복 패턴으로 이루어지는 누클레오티드 서열을 의미한다. 반복 패턴은 2 내지 10개의 염기쌍(bp) 길이의 범위일 수 있고, 이는 통상적으로 비-코딩 인트론 영역에 존재한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 신속하고, 제어가능하고, 재현가능하게 반응 용액을 가열하고 냉각시키는 능력을 갖는 열 순환기가 제공된다. 본 발명의 열 순환기의 구체예의 예는 도 1A에 도시되어 있다. 반응 용액 온도를 신속하게 가열하고 냉각시키는 능력은 램핑 및 세틀링 시간을 최소화시키고, 요망되는 온도에서 인큐베이션 시간이 전체 단계 시간을 좌우하는 것을 가능케 하여, 다중 순환 시간을 최소화시킬 수 있다.
높은 가열 및 냉각 속도는 단독이거나 열 싱크(sink)와 유체 소통하는 온도 제어 엘리먼트(TCE)를 이용함으로써 달성될 수 있다. TCE는 가열 및 냉각을 위한 수단, 써모센서, 써모센서로부터 신호를 수용하는 제어기, 및 전원 장치를 포함한다. 한 바람직한 구체예에서, TCE의 제 1 표면은 용액을 함유하는 샘플 챔버 및 추가 써모센서를 함유하는 센싱 챔버를 수용하도록 적합될 수 있다. 이러한 환경에서, 써모센서는 샘플 챔버 내의 상태를 시뮬레이션하기 위해 TCE에 마운팅(mounting)된 센싱 챔버 내에 위치된다. 이러한 센싱 챔버는 샘플 챔버와 동일한 물질 적층(stack-up)을 갖도록 제조된다. 온도 센서 내에 마운팅된 열전기쌍이 샘플 챔버 내의 샘플의 위치와 유사한 위치의 구조 내에 엠베딩(embedding)된다. 이러한 센서는 샘플 챔버 내의 용액의 효과적인 온도를 보고한다. 시판되는 타입-T 또는 타입-K 열전기쌍(Omega Engineering, Stamford, CT)이 가장 적용가능하나, 서미스터(thermister), 반도체 및 적외선을 포함하는 다른 유형의 열전기쌍 및 써모센서가 사용될 수 있다. 센싱 챔버 내의 써모센서는 샘플을 요망되는 온도로 설정하거나 유지시키기 위해 TCE에 피드백을 제공한다. 이러한 방식으로, 샘플 온도가 간접적으로 측정되고, 반응 챔버 자체로의 써모센서의 삽입 없이 제어될 수 있다. 대안적으로, 써모센서는 반응 챔버 내에 직접 위치될 수 있고, 센싱 챔버의 필요 없이 샘플 온도를 설정하고 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 당업자가 인지하게 되는 바와 같이, 압력 센서와 같은 다른 유형의 센서가 본 발명의 교시내용에 따라 사용될 수 있다.
*TCE의 제 1 표면은, 예를 들어, 기판을 수용하기 위한 제 1 표면(예를 들어, 바이오칩, 상기)에 후미진 곳(recess)을 형성함으로써 본질적으로 편평한 기판을 수용하도록 적합될 수 있다. 대안적으로, TCE는 200 μm 미만의 두께의 영역을 갖는 벽 직경을 갖는 튜브로 정의되는, 하나 이상의 얇은 벽의 튜브를 수용하도록 적합될 수 있다. 바람직하게는, 열 싱크는 구리 베이스(base) 및 냉각 핀을 갖는 팬에 의해 냉각되는 열 싱크를 포함하나, 이에 제한되지 않는 높은 효율의 열 싱크이다. 더욱 바람직하게는, 열 싱크는 약 0.4℃/W 이하의 열 저항을 갖는 팬에 의해 냉각되는 구리 베이스 및 핀일 수 있다. 높은 효율의 열 싱크의 특정한 비제한적인 예는 E1U-N7BCC-03-GP(Coolermaster, Taiwan ROC)이다.
본 발명의 열 순환기는 TCE의 제 1 표면의 온도를 모니터하도록 위치된 써모센서를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 써모센서는 샘플 온도 제어에서 추가의 개선을 달성하는 것이 요망됨에 따라 추가될 수 있다. 모니터될 수 있는 추가 온도는 기판 상 및 기판 내의 다중 영역, 열 싱크 상 및 열 싱크 내의 다중 영역, 냉각 공기 입구 및 출구, 샘플 입구 및 출구, 및 주위의 온도를 포함한다.
TCE와 열 싱크 사이의 우수한 열 소통이 요망된다. 2개의 짝을 이룬 표면이 적절히 제조되는 경우, 2개의 구성요소 사이에 적절한 열 전달을 제공하기에 충분한 밀접한 물리적 접촉이 존재한다. TCE와 열 싱크 사이의 열전달 물질(TEVI)이 열 커플링을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 TIM은 접착제, 그리스, 상 변환 물질(PCM), 금속 열 전달 물질, 세라믹 열 전달 물질, 연성 금속 합금, 인듐, 알루미나 나노층 코팅, 초미세 필름, 글리콜, 물, 오일, 부동액, 에폭시 화합물, 및 기타 물질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 예는 아크틱 실버(Arctic Silver) 또는 세라미크(Ceramique)(Arctic Silver, Visalia, CA; < 0.007℃-in2/W의 열 저항을 갖는 화합물), 압축성 열 스프링 HSD4(Indium Corp, Utica, NY), HITHERM(GrafTech International Holdings Inc., Lakewood, OH), 또는 열 싱크의 표면으로의 TCE의 직접적 결합을 포함한다. 열 접촉은 2 psi 이상, 또는 5 psi 이상, 또는 10 psi 이상, 또는 30 psi 이상, 또는 60 psi 이상, 또는 100 psi 이상, 200 psi 이상의 평균 힘으로 함께 구성요소를 물리적으로 클램핑시키거나, 표면의 직접적인 결합에 의해 추가로 향상될 수 있다.
TCE와 이와 접촉된 기판 사이의 열 전달은 기판을 TCE 상에 직접 둠으로써, 블록 열 순환기, 예를 들어, 에펜도르프 마스터사이클러 ep 그래디언트 S(Eppendorf Mastercycler™ ep gradient S) 열 순환기(높은 열 전도성 및 낮은 비열 용량을 갖는 은 블록을 통해 열 에너지를 제공함)와 관련하여 증가될 수 있다. 적절한 TCE는 높은 가열 및 냉각 능력의 열 펌프, 및 높은 출력의 펠티에(Peltier) 장치를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며; 펠티에 장치의 예로 9500/131/150B(Ferrotec, Bedford NH), XLT2393(Marlow, Dallas TX)가 있다. 본 발명의 열 순환기에 대한 TCE의 부분으로 사용되는 경우, 펠티에 장치는 유리하게는 H-브릿지(bridge)에 의해 동력이 공급된다. H-브릿지 장치의 예는 5R7-001(Oven Industries)이다.
펠티에 장치가 본 발명의 열 순환기에 대한 TCE의 부분으로 사용되는 경우, 가열 및 냉각을 위한 펄스 폭 제어를 갖는 H-브릿지에 의해 펠티에 장치에 전력을 공급하는 것이 이롭다. 샘플 온도를 측정하는 써모센서로부터의 온도 피드백은 TCE가 요망되는 샘플 온도를 설정하고 유지하도록 한다. TCE의 제어를 위한 폐쇄-루프 온도 제어 알고리듬은 PED 제어 및 퍼지 논리(fuzzy logic) 제어를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 열 제어기는 하나의 표적 온도 상태로부터 또 다른 표적 온도 상태로의 신속한 전이 능력을 제공하는 제어 알고리듬을 포함한다. 이러한 전이는 3개의 별개의 기로 나누어질 수 있다. 1기에서, 실제 온도와 표적 온도 사이에 큰 차이(예를 들어, 1 내지 20℃ 또는 이 이상)가 존재한다. 이러한 기에서, 램핑은 TCE 장치의 최대 속도 또는 이 근처에서 발생한다. 전이기인 2기에서, 실제 온도와 표적 온도가 보다 유사해진다(약 1 내지 20℃ 미만). 이러한 경우, 제어기는 용액 온도의 초과량을 방지하고, 최소 편차 및 진동을 갖는 표적 온도의 신속한 달성을 가능케 하기 위해 TCE로의 전력을 감소시켜야 한다. 3기에서, 표적 온도가 달성되고, 제어기는 표적 온도에 대해 협소한 범위 내로 용액을 유지시키기 위해 열 순환기로의 전력을 완화시킨다. 센서를 이용한 온도의 측정은 실제 온도의 보다 정확한 피드백을 제공하고, 또한 TCE 표면 온도의 온도가 과열(overdriven)되도록 한다. 상기 3개의 기의 각각은 보다 신속한 반응 시간, 보다 정확한 온도 제어, 증가된 안정성, 및 외부 변화에 대한 증가된 내성을 제공하기 위해 다수의 하위기(sub-phase)로 추가로 나누어질 수 있다.
한 예에서, 기판의 온도는 얇은 열전기쌍을 기판 표면 상의 채널에 둠으로써 측정될 수 있다. 또 다른 예에서, 제 2의 써모센서가 본질적으로 TCE와 접촉하는 기판 상의 반응 챔버와 동일한 TCE로부터의 거리로 제 2의 써모센서를 고정시키는, 사용되는 기판과 본질적으로 동일한 물질로부터 형성된 인클로저(enclosure)에 수용될 수 있다. 이러한 제 2의 써모센서가 일반적으로 기판으로부터 떨어져 존재(즉, 독립형(stand-alone) 센서)할 수 있고, 이는 TCE의 제 1 표면 상의 기판 옆에 위치될 수 있다.
임의로, 열 싱크는 열 싱크의 온도를 제어하기 위한 가변 속도 냉각 팬 및/또는 제 2의 가열 구성요소를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 열 싱크의 각각의 추가 구성요소는 제 2의 제어 구성요소와 소통한다. 이는 특히 열 싱크 온도를 본질적으로 일정하게 유지시키고, 환경 온도 변화와 독립적으로 유지시키기 위해, 열 싱크의 냉각 효율이 조정되는 것을 가능케 한다. 가열기는 또한 열 싱크를 본질적로 작업 온도로 미리 조정할 수 있다.
*기판 및 TCE에서 반응 용액의 열 커플링을 촉진하기 위해, 열 순환기가 작동 중이면서 기판을 TCE의 제 1 표면에 고정시키는 힘을 적용시킴으로써 기판과 TCE의 제 1 표면의 접촉 표면의 균일한 열 소통이 제공될 수 있다. 이러한 힘은 바람직하게는 기판을 TCE의 제 1 표면에 단지 일시적으로 고정시키고, 열 순환의 완료시 용이하게 제거될 수 있는 수단에 의해 적용된다. 예를 들어, 칩 압착 엘리먼트(CCE)가 TCE의 제 1 표면 상에 위치되어, 기판이 이 사이에 위치되도록 할 수 있다. 칩 압착 엘리먼트는 이후 열 순환기의 작동 동안 적소에 기판을 고정시키도록 구속될 수 있고, 해방되어 기판의 분리를 가능케 할 수 있다. CCE, TCE 및 열 싱크의 적절한 통합은 CCE가 상기 3개 모두의 구성요소 사이의 열 커플링을 개선시키도록 한다.
기판과 접촉된 CCE의 부분은 포움(foam), 예를 들어, WF71 로셀(Rohcell) 포움(Inspec foams, Magnolia, AR)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 저온 축열재(thermal mass)로부터 형성될 수 있다. 본원에 논의된 구체예에 대해, 로아셀(Rohacell)이 바람직하다. 이는 1.4-1.6(J/gK)의 비열 용량[또는 이 미만의 축열재] 및 0.0345 W/mK(또는 이 미만)의 열 전도성을 갖는다.
