JP2826366B2 - 蛍光検出型電気泳動装置 - Google Patents
蛍光検出型電気泳動装置Info
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- JP2826366B2 JP2826366B2 JP2095063A JP9506390A JP2826366B2 JP 2826366 B2 JP2826366 B2 JP 2826366B2 JP 2095063 A JP2095063 A JP 2095063A JP 9506390 A JP9506390 A JP 9506390A JP 2826366 B2 JP2826366 B2 JP 2826366B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は蛍光検出型電気泳動装置に関し、さらに詳し
くは、蛍光標識されたDNA、RNA、蛋白などの分離検出、
特にDNAシーケンサー、遺伝子診断等に好適な蛍光検出
型電気泳動装置に関する。
くは、蛍光標識されたDNA、RNA、蛋白などの分離検出、
特にDNAシーケンサー、遺伝子診断等に好適な蛍光検出
型電気泳動装置に関する。
従来DNAの塩基配列決定はオートラジオグラフィを用
いて行なっていた。一方、最近、蛍光標識を用いたリア
ルタイム検出システムが開発されてきた。それらでは４
種の末端塩基種ごとに異なる４種の蛍光色素でそれぞれ
のDNA断片を標識し、各DNA断片を１つの泳動路上に注入
して一定長さを泳動させた後、レーザーを照射して発す
る蛍光を観測する（Nature 321,674（1986）,Science 2
38,336（1987））。蛍光の波長と検出時間からDNA断片
の末端塩基種を知り、塩基配列を決定する。また、４種
の断片群を単一の蛍光体で標識し、４種の断片群を別々
の泳動路上に注入して蛍光測定し、配列を決定する方式
もある。
いて行なっていた。一方、最近、蛍光標識を用いたリア
ルタイム検出システムが開発されてきた。それらでは４
種の末端塩基種ごとに異なる４種の蛍光色素でそれぞれ
のDNA断片を標識し、各DNA断片を１つの泳動路上に注入
して一定長さを泳動させた後、レーザーを照射して発す
る蛍光を観測する（Nature 321,674（1986）,Science 2
38,336（1987））。蛍光の波長と検出時間からDNA断片
の末端塩基種を知り、塩基配列を決定する。また、４種
の断片群を単一の蛍光体で標識し、４種の断片群を別々
の泳動路上に注入して蛍光測定し、配列を決定する方式
もある。
これらの技術では測定しようとする試料毎に試料の調
製作業を必要とし、手間がかかる難点があった。このよ
うな手間を省略する手法として異なるDNA試料を別々の
ベクターに組み込み、単一の試験管内で同時に相補鎖合
成を行ない、電気泳動分離、フィルター転写後それぞれ
の試料とだけ結合する放射性標識されたDNAプローブを
付着させてDNA断片を検出し配列決定する手法が提案さ
れている。一度測定した後はこの放射性標識付プロープ
を洗い流して別のプローブを付着させれば別の試料の配
列決定データが得られる。このように１回の反応と泳動
で多種の試料のDNA塩基配列決定ができる（Biotechnolo
gy ７,576（1989））。しかし、この手法はDNAバンドパ
ターンをフィルターに固定化することが必要で放射性標
識以外には使用できない。蛍光プローブを使用しようと
すると、フィルターからの散乱光などのために十分な感
度が得られないからである。
製作業を必要とし、手間がかかる難点があった。このよ
うな手間を省略する手法として異なるDNA試料を別々の
ベクターに組み込み、単一の試験管内で同時に相補鎖合
成を行ない、電気泳動分離、フィルター転写後それぞれ
の試料とだけ結合する放射性標識されたDNAプローブを
付着させてDNA断片を検出し配列決定する手法が提案さ
れている。一度測定した後はこの放射性標識付プロープ
を洗い流して別のプローブを付着させれば別の試料の配
列決定データが得られる。このように１回の反応と泳動
で多種の試料のDNA塩基配列決定ができる（Biotechnolo
gy ７,576（1989））。しかし、この手法はDNAバンドパ
ターンをフィルターに固定化することが必要で放射性標
識以外には使用できない。蛍光プローブを使用しようと
すると、フィルターからの散乱光などのために十分な感
度が得られないからである。
本発明の目的はこのような難点を解消し、多数試料を
同時に処理して、かつ蛍光検出を可能とする蛍光検出型
電気泳動装置を提供することにある。
同時に処理して、かつ蛍光検出を可能とする蛍光検出型
電気泳動装置を提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明の蛍光検出型電気
泳動装置は、少なくとも励起光源とゲル電気泳動分離板
と蛍光検出器を具備した蛍光検出型電気泳動装置におい
て、前記励起光源が、波長の異なる複数の励起光を発す
る光源からなり、前記複数の励起光を、それぞれ、前記
ゲル電気泳動分離板の、所定間隔離れた異なる個所を照
射すべく構成し、かつ、前記電気泳動分離板の異なる個
所への複数の励起光照射によって得られる複数の蛍光画
像を前記蛍光検出器上の異なる個所に個別に結像せしめ
るように構成したことを特徴とするものである。
泳動装置は、少なくとも励起光源とゲル電気泳動分離板
と蛍光検出器を具備した蛍光検出型電気泳動装置におい
て、前記励起光源が、波長の異なる複数の励起光を発す
る光源からなり、前記複数の励起光を、それぞれ、前記
ゲル電気泳動分離板の、所定間隔離れた異なる個所を照
射すべく構成し、かつ、前記電気泳動分離板の異なる個
所への複数の励起光照射によって得られる複数の蛍光画
像を前記蛍光検出器上の異なる個所に個別に結像せしめ
るように構成したことを特徴とするものである。
本発明の装置の実用的な構成としては、前記ゲル電気
泳動分離板の異なる個所への励起光照射が、前記電気泳
動分離板中のゲル板の側面から前記電気泳動分離板の平
面に平行に貫通する方向の複数の励起光照射であり、前
記複数の励起光照射によって得られる複数の蛍光画像が
