TWI504750B - 快速多重擴增目標核酸的方法 - Google Patents

Description

快速多重擴增目標核酸的方法

本發明一般而言係關於用於快速擴增核酸樣品內之一或多個基因座的方法，以及適用於進行該等方法之熱循環器及系統。

本申請案主張2007年4月4日申請之美國臨時申請案第60/921,802號；2007年8月13日申請之美國臨時申請案第60/964,502號及2008年2月12日申請之美國臨時申請案第61/028,073號的35 U.S.C.§119(e)下申請日期之優先權，該等申請案各自據此以全文引用的方式併入本文中。本申請案亦以全文引用的方式併入與其同一日期申請之兩個美國專利申請案；第一者標題為"INTEGRATED NUCLEIC ACID ANALYSIS"，代理人案號第07-801-US號；且第二者標題為"PLASTIC MICROFLUIDIC SEPARATION AND DETECTION PLATFORMs"，代理人案號第07-865-US號。

聚合酶鏈反應(PCR)為促進核酸序列活體外快速指數式擴增的酶促反應。在法醫學中，可利用PCR基於含有一類稱為短串聯重複序列(STR)之重複DNA的人類基因組之小區域的擴增來鑑別個體。給定STR重複序列之單位長度介於2-10個鹼基對之間之範圍內，且STR通常在非編碼且側接序列內，但有時在編碼區域內(Edwards等人 ，Am.J.Hum.Genet. 1991,49,746-756)。在人類基因組中存在數十萬STR基因座，其平均每6-10 kb即出現(Beckman及 Weber,Genomics 1992,12,627-631)且似乎具高度多態性(Edwards等人 ，Trans.Assoc.Am.Physicians 1989,102,185-194)。STR分析已成為具有一組包括親子鑑定、重大災禍中之人類鑑定及常規幼兒分型檢測的增長應用之法醫學全套裝備中的主要工具。

儘管已開發數種市售STR套組用於合成所需具有高特異性之PCR產品，但仍存在可改良當前STR技術之重要領域。最重要地，使用商業STR分型檢測套組完成多重PCR之平均時間大約為2.14小時；該等檢定之耗時及勞動密集性質已造成法醫學實驗室工作積壓。儘管同時處理多重樣品之自動儀器的問世有助於減輕分型檢測產量之顯著瓶頸，但增加數目之待分析樣品將要求進一步加速處理。此外，需要增加STR檢定之敏感性以及改良擴增產品之偵測(Gill,Croat.Med.J. 2001,42,229-32)。當前可用之STR套組含有9至16個基因座且正在進行該領域之研究以增加可偵測基因座之數目。可使用4個或4個以上基因座來進行該領域中STR分析之某些應用。

亦可在廣泛臨床環境範圍內應用PCR。例如，PCR可用於診斷諸如由A組鏈球菌(Group AStreptococci )、二甲氧苯青黴素抗性金黃色葡萄球菌(S.aureus )及萬古黴素抗性腸球菌(Enterococci )所致之彼等細菌感染，且PCR通常比基於培養物之診斷技術更為敏感。可類似地診斷真菌感染。PCR可用於診斷呼吸道病毒(例如呼吸道融合性病毒、腺病毒及流行性感冒病毒及副流感病毒)、泌尿生殖器病 毒(例如疱疹單純型病毒及分型檢測人類乳頭狀瘤病毒)、腦膜炎(例如疱疹單純型病毒、伊波病毒(Epstein-Barr virus)、水痘-帶狀疱疹病毒及腸病毒)及肝炎(例如B型及C型肝炎)。PCR亦適用於植入前之遺傳診斷，包括評估非整倍體性以及診斷遺傳疾病。自腫瘤學至風濕病學且自血液學至腸胃病學，難以發現不受PCR影響之醫學領域。

PCR亦已用於多種非臨床環境，包括獸醫學鑑定(與人類STR分型檢測類似)、獸醫學診斷、評估食物安全、偵測農業病原體及藥物基因組學。重要性增加之應用涉及在臨床及環境樣品中鑑定生物武器藥劑。在基本上與PCR本身相同之應用中使用即時PCR，即允許對各擴增週期後反應中所存在之產物的量進行定量之PCR的近親(參見Espy等人 ，Clinical Microbiology Reviews 2006,19,1656-256)。

大多數市售熱循環儀器受限之處在於與PCR溶液溫度相反，其直接自模塊溫度接收溫度反饋且控制模塊溫度。因此，對於PCR之成功而言關鍵的溶液溫度分布可能與所需分布廣泛不同。

此外，大部分關於增加PCR速度及敏感性之文獻已集中於每次擴增一個特定基因座("單重檢定")且如法醫學STR分型檢測、臨床診斷及非臨床應用所需，在同時擴增多個基因座("多重檢定")中僅報導有限成功。例如，已展示與整合加熱器耦接之160 nL腔室能夠在80分鐘內以模板DNA之20個複本的偵測極限擴增且分離Y-STR檢定中所含的4個STR。(Liu等人 ，Anal.Chem. 2007,79,1881-1889)。亦已 報導對於PowerPlex^® 16 System而言，由於PCR反應體積降低而增加之PCR敏感性，儘管不曾試圖增加反應速度(Schmidt等人 ，Int.J.Legal Med. 2006,120,42-48)。然而，兩個報導均未提供此項技術中所需的顯著更短之擴增時間。Hopwood等人 (International Congress Series 1288(2006)639-641)報導使用一組11個STR引子之100分鐘擴增。關於臨床診斷學，使用奈米晶片系統在需要97.5分鐘之PCR檢定中擴增七種常見呼吸道病毒之面板(Takahashi等人 ，J.Clin.Microbiol 2008,doi：10.1128/JCM.01947-07)。

諸如藉由STR分型檢測之法醫學人類鑑定、臨床診斷學及生物武器藥劑偵測的許多PCR(及即時PCR)應用極具時間敏感性且最佳在多重環境中進行許多應用。另外，在有限樣品可用(例如，來自臨床或環境樣品之少量病原體，或來自法醫學樣品之少量人類細胞)且反應敏感性關鍵的環境中使用許多該等應用。