바이오칩 압착 엘리먼트는 TCE의 제 1 표면으로 기판을 고정시키는 힘을 제공하는 하나 이상의 클램프, 스프링, 압축성 포움, 또는 팽창될 수 있는 가압 공기 블래더(bladder)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 칩 압착 엘리먼트는 TCE의 제 1 표면으로 기판을 고정시키기 위해 기판의 표면에 약 5 내지 약 250 psia, 더욱 바람직하게는 약 20 내지 약 50 psia의 실질적으로 균일한 힘을 제공한다. 특히, 바이오칩 기판과 TCE의 접촉 표면 사이의 열 소통은 열 그리스 또는 글리콜과 같은 열 커플링 용액의 부재하에서 제공될 수 있으나, 상기 열 커플링 용액이 필요에 따라 사용될 수 있다.
바이오칩 압착 엘리먼트는 바이오칩-열전기 쿨러-열 싱크 상에 힘을 제공한다. 이러한 힘은 우수한 열 접촉을 보장하고, 이에 따라 바이오칩과 TCE의 상부 표면 사이에 열 전달을 보장한다.
한 구체예에서, 저온 축열재 절연체는 공기 블래더이고, 이는 저온 축열재 및 절연 특성을 제공하기 위해 사용된다. 또 다른 구체예에서, 저온 축열재 단열체는 포움 패드이다. 공기식 실린더, 또는 압착 또는 공기 블래더로부터의 공기압 하에서 폐쇄된 셀(cell) 포움에 의해 포움 패드에 클램핑 힘이 적용될 수 있다. 후자의 경우, 공기 블래더는 절연 및 압착력 둘 모두를 제공한다.
상기 기재된 바와 같이, 열 순환기는 TCE의 제 1 표면에서 초당 약 4-150℃, 바람직하게는 약 8-150℃/초, 더욱 바람직하게는 약 10-150℃/초의 가열 및/냉각 속도를 가질 수 있다. 열 순환기는 또한 TCE의 제 1 표면과 균일하게 열 소통하는 기판(예를 들어, 바이오칩)의 반응 챔버 내의 용액에서 초당 약 4-150℃, 바람직하게는 약 8-150℃/초, 더욱 바람직하게는 약 10-150℃/초의 가열 또는 냉각 속도를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 열 순환기는 +/- 1.0℃, 바람직하게는 +/- 0.50℃, 더욱 바람직하게는 +/- 0.25℃의 온도 안정성을 가질 수 있다.
바이오칩
본 발명의 또 다른 양태에 따른 바이오칩(즉, 본 발명의 열 순환기와 함께 사용하기 위한 기판)의 구체예는 도 1B에 예시를 위해 도시되어 있고, 이는 16개의 미세유체 시스템을 갖고, 이들 각각은 바이오칩 내에서 형성된 반응 챔버의 각각과 유체 소통하는 입구 및 출구를 포함한다. 그러나, 이러한 개시는 제한하고자 함이 아니며, 당업자는 바이오칩이 1개의 시스템을 갖는 바이오칩 및 2개 이상의 시스템을 갖는 바이오칩을 포함하여 또 다른 수의 미세유체 시스템(상기)을 함유할 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "다수"는 2개 이상, 4개 이상, 8개 이상, 16개 이상, 32개 이상, 48개 이상, 64개 이상, 96개 이상, 128개 이상, 또는 2-16, 2-32, 2-48, 2-64, 2-96, 2-128, 8-128, 8-64 또는 8-32개의 미세유체 채널을 의미한다.
바이오칩은 기판 및 덮개층을 포함할 수 있고, 여기서 그루브(groove) 및/또는 형태를 이룬 침하(shaped depression)를 포함하는 1개 또는 다수의 미세유체 시스템의 부분이 기판층에 패턴화된다. 일련의 바이어(즉, 홀 및/또는 입구 또는 출구를 통함)가 미세유체 채널 및 반응 챔버로의 유체 접근을 제공하기 위해 덮개층에 형성될 수 있고, 이는 바이오칩에 대하여 임의의 위치에 위치될 수 있다. 대안적으로, 바이어는 동일한 기능성(functionality)을 달성하기 위해 덮개층 대신 기판층에 형성될 수 있다. 기판층의 상부 표면은 미세유체 시스템을 완성하기 위해 덮개층의 바닥 표면과 결합될 수 있다. 중합체 기재 미세유체 시스템을 제조하기 위한 기술은 문헌[Becker and Gartner (Becker, 2000, Electrophoresis 21, 12-26 and Becker, 2008, Electrophoresis 390, 89)]에 광범위하게 개관되어 있으며, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 바이오칩은 불포화되거나, 부분적으로 불포화되거나, 포화된 시클릭 올레핀 공중합체 "COC", 불포화되거나, 부분적으로 불포화되거나, 포화된 시클릭 올레핀 중합체 "COP", 폴리(메틸)메타크릴레이트 "PMMA", 폴리카보네이트 "PC", 폴리프로필렌 "PP", 폴리에틸렌 "PE", 폴리에테르에테르케톤 "PEEK", 폴리(디메틸실록산) "PDMA", 폴리이미드 "PI"와 같은 물질을 이용하여 제조될 수 있다. 증폭 반응에서 사용되는 최대 온도의 유리 전이 온도보다 큰 유리 전이 온도를 갖는 플라스틱을 선택하는 것이 중요하다. 임의의 수의 상기 처리 및 물질이 본원에 기재된 바이오칩을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 바이오칩은 플라스틱 물질, 예를 들어, COC 또는 COP 기재 중합체(현재 상표명 토파스(Topas™), 제오넥스(Zeonex™), 제오노르(Zeonor™), 및 아펠(Apel™)로 시판됨)의 사출 성형에 의해 제조될 수 있다. 이러한 제조 방법에서, 형성되는 특징적인 음화(negative)로 이루어지는 사출 성형물 및 성형 삽입물은 기계가공 및 이후의 표면 연마에 의해 제조된다. 또한, 성형물 및 삽입물은 기판층이 제조되고, 형성된 기판이 채널, 반응 챔버 특징 및 바이어를 포함하는 것을 가능케 한다. 기판 및 덮개층은 열 및 압력의 적용에 의해 확산 접합될 수 있다.
대안적으로, 바이오칩은 생성되는 구조의 음화의 마스터 다이(master die)를 이용한 얇은 열가소성 필름의 고온 엠보싱(embossing)에 의해 제조될 수 있다. 마스터 다이는 고형 기판에서 제조된 장치를 복제하기 위해 전기주조(electroforming)를 이용하여 제조될 수 있다. 고형 기판은 당업자에게 공지된 표준 광식각(photolithographic) 및 화학 부식 방법에 의해 패턴화되는 유리 시트일 수 있다. 기판 및 덮개층은 열 및 압력의 적용에 의해 확산 접합될 수 있다.
*바이오칩의 기판 및 덮개층은 폴리에틸렌, 폴리(아크릴레이트)(예를 들어, 폴리(메틸 메타크릴레이트)), 폴리(카보네이트), 및 불포화되거나, 부분적으로 불포화되거나, 포화된 시클릭 올레핀 중합체(COP), 또는 불포화되거나, 부분적으로 불포화되거나, 포화된 시클릭 올레핀 공중합체(COC)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 플라스틱 기질로부터 제작될 수 있다. 본 공정에 사용되는 플라스틱 기판 및 덮개층의 두께는 이의 크기를 최소화시킴으로써, 사용 동안 각각의 반응 챔버에 함유된 반응 용액과 열 순환기 사이에 열 전달을 최대화시키기 위해 얇게 유지된다. 플라스틱 기판 및 덮개층은 각각 독립적으로 2 mm 미만, 1 mm 미만, 750 μm 미만, 650 μm 미만, 500 μm 미만, 400 μm 미만, 300 μm 미만, 200 μm 미만, 또는 100 μm 미만의 두께를 가질 수 있거나; 플라스틱 기판 및 덮개층은 각각 독립적으로 25-2000 μm, 25-1000 μm, 25-750 μm, 25-650 μm, 25-500 μm, 25-400 μm, 25-300 μm, 25-200 μm, 또는 25-100 μm의 범위의 두께를 갖는 플라스틱을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 기판 및 덮개층 중 하나 이상은 바이오칩의 반응 챔버에 함유된 반응 용액으로의 열 전달을 최대화시키기 위해 약 200 μm 미만의 두께를 갖는다. 더욱 바람직하게는, TCE의 제 1 표면과 접촉되는 바이오칩의 접촉표면은 약 200 μm 미만의 두께를 갖는다.
각각의 반응 챔버는, 예를 들어, 100 μL 미만의 부피를 갖도록 형성될 수 있다. 바람직하게는, 각각의 반응 챔버는 약 50 μL 미만, 또는 약 40 μL 미만, 또는 약 30 μL 미만, 또는 약 25 μL 미만, 또는 약 20 μL 미만, 또는 약 15 μL 미만, 또는 약 10 μL 미만, 또는 약 5 μL 미만, 또는 약 1 μL 미만, 또는 약 0.1 μL 미만의 부피를 갖는다. 대안적으로, 각각의 반응 챔버는 약 0.1 μL 내지 약 100 μL 범위의 부피를 갖도록 형성될 수 있다. 바람직하게는, 각각의 반응 챔버는 약 0.1 μL 내지 약 10 μL 또는 약 10 μL 내지 약 50 μL 범위의 부피를 갖는다. 반응 챔버는 일반적으로 중합체 또는 실란 코팅으로 코팅되지 않는다. 반응 챔버는 입구 및 출구 채널을 갖도록 고안될 수 있다. 대안적으로, 단일 채널이 입구 및 출구에 대해 사용될 수 있다.
본 발명의 바이오칩 고안은 높은 표면 대 부피비 및 열 전달을 최대화시키는 감소된 확산 시간, 및 균일한 가열 및 냉각을 갖는 것을 포함하여 미세유체의 이점을 도입시킨다. 미세유체 기술의 이용은 또한 완전히 통합된 법의학 분석 기계와 관련된 이점을 제공한다. 또한, 다양한 층(예를 들어, COC 층)을 결합시키기 위한 접착제의 사용 없이 확산 접합에 의해 제조된 바이오칩이 시험되었고, 이는 요망되는 적용의 필요조건에 기초한 실패 전에 100 내지 1500 psi의 압력에 견딜 수 있는 것이 입증되었다. 예를 들어, 본 발명의 바이오칩은 요망되는 열 순환 적용에 충분한 450 psi에 견딘다.
*본원에 기재된 본 발명의 바이오칩의 특정 구체예가 실질적으로 반응 챔버를 가열시키고/시키거나 냉각시키기 위해 바이오칩에 통합된 임의의 가열 구성요소가 없는 것이 인지된다. 바이오칩 상에서의 반응 챔버의 열 순환이, 예를 들어, 본 발명의 열 순환기에 의해 외부에서 제공된다. 그러나, 가열 구성요소는 본 발명의 바이오칩에 통합될 수 있다.
작업시, 바이오칩의 한 부분은 바이오칩 내에서 형성된 하나 이상의 반응 챔버와 유체 소통하는 하나 이상의 입구를 통해, 하나 이상의 시약(예를 들어, PCR용) 및/또는 핵산 샘플을 각각 독립적으로 포함하는 하나 이상의 반응 용액을 수용할 수 있다. 다수의 샘플의 동시 증폭은 별개의 분리 반응 챔버 내에 핵산 샘플 각각을 주입함으로써 수행될 수 있다. 다수의 샘플을 다수의 샘플 또는 완충용액 웰에 동시 주입하기 위한 주입기가 동시 다중 샘플 증폭을 가능하게 하기 위해 바이오칩에 제공될 수 있다. 이러한 주입기는, 예를 들어, 다수의 반응 챔버 중 하나의 반응 챔버에 다수의 샘플 중 하나의 샘플을 제공할 수 있다. 주입기는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 반응 챔버에 샘플을 연결시키는 바늘 또는 튜브 또는 채널을 통한 전기영동 수송(electrophoretic transport), 공기식 발동 작용 또는 액체 발동 작용에 의해 채널로 샘플을 도입시킬 수 있다.
증폭(및, 임의로 핵산 추출 및 정량화) 후, 증폭된 핵산 생성물은 단편 분리 및 STR 프로파일의 생성을 위해 반응 챔버와 유체 소통하는 하나 이상의 출구를 통해 통과(예를 들어, 진벤치-FX(Genebench-FX™) 100으로 통과)될 수 있다.