前記ゲル板中のレーザー照射の通路にそって発する複数
の線状蛍光画像である。また、蛍光検出器上に結像する
複数の蛍光画像を、それぞれ、結像前に分割する像分割
手段を設け、前記複数の蛍光画像を、それぞれ、さらに
複数に分割せしめた状態で前記蛍光検出器上に結像させ
るように構成される。
泳動分離板の異なる個所への励起光照射が、前記電気泳
動分離板中のゲル板の側面から前記電気泳動分離板の平
面に平行に貫通する方向の複数の励起光照射であり、前
記複数の励起光照射によって得られる複数の蛍光画像が
前記ゲル板中のレーザー照射の通路にそって発する複数
の線状蛍光画像である。また、蛍光検出器上に結像する
複数の蛍光画像を、それぞれ、結像前に分割する像分割
手段を設け、前記複数の蛍光画像を、それぞれ、さらに
複数に分割せしめた状態で前記蛍光検出器上に結像させ
るように構成される。
前記蛍光検出器としては、通常、二次元蛍光検出器が
用いられる。
用いられる。
また、別の態様として、励起光に対応して複数の光電
子増倍管を具備する態様、検出器の前に回転多色フィル
ターを具備する態様を挙げることができる。
子増倍管を具備する態様、検出器の前に回転多色フィル
ターを具備する態様を挙げることができる。
本発明の蛍光検出型電気泳動装置による、分離検出の
対象試料としては、塩基配列を決定すべきDNA或いはRNA
が挙げられるが、蛋白質等も対象試料とすることができ
る。
対象試料としては、塩基配列を決定すべきDNA或いはRNA
が挙げられるが、蛋白質等も対象試料とすることができ
る。
以下に、本発明の蛍光検出型電気泳動装置によりDNA
を塩基配列を決定する場合について具体的に説明する。
を塩基配列を決定する場合について具体的に説明する。
本発明の装置によれば、種々の試料を異なるベクター
にクローニングし、これらを混合物の形態で前記各ベク
ターに対応してそれぞれ特異的にハイブリダイズし得、
かつ、それぞれ異なる蛍光体で標識した異種プライマー
を用いて相補鎖合成し、得られた処理混合物から、４種
の末端塩基種を有するDNA断片群を調製し、これら４種
の群毎に別の泳動路上を泳動させ、各群の発する蛍光を
検出する手法をとることにより、上記目的が良好に達成
されるものである。
にクローニングし、これらを混合物の形態で前記各ベク
ターに対応してそれぞれ特異的にハイブリダイズし得、
かつ、それぞれ異なる蛍光体で標識した異種プライマー
を用いて相補鎖合成し、得られた処理混合物から、４種
の末端塩基種を有するDNA断片群を調製し、これら４種
の群毎に別の泳動路上を泳動させ、各群の発する蛍光を
検出する手法をとることにより、上記目的が良好に達成
されるものである。
つぎに、上記本発明の装置によるDNAの塩基配列決定
の手法をさらに詳細に説明する。
の手法をさらに詳細に説明する。
まず、それぞれ異なるベクターに組み込まれた複数の
塩基配列を決定すべき一本鎖のDNA試料を用意し、前記
ベクターの種類に対応した数の、それぞれ塩基配列が異
なり、前記各ベクターの中の一種類のものにのみハイブ
リダイズし得るプライマーを、それぞれ異なる発光波長
の蛍光体で標識し、ついで、前記各DNA試料と各プライ
マーの全てを一緒に混合して処理することにより、前記
複数の異なるベクターに組み込まれた一本鎖のDNA試料
のそれぞれに対し、前記それぞれ異なる発光波長の蛍光
体で標識した異なるプライマーを対応するベクターとハ
イブリダイズせしめた後、得られた各試料の処理混合物
を４分割し、これら４分割した各試料の処理混合物に対
し、それぞれ、末端塩基種がアデニン（Ａ）、シトシン
（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及び、チミン（Ｔ）となるよ
うに個別に相補鎖合成を行って、それぞれ、前記各試料
に由来し、その混合物中のDNA断片の末端塩基種が前記
４種のいずれかであるDNA断片群、すなわち、DNA断片の
末端塩基種がアデニンである群、DNA断片の末端塩基種
がシトシンである群、DNA断片の末端塩基種がグアニン
である群、及び、DNA断片の末端塩基種がチミンである
群を個別に作成し、前記各群毎に発光波長差を利用して
試料の分離検出を行うものである。
塩基配列を決定すべき一本鎖のDNA試料を用意し、前記
ベクターの種類に対応した数の、それぞれ塩基配列が異
なり、前記各ベクターの中の一種類のものにのみハイブ
リダイズし得るプライマーを、それぞれ異なる発光波長
の蛍光体で標識し、ついで、前記各DNA試料と各プライ
マーの全てを一緒に混合して処理することにより、前記
複数の異なるベクターに組み込まれた一本鎖のDNA試料
のそれぞれに対し、前記それぞれ異なる発光波長の蛍光
体で標識した異なるプライマーを対応するベクターとハ
イブリダイズせしめた後、得られた各試料の処理混合物
を４分割し、これら４分割した各試料の処理混合物に対
し、それぞれ、末端塩基種がアデニン（Ａ）、シトシン
（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、及び、チミン（Ｔ）となるよ
うに個別に相補鎖合成を行って、それぞれ、前記各試料
に由来し、その混合物中のDNA断片の末端塩基種が前記
４種のいずれかであるDNA断片群、すなわち、DNA断片の
末端塩基種がアデニンである群、DNA断片の末端塩基種
がシトシンである群、DNA断片の末端塩基種がグアニン
である群、及び、DNA断片の末端塩基種がチミンである
群を個別に作成し、前記各群毎に発光波長差を利用して
試料の分離検出を行うものである。
ベクターとしては、例えば、M13ベクター、YACベクタ
ー、pUCベクター等が用いられる。二本鎖のDNA試料は、
例えば、目的DNAをこれらにクローニングした後、アル
カリ変性させるなどして１本鎖DNAとしてから使用す
る。
ー、pUCベクター等が用いられる。二本鎖のDNA試料は、
例えば、目的DNAをこれらにクローニングした後、アル
カリ変性させるなどして１本鎖DNAとしてから使用す
る。
プライマーは、上記ベクターの一部と相補的な18〜20
塩基からなるオリゴヌクレオチドを合成し、これを蛍光
標識することにより得られ、配列がそれぞれ異なること
により、前記各ベクターの中の一種類のものにのみハイ