值得注意地，同上Horsman等人(J.Forensic Sci. ,2007,52,784-799)在792頁說明"如藉助於關於主題之文獻所證明，PCR已成為分析微晶片研究者之共同追求。然而，對於法醫學DNA分析而言，仍有許多途徑有待開發。大量工作並未展示在單一裝置上使用市售法醫學STR套組或進一步使用多個STR擴增。然而，當完全開發時，微晶片PCR將無疑為法醫學界節約大量時間及成本。"因此，此項技術中需要快速且敏感之方法以成功地提供對核酸樣品中多 個基因座之同時擴增以用於廣泛應用範圍。

本發明之儀器、生物晶片、方法及系統經由監控及控制熱循環器，至少部分地基於溶液之實際溫度提供快速、可控且可再現地加熱及冷卻PCR溶液之能力。本文所揭示之本發明儀器、生物晶片、方法及系統經由特定併入商業熱循環器中不存在之熱感應器，提供監控及/或精確控制生物晶片內之溶液的反應溫度以避免過熱或欠熱之能力。快速加熱及冷卻反應溶液至該等溫度之能力使得可最小化勻變及穩定時間，且使得所需溫度下之培育時間可支配總階躍時間。另外，本文中提供之本發明之儀器、生物晶片、方法及系統賦予快速改變反應溶液之溫度且使其平衡的能力，由此極大地增加擴增反應可進行之速度。

已使用本發明之儀器、生物晶片、方法及系統達成短至17分鐘的快速多重PCR擴增時間。基於本發明之教示，額外之時間減少係可能的。另外，本發明之快速PCR方法在廣泛動態範圍內有效，極其敏感且與多種市售酶及試劑相容。對於法醫學應用而言，本發明之儀器、生物晶片、方法及系統能夠使產生滿足STR分析之解釋準則的完整圖譜所需之時間顯著減少。

在第一態樣中，本發明提供包含溫度控制元件(TCE)之熱循環器，其中該TCE之第一表面適合於接收含有溶液之樣品室及含有熱感應器之感應室，其中該熱感應器提供反饋至TCE以將樣品設定或維持在所需溫度。在第二態樣 中，本發明提供另外包含經定位以監控TCE之第一表面之溫度的第二熱感應器之熱循環器。

在第二態樣中，本發明提供包含生物晶片之系統，該生物晶片包含一或多個包含具有一定體積的該生物晶片之一部分的反應室，其中各反應室另外包含微流體入口通道及微流體出口通道，其中各反應室距離生物晶片基板之接觸表面小於200 μm；該系統另外包含熱循環器，其包含溫度控制元件(TCE)，其中該TCE之第一表面適合於接收含有樣品之基板，及經定位以量測基板內樣品之溫度且提供反饋至TCE以將樣品設定或維持在所需溫度的熱感應器，該熱循環器與生物晶片基板之接觸表面熱連通。

在第三態樣中，本發明提供包含生物晶片之系統，該生物晶片包含一或多個反應室，其中各反應室包含具有一定體積的該生物晶片之一部分，其另外包含微流體入口通道及微流體出口通道，其中各反應室距離生物晶片基板之接觸表面小於100 μm；及熱循環器，其包含溫度控制元件(TCE)，其中該TCE之第一表面適合於接收含有樣品之基板，及經定位以量測基板內樣品之溫度且提供反饋至TCE以將樣品設定或維持在所需溫度的熱感應器，該熱循環器與生物晶片基板之接觸表面熱連通。

在第四態樣中，本發明提供用以同時擴增核酸溶液中之多個基因座的方法，其包含提供一或多個反應室，其中各反應室包含(i)包含待擴增之至少一種目標核酸的至少一個複本之核酸溶液；(ii)一或多種緩衝液；(iii)一或多種鹽； (iv)對應於待擴增之多個基因座的每一者之引子組；(v)核酸聚合酶及(vi)核苷酸；在約4-150℃/秒鐘之加熱及冷卻速率下，依次使各反應室內之核酸溶液的溫度在變性狀態、黏合(annealing)狀態與擴展狀態之間熱循環預定週期數，以在約97分鐘或更短時間內在各反應室中得到多個經擴增之基因座。

在第五態樣中，本發明提供用以同時擴增核酸溶液中之多個基因座的方法，其包含提供一或多個反應室，其中各反應室包含(i)包含待擴增之至少一種目標核酸的至少一個複本之核酸溶液；(ii)一或多種緩衝液；(iii)一或多種鹽；(iv)對應於待擴增之多個基因座的每一者之引子組；(v)核酸聚合酶及(vi)核苷酸；在約4-150℃/秒鐘之加熱及冷卻速率下，依次使各反應室內之核酸溶液的溫度熱循環預定週期數，以在約97分鐘或更短時間內在各反應室中得到多個經擴增之基因座。

在第六態樣中，本發明提供用以同時擴增核酸溶液中之5個或5個以上基因座的方法，其包含提供一或多個反應室，其中各反應室包含(i)包含待擴增之至少一種目標核酸的至少一個複本之核酸溶液；(ii)一或多種緩衝液；(iii)一或多種鹽；(iv)對應於待擴增之5個或5個以上基因座的引子組；(v)核酸聚合酶及(vi)核苷酸；在約4-150℃/秒鐘之加熱及冷卻速率下，依次使各反應室內之核酸溶液的溫度在變性狀態、黏合狀態與擴展狀態之間熱循環預定週期數，以在各反應室中得到5個或5個以上經擴增之基因座。

在第七態樣中，本發明提供整合生物晶片系統，其包含生物晶片，該生物晶片包含至少兩個微流體連通之反應室，其中第一反應室與熱循環器熱連通，該熱循環器包含溫度控制元件(TCE)，其中TCE之第一表面適合於接收含有樣品之基板，及經定位以量測基板內樣品之溫度且提供反饋至TCE以將樣品設定或維持在所需溫度的熱感應器，其中生物晶片之接觸表面與熱循環器之第一表面熱連通；及與第一反應室流體連接且適合於核酸提取、核酸純化、PCR前核酸清除、PCR後清除、定序前清除、定序、定序後清除、核酸分離、核酸偵測、逆轉錄、逆轉錄前清除、逆轉錄後清除、核酸接合、核酸雜交或定量的第二反應室，其中第一反應室距離生物晶片之接觸表面小於200 μm。

自以下某些較佳實施例及申請專利範圍之更詳細描述，本發明之特定較佳實施例將變得顯而易見。

為實現快速多重核酸擴增，諸如PCR，本發明提供可用於擴增目標核酸樣品內之多個基因座的熱循環儀器、反應容器及反應條件。如本文中提供之實例所說明，可在微流體生物晶片中使用本發明之熱循環器及本文所述之方法進行本發明之快速熱循環方法。