비교적 낮은 비용의 플라스틱 제품이 본 발명의 바이오칩이 일회용이 되는 것을 가능케 하고, 바이오칩을 재사용하는 것에 필요한 수고를 배제시키고, 본질적으로 오염 가능성을 배제시키는 것을 가능케 한다. 1회 사용의 일회용은 오염 가능성이 존재하지 않아야 하는 적은 카피 수의 분석(최초 샘플 수집이 아님)에 특히 이로울 것이다. 오염 및 수고가 주요 고려사항이 아닌 환경에서, 재활용 플라스틱 및 유리 바이오칩이 사용될 수 있다.
통합 방법
미세유체의 사용은 특징적인 제조물이 단일한 바이오칩 상에서 하나 이상의 기능을 수행하는 것을 가능케 한다. 이러한 기능은 핵산 추출, 핵산 정제, PCR 전 핵산 정화, PCR 후 정화, 서열분석 전 정화, 서열분석, 서열분석 후 정화, 핵산 분리, 핵산 검출, 역전사, 역전사 전 정화, 역전사 후 정화, 핵산 라이게이션, 핵산 하이브리드화 및 정량화를 포함할 수 있다. 이러한 기능 중 2개 이상이 샘플의 순차적 처리를 가능하게 하기 위해 미세유체적으로 연결될 수 있고; 이러한 커플링이 통합이라 언급된다.
미세 유체 DNA 추출의 한 형태는 입구 및 출구 채널 사이에 정제 매질을 삽입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 정제 매질은 실리카 섬유를 기초로 할 수 있고, 이는 생물학적 샘플을 용해시키기 위해 카오트로픽(chaotropic) 염 시약을 이용하고, DNA가 노출되고, 정제 매질에 DNA가 결합된다. 이후, 용해질은 DNA를 결합시키는 정제 매질을 통해 입구 채널을 통과하여 수송된다. 결합된 DNA는 오염물질을 제거하기 위해 에탄올 기재 완충용액에 의해 세척된다. 이는 정제 막을 통해 입구 채널을 통과하는 세척 시약의 유동에 의해 달성될 수 있다. 이후, 결합된 DNA는 정제 매질을 통해 입구 채널을 통과하여 출구 채널로 배출되는 적절한 저염 완충용액(Boom, US5,234,809 참조)을 유동시켜 막으로부터 용리된다.
미세 유체 포맷에서 DNA 정량의 한 접근법은 실시간 PCR을 기초로 한다. 이러한 정량 방법에서, 반응 챔버는 입구 채널과 출구 채널 사이에 제조된다. 반응 챔버는 열 순환기에 커플링되고, 광학 여기 및 검출 시스템은 반응 챔버와 커플링되어, 반응 용액으로부터의 형광이 측정되는 것을 가능케 한다. 샘플 내의 DNA의 양은 순환 주기 당 반응 챔버로부터의 형광의 강도와 상관된다(예를 들어, Heid et al., Genome Research 1996, 6, 986-994 참조).
미세유체 포맷에서의 통합에 관한 추가의 정보는, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는, 본원과 동일 날짜에 출원된 "통합된 핵산 분석(INTEGRATED NUCLEIC ACID ANALYSIS)"의 표제의 미국 특허 출원(Attorney Docket No. 07-801-US)을 참조하라. 미세유체 포맷에서의 분리 및 검출에 대한 추가 정보는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는, 본원과 동일 날짜에 출원된 "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼(PLASTIC MICROFLUIDIC SEPARATION AND DETECTION PLATFORMS)"의 표제의 미국 특허 출원(Attorney Docket No. 07-865-US)을 참조하라.
본 발명의 미세유체 구동(drive)은 통합된 바이오칩의 반응 챔버 내의 유체를 수송하기 위한 수단이다. 미세유체 구동의 한 유형은 막에 양성 및 음성 압력을 순차적으로 적용함으로써 유체를 수송하는 통합된 막 펌프에 의해 실시된다. 대안적으로, 양성 변위(displacement) 펌프가 미세유체 챔버의 입구에 연결될 수 있다. 펌프의 변위는 미세유체 채널을 통해 유체를 밀어낸다.
통합은 바이오칩 내에 유체 유동을 제어하는 미세유체 밸브를 사용할 수 있다. 밸빙(Valving)은 수동 또는 능동 구조로 달성될 수 있다. 수동 밸빙 구조는 모세관압을 이용함으로써 유체 유동을 정지시키는 모세관 밸브를 포함한다. 유체는 모세관압을 극복하기에 충분히 큰 압력의 적용에 의해 모세관 밸빙 구조를 통해 유동할 수 있다. 능동 밸빙 구조는 2개의 채널 사이의 포인트에 가요성 또는 반-강성 구조를 사용하는 막 밸브를 포함한다. 막 상의 압력의 적용은 막이 채널을 폐쇄하도록 한다. 막으로의 진공 적용은 채널로부터 막을 치워, 유체의 통과를 가능케 한다.
증폭 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 신속한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 하나 이상의 표적 핵산 중의 다수의 핵산 유전자좌를 동시에 증폭시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 1개 또는 다수의 반응 챔버에 1개 또는 다수의 반응 용액을 제공하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 반응 용액은 (ⅰ) 하나 이상의 표적 핵산의 하나 이상의 카피(여기서, 각각의 표적 핵산은 동일하거나 상이하고, 각각의 표적 핵산은 독립적으로 증폭되는 다수의 유전자좌를 포함함); (ⅱ) 하나 이상의 완충용액; (ⅲ) 하나 이상의 염; (ⅳ) 증폭되는 다수의 유전자좌에 해당하는 프라이머 세트; (ⅴ) 핵산 중합효소; 및 (vi) 누클레오티드를 포함한다. 반응 용액 각각, 예를 들어, 표적 핵산 각각은, 예를 들어, 동일 핵산 샘플에서 다수의 동시 분석을 수행하거나, 다수의 핵산 샘플 분석을 동시에 수행하기 위해 필요에 따라 동일하거나 상이할 수 있다.
각각의 반응 챔버는 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 바이오칩 또는 얇은 벽의 반응 튜브에 함유될 수 있다. 얇은 벽의 반응 튜브는 바람직하게는 200 μm 미만의 벽 두께를 갖는다. 바람직하게는, 얇은 벽의 반응 튜브는 바람직하게는 약 100 μm 미만의 벽 두께를 갖는다.
PCR 증폭을 위한 프라이머는 표적 DNA의 유전자좌에 하이브리드 되도록 특별히 고안된 올리고누클레오티드 서열이다. 이러한 프라이머는 중합효소 신장을 위한 시작 포인트로 작용한다. 증폭된 단편의 분석을 촉진하기 위해, PCR 반응에서 표지된 프라이머가 또한 사용될 수 있다. 표지된 프라이머는 검출가능한 부분, 이의 비제한적인 예로 형광 염료에 커플링된 올리고누클레오티드 서열이다. 형광 표지된 프라이머를 이용하여 PCR이 수행되는 경우, 형광 표지를 갖는 앰플리콘이 생성된다. 신속한 PCR을 수행하기 위한 방법은 표지된 프라이머 및 표지되지 않은 프라이머 둘 모두와 양립되고, 신속한 다중 PCR이 입증되었다.
프라이머 세트는 상기 기재된 바와 같이 표적 핵산을 이용한 다수의 유전자좌의 증폭을 위해 당업자에게 공지된 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 인간 핵산 샘플 중의 하나 이상의 유전자좌의 증폭에 유용한 프라이머는 US5,582,989호; US5,843,660호; US6,221,598호; US6,479,235호; US6,531,282호; 및 US7,008,771호; 및 US 특허 출원 공개 번호 2003/0180724호; 2003/0186272호; 및 2004/0137504호에 기재되어 있고, 이들 각각은 참조로서 본원에 포함된다.
추가로, 바이러스 핵산 샘플 내의 하나 이상의 유전자좌의 증폭에 유용한 프라이머가, 예를 들어, US7,312,036호; US6,958,210호; US6,849,407호; US6,790,952호, 및 US6,472,155호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로서 본원에 포함된다.
박테리아 핵산 샘플 내의 하나 이상의 유전자좌의 증폭에 유용한 프라이머의 예는 US7,326,779호; US7,205,111호; US7,074,599호; US7,074,598호; US6,664,080호; 및 US5,994,066호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로서 본원에 포함된다.
염 및 완충용액은 MgCl2, 및 Tris-HCl 및 KCl을 각각 포함하는 염 및 완충용액을 포함하여, 당업자에게 친숙한 것을 포함한다. 완충용액은 첨가제, 예를 들어, 계면활성제(예를 들어, Tweens), 디메틸 술폭시드(DMSO), 글리세롤, 우혈청 알부민(BSA) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 뿐만 아니라 당업자에게 친숙한 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 누클레오티드는 일반적으로 데옥시리보누클레오시드 트리포스페이트, 예를 들어, 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP) 및 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP)가 있으며, 이는 또한 표적 핵산의 증폭을 위해 적절한 양으로 합성 혼합물에 첨가된다.
용액은 임의로 핵산 중합효소의 고온-시작 활성화에 적합한 제 1 기간 동안 제 1 온도로 가열되고, 이에 고정될 수 있다. 일반적으로, 제 1 기간은 약 90초 미만이다. 제 1 온도는 약 95℃ 내지 약 99℃일 수 있다. 60초 이하에 활성화될 수 있는 고온 시작 메커니즘을 갖는 중합효소는 항체 매개 고온-시작 및 앱트머(aptmer) 매개 고온 시작 메커니즘을 이용하는 것을 포함한다. 대안적으로, 고온-시작 중합효소가 본 발명에서 이용되는 것이 필요하지는 않다.
이후, 반응 용액의 온도는 소정의 수의 순환 주기 동안 변성 상태, 어닐링 상태, 및 신장 상태 사이에서 순차적으로 순환된다. 일반적으로, 1개 또는 다수의 반응 용액이 약 1 내지 약 150℃/초, 또는 약 1 내지 약 100℃/초; 또는 약 1 내지 약 80℃/초; 또는 약 1 내지 약 60℃/초; 또는 약 1 내지 약 40℃/초; 또는 약 1 내지 약 30℃/초; 또는 약 1 내지 약 20℃/초; 약 4 내지 약 150℃/초, 또는 약 4 내지 약 100℃/초; 또는 약 4 내지 약 80℃/초; 또는 약 4 내지 약 60℃/초; 또는 약 4 내지 약 40℃/초; 또는 약 4 내지 약 30℃/초; 또는 약 4 내지 약 20℃/초; 또는 약 10 내지 약 150℃/초; 또는 약 10 내지 약 100℃/초; 또는 약 10 내지 약 80℃/초; 또는 약 10 내지 약 60℃/초; 또는 약 10 내지 약 40℃/초; 또는 약 10 내지 약 30℃/초; 또는 약 10 내지 약 20℃/초의 제 1 냉각 속도로 변성 상태로부터 어닐링 상태로 냉각된다. 1개 또는 다수의 반응 용액이 약 1 내지 약 150℃/초, 또는 약 1 내지 약 100℃/초; 또는 약 1 내지 약 80℃/초; 또는 약 1 내지 약 60℃/초; 또는 약 1 내지 약 40℃/초; 약 1 내지 약 30℃/초; 약 1 내지 약 20℃/초; 4 내지 약 150℃/초, 또는 약 4 내지 약 100℃/초; 또는 약 4 내지 약 80℃/초; 또는 약 4 내지 약 60℃/초; 또는 약 4 내지 약 40℃/초; 약 4 내지 약 30℃/초; 약 4 내지 약 20℃/초; 또는 약 10 내지 약 150℃/초; 또는 약 10 내지 약 100℃/초; 또는 약 10 내지 약 80℃/초; 또는 약 10 내지 약 60℃/초; 또는 약 10 내지 약 40℃/초; 또는 약 10 내지 약 30℃/초; 또는 약 10 내지 약 20℃/초의 제 1 가열 속도로 어닐링 상태로부터 신장 상태로 가열될 수 있고/있거나; 1개 또는 다수의 반응 용액이 약 1 내지 약 150℃/초, 또는 약 1 내지 약 100℃/초; 또는 약 1 내지 약 80℃/초; 또는 약 1 내지 약 60℃/초; 또는 약 1 내지 약 40℃/초; 약 1 내지 약 30℃/초; 약 1 내지 약 20℃/초; 약 4 내지 약 150℃/초, 또는 약 4 내지 약 100℃/초; 또는 약 4 내지 약 80℃/초; 또는 약 4 내지 약 60℃/초; 또는 약 4 내지 약 40℃/초; 약 4 내지 약 30℃/초; 약 4 내지 약 20℃/초; 또는 약 10 내지 약 150℃/초; 또는 약 10 내지 약 100℃/초; 또는 약 10 내지 약 80℃/초; 또는 약 10 내지 약 60℃/초; 또는 약 10 내지 약 40℃/초; 또는 약 10 내지 약 30℃/초; 또는 약 10 내지 약 20℃/초의 제 2 가열 속도로 신장 상태로부터 변성 상태로 가열된다. 최종적으로, 반응 용액은 1개 또는 다수의 증폭된 핵산 생성물을 제공하기 위해 최종 상태에서 유지된다.