ブリダイズし得る構成となっている。プライマーを標識
する蛍光体としては、SF（succinyl fluoreceine）,FIT
C（Fluoreseince isothicayanate,発光極大波長515n
m）,NBD−Ｆ（発光極大波長540nm）,TRITC（発光極大波
長575nm）,Texas Red（発光極大波長605nm）等を用いる
ことができる。
塩基からなるオリゴヌクレオチドを合成し、これを蛍光
標識することにより得られ、配列がそれぞれ異なること
により、前記各ベクターの中の一種類のものにのみハイ
ブリダイズし得る構成となっている。プライマーを標識
する蛍光体としては、SF（succinyl fluoreceine）,FIT
C（Fluoreseince isothicayanate,発光極大波長515n
m）,NBD−Ｆ（発光極大波長540nm）,TRITC（発光極大波
長575nm）,Texas Red（発光極大波長605nm）等を用いる
ことができる。
上記プライマーをベクターにハイブリダイズさせる処
理、及び、相補鎖合成は、いずれも常法にしたがって行
うことができる。
理、及び、相補鎖合成は、いずれも常法にしたがって行
うことができる。
A,C,G,T各群の分離検出は、例えば、各群を別々の泳
動路で泳動させて、各群が所定距離泳動した部位をレー
ザー照射することによって発する蛍光を波長分割手段で
分割し、前記分割した各波長の光を二次元蛍光検出器で
個別に検出することにより試料の分離検出を行うととも
に、発光する泳動路の位置に基づいて末端塩基種の種類
を特定することにより、複数の異なる塩基配列を持っ
た、一本鎖のDNA試料の塩基配列を同時に決定すること
ができる。
動路で泳動させて、各群が所定距離泳動した部位をレー
ザー照射することによって発する蛍光を波長分割手段で
分割し、前記分割した各波長の光を二次元蛍光検出器で
個別に検出することにより試料の分離検出を行うととも
に、発光する泳動路の位置に基づいて末端塩基種の種類
を特定することにより、複数の異なる塩基配列を持っ
た、一本鎖のDNA試料の塩基配列を同時に決定すること
ができる。
本発明の装置を用いた上記DNAの塩基配列決定の手法
においては、励起光源としてレーザーあるいは輝線ラン
プが用いられる。ここで、単一波長のレーザーで複数の
色素を励起すると、色素の種類により各色素の発光量が
大きく異なってしまい、発光波長の差を用いて複数色素
から得られる信号を分離し、精度良く配列決定すること
が困難となることがある。なぜなら、発光量の少ない色
素で標識された試料は測定誤差が大きくなってしまうか
らである。そこでそれぞれの色素に適した複数の波長の
レーザーを用いることが考えられる。しかし、複数の波
長のレーザー光が同一の光路を通ると、ある波長のレー
ザー光により励起された色素からの発光波長が別の色素
の励起に都合の良い場合、ある色素の発光により周辺の
他の色素が励起発光し、解析能が低下する等の不都合が
生じる可能性がある。そこで、本願発明においては、複
数の発振波長のレーザー光でゲル電気泳動分離板上の所
定間隔離れた異なる個所照射し、解析能を向上させてい
る。なおレーザー光の間隔は解析能を低下させない限り
任意に設定することができるが、好ましくは1cm以上で
ある。
においては、励起光源としてレーザーあるいは輝線ラン
プが用いられる。ここで、単一波長のレーザーで複数の
色素を励起すると、色素の種類により各色素の発光量が
大きく異なってしまい、発光波長の差を用いて複数色素
から得られる信号を分離し、精度良く配列決定すること
が困難となることがある。なぜなら、発光量の少ない色
素で標識された試料は測定誤差が大きくなってしまうか
らである。そこでそれぞれの色素に適した複数の波長の
レーザーを用いることが考えられる。しかし、複数の波
長のレーザー光が同一の光路を通ると、ある波長のレー
ザー光により励起された色素からの発光波長が別の色素
の励起に都合の良い場合、ある色素の発光により周辺の
他の色素が励起発光し、解析能が低下する等の不都合が
生じる可能性がある。そこで、本願発明においては、複
数の発振波長のレーザー光でゲル電気泳動分離板上の所
定間隔離れた異なる個所照射し、解析能を向上させてい
る。なおレーザー光の間隔は解析能を低下させない限り
任意に設定することができるが、好ましくは1cm以上で
ある。
上記、泳動路は、石英板、ガラス板等のゲル保持板間
に形成されたポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲ
ルからなる板状ゲルにより構成することができる。
に形成されたポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲ
ルからなる板状ゲルにより構成することができる。
本発明の蛍光検出型電気泳動装置は、上記のような構
成であるから、多色の蛍光標識で標識した分離検出等の
資料の混合物を、各資料毎にゲル電気泳動分離板の泳動
路上を個別に泳動させる際、複数の励起光を、それぞ
れ、前記電気泳動分離板の、所定間隔離れた異なる個所
を照射させ、それによって得られる複数の蛍光画像を前
記蛍光検出器上の異なる個所に個別に結像せしめること
により、解析能の低下等の不都合を生じることなく、良
好に所期の分離解析等を行うものである。
成であるから、多色の蛍光標識で標識した分離検出等の
資料の混合物を、各資料毎にゲル電気泳動分離板の泳動
路上を個別に泳動させる際、複数の励起光を、それぞ
れ、前記電気泳動分離板の、所定間隔離れた異なる個所
を照射させ、それによって得られる複数の蛍光画像を前
記蛍光検出器上の異なる個所に個別に結像せしめること
により、解析能の低下等の不都合を生じることなく、良
好に所期の分離解析等を行うものである。
この作用を、その代表的な使用例であるDNAの塩基配
列決定の場合に基づいてさらに具体的に説明する。すな
わち、 異種プライマーを発光波長の異なる蛍光体で標識し、
前記各プライマーでハイブリダイスした異種のDNA断片
からなる試料は混合物の状態で塩基種毎に相補鎖合成す
る。前記相補鎖合成した混合物について、各末端塩基種
の群毎に別の泳動路上を泳動させる。一定距離泳動させ