本發明提供之方法能夠在除使用本文所述之生物晶片及熱循環器之彼等應用以外的應用中快速多重擴增。例如，尤其預期在習知熱循環器(例如模塊基熱循環器及Roche LightCycler^TM )中使用薄壁管及使用除溫度循環PCR(例如 等溫PCR或滾圓擴增)以外之擴增方法。

本發明提供之方法、生物晶片及熱循環器能夠在100分鐘內擴增以至少0.006 ng含有目標核酸基因座之人類染色體組DNA(單核人類細胞中DNA之近似量)之量存在的給定核酸溶液中之多個基因座。在其他實施例中，在小於90分鐘、小於80分鐘、小於70分鐘、小於60分鐘、小於50分鐘、小於40分鐘、小於30分鐘、小於20分鐘、小於17.7分鐘、小於15分鐘、小於10分鐘或小於5分鐘內進行擴增。

在其他實施例中，可由目標核酸基因座之至少一個複本起始來擴增源自細菌、病毒、真菌、動物或植物之基因組的多個基因座。例如，在多重擴增反應之前，待分析樣品可包含目標核酸之小於1000個複本、小於400個複本、小於200個複本、小於100個複本、小於50個複本、小於30個複本、小於10個複本或至少1個複本。另外，若基因組之一個以上複本中存在目標核酸基因座，則可使用DNA之不足單一基因組等效物進行擴增。通常，可在樣品之每一目標核酸內根據本文所述之方法同時擴增至少兩個基因座且至多約250個基因座。另外，可在多個目標核酸中根據本文所述之方法同時擴增至少兩個基因座且至多約250個基因座。

本文中所用之目標核酸可為任意核酸，例如人類核酸、細菌核酸或病毒核酸。目標核酸樣品可為例如來自一或多種細胞、組織或體液(諸如血液、尿液、精液、淋巴液、腦脊髓液或羊水)或其他生物樣品(諸如組織培養細胞、口 腔拭子、漱口劑、糞便、組織切片、活組織檢查吸出物及諸如骨或乾化組織之考古學樣品)之核酸樣品。目標核酸可為例如DNA、RNA或RNA逆轉錄之DNA產物。目標樣品可源自任何來源，包括(但不限於)真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚、哺乳動物、人類、非人類、細菌、微生物、病毒、生物來源、血清、血漿、血液、尿液、精液、淋巴液、腦脊髓液、羊水、生物檢體、針吸取之生物檢體、癌、腫瘤、組織、細胞、細胞溶解物、粗細胞溶解物、組織溶解物、組織培養細胞、口腔拭子、漱口劑、糞便、乾化組織、法醫學來源、屍檢體、考古學來源、感染、醫院感染、生產來源、藥物製劑、生物分子生產、蛋白製劑、脂質製劑、碳水化合物製劑、無生命物體、空氣、土壤、汁液、金屬、化石、挖掘材料及/或其他地球上或地球外之材料及來源。樣品亦可含有一種來源或不同來源之材料的混合物。例如，當使用所揭示之方法來擴增該等受感染細胞或組織之核酸時，感染細菌或病毒之核酸可與人類核酸一起擴增。適用目標樣品之類型包括真核生物樣品、植物樣品、動物樣品、脊椎動物樣品、魚樣品、哺乳動物樣品、人類樣品、非人類樣品、細菌樣品、微生物樣品、病毒樣品、生物樣品、血清樣品、血漿樣品、血液樣品、尿液樣品、精液樣品、淋巴液樣品、腦脊髓液樣品、羊水樣品、生物檢體樣品、針吸取之生物檢體樣品、癌樣品、腫瘤樣品、組織樣品、細胞樣品、細胞溶解物樣品、粗細胞溶解物樣品、組織溶解物樣品、組織培養細胞 樣品、口腔拭子樣品、漱口劑樣品、糞便樣品、乾化組織樣品、屍檢樣品、考古學樣品、感染樣品、醫院感染樣品、生產樣品、藥物製劑樣品、生物分子生產樣品、蛋白製劑樣品、脂質製劑樣品、碳水化合物製劑樣品、無生命物體樣品、空氣樣品、土壤樣品、汁液樣品、金屬樣品、化石樣品、挖掘材料樣品及/或其他地球上或地球外樣品。法醫學樣品之類型包括血液、乾血、血跡、口腔拭子、指紋、接觸樣品(例如留在玻璃杯唇緣、棒球帽內緣或香煙頭上之上皮細胞)、口香糖、胃內含物、唾液、指甲碎片、土壤、性侵害樣品、毛髮、骨、皮膚及固體組織。環境樣品之類型包括未過濾及過濾之空氣及水、土壤、表面之拭子樣品、包膜及粉末。

例如，本文之方法可提供經擴增之核酸樣品，其分析得到適於法醫學解釋之資料，及特定言之滿足法醫學解釋準則之資料。該等準則包括信號強度、基因座內峰高平衡、雜合峰高比率(PHR)、不完全非模板核苷酸添加(NTA)及影子帶(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,Short Tandem Repeat(STR)Interpretation Guidelines. Forensic Science Communications,2000,2(3))。

如本文中所用之短語"流體連通"係指兩個含有流體之腔室或其他組件或區域連接在一起以便流體可在該兩個腔室、組件或區域之間流動。因此，"流體連通"之兩個腔室可(例如)經該兩個腔室之間的微流體通道連接在一起，以使得流體可在兩個腔室之間自由流動。該等微流體通道可 視情況包括一或多個閥門，其可閉合或阻塞以阻斷及/或另外控制腔室之間的流體連通。

如本文中所用之術語"聚(甲基丙烯酸甲酯)"或"PMMA"意謂甲基丙烯酸甲酯之合成聚合物，其包括(但不限於)彼等以商標Plexiglas^TM 、Limacryl^TM 、R-Cast^TM 、Perspex^TM 、Plazcryl^TM 、Acrylex^TM 、ACrylite^TM 、ACrylplast^TM 、Altuglas^TM 、Polycast^TM 及Lucite^TM 銷售者，以及描述於美國專利第5,561,208號、第5,462,995號及第5,334,424號中之彼等聚合物，其各自據此以引用的方式併入本文中。