변성 상태는 약 1 내지 약 30초 범위의 시간 동안 약 90 내지 99℃의 범위를 포함할 수 있다. 실제 시간 및 온도는 효소, 프라이머 및 표적 의존적이다. 인간 유전체 DNA를 증폭시키기 위한 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems, AB)사의 다중화 STR 키트에 대해서는, 약 5초 동안 약 95℃가 바람직하다.
어닐링 온도 및 시간은 표적 핵산 내의 특정 유전자좌로의 프라이머 결합의 특이성 및 효율성에 영향을 주고, 다중화 PCR 반응에 특히 중요하다. 어닐링 단계 동안 완전한 세트의 프라이머 쌍의 정확한 결합은 다수의 유전자좌의 다중 증폭의 생성, 예를 들어, 허용되는 PHR 및 유전자좌 간 신호 강도 균형을 갖는 1개 또는 다수의 충분한 STR 프로파일의 생성을 가능케 할 수 있다. 제공된 프라이머 쌍에 대해, 어닐링 상태는 약 50℃ 내지 70℃의 온도 및 약 1 내지 30초의 시간의 범위일 수 있다. 실제 시간 및 온도는 효소, 프라이머 및 표적 의존적이다. 인간 유전체 DNA를 증폭시키기 위한 AB 다중화 STR 키트에 대해서는, 15초 동안 약 59℃가 바람직하다.
신장 온도 및 시간은 주로 대립유전자 생성 수율에 영향을 주고, 이는 연구 중인 효소의 고유의 특성이다. 제조업체에 의해 보고된 신장 속도는 종종 단일(singleplex) 반응에 대해 제공된 것임이 인지되어야 하며; 다중 반응에 대한 신장 속도는 훨씬 느릴 수 있다. 제공된 효소에 대해, 신장 상태는 약 60 내지 75℃의 온도 및 약 1 내지 30초의 시간 범위일 수 있다. 실제 시간 및 온도는 효소, 프라이머 및 표적 의존적이다. 인간 유전체 DNA를 증폭시키기 위한 AB 다중화 STR 키트에 대해서는, 약 5초 동안 약 72℃가 바람직하다. 바람직하게는, 소정의 수의 순환 주기를 지속시키기 위해, 반응 용액은 약 1 내지 약 150℃/초, 또는 약 1 내지 약 100℃/초; 또는 약 1 내지 약 80℃/초; 또는 약 1 내지 약 60℃/초; 또는 약 1 내지 약 40℃/초; 또는 약 1 내지 약 30℃/초; 또는 약 1 내지 약 20℃/초; 4 내지 약 150℃/초, 또는 약 4 내지 약 100℃/초; 또는 약 4 내지 약 80℃/초; 또는 약 4 내지 약 60℃/초; 또는 약 4 내지 약 40℃/초; 또는 약 4 내지 약 30℃/초; 또는 약 4 내지 약 20℃/초; 또는 약 10 내지 약 150℃/초; 또는 약 10 내지 약 100℃/초; 또는 약 10 내지 약 80℃/초; 또는 약 10 내지 약 60℃/초; 또는 약 10 내지 약 40℃/초; 또는 약 10 내지 약 30℃/초; 또는 약 10 내지 약 20℃/초의 제 3의 속도로 신장 상태로부터 변성 상태로 가열된다. 일반적으로, 소정의 수의 순환 주기가 약 10 내지 약 50 순환 주기로 선택되나, 필요에 따라 더 적거나 많은 순환 주기가 이용될 수 있다.
최종 신장 시간은 불완전한 NTA가 증가하기 시작할때까지 현저하게 감소될 수 있다. 제공된 효소에 대해, 최종 신장 온도는 약 60 내지 75℃의 범위일 수 있고, 시간은 약 0 내지 300초일 수 있다. 실제 시간 및 온도는 효소, 프라이머 및 표적 의존적이다. 인간 유전체 DNA를 증폭시키기 위한 AB 다중화 STR 키트에 대해서는, 약 90초 동안 약 72℃가 바람직하다.
상기 기재된 3-단계의 열 순환 접근법에 더하여, 상기 공정은 또한 2-단계의 열 순환 접근법이 될 수 있다. 이러한 접근법에서, 반응 용액은 소정의 수의 순환 주기 동안 변성 상태, 및 어닐링/신장 상태 사이로 순차적으로 순환된다. 이러한 접근법은 신장 온도에서 어닐링되어, 어닐링 및 신장 단계가 동일한 온도를 공유하도록 고안된 프라이머를 이용한다. 감소된 수의 온도 전이는 순환 주기 시간의 추가 감소를 발생시킨다.
특정 구체예에서, 다수의 증폭된 핵산 생성물이 약 5 내지 약 20분 동안 수득될 수 있다. 특정한 다른 구체예에서, 다수의 증폭된 핵산 생성물이 약 5 내지 10분, 약 1 내지 5분, 또는 5분 미만 동안 수득될 수 있다. 각각의 증폭된 핵산 생성물은 약 10 ng 미만의 표적 핵산으로부터 시작하여 생성될 수 있다. 바람직하게는, 증폭된 핵산 생성물은 약 5 ng 미만 또는 약 2 ng 미만의 핵산, 또는 약 1 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.5 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.2 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.1 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.05 ng 미만의 핵산, 또는 약 0.006 ng 미만의 핵산으로부터 시작하여 생성될 수 있다.
임상 또는 환경 샘플에서의 생물학적 무기 작용제의 확인, 또는 인간, 식물 및 동물에서의 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염의 진단과 같은 다른 구체예에서, 증폭된 핵산 생성물은 표적 핵산의 1개 이상의 카피로부터 시작하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 분석되는 샘플은 다중 증폭 반응 전에 1000개 미만의 카피(예를 들어, 1-1000개의 카피), 400개 미만의 카피, 200개 미만의 카피, 100개 미만의 카피, 50개 미만의 카피, 30개 미만의 카피, 10개 미만의 카피 또는 1개 카피의 표적 핵산을 포함할 수 있다.
또한, 표적 핵산 유전자좌가 유전체 내에 1개 이상의 카피로 존재하는 경우 단일 유전체 당량 미만의 DNA가 증폭에 이용될 수 있다.
임의의 상기 방법에서, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 바와 같이 표적 핵산 내의 유전자좌의 충분한 증폭을 달성하기 위해 열 순환이 소정의 수의 순환 주기 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 소정의 수의 순환 주기는 약 10 내지 약 50 순환 주기, 바람직하게는 약 20 내지 50 순환 주기의 범위일 수 있다. 추가로, 임의의 상기 방법에서, 1개 또는 다수의 핵산의 2개 이상의 유전자좌가 동시에 증폭될 수 있다. 바람직한 적용에 따라, 4개 이상, 5 내지 10개, 10 내지 20개, 20 내지 30개 또는 약 10 내지 250개의 유전자좌가 동시에 증폭된다. 예를 들어, STR 유전자좌의 증폭을 위해, 10-20개의 유전자좌가 바람직할 수 있다.
바람직하게는, 반응 용액의 온도는 본 발명의 열 순환기(상기)에 의해 순환된다. 가열 단계에서 요망되는 용액 온도보다 높은 블록 온도를 설정하고, 냉각 단계에서 요망되는 용액 온도보다 낮은 블록 온도를 설정함으로써 PCR 용액의 지체 반응을 보상하여 신속한 열 순환을 위해 시판되는 블록 열 순환기를 이용하는 것이 가능할 수 있으나, 이러한 작업 방식은 느린 램핑 반응을 벌충하는데 필요한 온도 설정점이 경험적으로 결정되어야 하므로 실행에 부담이 된다. 더욱이, 피드백 및 제어가 여전히 블록에 의해 수행되고, 용액 온도의 모니터링이 수행되지 않으므로, 프로파일의 반복성 및 재현성이 실온의 변화를 포함하는 외부 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 용액의 온도 프로파일은 재현적이지 않게 된다.
다수의 시판되는 중합효소가 본원에 기재된 접근법을 이용하여 신속한 PCR 적용에 사용하기 위해 적합될 수 있다. 통상적으로, 핵산 중합효소는 100 염기/초 이상의 신장 속도를 갖는다. 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq), 피로코쿠스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus)(Pfu), 피로코쿠스 웨세이(Pyrococcus woesei)(Pwo), 써마스 플라부스(Thermas flavus)(Tfl), 쎄무스 서모필루스(Themus thermophilus)(Tth), 써무스 리토리스(Thermus litoris)(TIi) 및 써모토가 마리티메(Thermotoga maritime)(Tma)를 포함하는 다수의 중합효소가 PCR 증폭에 이용가능하다. 상기 효소, 상기 효소의 변형된 형태, 및 상기 효소의 조합물이 로슈(Roche), 인비트로젠(Invitrogen), 키아젠(Qiagen), 스트라테진(Strategene), 및 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)를 포함하는 업체에서 시판된다. 대표적인 효소는 퓨젼(PHUSION)(New England Biolabs, Ipswich, MA), 핫 마스터택(Hot MasterTaq™)(Eppendorf), 퓨젼 Mpx(PHUSION Mpx)(Finnzymes), 피로스타트(PyroStart)(Fermentas), KOD(EMD Biosciences), Z-택(Z-Taq)(TAKARA), 및 CS3AC/LA(KlenTaq, University City, MO)를 포함한다. STR 형결정을 위한 PCR 증폭에 널리 사용되는 효소는 Taq 중합효소이고, 택골드(TaqGold) 변이체가 아이덴티필러(Identifiler™), 프로파일러(Profiler™), 및 코필러(COfiler™) 키트로 공급된다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 PCR 조건은 인간 표적 핵산으로부터 완전한 STR 프로파일을 높은 효율로 생성시킬 수 있으나, 완전한 프로파일의 생성이 요구되지는 않는다. 상염색체 STR에 대한 완전한 프로파일은 아멜로게닌(amelogenin), D8S1179, D21S11, D7S820, CFS1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA, 또는 이들의 다수와 같은 유전자좌를 포함할 수 있다. 다른 STR 유전자좌는 미니-STR, 및 Y-STR 분석을 포함한다. 프로토콜의 최적화를 위한 기준은 완전한 프로파일의 생성, 신호 강도, 동적 구역, 유전자좌 간 신호 강도 균형, PHR, 불완전 NTA, 스터터, 및 전체 순환 주기 시간을 포함한다.
*한 구체예에 따르면, 스피드스타(SpeedSTAR) 효소 및 본 발명의 열 순환기를 이용하는 프로토콜은 완전한 STR 프로파일을 생성시키기 위해 바이오칩 및 튜브 반응에 대한 전체 순환 시간을 각각 17.3 및 19.1분으로 감소시킬 수 있다. 프로토콜에서, 변성 상태는 약 4초 동안 약 98℃이고, 어닐링 상태는 약 15초 동안 약 59℃이고, 신장 상태는 약 7초 동안 약 72℃이고, 최종 상태는 약 90초 동안 약 70℃이다.