た所を複数の発振波長のレーザー光で照射する。この
際、波長毎に位置を少しずらせて照射し、各照射部から
の蛍光を区別して検出する。照射位置と発光波長から試
料の種類を、また、泳動路の違いあるいは発光波長の違
いから末端塩基種を特定する。
列決定の場合に基づいてさらに具体的に説明する。すな
わち、 異種プライマーを発光波長の異なる蛍光体で標識し、
前記各プライマーでハイブリダイスした異種のDNA断片
からなる試料は混合物の状態で塩基種毎に相補鎖合成す
る。前記相補鎖合成した混合物について、各末端塩基種
の群毎に別の泳動路上を泳動させる。一定距離泳動させ
た所を複数の発振波長のレーザー光で照射する。この
際、波長毎に位置を少しずらせて照射し、各照射部から
の蛍光を区別して検出する。照射位置と発光波長から試
料の種類を、また、泳動路の違いあるいは発光波長の違
いから末端塩基種を特定する。
従って、本発明の蛍光検出型電気泳動装置によれば、
例えば表および裏DNAの塩基配列を同時に決定できる
等、複数の核酸、蛋白などの試料の分析を同時に、しか
も、解析能の低下等の不都合を生じることなく行える利
点があり、通常表か裏のみ400〜500塩基しか一度に決定
できないが本法を用いると裏と表合わせて一度に決定で
きる塩基長を1K塩基以上にまですることができ人遺伝子
など長いDNAの配列決定に有効である。更に８種あるい
はそれ以上ある蛍光標識プライマーを異種クローンに対
応させ、各異種クローンに対して同時に試料調製を行な
いＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴを泳動路の差により識別するよ
うにすると、試料調整の手間を大幅に削減することもで
きる。一枚の泳動板に確保できる泳動路は30〜40本であ
るが、本発明を用いると１つのレーンで２クローン以上
の配列決定が可能となるので、１回の電気泳動で60〜80
クローン以上の塩基配列決定を一度に行なうことがで
き、大きな遺伝子の解析に大きく寄与できる。
例えば表および裏DNAの塩基配列を同時に決定できる
等、複数の核酸、蛋白などの試料の分析を同時に、しか
も、解析能の低下等の不都合を生じることなく行える利
点があり、通常表か裏のみ400〜500塩基しか一度に決定
できないが本法を用いると裏と表合わせて一度に決定で
きる塩基長を1K塩基以上にまですることができ人遺伝子
など長いDNAの配列決定に有効である。更に８種あるい
はそれ以上ある蛍光標識プライマーを異種クローンに対
応させ、各異種クローンに対して同時に試料調製を行な
いＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴを泳動路の差により識別するよ
うにすると、試料調整の手間を大幅に削減することもで
きる。一枚の泳動板に確保できる泳動路は30〜40本であ
るが、本発明を用いると１つのレーンで２クローン以上
の配列決定が可能となるので、１回の電気泳動で60〜80
クローン以上の塩基配列決定を一度に行なうことがで
き、大きな遺伝子の解析に大きく寄与できる。
以下、本発明の実施例を添付図面に基づいて説明す
る。
る。
第１図は、本発明に係る蛍光検出型電気泳動装置の一
実施例を概略的に示し、図において、ゲル泳動板15は、
約0.3mmの間隙をもって相互に対向するように配置され
た、巾200mm,長さ300mm,厚さ5mmの一対の石英板からな
るゲル保持板15A,15Bと、それらの間隙に形成された4.5
％のポリアクリルアミドからなる泳動分離用のゲル板15
C（第２図も参照）とで構成されてなり、その上部には
所定数の試料注入溝16が形成され、この試料注入溝16に
その上方から試料注入具14により試料が注入されるよう
になされている。なお、図示が省略されているが、ゲル
泳動板15に関連して試料注入溝16に注入された試料を下
方に泳動させるための電極を形成する電源装置等は当業
者にはよく知られている態様をもって配設されている。
実施例を概略的に示し、図において、ゲル泳動板15は、
約0.3mmの間隙をもって相互に対向するように配置され
た、巾200mm,長さ300mm,厚さ5mmの一対の石英板からな
るゲル保持板15A,15Bと、それらの間隙に形成された4.5
％のポリアクリルアミドからなる泳動分離用のゲル板15
C（第２図も参照）とで構成されてなり、その上部には
所定数の試料注入溝16が形成され、この試料注入溝16に
その上方から試料注入具14により試料が注入されるよう
になされている。なお、図示が省略されているが、ゲル
泳動板15に関連して試料注入溝16に注入された試料を下
方に泳動させるための電極を形成する電源装置等は当業
者にはよく知られている態様をもって配設されている。
上記ゲル泳動板15の一方の側端面に対向して励起光源
とされる、488nmの波長を持つレーザー光を照射するア
ルゴンレーザー17と532nmの波長を持つレーザー光を照
射するYAGレーザー18とが上下方向に並置されている。
アルゴンレーザー17及びYAGレーザー18から照射される
レーザー光は、それらの光路がそれぞれ第１図及び第２
図において符号27,28で示される如くに、ゲル泳動板15
の厚み方向で見た中央部、従ってゲル板15Cの厚み範囲
内における、注入溝16下底から下方に25cm離隔した部位
とかかる部位からさらに1cm下方の部位とをゲル泳動板1
5の対向平面に平行に貫通するようにされている。
とされる、488nmの波長を持つレーザー光を照射するア
ルゴンレーザー17と532nmの波長を持つレーザー光を照
射するYAGレーザー18とが上下方向に並置されている。
アルゴンレーザー17及びYAGレーザー18から照射される
レーザー光は、それらの光路がそれぞれ第１図及び第２
図において符号27,28で示される如くに、ゲル泳動板15
の厚み方向で見た中央部、従ってゲル板15Cの厚み範囲
内における、注入溝16下底から下方に25cm離隔した部位
とかかる部位からさらに1cm下方の部位とをゲル泳動板1
5の対向平面に平行に貫通するようにされている。
一方、ゲル泳動板15における一方のゲル保持板15B側
には像分割フィルター光学系19が配されている。像分割