如本文中所用之術語"聚碳酸酯"意謂碳酸與二醇或二價酚之聚酯。該等二醇或二價酚之實例為對伸二甲苯基二醇、2,2-雙(4-氧基苯基)丙烷、雙(4-氧基苯基)甲烷、1,1-雙(4-氧基苯基)乙烷、1,1-雙(氧基苯基)丁烷、1,1-雙(氧基苯基)環己烷、2,2-雙(氧基苯基)丁烷及其混合物，包括(但不限於)彼等以商標Calibre^TM 、Makrolon^TM 、Panlite^TM 、Makroclear^TM 、Cyrolon^TM 、Lexan^TM 及Tuffak^TM 銷售者。

如本文中所用之術語"核酸"意欲包含單股及雙股DNA及RNA，以及任何及所有形式之含有修飾鹼基、糖及骨架的替代核酸。因此，應理解術語"核酸"包括(但不限於)單股或雙股DNA或RNA(及其可為部分單股或部分雙股之形式)、cDNA、適體、肽核酸("PNA")、2'-5' DNA(具有縮短之骨架的合成物質，該骨架具有與DNA之A構形匹配的鹼基間距；2'-5' DNA通常不與B形式之DNA雜交，但其易於 與RNA雜交)及鎖核酸("LNA")。核酸類似物包括具有鹼基對特性之類似或改良結合、雜交的天然核苷酸之已知類似物。此項技術中熟知嘌呤及嘧啶之"類似"形式且包括(但不限於)氮丙啶基胞嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、肌苷、N⁶ -異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶ -甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸及2,6-二胺基嘌呤。本發明提供之DNA骨架類似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、胺基磷酸酯、烷基磷酸三酯、胺基磺酸酯、3'-硫縮醛、亞甲基(甲基亞胺基)、3'-N-胺基甲酸酯、嗎啉胺基甲酸酯及肽核酸(PNA)、膦酸甲酯鍵聯或替代膦酸甲酯及磷酸二酯鍵聯(Strauss-Soukup,1997,Biochemistry 36：8692-8698)及膦酸苄酯鍵聯，如US 6,664,057中所論述；亦參見OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES,A PRACTICAL APPROACH，由F.Eckstein編，IRL Press at Oxford University Press(1991)；Antisense Strategies , Annals of the New York Academy of Sciences，第600卷，Baserga及Denhardt編(NYAS 1992)；Milligan,1993,J.Med.Chem. 36：1923-1937；Antisense Research and Applications(1993,CRC Press)。本文之核酸可自細胞提取或根據熟習此項技術者已知之任何方式而合成製備；例如可在其他來源中自cDNA或mRNA經化學合成或轉錄或逆轉錄核酸。

如本文中所用之術語"通孔"意謂固體材料中形成之穿通孔以允許材料之頂部與底部表面之間流體連接。

如本文中所用之術語"基因座"意謂如本文中所定義之一或多個核酸(例如一或多個染色體)上之一或多個特定位置。

如本文中所用之術語"STR基因座"意謂由位於目標核酸之給定基因座的重複模式之兩種或兩種以上核苷酸所組成的核苷酸序列。重複模式之長度範圍可為2至10個鹼基對(bp)且其通常位於非編碼內含子區域中。

根據本發明之一態樣，提供一種具有快速、可控制且可再現地加熱及冷卻反應溶液之能力的熱循環器。本發明熱循環器之實施例的實例展示於圖1A 中。快速加熱及冷卻反應溶液溫度之能力使得可最小化勻變及穩定時間，且使得所需溫度下之培育時間可支配總階躍時間，從而能夠實現多重循環時間之最小化。

可藉由單獨或與散熱片流體連通使用溫度控制元件(TCE)實現高加熱及冷卻速率。TCE包含加熱及冷卻構 件、熱感應器、自熱感應器接收信號之控制器及電源。在一較佳實施例中，TCE之第一表面可適合於接收含有溶液之樣品室及含有另一熱感應器之感應室。在此配置中，熱感應器經定位於安裝至TCE之感應室內，以便其模擬樣品室內之條件。製造該感應室以使其具有與樣品室相同材料之層疊。安裝在溫度感應器內之熱電偶在與樣品室內之樣品類似的位置嵌埋於該結構中。該感應器報導樣品室內溶液之有效溫度。市售T型或K型熱電偶(來自Omega Engineering,Stamford,CT)最為適用，但亦可使用其他類型之熱電偶及熱感應器，包括熱敏電阻、半導體及紅外。感應室內之熱感應器提供反饋至TCE以將樣品設定或維持在所需溫度。以此方式，可在不將熱感應器插入反應室本身內之情況下間接量測及控制樣品溫度。或者，可將熱感應器直接置於反應室中且用以設定及維持樣品溫度，消除感應室之必要性。如熟習此項技術者將瞭解，可根據本發明之教示使用其他類型之感應器，諸如壓力感應器。

藉由(例如)在用以接受基板(例如下文之生物晶片)之第一表面中形成凹座，TCE之第一表面可適合於接受基本上平坦之基板。或者，TCE可適合於接受一或多個薄壁管，其經定義為具有小於200 μm厚之區域的壁直徑之管。較佳地，散熱片為高效率散熱片，諸如(但不限於)具有銅基部及冷卻翼之扇冷卻散熱片。更佳地，散熱片可為具有約0.4℃/W或更低之熱阻的扇冷卻銅基部及翼。高效率散熱片之特定及非限制性實例為E1U-N7BCC-03-GP (Coolermaster,Taiwan ROC)。

本發明之熱循環器可另外包含經定位以監控TCE之第一表面溫度的熱感應器。可視需要添加另一熱感應器以實現對樣品溫度控制之進一步改良。可監控之補充溫度包括基板上及基板內之多個區域、散熱片上及散熱片內之多個區域、冷卻空氣輸入及輸出、樣品輸入及輸出及周圍的彼等溫度。

TCE與散熱片之間需要良好的熱連通。當適當地製備兩個配合面時，直接物理接觸足以在兩個組件之間提供充分傳熱。可使用TCE與散熱片之間的熱界面材料(TIM)來增強熱耦接。該等TIM包括(但不限於)黏著劑、潤滑脂、相變材料(PCM)、金屬熱界面材料、陶瓷熱界面材料、軟金屬合金、銦、氧化鋁奈米層塗層、亞微米薄膜、二醇、水、油、防凍劑、環氧化合物及其他。特定實例包括Arctic Silver或Ceramique(Arctic Silver,Visalia,CA；具有<0.007℃-in² /W之熱阻的化合物)、可壓縮加熱彈簧HSD4(Indium Corp,Utica,NY)、HITHERM(GrafTech International Holdings Inc.,Lakewood,OH)或將TCE直接黏結至散熱片表面。可藉由以大於2 psi或大於5 psi或大於10 psi或大於30 psi或大於60 psi或大於100 psi或大於200 psi之平均力物理性地將各組件夾持在一起或藉由直接黏結表面來進一步增強熱接觸。