특정 구체예에서, 10, 20 또는 30회 이상의 다중 PCR 순환 주기 동안의 전체 순환 시간은 약 1분 내지 약 90분의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 10, 20 또는 30회 이상의 다중 PCR 순환 주기 동안의 전체 순환 시간은 약 1분 내지 약 90분; 또는 약 1분 내지 약 85분; 또는 약 1분 내지 약 80분; 또는 약 1분 내지 약 75분; 또는 약 1분 내지 약 70분; 또는 약 1분 내지 약 65분; 또는 약 1분 내지 약 60분; 또는 약 1분 내지 약 55분; 또는 약 1분 내지 약 50분; 또는 약 1분 내지 약 45분; 또는 약 1분 내지 약 40분; 또는 약 1분 내지 약 35분; 또는 약 1분 내지 약 30분; 또는 약 1분 내지 약 25분; 또는 약 1분 내지 약 20분; 또는 약 1분 내지 약 15분; 또는 약 1분 내지 약 10분 또는 약 1분 내지 약 5분의 범위이다. 다른 구체예에서, 10, 20 또는 30회 이상의 다중 PCR 순환 주기 동안의 전체 순환 시간은 약 90분 미만이다. 바람직하게는, 10, 20 또는 30회 이상의 다중 PCR 순환 주기 동안의 전체 순환 시간은 약 89, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1분 미만이다.
본 발명은 핵산 샘플 뿐만 아니라 하나 이상의 다른 샘플 제조물 내의 다수의 유전자좌의 다중 PCR 증폭을 수행하기 위한 1개 또는 다수의 미세유체 시스템을 포함하는 통합된 바이오칩 및/또는 상기 바이오칩 플랫폼에서의 분석 방법을 고려한다. 예를 들어, 입구로부터 배출구로의 유동 방향을 각각 갖는 바이오칩 상의 각각의 미세유체 시스템에서, 시스템은 다수의 반응 챔버로의 제 1 반응 챔버가 입구와 유체 소통하고, 이의 마지막 챔버가 출구와 유체 소통하는 다수의 반응 챔버, 및 유동 방향에 따라 반응 챔버의 연속적인 쌍을 유체 연결시키는 하나 이상의 미세채널(microchannel)을 포함할 수 있다. 각각의 미세유체 시스템 내의 하나 이상의 반응 챔버는 상기 반응 챔버에서 다중 PCR을 수행하기 위해 본 발명의 열 순환기와의 열 소통을 촉진하기 위해 바이오칩 기판의 접촉 표면으로부터 200 μm 미만으로 존재할 수 있다.
바이오칩의 각각의 미세유체 시스템 내의 나머지 반응 챔버 각각은 핵산 추출, 핵산 정제, 핵산 하이브리드화, 핵산 라이게이션, PCR 전 핵산 정화, PCR 후 정화, 서열분석 전 정화, 서열분석, 서열분석 후 정화, 분리 및 검출, 역전사, 역전사 전 정화, 및/또는 역전사 후 정화, 전기영동 분리, 핵산 검출에 적합될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "정화"는 상기 나열된 임의의 반응 챔버 공정을 방해할 수 있는 반응 구성요소(음이온, 양이온, 올리고누클레오티드, 누클레오티드, 보존제, 효소 또는 억제제를 포함함)의 제거를 의미한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 구체예, 및 이의 다양한 용도의 예시이다. 이들은 설명의 목적으로만 기재된 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
실시예 1
통상적인 열 순환기 및 미세유체 바이오칩
도 1A에 도시된 바와 같은 본 발명의 열 순환기를 PCR 반응 용액 온도가 신속하고, 제어가능하고, 재현가능하게 가열되고 냉각되도록 함으로써 신속한 순환을 수행하는데 사용하였다. 이러한 기계는 16-챔버 미세유체 바이오칩을 수용하며, 이는 고 효율 열 싱크에 마운팅된 고전력의 열전기 냉각기/가열기로 구성된다. 16개의 PCR 반응 용액 각각을 클램핑 메커니즘을 이용하여 0.2 MPa의 압축압을 적용시킴으로써 열 펌프에 커플링된 미세유체 바이오칩의 개별적 챔버에 두었다. 도 1B는 16-샘플의 일회용 플라스틱 미세유체 바이오칩의 사진을 도시한다. 각각의 PCR 챔버는 500 μm의 깊이 및 약 1 mm의 폭이며, 7 μl의 PCR 반응 용액을 수용한다.
기계 및 온도 프로파일
하기 실시예에서, 튜브 내에서의 모든 증폭 반응을 에펜도르프 마스터사이클러 ep 그래디언트 S(Eppendorf Mastercyler™ ep gradient S)(Eppendorf North America, Westbury, NY)를 이용하여 수행하였다. 상기 기계의 블록 온도 프로파일을 블록에 직접 부착된 127 μm 직경의 타입 K 열전기쌍 센서를 이용하여 수득하였다. 반응 용액 프로파일을 위해, 127 μm 직경의 타입 K 열전기쌍 센서를 얇은 벽의 PCR 튜브 내의 20 μL의 반응 용액에 두었다. 100 Hz의 속도에서 데이터를 획득하도록 설정된 오메가(Omega) HH506RA 멀티로거(Multilogger) 온도계로 데이터 획득을 수행하였다.
반응 용기로서 16-샘플 플라스틱 바이오칩을 이용하여 실시예 1의 열 순환기를 이용하여 바이오칩에서의 증폭 반응을 수행하였다. 열전기쌍을 바이오칩 내의 센싱 챔버에 삽입하여 미세유체 바이오칩 내의 용액 온도를 모니터하였다.
PCR - 반응 혼합물 구성요소 및 순환 조건
주형으로 9947A 유전체 DNA(Promega, Madison, WI)를 이용하여 AmpF
Figure pat00001
STR® 프로파일러 플러스(Profiler Plus®) ID PCR 증폭 키트(Profiler Plus ID kit)(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 다중 PCR 반응을 수행하였다. 증폭에 사용된 중합효소는 프로파일러 플러스 ID 키트에서 공급된 앰플리택 골드(AmpliTaq Gold®) DNA 중합효소(TaqGold™) 또는 다른 중합효소인 스피드스타(SpeedSTAR) HS DNA 중합효소(SpeedSTAR)(Takara BIO USA Inc., Madison, WI), KOD 핫 스타트(Hot Start) DNA 중합효소(KOD)(EMD Biosciences Inc., Gibbstown, NJ) 또는 피로스타트 패스트 PCR 마스터 믹스(PyroStart™ Fast PCR Master Mix)(PyroStart)(Fermentas Inc., Glen Burnie, MD)였다. 다른 중합효소를 이용한 다중 PCR을 중합효소 특이적 완충용액 및 dNTP와 조합된 프로파일러 플러스 ID 키트로부터의 표지된 다중 프라이머 세트를 이용하여 수행하였다. 모든 튜브 PCR을 에펜도르프 마스터사이클러™ 이피 그래디언트 에스를 이용하여 0.2 mL 얇은 벽의 PCR 튜브(Eppendorf North America, Westbury, NY)에서 수행하였다. 모든 바이오칩 반응을 16-샘플 바이오칩을 이용하여 도 1A의 열 순환기에서 증폭시켰다.
하기 PCR 반응 혼합물을 제조하고, 열 순환에 사용하였다:
표준 택골드(TaqGold™) 반응:
표준 택골드(TaqGold™) 다중 반응을 25 μL 반응 부피의 9.55 μL 프로파일러 플러스(Profiler Plus) ID 반응 혼합물, 1 ng 9947A 유전체 DNA, 5 μL 프로파일러 플러스 ID 프라이머 세트 및 2.25U 택골드(TaqGold™)로 구성하였다. 순환 조건(블록 온도 및 시간)을 제조업체의 권고에 따라 선택하고, 11분 동안 최초 95℃(고온 시작) 후, 94℃에서 1분(변성), 59℃에서 1분(어닐링) 및 72℃에서 1분(신장)의 28순환 주기 후, 60℃에서 45분의 최종 신장으로 설정하였다.
최적화된 택골드(TaqGold™) 반응:
신속한 순환에 최적화된 택골드(TaqGold™) 반응을 3.82 μL 프로파일러 플러스 ID 반응 혼합물, 1 ng 9947A 유전체 DNA, 2 μL 프로파일러 플러스 ID 프라이머 세트 및 0.9U 택골드(TaqGold™)를 함유하는 10 μL 반응 부피로 수행하였다. 반응을 95℃에서 11분 후, 98℃에서 10초, 59℃에서 45초 및 72℃에서 30초의 28 순환 주기 후, 72℃에서 15분의 최종 신장으로 순환시켰다.
스피드스타(SpeedSTAR) 튜브 반응:
튜브 PCR을 위한 스피드스타(SpeedSTAR) PCR 혼합물 구성요소는 10 μL 반응 부피 중의 2 μL 프로파일러 플러스 ID 프라이머 세트, 9947A 유전체 DNA, 1x 패스트(Fast) 완충용액 I(Takara BIO USA Inc., Madison, WI), 200 μM dNTP 및 0.315U 스피드스타(SpeedSTAR)였다. 신속한 수행을 위한 순환 조건을 95℃에서 1분(효소 활성화) 후, 98℃에서 4초, 59℃에서 15초 및 72℃에서 5초의 28 순환 주기 후, 72℃에서 1분의 최종 신장으로 설정하였다.
스피드스타(SpeedSTAR) 바이오칩 반응:
바이오칩 PCR을 위해, 7 μL 반응 혼합물에 1.4 μL 프로파일러 플러스 ID 프라이머 세트, 9947A 유전체 DNA, 1x 패스트(Fast) 완충용액 I 완충용액, 200 μM dNTP 및 0.42U 스피드스타(SpeedSTAR)를 함유시켰다. 순환 파라미터를 95℃에서 70초 후, 98℃에서 4초, 59℃에서 15초 및 72℃에서 7초의 28순환 주기 후, 70℃에서의 1분 30초의 최종 신장으로 설정하였다.
KOD 반응:
KOD를 이용한 증폭을 10 μL 반응 부피의 2 μL 프로파일러 플러스 ID 프라이머 세트, 1x KOD 완충용액(EMD Biosciences Inc., Gibbstown, NJ), 200 μM dNTP, 1 ng 9947A 유전체 DNA, 1.5 mM MgSO4, 0.2U KOD로 수행하였다. 순환 조건은 95℃에서 2분 후, 98℃에서 4초, 59℃에서 30초 및 72℃에서 10초의 28순환 주기 후, 72℃에서 1분의 최종 신장이었다.
피로스타트(PyroStart) 반응:
1x 최종 농도의 피로스타트(PyroStart)를 갖는 반응 혼합물은 또한 10 μL 반응물 중에 2 μL 프로파일러 플러스 ID 프라이머 세트 및 1 ng 9947A 유전체 DNA를 함유하였고, 95℃에서 1분 후, 98℃에서 4초, 59℃에서 20초 및 72℃에서 30초의 28 순환 주기 후, 72℃에서 1분의 최종 신장으로 순환시켰다.
다른 STR 형결정 키트를 이용한 다중 PCR:
다른 STR 형결정 키트(AmpF
Figure pat00002
STR® Identifiler® (Identifiler), AmpF
Figure pat00003
STR® COfiler® PCR Amplification Kit (COfiler))(Applied Biosystems)를 이용하여 완전한 STR 프로파일을 생성시키기 위한 스피드스타(SpeedSTAR)의 적합성을 프로파일러 플러스 ID 키트를 이용하여 스피드스타(SpeedSTAR)에 대해 상기 기재된 바와 같은 반응 조건으로 튜브 및 바이오칩에서 시험하였다. 이러한 반응에서, 프로파일러 플러스 ID 프라이머 세트를 키트의 각각으로부터의 프라이머 세트로 대체하였다.