フィルター光学系19は、分離隔壁33を挟んで上側に光路
27に沿うように配された４つの出射面を持つ多面体プリ
ズム29及び後述のように所定の透過帯域を持つ多色用フ
ィルター30と分離隔壁33を挟んで下側に光路28に沿うよ
うに配された４つの出射面を持つ多面体プリズム32及び
後述のように所定の透過帯域を持つ多色用フィルター31
とからなっており、アルゴンレーザー17及びYAGレーザ
ー18のそれぞれが励起する二本の蛍光線画像はそれぞれ
多面体プリズム29及び30により４つに像分割され、多色
用フィルター30を通過した後、収光レンズ及び光電変換
部を具備する二次元蛍光検出器20内で結像せしめられ
る。
には像分割フィルター光学系19が配されている。像分割
フィルター光学系19は、分離隔壁33を挟んで上側に光路
27に沿うように配された４つの出射面を持つ多面体プリ
ズム29及び後述のように所定の透過帯域を持つ多色用フ
ィルター30と分離隔壁33を挟んで下側に光路28に沿うよ
うに配された４つの出射面を持つ多面体プリズム32及び
後述のように所定の透過帯域を持つ多色用フィルター31
とからなっており、アルゴンレーザー17及びYAGレーザ
ー18のそれぞれが励起する二本の蛍光線画像はそれぞれ
多面体プリズム29及び30により４つに像分割され、多色
用フィルター30を通過した後、収光レンズ及び光電変換
部を具備する二次元蛍光検出器20内で結像せしめられ
る。
そして、二次元蛍光検出器20内で結像した蛍光線画像
は電気信号に変換されてモニター25,コントローラ22,デ
ータ処理装置23に供給され、データ処理装置23から得ら
れるデータは外部記憶装置あるいはプリンタ等の外部出
力機器24に出力されるようになされている。
は電気信号に変換されてモニター25,コントローラ22,デ
ータ処理装置23に供給され、データ処理装置23から得ら
れるデータは外部記憶装置あるいはプリンタ等の外部出
力機器24に出力されるようになされている。
次に、上述の如くの構成を有する蛍光検出型電気泳動
装置の動作及び作用を、DNAの塩基配列の決定に利用し
た場合を例にとって第３図及び第４図を参照しつつ説明
する。
装置の動作及び作用を、DNAの塩基配列の決定に利用し
た場合を例にとって第３図及び第４図を参照しつつ説明
する。
塩基配列を決定しようとする二本鎖DNA1を単離してそ
の表・裏（正・逆）合計２種の塩基配列を同時に決定す
る場合には、まず、第３図に示される如くに、二本鎖DN
Aをプラスミドベクター２に組み込んだ二本鎖プラスミ
ドをアルカリ変性等の常法によって、表・裏に対応する
二種類のDNAが組み込まれた二種類の一本鎖DNAの混合物
（表配列を組み込んだベクター４と裏配列を組み込んだ
ベクターと５の混合物）にする。その際、表・裏２種の
DNAに対応して２種の標識プライマーセットを用意す
る。各プライマーセットは末端塩基種がアデニン
（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ），及び，チミ
ン（Ｔ）のうちのいずれであるかに対応して異なる発光
波長を持つ蛍光体で標識されたプライマー４種が含まれ
ている。標識蛍光体として、succinyl fluoreceine（S
F）とその誘導体（発光極大波長512〜540nm,Science 23
8,336−341参照）合計４種をＡセットとした。また、TR
ITC,Texas Redとその異性体（発光波長570〜620nm）合
計４種をＢセットとして用いた。なお、SF誘導体は発振
波長488nmのアルゴンレーザーが、TRITC,Texas Redとそ
の異性体は532nmのYAGレーザー（515nmのアルゴンレー
ザーなどでも良い）が励起光源として好適である。
の表・裏（正・逆）合計２種の塩基配列を同時に決定す
る場合には、まず、第３図に示される如くに、二本鎖DN
Aをプラスミドベクター２に組み込んだ二本鎖プラスミ
ドをアルカリ変性等の常法によって、表・裏に対応する
二種類のDNAが組み込まれた二種類の一本鎖DNAの混合物
（表配列を組み込んだベクター４と裏配列を組み込んだ
ベクターと５の混合物）にする。その際、表・裏２種の
DNAに対応して２種の標識プライマーセットを用意す
る。各プライマーセットは末端塩基種がアデニン
（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ），及び，チミ
ン（Ｔ）のうちのいずれであるかに対応して異なる発光
波長を持つ蛍光体で標識されたプライマー４種が含まれ
ている。標識蛍光体として、succinyl fluoreceine（S
F）とその誘導体（発光極大波長512〜540nm,Science 23
8,336−341参照）合計４種をＡセットとした。また、TR
ITC,Texas Redとその異性体（発光波長570〜620nm）合
計４種をＢセットとして用いた。なお、SF誘導体は発振
波長488nmのアルゴンレーザーが、TRITC,Texas Redとそ
の異性体は532nmのYAGレーザー（515nmのアルゴンレー
ザーなどでも良い）が励起光源として好適である。
各プライマーセットのうち末端塩基種がアデニン
（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ），及び，チミ
ン（Ｔ）で終る断片群を標識する蛍光体をそれぞれ、
AA,AC,AG,ATあるいはBA,BC,BG,BTと表わすことにする。
試料調整の鋳型となる表裏二種類のDNAが組み込まれた
二種類の一本鎖DNAの混合物（表配列を組み込んだベク
ター４と裏配列を組み込んだベクターと５の混合物）３
を４分割し、プライマーと混合する。この場合、AAと
BA,ACとBC,AGとBG,ATとBTを混合し、それぞれ４分割し
た鋳型DNAと混ぜる。ＡプライマーとＢプライマーはそ
れぞれ表および裏DNAと特異的にハイブリダイズする。
末端塩基種がアデニン（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニ
ン（Ｇ），及び，チミン（Ｔ）となるように個別にデオ
キシヌクレオチドおよびダイデオキシヌクレオチドを調
合し、酵素反応して相補鎖合成を行ない試料群｛Ａ｝，