關於模塊熱循環器，諸如Eppendorf Mastercycler^TM ep梯度S熱循環器(其經由具有高導熱率及低比熱容之銀模塊提 供熱能)，TCE與與其接觸之基板之間的傳熱可藉由將基板直接置於TCE上而增加。合適之TCE包括(但不限於)高加熱及冷卻容量熱泵及大功率輸出Peltier裝置；Peltier裝置之實例為9500/131/150B(Ferrotec,Bedford NH)、XLT2393(Marlow,Dallas TX)。當用作本發明熱循環器之TCE的一部分時，Peltier裝置有利地藉由H橋接器供電。H橋接器裝置之實例為5R7-001(Oven Industries)。

當Peltier裝置用作本發明熱循環器之TCE的一部分時，有利的係藉由具有用於加熱及冷卻之脈寬調製之H橋接器向Peltier裝置供電。來自量測樣品溫度之熱感應器的溫度反饋驅動TCE以設定且維持所需樣品溫度。用於控制TCE之閉環溫度控制演算法包括(但不限於)PID控制及模糊邏輯控制。

該等熱控制器包含一種提供自一種目標溫度狀態快速過渡至另一目標溫度狀態之能力的控制演算法。此過渡可分成3個不同階段。在第1階段，實際溫度與目標溫度之間存在大的差異(例如1至20℃或更高)。在此階段中，勻變發生在TCE裝置之最大速率時或其附近。在第2階段，過渡階段，實際溫度與目標溫度較接近(小於約1至20℃)。在此情況下，控制器必須降低TCE之電力以防止超過溶液溫度且允許以最小偏差及振盪快速達成目標溫度。在第3階段，已達成目標溫度且控制器節制熱循環器之電力以將溶液維持在目標溫度附近之窄範圍內。以感應器量測溫度提供對實際溫度之更精確反饋且亦使得TCE表面溫度之溫度可過 度驅動。以上3個階段之每一者可進一步再分成多個子階段以提供更快速之反應時間、更精確之溫度控制、增加之穩定性及對外部變化增加之耐受性。

在一實例中，可藉由將薄熱電偶置於基板表面之通道中來量測基板之溫度。在另一實例中，可將第二熱感應器收納於外殼中，該外殼基本上由與所用基板相同之材料形成，其將第二熱感應器基本上固持在距TCE與基板上與TCE接觸之反應室相同之距離處。該第二熱感應器通常可與基板分離(亦即獨立感應器)且可緊接基板置於TCE之第一表面上。

散熱片可視情況另外包含變速冷卻扇及/或用於控制散熱片溫度之第二加熱元件，其中散熱片之每一額外元件均與第二控制元件連通。此使得可調節散熱片之冷卻效率，尤其保持散熱片溫度基本上恆定且與環境溫度變化無關。加熱器亦可將散熱片預調節至基本上運作溫度。

為促進基板中反應溶液與TCE之熱耦接，可藉由對基板施力以在熱循環器運作時將其固定至TCE來提供基板之接觸表面與TCE之第一表面的均勻熱連通。較佳地，藉由僅暫時將基板固持至TCE之第一表面且在熱循環完成後可易於移除之構件來施加該等力。例如，晶片壓縮元件(CCE)可位於TCE之第一表面上以使得可將基板置於其間。隨後可將晶片壓縮元件嚙合以在熱循環器運作期間將基板固持在適當位置，且經釋放以使得可移除基板。CCE、TCE與散熱片之適當整合使得CCE可改良該等組件之兩者之間及 所有三者之間的熱耦接。

CCE與基板接觸之部分可由包括(但不限於)例如WF71 Rohcell發泡體(Inspec foams,Magnolia,AR)之發泡體的低熱質量絕緣材料而形成。對於本文中論述之實施例而言，Rohacell係較佳的。其具有1.4-1.6(J/gK)[或更低熱質量]之比熱容及0.0345 W/mK(或更低)之熱導率。

生物晶片壓縮元件包括(但不限於)一或多個夾持器、彈簧、可壓縮發泡體或壓縮空氣氣囊，其可膨脹以提供力而將基板固持在TCE之第一表面上。較佳地，晶片壓縮元件向基板表面提供約5至約250 psia的大體上均勻之力，且更佳為約20至約50 psia以將基板固持至TCE之第一表面。值得注意地，可在不存在諸如熱油脂或二醇之熱耦接溶液的情況下提供生物晶片基板之接觸表面與TCE之間的熱連通，儘管可視需要使用該等熱耦接溶液。

生物晶片壓縮元件在生物晶片-熱電冷卻器-散熱片上提供力。此力用以確保生物晶片與TCE上表面之間的良好熱接觸且因此確保傳熱。

在一實施例中，低熱質量絕緣體為空氣氣囊，且其用以提供低熱質量及絕緣特性。在另一實施例中，低熱質量絕緣體為發泡體襯墊。可藉由氣壓缸或受壓縮或來自空氣氣囊之氣壓的閉孔發泡體襯墊將夾持力施加至發泡體襯墊。在後者情況中，空氣氣囊提供絕緣及壓縮力。

如上所述，熱循環器在TCE表面之第一表面可具有約4-150℃/秒鐘，且較佳約8-150℃/秒鐘，且更佳約10-150℃/ 秒鐘之加熱及/或冷卻速率。熱循環器亦可在與TCE之第一表面均勻熱連通的基板之反應室內的溶液中具有約4-150℃/秒鐘且較佳約8-150℃/秒鐘，且更佳約10-150℃/秒鐘之加熱或冷卻速率。另外，本發明之熱循環器可具有+/-1.0℃、且較佳+/-0.50℃且更佳+/-0.25℃之溫度穩定性。