재현성
튜브 및 바이오칩에서의 재현성 연구를 주형으로 1ng의 9947A 유전체 DNA를 이용하여 택골드(TaqGold™) 및 스피드스타(SpeedSTAR)로 수행하였다. 튜브 재현성을 위해, 5개의 개별적 반응물을 제조하였다. 각각 8회 반응으로 3회의 바이오칩 PCR 작업으로 바이오칩 재현성을 결정하였다.
민감성
튜브 및 바이오칩에서 스피드스타(SpeedSTAR) 증폭에 대한 민감성 연구를 하기량의 9947A 주형 DNA를 이용하여 수행하였다: 튜브 중: 4 ng, 2 ng, 1.5 ng, 1 ng, 0.5 ng, 0.25 ng, 0.125 ng, 0.1 ng, 0.05 ng, 0.03 ng, 0.02 ng, 0.01 ng, 0.006 ng; 바이오칩 중: 4 ng, 2 ng, 1.5 ng, 1 ng, 0.5 ng, 0.25 ng, 0.1 ng, 0.05 ng, 0.025 ng, 0.02 ng, 0.015 ng, 0.01 ng, 0.006 ng. 각각의 주형 수준에서의 반응을 이중으로 수행하였다.
STR 분리 및 검출 기계
증폭된 생성물을 분리시키고, 네트워크 바이오시스템 진벤치-FX 시리즈 100(Network Biosystem Genebench-FX™ Series 100)을 이용하여 검출하였다(Pyzowski and Tan, Advances in Biochip-Based Analysis: A Rapid Field-Based Approach 59th Annual Meeting of the American Academy of Forensic Sciences San Antonio, TX, February 19-24, 2007). 이러한 기계를 개발하고, STR 분석에 대해 특이적으로 최적화시켰다. 2.7 μL의 각각의 증폭된 생성물에 10.2 μL의 Hi-Di™ 포름아미드 및 0.1 μL의 진스캔(Genescan) 500 LIZ 내부 레인 표준(둘 모두 Applied Biosystems, Foster City, CA)을 첨가하였다. 3분 동안 95℃에서 변성시킨 후, 얼음 상에서 급속 냉동시키고, 샘플을 분리 칩에 로딩시키고, 90초 동안 350 V/cm의 전기장을 적용시켜 분리 채널로 전기영동적으로 이동시켰다. 이후, 분리 채널을 따라 150 V/cm의 전기장을 적용시켜, DNA 단편을 분리시켰다. 모든 분리를 50℃에서 수행하였다.
데이터 분석
진마커(GeneMarker®) HID STR 인간 확인 소프트웨어(Human Identification Software), 버전 1.51(SoftGenetics LLC, State College, PA)을 이용하여 데이터를 분석하였다. 신호 강도를 내부 레인 표준으로 표준화시키고, 스터터, 불완전 NTA 뿐만 아니라 PHR의 백분율을 결정하였다. PHR은 유전자좌 내의 보다 낮은 신호 강도 대립유전자를 보다 높은 신호 강도 대립유전자로 나누어 계산된다. 불완전 NTA의 수준은 주형 단편의 신호 강도(-A)를 아데닐화된 단편의 신호 강도(+A)로 나누어 계산된다.
실시예 2
통상적인 PCR 튜브 및 미세유체 바이오칩에서의 열 순환 기계 및 반응 용액의 온도 프로파일
시판되는 열 순환기를 이용한 얇은 벽의 PCR 튜브, 및 실시예 1의 열 순환기를 이용한 미세유체 바이오칩에서 증폭 반응을 수행하였다. 튜브 반응을 위해, 에펜도르프 마스터사이클러(Eppendorf Mastercycler™)를 이용하였다. 도 2A는 통상적인 STR 순환 프로토콜을 이용한 28회의 열 순환 주기 중 1회 순환 주기에 대한 블록 및 튜브 내의 반응 용액의 온도를 도시한다. 마스터사이클러™ 가열 및 냉각 시스템은 튜브 삽입을 위한 통합된 블록을 갖는 열 펌프를 기초로 한다. 시간 및 온도 설정점은 변성에 대해 98℃에서 1분, 어닐링에 대해 59℃에서 1분, 및 신장에 대해 72℃에서 1분이다. 열 블록 및 반응 용액에 대한 온도 프로파일의 비교는 블록 온도에 대한 용액 온도 반응의 지체를 나타낸다. 블록의 측정된 가열 및 냉각 속도는 5.6℃/초 및 4.9℃/초이고, 용액은 4.8℃/초 및 3.3℃/초이다. 블록은 신장(72℃)으로부터 변성(98℃)으로의 온도 전이가 14초이나, 용액은 39초 동안 설정점 온도를 달성하지 않았다. 블록 및 용액 각각에 대해 변성 및 어닐링 단계(59℃) 사이의 전이는 10 및 27초가 걸렸고, 어닐링 및 신장 단계 사이는 7 및 24초가 걸렸다.
신속한 순환 조건 하에서의 28회의 열 순환 주기 중 1회의 열 순환 주기에 대한 에펜도르프 마스터사이클러™ 블록 및 반응 용액의 온도 프로파일은 도 2B에 도시되어 있다. 시간 및 온도 설정점은 변성에 대해 98℃에서 5초, 어닐링에 대해 59℃에서 15초, 및 신장에 대해 72℃에서 5초이다. 그러나, 용액의 지연되고 완충된(dampened) 반응은 용액으로부터 요망되는 설정점 온도를 달성하는 것을 방해한다.
신속한 순환 조건을 이용하는 본 발명의 열 순환기에 대한 28회의 열 순환 주기 중 1회의 열 순환 주기에 대한 열 펌프 및 반응 용액의 온도 프로파일을 또한 결정하였다(도 3). 반응 용액 온도의 결정을 위해, 바이오칩 내에 센싱 챔버를 사용하였다. 시간 및 온도 설정점은 변성에 대해 95℃에서 4초, 어닐링에 대해 59℃에서 15초, 및 신장에 대해 72℃에서 7초이다. 열 펌프의 측정된 가열 및 냉각 속도는 21.5℃/초 및 21.7℃/초이고, 반응 용액의 측정된 가열 및 냉각 속도는 14.8℃/초 및 15.4℃/초이다.
따라서, 본 발명의 열 순환기는 시판되는 블록 기재의 순환기 보다 3 내지 5배 신속한 속도로 반응 용액을 가열 및 냉각시킬 수 있다. 열 펌프에 대한 신장, 변성 및 어닐링 단계 사이의 전이 시간은 1.7, 2.1 및 0.7초이고, 용액에 대해서는 2.7, 4.5 및 2.2초이다. 본 발명의 열 순환기는 반응 용액이 요망되는 온도에 도달하는데 블록 기재 순환기 보다 대략 7배 신속하게 하여, 신속한 순환 조건하에서 규정되고 제어된 인큐베이션 온도 및 시간을 발생시킨다.
실시예 3
튜브 내의 PCR 효소의 평가
다수의 중합효소를 신속한 다중 STR 분석에 대한 잠재적 용도에 대해 평가하고, 고온 시작 활성화 시간 및 신장 속도에 부분적으로 기초하여 후보자를 선택하였다. 택골드(TaqGold™)에 대해 권고된 조건과 비교한 실험 평가를 위해 선택된 4개의 중합효소의 보고된 특성이 표 1(A)에 제시되어 있다.
Figure pat00004
평가된 효소는 약 15-200 누클레오티드/초의 범위의 보고된 신장 속도를 갖고; 일반적으로, 보고된 신장 속도는 단일(singleplex) 증폭을 기초로 하고, 다중 적용에 대해서는 다소 낮을 수 있다.
최소 시간으로 완전한 STR 프로파일을 달성하기 위해 상기 4개의 효소에 대해 튜브에서의 PCR 조건을 처음 연구하였다. 모든 반응에 대해, 프로파일러 플러스 ID 키트로부터의 프라이머 쌍 및 업체에서 권고된 완충용액 및 효소 농도를 이용하여 1 ng의 인간 유전체 DNA를 증폭시키고, 생성된 프로파일을 분리시키고, 검출하고, 크기 분류하고, 진벤치-FX(Genebench-FX™) 시리즈 100을 이용하여 정량하였다. 변성, 어닐링 및 신장 단계에 대한 다양한 시간 및 온도를 결정하여, 스피드스타(SpeedSTAR)에 대해 19.13분 내지 택골드(TaqGold™)에 대해 71.7분 범위의 STR 해석에 적합한 신호 강도를 갖는 PCR 증폭에 대해 전체 시간을 생성시켰다[표 1(B)]. 본 발명의 방법 조건은 택골드(TaqGold™)에 대해 권고된 조건보다 2-10배 더 신속히 증폭이 수행되는 것을 가능케 한다.
법의학 관련 작업을 위한 효소의 추가 평가는 신호 강도, 스터터 및 불완전 NTA 및 PHR의 수준을 포함한다[표 1(B)]. 모든 효소는 프로파일러 플러스 ID 프라이머를 이용하여 고도로 다중화된 증폭을 수행할 수 있다. 스피드스타(SpeedSTAR), 피로스타트(PyroStart), KOD, 및 최적화된 택골드(TaqGold™) 반응에 대한 신호 강도는 모두 표준 택골드(TaqGold™) PCR 조건을 이용하여 생성된 것과 대략 동일하거나 이보다 높다.
불완전 NTA와 관련하여, 스피드스타(SpeedSTAR) 및 피로스타트(PyroStart) 둘 모두 뿐만 아니라 최적화된 택골드(TaqGold™) 반응은 표준 택골드(TaqGold™) 반응의 불완전 NTA보다 3배 이하의 높은 수준을 나타내었다. 대부분의 대립유전자에 대해, 수준은 15% 미만의 해석 역치에 해당한다. 보다 높은 수준의 불완전 NTA를 갖는 대립유전자는 하기 논의되는 바와 같이 15% 해석 역치 미만으로 감소될 수 있다. KOD 중합효소는 3'-5' 엑소누클레아제 활성을 지니고, 이는 A-오버행(overhang)을 갖는 단편을 생성하지 않고; 따라서, 모든 대립유전자는 이들의 대립유전자 래더 대응물(counterpart)보다 1개의 누클레오티드가 짧았다.
최적화된 택골드(TaqGold™), 스피드스타(SpeedSTAR) 및 피로스타트(PyroStart) 반응에 대해 관찰된 스터터의 상대 수준은 표준 택골드(TaqGold™) 반응으로 생성된 스터터의 범위와 유사하고; KOD로 생성된 스터터의 범위는 표준 택골드(TaqGold™)에 대한 스터터보다 약간 높다.
실시예 4a
튜브 및 바이오칩에서의 스피드스타(SpeedSTAR) 중합효소를 이용하는 신속한 PCR 프로토콜
상기 제시된 결과에 기초하여, 전체 순환 시간을 최소화시키고, 신호 강도, PHR, 불완전 NTA 및 스터터 해석 필요조건을 만족시키는 완전한 STR 프로파일을 달성하기 위해, 바이오칩에서의 추가 평가를 위해 스피드스타(SpeedSTAR) 중합효소를 선택하였다.
본 발명의 열 순환기에 대해 미세유체 16-샘플 바이오칩에서 스피드스타(SpeedSTAR)를 이용한 증폭에 대해 시간 및 온도 설정점은 고온-시작 활성화에 대해 95℃에서 70초 후, 변성에 대해 95℃에서 4초, 어닐링에 대해 59℃에서 15초, 및 신장에 대해 72℃에서 7초의 28순환 주기이다. 72℃에서 90초의 최종 신장이 17.3분의 전체 프로토콜 시간에 대해 수행된다. 에펜도르프 마스터사이클러에서의 튜브 반응을 95℃에서 1분의 최초 활성화 시간 후, 98℃에서 4초, 59℃에서 15초 및 72℃에서 5초의 28순환 주기 후, 72℃에서 1분의 최종 신장으로 설정된 블록 시간 및 온도를 포함하는 19.13분 동안 수행하였다.