｛Ｃ｝，｛Ｇ｝，｛Ｔ｝を作製する。｛Ａ｝には、表の
DNAを鋳型とし、プライマーAAを用いて合成された末端
アデニンで終わる断片群６と裏のDNAを鋳型とし、プラ
イマーBAを用いて合成された末端がアデニンで終わる断
片群７とが含まれる。｛Ｃ｝，｛Ｇ｝，および｛Ｔ｝に
ついてもそれぞれ表および裏DNAを鋳型とし、互いに異
なる色素で標識されたDNA断片群８と9,10と11および12
と13が含まれる。これらをすべて混合し、泳動用の試料
Ｓとする。
（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニン（Ｇ），及び，チミ
ン（Ｔ）で終る断片群を標識する蛍光体をそれぞれ、
AA,AC,AG,ATあるいはBA,BC,BG,BTと表わすことにする。
試料調整の鋳型となる表裏二種類のDNAが組み込まれた
二種類の一本鎖DNAの混合物（表配列を組み込んだベク
ター４と裏配列を組み込んだベクターと５の混合物）３
を４分割し、プライマーと混合する。この場合、AAと
BA,ACとBC,AGとBG,ATとBTを混合し、それぞれ４分割し
た鋳型DNAと混ぜる。ＡプライマーとＢプライマーはそ
れぞれ表および裏DNAと特異的にハイブリダイズする。
末端塩基種がアデニン（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニ
ン（Ｇ），及び，チミン（Ｔ）となるように個別にデオ
キシヌクレオチドおよびダイデオキシヌクレオチドを調
合し、酵素反応して相補鎖合成を行ない試料群｛Ａ｝，
｛Ｃ｝，｛Ｇ｝，｛Ｔ｝を作製する。｛Ａ｝には、表の
DNAを鋳型とし、プライマーAAを用いて合成された末端
アデニンで終わる断片群６と裏のDNAを鋳型とし、プラ
イマーBAを用いて合成された末端がアデニンで終わる断
片群７とが含まれる。｛Ｃ｝，｛Ｇ｝，および｛Ｔ｝に
ついてもそれぞれ表および裏DNAを鋳型とし、互いに異
なる色素で標識されたDNA断片群８と9,10と11および12
と13が含まれる。これらをすべて混合し、泳動用の試料
Ｓとする。
つぎに、ゲル泳動板15の試料注入溝16に試料注入具14
を用いて上記試料Ｓを注入し泳動させる。その場合、前
述のように、試料注入溝16下底から下方へ25cmの部位を
アルゴンレーザー17で照射し、26cmの部位をYAGレーザ
ー18で照射する。従って、本実施例では２種のレーザー
光が複数の泳動路を同時に縦列照射することになる。
を用いて上記試料Ｓを注入し泳動させる。その場合、前
述のように、試料注入溝16下底から下方へ25cmの部位を
アルゴンレーザー17で照射し、26cmの部位をYAGレーザ
ー18で照射する。従って、本実施例では２種のレーザー
光が複数の泳動路を同時に縦列照射することになる。
試料Ｓが488nmの波長を持つアルゴンレーザー17で照
射している領域（光路27上）を通過する時、SF異性体は
効率良く励起され、512〜540nmの蛍光を発する。線状蛍
光像は多面体プリズム29で像分割され、各SF異性体に合
わせて、512〜540nmの範囲に透過帯域をもつ多色用フィ
ルター30を通過して検出される。その場合、強い蛍光を
受光することができる。一方、TRITCやTexas Redとその
異性体が上記領域を通過しても、発光効率は低く、発光
波長帯も長波長にずれており、多色用フィルター30を通
過する蛍光は殆んど無視できる強度であり、SF異性体で
標識された表DNA断片の配列決定の障害とはならない。
射している領域（光路27上）を通過する時、SF異性体は
効率良く励起され、512〜540nmの蛍光を発する。線状蛍
光像は多面体プリズム29で像分割され、各SF異性体に合
わせて、512〜540nmの範囲に透過帯域をもつ多色用フィ
ルター30を通過して検出される。その場合、強い蛍光を
受光することができる。一方、TRITCやTexas Redとその
異性体が上記領域を通過しても、発光効率は低く、発光
波長帯も長波長にずれており、多色用フィルター30を通
過する蛍光は殆んど無視できる強度であり、SF異性体で
標識された表DNA断片の配列決定の障害とはならない。
また、試料Ｓが532nmの波長を持つYAGレーザー18で照
射している領域（光路28上）を通過する時、TRITC,Texa
s Redおよびその異性体で標識されたDNA断片は効率良く
励起され、強い蛍光を発する。線状蛍光像は多面体プリ
ズム32で像分割され、各標識色素に対応した570〜620nm
の範囲に透過帯域を持つ多色用フィルター31を通過して
検出される。SF標識物も蛍光を発するが、上記フィルタ
ー31を透過する蛍光強度はあまり大きくない。また570
〜620nmの波長領域でSFからの発光の波長依存性はゆる
やかなので４つの蛍光像の強度の差を取るなどのデータ
ー処理により、配列決定への影響を非常に小さくでき
る。SF異性体は光照射により分解しやすいので、488nm
励起光を30mW程度に強くしたり、488nm照射部と532nm照
射部の中間部をSF消去用として488nmのアルゴンレーザ
ーで照射し、SFを破壊して532nm照射部でSFの発光がほ
とんどなくなるようにすることもできる。
射している領域（光路28上）を通過する時、TRITC,Texa
s Redおよびその異性体で標識されたDNA断片は効率良く
励起され、強い蛍光を発する。線状蛍光像は多面体プリ
ズム32で像分割され、各標識色素に対応した570〜620nm
の範囲に透過帯域を持つ多色用フィルター31を通過して
検出される。SF標識物も蛍光を発するが、上記フィルタ
ー31を透過する蛍光強度はあまり大きくない。また570
〜620nmの波長領域でSFからの発光の波長依存性はゆる
やかなので４つの蛍光像の強度の差を取るなどのデータ
ー処理により、配列決定への影響を非常に小さくでき
る。SF異性体は光照射により分解しやすいので、488nm
励起光を30mW程度に強くしたり、488nm照射部と532nm照
射部の中間部をSF消去用として488nmのアルゴンレーザ
ーで照射し、SFを破壊して532nm照射部でSFの発光がほ
とんどなくなるようにすることもできる。
このようにして、光路27,28をDNA断片が通過する時発