生物晶片

為說明起見，在圖1B 中展示根據本發明之另一態樣的生物晶片(亦即用於本發明之熱循環器的基板)之實施例，其具有16個微流體系統，各自包含與生物晶片內所形成之各反應室流體連通的入口及出口。然而，本揭示案並不意欲限制，相反地熟習此項技術者將易於認識到生物晶片可含有替代數目之微流體系統(下文)，包括具有一個系統之生物晶片及具有兩個或兩個以上系統之生物晶片。如本文中所用之術語"多個"意謂兩個或兩個以上、4個或4個以上、8個或8個以上、16個或16個以上、32個或32個以上、48個或48個以上、64個或64個以上、96個或96個以上、128個或128個以上，2-16個、2-32個、2-48個、2-64個、2-96個、2-128個、8-128個、8-64個或8-32個微流體通道。

生物晶片可包含基板層及覆蓋層，其中將一或多個包含溝槽及/或成形凹陷之微流體系統的一部分圖案化於基板層中。可在覆蓋層中形成一系列通孔(亦即穿通孔及/或入口或出口)以提供流向微流體通道及反應室之流體通路，且其可位於生物晶片附近之任何位置。或者，可在基板層中形成通孔來代替覆蓋層以獲得相同功能性。可將基板層 之上表面與覆蓋層之下表面相黏結以完成微流體系統。Becker及Gartner(Becker,2000,Electrophoresis 21,12-26及Becker,2008,Electrophoresis 390,89)廣泛地回顧關於製造聚合物基微流體系統之技術，其據此以全文引用的方式併入本文中。可使用諸如不飽和、部分不飽和或飽和環烯烴共聚物"COC"，不飽和、部分不飽和或飽和環烯烴聚合物"COP"，聚甲基丙烯酸甲酯"PMMA"，聚碳酸酯"PC"，聚丙烯"PP"，聚乙烯"PE"，聚醚醚酮"PEEK"，聚(聚二甲基矽氧烷)"PDMA"，聚醯亞胺"PI"之物質來製造生物晶片。重要的係選擇具有大於擴增反應中所用之最大溫度的玻璃轉移溫度之塑料。可使用任何數目之該等方法及物質來製造本文所述之生物晶片。特定言之，可藉由例如COC或COP基聚合物(目前以商標Topas^TM 、Zeonex^TM 、Zeonor^TM 及Apel^TM 銷售)之塑料基板的射出成型來製備生物晶片。在此製造方法中，藉由加工且隨後表面拋光來製造由待形成特徵之負片組成的射出模及模插入物。模及插入物一起使得可製造基板層且使所形成之基板包含通道、反應室特徵及通孔。基板及覆蓋層可藉由施加熱及壓力而擴散結合。

或者，可藉由以待製造結構之負片的母模熱壓印薄的熱塑性薄膜來製備生物晶片。可藉由使用電鑄法製備母模以複製固體基板中製備之裝置。固體基板可為玻璃片，其經標準光微影及熟習此項技術者已知之化學蝕刻法圖案化。基板及覆蓋層係藉由施加熱及壓力而擴散結合。

生物晶片之基板及覆蓋層可由多種塑料基板來構建，該等塑料基板包括(但不限於)聚乙烯、聚(丙烯酸酯)(例如聚(甲基丙烯酸甲酯))、聚(碳酸酯)，及不飽和、部分不飽和或飽和環烯烴聚合物(COP)，或不飽和、部分不飽和或飽和環烯烴共聚物(COC)。本發明方法中所用之塑料基板及覆蓋層的厚度保持較薄以最小化其質量，以由此最大化在其使用期間熱循環器與各反應室中所含反應溶液之間的傳熱。塑料基板及覆蓋層可各自獨立地具有小於2 mm、小於1 mm、小於750 μm、小於650 μm、小於500 μm、小於400 μm、小於300 μm、小於200 μm或小於100 μm之厚度；或塑料基板及覆蓋層可各自獨立地包含具有25-2000 μm、25-1000 μm、25-750 μm、25-650 μm、25-500 μm、25-400 μm、25-300 μm、25-200 μm或25-100 μm範圍內之厚度的塑料。較佳地，基板及覆蓋層中之至少一者具有小於約200 μm之厚度以最大化對生物晶片之反應室中所含反應溶液的傳熱。更佳地，與TCE之第一表面接觸的生物晶片之接觸表面具有小於約200 μm之厚度。

各反應室可形成為具有例如小於100 μL之體積。較佳地，各反應室具有小於約50 μL或小於約40 μL或小於約30 μL或小於約25 μL或小於約20 μL或小於約15 μL或小於約10 μL或小於約5 μL或小於約1 μL或小於約0.1 μL之體積。或者，各反應室可形成為具有約0.1 μL至約100 μL範圍內之體積。較佳地，各反應室具有約0.1 μL至約10 μL或約10 μL至約50 μL範圍內之體積。反應室通常未經聚合物或矽 烷塗層塗佈。反應室可經設計為具有入口及出口通道。或者，單一通道可用作入口及出口。

本發明之生物晶片設計影響微流體之優點，包括具有高的表面與體積比且用以最大化傳熱之擴散時間減少，以及均勻之加熱及冷卻。使用微流體技術亦提供關於完全整合之法醫學分析儀器的優點。另外，基於所需應用之要求，測試且證明藉由擴散結合且在不使用黏著劑黏結各種層(例如COC層)之情況下所製造之生物晶片在失效之前能夠經受100至1500 psi之壓力。例如，本發明之生物晶片經受450 psi，此足以用於所需之熱循環應用。

應注意，本文中闡述之本發明的生物晶片之特定實施例實質上缺乏任何整合於生物晶片中用於加熱及/或冷卻反應室之加熱元件。例如藉由本發明之熱循環器，在外部提供生物晶片上反應室之熱循環。然而，可將加熱元件整合至本發明之生物晶片中。

在運作中，生物晶片之一部分可經由一或多個與生物晶片內所形成之一或多個反應室流體連通的入口來接收一或多種反應溶液，各反應溶液獨立地包含一或多種試劑(例如用於PCR)及/或核酸樣品。可藉由將各核酸樣品注射至獨立分離反應室中來進行多種樣品之同時擴增。用以將多種樣品同時注射至多個樣品或緩衝液孔之注射器可具備生物晶片以能夠實現同時多樣品之擴增。該等注射器(例如)將多種樣品中之一種樣品提供至多個反應室中之一個反應室。根據熟習此項技術者已知之任何方法，例如藉由電泳 輸送、經由將樣品連接至反應室之針或管或通道氣壓致動或液體致動，注射器可將樣品引入通道。