도 4A 및 4B는 0.5 ng의 DNA를 이용하는 7 μL 바이오칩(도 4A) 및 10 μL 튜브 반응(도 4B)에서 상기 스피드스타(SpeedSTAR) 순환 조건으로 생성된 STR 프로파일을 나타내고, 표 2는 표준 프로토콜을 이용하는 스피드스타(SpeedSTAR) 바이오칩 및 튜브 반응 뿐만 아니라 튜브에서의 택골드(TaqGold™)로부터의 모든 프로파일러 플러스 ID 대립유전자에 대한 신호 강도를 나타낸다. 0.5 ng의 스피드스타(SpeedSTAR) 바이오칩 반응의 신호 강도는 1ng의 표준 택골드(TaqGold™) 반응의 신호 강도 보다 평균 약 2배 더 높은 반면, 0.5 ng의 스피드스타(SpeedSTAR) 튜브 반응의 신호 강도는 택골드(TaqGold™) 반응의 신호 강도와 평균적으로 대략 동일하다.
Figure pat00005
실시예 4b
튜브 및 바이오칩에서의 스피드스타(SpeedSTAR) 중합효소를 이용한 신속한 PCR의 대립유전자 특성규명
실시예 4a로부터의 신속한 PCR 반응의 생성물을 특성규명하기 위해, PHR, 불완전 NTA 및 스터터의 정량을 수행하였다. 스피드스타(SpeedSTAR) 중합효소를 이용한 바이오칩 및 튜브 반응은 택골드(TaqGold™) 반응에 대한 것에 비해 높은 유전자좌 간 피크 높이 불균형을 나타낸다. 바이오칩 반응에서 생성된 대립유전자에 대한 PHR은 0.70 내지 0.95이고, 이는 튜브에서 대략 동일하고; 모두 허용되는 해석 가이드라인에 해당한다. 스피드스타(SpeedSTAR)를 이용한 반응은 표준 택골드(TaqGold™) 반응에 대해 결정된 것보다 약 10% 낮은 PHR을 갖는다. 유사하게, 스피드스타(SpeedSTAR)를 이용하는 바이오칩 및 튜브 반응 둘 모두에서 대부분의 대립유전자에 대한 불완전 NTA의 수준은 대략 동일(2.0 및 10.6%)하고; 둘 모두는 택골드(TaqGold™) 대조군 반응에 대한 것보다 대략 2배 높다. D3S1358 대립유전자에 대한 불완전 NTA가 예외이며, 이는 택골드(TaqGold™)를 이용하는 것보다 스피드스타(SpeedSTAR)를 이용하여 4.8 내지 7배 더 높고; 이러한 경우에도, 불완전 NTA의 수준은 스피드스타(SpeedSTAR) 효소에 대해 12% 미만이다. 최종적으로, 스피드스타(SpeedSTAR)를 이용하는 바이오칩 및 튜브 기재 반응 둘 모두에서의 스터터의 수준은 약 6.0 내지 14.1%이며, 이는 표준 택골드(TaqGold™) 튜브 반응에 대한 것보다 평균적으로 대략 1.6배 더 높다.
0.5 ng의 주형 DNA를 이용하는 미세유체 바이오칩 반응은 1 ng의 주형을 이용하는 표준 택골드(TaqGold™) 반응에 대한 것보다 대략 2배 더 높은 신호 강도를 발생시킨다. 이러한 결과는 바이오칩에서의 스피드스타(SpeedSTAR) 효소 및 통상적인 반응에서의 택골드(TaqGold™) 효소가 유사한 효율로 작용하는 것을 암시하고; 바이오칩에서의 DNA 농도는 튜브에서의 농도보다 약 1.8배이며, 이는 신호 강도에서 2배 더 높은 것에 해당한다. 대조적으로, 신속한 튜브 기재 반응은 대조군 택골드(TaqGold™) 반응 보다 덜 효율적이며; 생성물 수율에서의 약 40% 감소가, 시판되는 열 순환기가 신속한 열 순환에 대해 사용되는 경우에 발생하는 불량한 순환 프로파일의 결과일 수 있다. 이러한 상황에서도, 신호 강도는 해석에 필요한 수준을 충분이 넘고, 이는 순환 주기당 수초까지 신장 속도를 증가시킴으로써 현저하게 상승될 수 있다(데이터는 나타내지 않음). 바이오칩 및 튜브에서의 신속한 PCR 반응에 대한 신호 강도의 반복성 및 재현성은 통상적인 반응에서의 반복성 및 재현성과 유사하다.
신속한 바이오칩 및 튜브 반응에 대한 유전자좌 간 대립유전자 신호 강도는 택골드(TaqGold™) 반응에 비해 높은 수준의 불균형을 나타낸다. 유전자좌 같 신호 강도 균형은 프라이머 농도, 어닐링 온도 및 시간, 및 유전자좌의 분자량을 포함하는 다수의 요인에 의해 영향을 받는다. 이러한 실험에 사용되는 STR 증폭 키트는 택골드(TaqGold™) 효소 및 권고된 순환 프로토콜에 대해 최적화된 프라이머 세트 농도를 갖는다. 유전자좌의 신호 강도는 증폭 반응에 사용되는 프라이머 농도를 조정함으로써 변형될 수 있다(Henegariu et al., Biotechniques 1997, 23, 504-11).
신속한 바이오칩 및 튜브 반응을 위한 신호 강도와 주형 수준 사이의 상관관계는 일반적으로 주형이 증가하면 신호 강도가 증가하는 것으로 예상된다. 4 ng의 높은 주형 수준에서 모든 대립유전자에 대해 우수한 피크 형태가 관찰된다(이는 12000 RFU보다 큰 신호 강도를 갖는 대립유전자를 발생시킴). 0.03 ng의 주형 수준에서, 다소 낮은 대립유전자 드롭-아웃(drop-out)이 발생한다. 이러한 효과는 증폭 반응이 확률적(stochastic) 증폭을 발생시키는 용액 중의 제한된 수의 주형 DNA 가닥으로 수행되는 경우에 관찰된다(Walsh et al., PCR Methods Appl. 1992, 1, 241-250). 0.006 ng의 주형 수준에서의 높은 신호 강도의 대립유전자 및 낮은 신호 강도의 대립유전자 둘 모두에 대한 용이하게 검출가능한 신호의 존재는 진벤치-FX(Genebench-FX™) 시리즈 100 분리 및 검출과 커플링된 신속한 바이오칩 및 튜브 반응의 높은 민감성을 입증하고, 이는 낮은 카피 수의 분석에 대한 상기 시스템의 유용성을 입증한다. 이와 함께, 이러한 데이터는 또한 본 발명의 신속한 PCR 접근법 및 열 순환기 및 진벤치(Genebench) 기계가 높은 주형 동적 구역을 갖는 것을 암시한다.
실시예 4c
신속한 PCR 반응에서의 DNA 주형 수준 및 대립유전자 특성규명
바이오칩(도 5A) 및 튜브(도 5B) 반응에서 스피드스타(SpeedSTAR) 중합효소를 이용한 신속한 PCR 반응에 대한 신호 강도에서의 주형 DNA의 효과가 도 5A 및 5B에 제시되어 있다. 분석을 위해 선택된 대립유전자는 STR 프로파일에서 가장 높은 신호 수준을 갖는 대립유전자인 아멜로게닌(Amelogenin), 및 프로파일에서 가장 낮은 신호 수준을 갖는 대립유전자인 FGA 23 및 24 및 D7S820 10 및 11이었다. 모든 대립유전자에 대한 신호 강도는 스피드스타(SpeedSTAR) 바이오칩 및 튜브 반응 둘 모두에서 DNA 주형 수준이 0.006 ng으로부터 4 ng으로 증가함에 따라 증가한다. 0.006 ng의 주형 수준에서, 바이오칩에 대해 111 RFU 및 튜브 반응에 대해 58 RFU의 아멜로게닌 피크에 대한 신호 강도가 관찰되었다. 4 ng의 주형 수준에서, 12680 RFU의 신호 강도가 바이오칩에 대해 관찰되었고, 튜브 반응에 대해 5570 RFU가 관찰되었다. 둘 모두의 반응 유형에서 관찰된 모든 대립유전자는 우수한 피크 형태를 나타내었다.
신속한 바이오칩 반응(도 6A)에 대해, PHR은 0.05 내지 4.0 ng 범위의 주형 수준에 대해 0.6 내지 1.0이다. 0.05 ng 미만의 주형 수준에 대해, 0.025 ng까지 PHR이 감소하며, 대립유전자 드롭아웃이 발생하는 경우, 0의 PHR이 관찰된다. 신속한 튜브 반응에 대해 유사한 결과가 관찰되나, 이들은 일반적으로 바이오칩 반응 보다 다소 낮은 PHR을 나타낸다(도 6B). 바이오칩 반응에 대해, 불완전 NTA의 수준은 2.0 ng 이하의 주형 수준에 대해 15% 이하이다. 튜브 반응에 대해, 불완전 NTA 수준은 1 ng의 주형 수준에서 15%를 초과하고, 이는 4 ng까지 극적으로 증가한다.
바이오칩과 튜브 반응 사이의 2개의 주요한 차이는 반응 용액의 온도 프로파일 및 주형 및 중합효소의 상대 농도이다. 불완전 NTA의 수준은 보다 많은 중합효소가 이용가능함에 따라 감소한다. 바이오칩 반응에 대해, 실험 데이터는 0.5-4.0 ng 범위의 DNA 주형에 걸쳐, 불완전 NTA의 수준은 스피드스타(SpeedSTAR) 중합효소의 양이 0.3U으로부터 1.2U으로 증가함에 따라 약 50%로 감소한다(도 7A 및 7B). 신속한 바이오칩 및 튜브 반응에 대한 스터터의 수준은 비교적 일정하였고, 0.25-4.0 ng의 주형 수준 범위에 걸쳐 모든 대립유전자에 대해 일반적으로 15% 미만이었다(도 8A 및 8B).
STR 증폭 반응의 속도는 반응 자체가 법의학 해석 가이드라인을 충족시키는 기소할 수 있는 데이터를 발생시키는 경우에만 적절하다. FBI는 STR 해석에 사용되는 일반적인 가이드라인을 가지며, 개별적 연구소는 이들의 확인 작업에 기초하여 프로파일이 허용되는 것으로 간주될 수 있기 전에 충족되어야 하는 역치를 설정한다(Holt et al., J. Forensic Sci. 2002, 47(1), p. 66-96; LaFountain et al., J. Forensic Sci, 2001, 46(5), 1191-8).
본원에 제시된 조건은 상기 가이드라인을 충족시키는 신속한 STR 프로파일을 발생시킬 수 있다. 바이오칩 및 튜브 반응에서의 0.5 ng의 주형에 대한 PHR은 0.6 이상의 수준이 요구되고, 이전에 보고된 결과와 일치하는 것을 기술하는 해석 가이드라인을 충족시킨다(Leclair et al., J. Forensic Sci. 2004, 49, 968-80). 보다 높은 DNA 주형의 양에 대해, PHR은 비교적 일정하게 유지되나, 이는 1ng의 택골드(TaqGold™) 반응의 PHR 보다 낮다. 낮은 카피 수에 대해, PHR은 확률적 변동(stochastic fluctuation)으로 인해 증폭에 의해 좌우된다.
불완전 NTA의 수준은 모든 STR 앰플리콘을 완전히 아데닐화시키는 중합효소의 능력을 기초로 한다. 통상적인 증폭에 대해, 이는 프라이머에 "돼지꼬리(pigtail)"를 부착시키고, 최종 신장 시간을 증가시킴으로써 달성된다. 본원에 기재된 0.5 ng의 바이오칩 및 튜브 반응에 대한 불완전 NTA의 수준은 해석 가이드라인에 해당한다.
DNA 주형을 증가시키면 불완전 NTA의 수준이 증가(중합효소에 대한 DNA의 비를 증가시킨 결과)하고, 이는 중합효소의 양, 순환 주기 당 신장 시간, 및 최종 신장 시간을 증가시킴으로써 감소될 수 있다. 순환 주기 당 신장 시간 및 최종 신장 시간의 증가의 두 접근법은 이들이 반응 시간을 증가시킴에 따라 신속한 다중화 증폭에 적합하지 않다. 중합효소 농도를 증가시키는 것은 효과적이고, 신속한 PCR과 양립된다. 스터터는 신장 동안 DNA 가닥 손실의 결과이다(Walsh et al., Nucleic Acids Res. 1996, 24(14), 2807-12). 0.5 ng의 바이오칩 및 튜브 반응에 대한 본원에 기재된 스터터의 수준은 해석 가이드라인에 해당하고, 이는 또한 이전에 언급된 보고와 일치한다. 예상되는 바와 같이, 스터터의 수준은 DNA 주형 수준에 독립적인 것으로 보인다.