する蛍光を波長分解して検出し、二本の蛍光線画像から
合計８本の波長選別した線画像26をモニター25の表示部
に表示させる。観測された表・裏DNAに対応する、それ
ぞれ４本の蛍光線画像の強度を比較することにより、通
過中のDNA断片の末端塩基種を決定し、DNA塩基配列を決
定できる。
する蛍光を波長分解して検出し、二本の蛍光線画像から
合計８本の波長選別した線画像26をモニター25の表示部
に表示させる。観測された表・裏DNAに対応する、それ
ぞれ４本の蛍光線画像の強度を比較することにより、通
過中のDNA断片の末端塩基種を決定し、DNA塩基配列を決
定できる。
なお、第４図では、多面体プリズム29,32の出射面が
それぞれ４面とされているが、それをそれぞれ２面ある
いは３面とし、それぞれの面に透過帯の異なる複数のフ
ィルターを並べて装着し、それぞれのフィルターを介し
ての透過光量の大小関係から通過中の標識色素を同定し
て末端塩基種を決定するようにすることもできる。
それぞれ４面とされているが、それをそれぞれ２面ある
いは３面とし、それぞれの面に透過帯の異なる複数のフ
ィルターを並べて装着し、それぞれのフィルターを介し
ての透過光量の大小関係から通過中の標識色素を同定し
て末端塩基種を決定するようにすることもできる。
また、上記実施例ではレーザー光をゲル板15Cの側面
に入射させて二次元蛍光検出器で蛍光画像を検出するよ
うにしたが、レーザーと回転フィルター付光検出器を２
セット用い、照射部をスキャンしながら計測することも
できる。もちろん、像分割プリズムの代わりに回転フィ
ルターを二次元検出の前に付けて波長選別することもで
きる。
に入射させて二次元蛍光検出器で蛍光画像を検出するよ
うにしたが、レーザーと回転フィルター付光検出器を２
セット用い、照射部をスキャンしながら計測することも
できる。もちろん、像分割プリズムの代わりに回転フィ
ルターを二次元検出の前に付けて波長選別することもで
きる。
さらに、励起光を３本以上用い、３カ所以上を照射す
ることにより更に多種のDNA試料等を同時に解析するこ
ともできる。
ることにより更に多種のDNA試料等を同時に解析するこ
ともできる。
また、標識蛍光体と励起光源の選択は実施例の限りで
なく、赤色He−Neレーザー（633nm）や半導体レーザー
（670nm）でフタロシアニン系色素を励起しても良い。
なく、赤色He−Neレーザー（633nm）や半導体レーザー
（670nm）でフタロシアニン系色素を励起しても良い。
本発明の装置では、複数の蛍光体で標識された試料が
泳動、分離される電気泳動路の泳動開始点から所定の間
隔離れた異なる位置に、複数の励起光をそれぞれ照射し
て得られる蛍光画像を検出するので、良好に多数の試料
を同時に分離解析できる。
泳動、分離される電気泳動路の泳動開始点から所定の間
隔離れた異なる位置に、複数の励起光をそれぞれ照射し
て得られる蛍光画像を検出するので、良好に多数の試料
を同時に分離解析できる。
第１図は本発明に係る蛍光検出型電気泳動装置の一実施
例を示す概略図、第２図は第１図に示される実施例の主
要部を示す図、第３図は試料調整の手順の説明に供され
る図、第４図は調整DNA断片の説明にきょうされる図で
ある。 図において １……配列決定すべき２本鎖DNA、２……目的DNAを組み
込んだベクター、３……表配列を組み込んだベクターと
裏配列を組み込んだベクターの混合溶液、４……表配列
を組み込んだベクター、５……裏配列を組み込んだベク
ター、6,7……末端がＡで終わる断片群、8,9……末端が
Ｃで終わる断片群、10,11……末端がＧで終わる断片
群、12,13……末端がＴで終わる断片群、14……試料注
入具、15……ゲル泳動板、16……試料注入溝（ウェ
ル）、17……アルゴンレーザー、18……YAGレーザー、1
9……像分割フィルター光学系、20……二次元蛍光検出
器、22……コントローラ、23……データ処理装置、24…
…外部出力機器、25……モニター、26……分光後の線画
像、27,28……光路、29,32……多面帯プリズム、30,31
……多色用フィルター、33……分離隔壁。
例を示す概略図、第２図は第１図に示される実施例の主
要部を示す図、第３図は試料調整の手順の説明に供され
る図、第４図は調整DNA断片の説明にきょうされる図で
ある。 図において １……配列決定すべき２本鎖DNA、２……目的DNAを組み
込んだベクター、３……表配列を組み込んだベクターと
裏配列を組み込んだベクターの混合溶液、４……表配列
を組み込んだベクター、５……裏配列を組み込んだベク
ター、6,7……末端がＡで終わる断片群、8,9……末端が
Ｃで終わる断片群、10,11……末端がＧで終わる断片
群、12,13……末端がＴで終わる断片群、14……試料注
入具、15……ゲル泳動板、16……試料注入溝（ウェ
ル）、17……アルゴンレーザー、18……YAGレーザー、1
9……像分割フィルター光学系、20……二次元蛍光検出
器、22……コントローラ、23……データ処理装置、24…
…外部出力機器、25……モニター、26……分光後の線画
像、27,28……光路、29,32……多面帯プリズム、30,31
……多色用フィルター、33……分離隔壁。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−21556（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−231247（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−242368（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−263458（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 27/447
Claims (10)
- 【請求項１】異なる蛍光標識で標識され、複数の泳動路
で泳動・分離される試料の、泳動開始点から離れた異な
る位置にある複数の光照射部位毎で異なる波長の光を前
記複数の泳動路に照射し、前記蛍光標識を励起する光照
射手段と、前記光の照射により前記蛍光標識から発する