擴增(及視情況核酸萃取及定量)之後，可使擴增之核酸產物通過(例如至Genebench-FX^TM 100)一或多個與反應室流體連通的出口以分離片段及產生STR圖譜。

塑料製造之相對低成本使得本發明之生物晶片可為拋棄式的，消除再使用生物晶片所需之勞動力且基本上消除污染之可能性。單次使用之拋棄式物品尤其有利於低複本數分析之處在於不可能存在污染(除初始採樣以外)。在污染與勞動力均非主要考慮因素之情況下，可使用可重複使用之塑料及玻璃生物晶片。

整合法

使用微流體可使得特徵之製造於單一生物晶片上執行一種以上之功能。該等功能可包括核酸提取、核酸純化、PCR前核酸清除、PCR後清除、定序前清除、定序、定序後清除、核酸分離、核酸偵測、逆轉錄、逆轉錄前清除、逆轉錄後清除、核酸接合、核酸雜交及定量。該等功能中之兩者或兩者以上可以微流體連接以能夠連續處理樣品；此耦接稱為整合。

可藉由將純化介質插於輸入與輸出通道之間來實現一種形式之微流體DNA萃取。此純化介質可基於二氧化矽纖維，且使用離液(chaotropic)鹽試劑以溶解生物樣品、暴露DNA且將DNA結合至純化介質。接著溶解物經由輸入通道輸送穿過純化介質以結合DNA。結合之DNA藉由基於乙醇 之緩衝液洗滌以移除污染物。此可由洗滌試劑流經輸入通道穿過純化膜而完成。接著藉由使適當低鹽緩衝液(參見例如Boom之US 5,234,809)經由輸入通道流經純化膜且流出輸出通道而自純化膜溶離結合之DNA。

一種微流體形式之DNA定量方法係基於即時PCR。在此定量方法中，在輸入與輸出通道之間製造反應室。將反應室與熱循環器耦接，且將光激發及偵測系統與反應室耦接以使得可量測來自反應溶液之螢光。樣品中DNA之量與每個循環來自反應室之螢光的強度有關(參見例如Heid等人 ，Genome Research 1996,6,986-994)。

關於微流體形式之整合的其他資訊，參見與此同日申請之標題為"INTEGRATED NUCLEIC ACID ANALYSIS"的美國專利申請案(代理人案號第07-801-US號)，其據此以全文引用的方式併入本文中。關於微流體形式之分離及偵測的其他資訊，參見與此同日申請之標題為"Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms"的美國專利申請案(代理人案號第07-865-US號，其據此以全文引用的方式併入本文中)。

本發明之微流體驅動為在整合生物晶片之反應室內輸送流體之方式。藉由併入藉由連續向膜施加正壓及負壓輸送流體之隔膜泵來實現一種類型之微流體驅動。或者，可將正排量泵連接至微流體腔室之輸入端。泵之排量強制流體穿過微流體通道。

整合可利用微流體閥來閘控生物晶片內之流體流動。可 以被動或主動結構來實現閥控。被動閥控結構包括藉由使用毛細管壓力終止流體流動之毛細管閥。藉由施加足夠大以克服毛細管力之壓力，可使流體流經毛細管閥控結構。主動閥控結構包括在兩個通道之間的點使用可撓性或半剛性結構之膜片閥。對膜施加壓力使其封閉通道。對膜施加真空使其自通道上移，從而允許流體通過。

擴增方法

在另一態樣中，本發明提供經由快速聚合酶鏈反應(PCR)同時擴增一或多種目標核酸中之多個核酸基因座的方法。該等方法包含向一或多個反應室提供一或多種反應溶液，其中各反應溶液包含(i)至少一種目標核酸之至少一個複本，其中各目標核酸係相同或不同的，且各目標核酸獨立地包含多個待擴增之基因座；(ii)一或多種緩衝液；(iii)一或多種鹽；(iv)對應於待擴增之多個基因座的引子組；(v)核酸聚合酶及(vi)核苷酸。視需要，各反應溶液，例如各目標核酸可為相同或不同的以(例如)對同一核酸樣品運行多個同時分析或同時運行多個核酸樣品。

各反應室可含於如上所述本發明之生物晶片內或含於薄壁反應管內。薄壁反應管較佳具有小於約200 μm之壁厚度。較佳地，薄壁反應管較佳具有小於約100 μm之壁厚度。

PCR擴增之引子為經特定設計以雜交目標DNA之基因座的寡核苷酸序列。該等引子充當聚合酶擴展之起始點。為促進擴增片段之分析，標記引子亦可用於PCR反應。標記 引子為與可偵測部分偶接之寡核苷酸序列；其非限制性實例為螢光染料。當以螢光標記之引子進行PCR時，產生具有螢光標記物之擴增子。進行快速PCR之方法與標記及未標記之引子相容，且快速多重PCR已得以證明。

如上所述，引子組可為熟習此項技術者已知用於以目標核酸擴增多個基因座的任何引子組。例如，適用於擴增人類核酸樣品中之一或多個基因座的引子係描述於US 5,582,989；US 5,843,660；US 6,221,598；US 6,479,235；US 6,531,282及US 7,008,771；以及美國專利申請公開案第2003/0180724號、第2003/0186272號及第2004/0137504號中，其各自據此以引用的方式併入本文中。

另外，適用於擴增病毒核酸樣品中之一或多個基因座的引子係描述於例如US 7,312,036；US 6,958,210；US 6,849,407；US 6,790,952及US 6,472,155中，其各自據此以引用的方式併入本文中。

適用於擴增細菌核酸樣品中之一或多個基因座之引子的實例係描述於US7,326,779、US7,205,111、US7,074,599、US7,074,598、US6,664,080及US5,994,066中，其各自據此以引用的方式併入本文中。

鹽及緩衝液包括熟習此項技術者熟悉之彼等，包括彼等分別包含MgCl₂ 及Tris-HCl及KCl者。緩衝液可含有諸如界面活性劑(例如吐溫(Tween))、二甲亞碸(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)及聚乙二醇(PEG)以及其他為熟習此項 技術者所熟悉之添加劑。核苷酸通常為去氧核苷三磷酸，諸如去氧腺苷三磷酸(dATP)、去氧胞苷三磷酸(dCTP)、去氧鳥苷三磷酸(dGTP)及去氧胸苷三磷酸(dTTP)，其亦以足量添加至合成混合物中以用於擴增目標核酸。