실시예 4d
반복성 및 재현성 연구
스피드스타(SpeedSTAR) 중합효소를 이용하는 신속한 바이오칩(표 3A) 및 튜브(표 3B) 반응의 반복성 및 재현성을 3개의 PCR 바이오칩에서 24개의 동일한 PCR 반응을 수행하고, 5개의 동일한 튜브 반응을 수행함으로써 평가하였다. 바이오칩 반응에 대해, 신호 강도에 대한 신뢰 값(CV)은 17 내지 24%의 범위이고, 튜브 반응에 대한 신뢰 값은 15 내지 34%의 범위이다. 표준 택골드(TaqGold™) 반응에 대한 CV는 6 내지 21%이다.
Figure pat00006
PHR에 대한 CV는 표준 택골드(TaqGold™) 반응에 대해 관찰된 5% 내지 10%에 비해, 바이오칩에 대해 14% 이하이고, 튜브 반응에 대해 21%이다. 바이오칩 반응에서의 불완전 NTA에 대한 CV는 6% 내지 28%로 다양하고, 튜브 반응에 대해서는 2 내지 13%이다. 또한, 이러한 변화는 표준 택골드(TaqGold™) 반응에 대해 관찰된 4 내지 28% 범위와 유사하다. 바이오칩에서의 스터터에 대한 CV는 4 내지 9%이고, 튜브에서 2 내지 6%이고, 이는 또한 표준 택골드(TaqGold™) 반응에 대해 관찰된 4 내지 13%의 범위와 유사하다.
실시예 4e
다른 시판되는 STR 키트와의 양립성
상기 기재된 것과 동일한 신속한 바이오칩 및 튜브 조건을 이용하여, 일련의 샘플을 코필러(COfiler™) 및 아이덴티필러(Identifiler™) 키트로부터의 프라이머 세트를 이용하여 평가하였다. 도 9A 및 9B는 본 발명의 열 순환기, 스피드스타(SpeedSTAR) 효소, 및 본원에 기재된 프로토콜을 이용하여 상기 프라이머 세트를 이용한 완전한 프로파일의 달성을 나타낸다. 각각은 또한 상기 시판되는 키트에 적합하다. 완전한 프로파일이 달성되었으나, 유전자좌 전역에서 신호 강도의 불균형이 관찰되었다.
실시예 5
*열 순환기를 이용한 신속한 서열분석
열 순환 기계 및 방법은 또한 신속한 DNA 서열분석 반응에 적용될 수 있다. 상기 신속한 열 순환기의 수행에서, 기계 및 바이오칩은 PCR에 사용된 것과 동일하다. 다양한 반응 용액, 중합효소 및 순환 온도가 서열분석 반응에 적용된다. 현재 상업적으로 이용가능한 서열분석 반응은 49분(GE Amersham DYEnamic™ ET Terminato Cycle Sequencing Kit에 대해) 및 2.25시간(AB Big Dye V3.1에 대해)이 소요된다. 통상적인 시약과 함께 넷바이오(NetBio) 열 순환기를 이용하는 것은 서열분석 반응 시간을 21분으로 감소시킨다.
본원에 기재된 열 순환기 및 16개의 레인을 포함하는 바이오칩을 이용하여 신속한 서열분석이 달성되었다. 칩에서의 최종 반응 부피는 7 μL였다. 절반 강도(Half strength)의 서열분석 반응을 제조업체의 프로토콜에 따라 GE 헬쓰케어(GE Healthcare)사로부터의 다이나믹 이티 터미네이터 사이클 서열분석 키트(DYEnamic™ ET Terminator Cycle Sequencing Kit)를 이용하여 설정하였다. 따라서, 모든 부피를 7 μL 최종 부피를 수용하기 위해 규모를 줄였다. 반응을 위한 주형은 343 bp의 단편 크기를 갖는 0.1 pmol의 B. 섭틸리스(B. subtilus)였다.
3개의 순환 프로토콜을 30순환 주기로 이루어지는 제 1 프로토콜(95℃에서 20초, 50℃에서 15초, 및 60℃에서 60초)(전체 순환 시간은 51.7분임), 95℃에서 5초, 50℃에서 15초 및 60℃에서 30초의 30순환 주기로 구성된 제 2 프로토콜(전체 순환 시간은 29분임), 및 95℃에서 5초, 50℃에서 10초 및 60℃에서 20초의 30순환 주기로 구성된 제 3 프로토콜(전체 순환 시간은 21.6분임)를 이용하여 입증하였다. 각각의 서열분석 반응물을 에탄올 침전으로 세척하고, 진벤치(Genebench) FX 시리즈 100 상에서 분리시켰다. 3개의 순환 프로토콜에 대한 343 bp PCR 생성물을 서열분석하기 위한 평균 PHRED 스코어는 각각 282, 287 및 279였고; 이는 343 bp의 생성물의 서열분석이 22분 미만 동안 칩에서 달성될 수 있는 것을 입증한다. 도 10은 신속한 DNA 서열분석 프로토콜의 DNA 서열을 나타낸다.
일반적으로, 본원에 기재된 시스템 및 방법을 이용하는 하나 이상의 핵산의 바이오칩 기재 다중화 증폭은 얇은 벽의 튜브에서의 반응 수행과 관련하여 현저하게 짧은 전체 반응 시간으로 증폭된 핵산 생성물을 제공하고, 현재 시판되는 열 순환 유닛을 이용하는 장점을 갖는다.

Claims (32)

  1. (ⅰ) 증폭되는 하나 이상의 표적 핵산의 하나 이상의 카피를 포함하는 핵산 용액; (ⅱ) 하나 이상의 완충용액; (ⅲ) 하나 이상의 염; (ⅳ) 증폭되는 다수의 유전자좌의 각각에 해당하는 프라이머 세트; (ⅴ) 핵산 중합효소; 및 (ⅵ) 누클레오티드를 각각 포함하는, 1개 또는 다수의 반응 챔버를 제공하는 단계, 및
    4-150℃/초의 가열 및 냉각 속도로 소정의 수의 순환 주기 동안 변성 상태, 어닐링(annealing) 상태 및 신장(extension) 상태 사이로 각각의 반응 챔버 내의 핵산 용액의 온도를 순차적으로 열 순환시켜 97분 이하 동안 각각의 반응 챔버에서 다수의 증폭된 유전자좌를 생성시키는 단계를 포함하는,
    핵산 용액 중의 다수의 유전자좌를 동시에 증폭시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 최종 상태에서 1개 또는 다수의 반응 용액을 고정시켜 1개 또는 다수의 증폭된 핵산 생성물을 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. (ⅰ) 증폭되는 하나 이상의 표적 핵산의 하나 이상의 카피를 포함하는 핵산 용액; (ⅱ) 하나 이상의 완충용액; (ⅲ) 하나 이상의 염; (ⅳ) 증폭되는 다수의 유전자좌의 각각에 해당하는 프라이머 세트; (ⅴ) 핵산 중합효소; 및 (ⅵ) 누클레오티드를 각각 포함하는, 1개 또는 다수의 반응 챔버를 제공하는 단계; 및
    4-150℃/초의 가열 및 냉각 속도로 소정의 수의 순환 주기 동안 각각의 반응 챔버 내의 핵산 용액의 온도를 순차적으로 열 순환시켜 97분 이하 동안 각각의 반응 챔버에서 다수의 증폭된 유전자좌를 생성시키는 단계를 포함하는,
    핵산 용액 중의 다수의 유전자좌를 동시에 증폭시키는 방법.
  4. (ⅰ) 증폭되는 하나 이상의 표적 핵산의 하나 이상의 카피를 포함하는 핵산 용액; (ⅱ) 하나 이상의 완충용액; (ⅲ) 하나 이상의 염; (ⅳ) 증폭되는 5개 이상의 유전자좌에 해당하는 프라이머 세트; (ⅴ) 핵산 중합효소; 및 (ⅵ) 누클레오티드를 각각 포함하는, 1개 또는 다수의 반응 챔버를 제공하는 단계; 및
    4-150℃/초의 가열 및 냉각 속도로 소정의 수의 순환 주기 동안 변성 상태, 어닐링 상태 및 신장 상태 사이로 각각의 반응 챔버 내의 핵산 용액의 온도를 순차적으로 열 순환시켜 각각의 반응 챔버에서 5개 이상의 증폭된 유전자좌를 생성시키는 단계를 포함하는,
    핵산 용액 중의 5개 이상의 유전자좌를 동시에 증폭시키는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 핵산 용액이 바이오칩에 존재하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 핵산 용액이 얇은 벽의 튜브에 존재하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 5개 이상의 증폭된 유전자좌가 97분 미만 동안 생성되는 방법.
  8. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 유전자좌가 45분 미만 동안 생성되는 방법.
  9. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 순차적 열 순환 전에 상기 1개 또는 다수의 반응 용액을 상기 핵산 중합효소의 고온-시작 활성화에 적합한 제 1 온도로 가열하는 단계; 및 1개 또는 다수의 반응 용액을 상기 핵산 중합효소의 고온-시작 활성화에 적합한 제 1 기간 동안 제 1 온도에서 유지시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 제 1 기간이 90초 미만인 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 제 1 온도가 90 내지 99℃인 방법.
  12. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열 순환이 제 1항의 열 순환기에 의해 제공되는 방법.
  13. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 중합효소가 100 bp/초 이상의 신장 속도를 갖는 방법.
  14. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 반응 챔버가 100 μL 미만의 부피를 갖는 방법.
  15. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 반응 챔버가 200 μm 미만으로 열 순환기로부터 떨어져 있는 방법.
  16. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 핵산 용액이 표적 핵산의 1 내지 1000 카피를 포함하는 방법.
  17. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 중합효소가 스피드스타(SpeedSTAR), 퓨젼(PHUSION), 핫 마스터택(Hot MasterTaq™), 퓨젼 Mpx(PHUSION Mpx), 피로스타트(PyroStart), KOD, Z-택(Z-Taq), 또는 CS3AC/LA인 방법.
  18. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 핵산 생성물 각각의 분석이 법의학적 해석(forensic interpretation) 가이드라인을 충족시키는 방법.
  19. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변성 상태가 4초 동안 95℃인 방법.
  20. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어닐링 상태가 15초 동안 59℃인 방법.
  21. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장 상태가 7초 동안 72℃인 방법.
  22. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 최종 상태가 90초 동안 70℃인 방법.
  23. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 또는 다수의 반응 용액이 10 내지 50℃/초의 제 1 냉각 속도로 변성 상태로부터 어닐링 상태로 냉각되는 방법.
  24. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 또는 다수의 반응 용액이 10 내지 50℃/초의 제 1 가열 속도로 어닐링 상태로부터 신장 상태로 가열되는 방법.
  25. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 또는 다수의 반응 용액이 10 내지 50℃/초의 제 2 가열 속도로 신장 상태로부터 변성 상태로 가열되는 방법.
  26. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 또는 다수의 증폭된 핵산 생성물이 10 내지 90분 동안 수득되는 방법.
  27. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 반응 용액이 0.005 내지 10 ng의 표적 핵산을 포함하는 방법.
  28. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산이 인간 핵산, 미생물 핵산 또는 바이러스 핵산을 포함하는 방법.
  29. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 10 내지 250개의 유전자좌가 동시에 증폭되는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 유전자좌가 아멜로게닌(amelogenin), D8S1179, D21S11, D7S820, CFS1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, FGA, 또는 이들의 다수를 포함하는 방법.
  31. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소정의 수의 순환 주기가 10 내지 50 순환 주기인 방법.
  32. 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 또는 다수의 얇은 벽의 반응 튜브가 상기 1개 또는 다수의 반응 챔버를 포함하는 방법.
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