蛍光を検出する蛍光検出手段、とを有することを特徴と
する蛍光検出型電気泳動装置。 - 【請求項２】請求項１に記載の蛍光検出型電気泳動装置
において、蛍光検出手段は、蛍光検出器と、像分割手段
と、波長選択手段とを具備し、前記像分割手段は光照射
手段により光照射部位毎に形成される蛍光像を複数に分
割し、前記像分割手段と前記波長選択手段は、前記蛍光
像と前記蛍光検出器との間に配置されることを特徴とす
る蛍光検出型電気泳動装置。 - 【請求項３】請求項１又は２に記載の蛍光検出型電気泳
動装置において、光照射部位の各各は、少なくとも1cm
分離していることを特徴とする蛍光検出型電気泳動装
置。 - 【請求項４】請求項１乃至３のいずれか一項に記載の蛍
光検出型電気泳動装置において、照射手段による照射
は、複数の泳動路と交叉する方向から照射することを特
徴とする蛍光検出型電気泳動装置。 - 【請求項５】請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛍
光検出型電気泳動装置において、光照射部位が２個所で
あることを特徴とする蛍光検出型電気泳動装置。 - 【請求項６】請求項２に記載の蛍光検出型電気泳動装置
において、像分割手段は、光照射部位毎に対応して配置
される多面体プリズムを具備し、前記多面体プリズムの
各々は１つの面と対向する複数の面とを有することを特
徴とする蛍光検出型電気泳動装置。 - 【請求項７】請求項２に記載の蛍光検出型電気泳動装置
において、蛍光検出器は、２次元蛍光検出器であること
を特徴とする蛍光検出型電気泳動装置。 - 【請求項８】請求項２に記載の蛍光検出型電気泳動装置
において、波長選択手段は、所定の透過帯域を有するフ
ィルタを具備することを特徴とする蛍光検出型電気泳動
装置。 - 【請求項９】異なる波長の光を発生する光源と、異なる
蛍光標識で標識された試料が泳動する複数の泳動路を有
する電気泳動手段と、前記試料の泳動距離の異なる部位
毎で異なる波長の前記光を前記複数の泳動路に照射し、
前記蛍光標識を励起する光照射手段と、前記光の照射に
より前記蛍光標識から発する蛍光を検出する蛍光検出手
段とを有することを特徴とする蛍光検出型電気泳動装
置。 - 【請求項１０】蛍光標識した試料を電気泳動、分離する
ための複数の泳動路と、該泳動路の泳動開始点から離れ
た位置において、泳動、分離された前記蛍光標識した試
料に対し、波長の異なる複数の励起光を照射する励起光
源と、励起された前記試料から発する蛍光を蛍光検出器
に向ける光学系とを具備し、前記複数の励起光の照射に
よって得られる複数の蛍光画像を前記蛍光検出器の異な
った位置に結像させるように前記光学系を構成すること
を特徴とする蛍光検出型電気泳動装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2095063A JP2826366B2 (ja) | 1990-04-12 | 1990-04-12 | 蛍光検出型電気泳動装置 |
| US07/684,113 US5307148A (en) | 1990-04-05 | 1991-04-12 | Fluorescence detection type electrophoresis apparatus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2095063A JP2826366B2 (ja) | 1990-04-12 | 1990-04-12 | 蛍光検出型電気泳動装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03293557A JPH03293557A (ja) | 1991-12-25 |
| JP2826366B2 true JP2826366B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=14127555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2095063A Expired - Fee Related JP2826366B2 (ja) | 1990-04-05 | 1990-04-12 | 蛍光検出型電気泳動装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2826366B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101530943B1 (ko) * | 2007-04-04 | 2015-06-23 | 네트바이오, 인코포레이티드 | 통합된 핵산 분석 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2815506B2 (ja) * | 1992-04-14 | 1998-10-27 | 株式会社日立製作所 | 光検出型電気泳動装置 |
| JP3400650B2 (ja) * | 1996-06-28 | 2003-04-28 | 株式会社日立製作所 | 電気泳動分離検出方法及び装置 |
| PL2106541T3 (pl) * | 2007-01-19 | 2018-05-30 | Tudor Arvinte | Sposób i urządzenie do oznaczania parametrów zanieczyszczeń w roztworze ciekłym |
-
1990
- 1990-04-12 JP JP2095063A patent/JP2826366B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101530943B1 (ko) * | 2007-04-04 | 2015-06-23 | 네트바이오, 인코포레이티드 | 통합된 핵산 분석 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03293557A (ja) | 1991-12-25 |
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