可視情況將溶液加熱至且保持在適於核酸聚合酶之熱起始活化的第一溫度下歷時第一時間段。通常，第一時間段小於約90秒鐘。第一溫度可為約95至約99℃。可在60秒鐘或60秒鐘以下之時間內活化的具有熱起始機制之聚合酶包括彼等使用抗體介導之熱起始及適體介導之熱起始機制者。或者，本發明中無需使用熱起始聚合酶。

隨後，依次使反應溶液之溫度在變性狀態、黏合狀態及擴展狀態之間循環預定週期數。通常，將一或多種反應溶液以約1至約150℃/秒鐘、或約1至約100℃/秒鐘；或約1至約80℃/秒鐘；或約1至約60℃/秒鐘；或約1至約40℃/秒鐘；或約1至約30℃/秒鐘；或約1至約20℃/秒鐘；約4至約150℃/秒鐘、或約4至約100℃/秒鐘；或約4至約80℃/秒鐘；或約4至約60℃/秒鐘；或約4至約40℃/秒鐘；或約4至約30℃/秒鐘；或約4至約20℃/秒鐘；或約10至約150℃/秒鐘；或約10至約100℃/秒鐘；或約10至約80℃/秒鐘；或約10至約60℃/秒鐘；或約10至約40℃/秒鐘；或約10至約30℃/秒鐘；或約10至約20℃/秒鐘之第一冷卻速率自變性狀態冷卻至黏合狀態。可將一或多種反應溶液以約1至約150℃/秒鐘、或約1至約100℃/秒鐘；或約1至約80℃/秒鐘；或約1至約60℃/秒鐘；或約1至約40℃/秒鐘；約1至約 30℃/秒鐘；約1至約20℃/秒鐘；4至約150℃/秒鐘、或約4至約100℃/秒鐘；或約4至約80℃/秒鐘；或約4至約60℃/秒鐘；或約4至約40℃/秒鐘；約4至約30℃/秒鐘；約4至約20℃/秒鐘；或約10至約150℃/秒鐘；或約10至約100℃/秒鐘；或約10至約80℃/秒鐘；或約10至約60℃/秒鐘；或約10至約40℃/秒鐘；或約10至約30℃/秒鐘；或約10至約20℃/秒鐘之第一加熱速率自黏合狀態加熱至擴展狀態；及/或可將一或多種反應溶液以約1至約150℃/秒鐘或約1至約100℃/秒鐘；或約1至約80℃/秒鐘；或約1至約60℃/秒鐘；或約1至約40℃/秒鐘；約1至約30℃/秒鐘；約1至約20℃/秒鐘；約4至約150℃/秒鐘或約4至約100℃/秒鐘；或約4至約80℃/秒鐘；或約4至約60℃/秒鐘；或約4至約40℃/秒鐘；約4至約30℃/秒鐘；約4至約20℃/秒鐘；或約10至約150℃/秒鐘；或約10至約100℃/秒鐘；或約10至約80℃/秒鐘；或約10至約60℃/秒鐘；或約10至約40℃/秒鐘；或約10至約30℃/秒鐘；或約10至約20℃/秒鐘之第二加熱速率自擴展狀態加熱至變性狀態。最後，將反應溶液保持在最終狀態以提供一或多種經擴增之核酸產物。

變性狀態之範圍通常可包括約90至99℃，歷時約1至30秒鐘範圍內之時間。實際時間及溫度取決於酶、引子及目標。對於用以擴增人類染色體組DNA之Applied Biosystems(AB)多重7STR套組而言，約95℃歷時約5秒鐘係較佳的。

黏合溫度及時間影響結合至目標核酸內之特定基因座之 引子的特異性及效率且對於多重PCR反應而言係尤其重要的。黏合步驟期間整組引子對之準確結合可允許產生多個基因座之多重擴增，例如一或多個具有可接受之PHR及基因座內信號強度平衡的完整STR圖譜。對於給定引子對而言，黏合狀態可介於約50℃至70℃之範圍內及時間為約1至30秒鐘。實際時間及溫度取決於酶、引子及目標。對於用以擴增人類染色體組DNA之AB多重STR套組而言，約59℃歷時15秒鐘係較佳的。

擴展溫度及時間主要影響等位基因產物產率且為研究中之酶的固有特性。應注意，製造商所報導之擴展速率通常為單重反應而設；多重反應之擴展速率可能慢得多。對於給定酶而言，擴展狀態可介於約60至75℃之範圍內且時間為約1至30秒鐘。實際時間及溫度取決於酶、引子及目標。對於用以擴增人類染色體組DNA之AB多重STR套組而言，約72℃歷時約5秒鐘係較佳的。較佳地，為持續預定週期數，將反應溶液以約1至約150℃/秒鐘或約1至約100℃/秒鐘；或約1至約80℃/秒鐘；或約1至約60℃/秒鐘；或約1至約40℃/秒鐘；或約1至約30℃/秒鐘；或約1至約20℃/秒鐘；4至約150℃/秒鐘或約4至約100℃/秒鐘；或約4至約80℃/秒鐘；或約4至約60℃/秒鐘；或約4至約40℃/秒鐘；或約4至約30℃/秒鐘；或約4至約20℃/秒鐘；或約10至約150℃/秒鐘；或約10至約100℃/秒鐘；或約10至約80℃/秒鐘；或約10至約60℃/秒鐘；或約10至約40℃/秒鐘；或約10至約30℃/秒鐘；或約10至約20℃/秒鐘之第 三速率自擴展狀態加熱至變性狀態。通常，預定週期數經選擇為約10至約50個週期，儘管視需要可使用更少或更多個週期。

直至不完全NTA開始增加，最終擴展時間可顯著減少。對於給定酶而言，最終擴展溫度可介於約60至75℃之範圍內且時間為約0至300秒鐘。實際時間及溫度取決於酶、引子及目標。對於用以擴增人類染色體組DNA之AB多重STR套組而言，約72℃歷時約90秒鐘係較佳的。

除上文闡述之3步熱循環方法之外，該方法亦適合於2步熱循環方法。在此方法中，依次使反應溶液在變性狀態與黏合/擴展狀態之間循環預定週期數。該方法使用經設計以在擴展溫度下黏合之引子，使得黏合及擴展步驟共有相同溫度。降低數目之溫度過渡使得循環時間進一步降低。

在某些實施例中，可在約5至約20分鐘內獲得多種經擴增之核酸產物。在某些其他實施例中，可在約5至10分鐘、約1至5分鐘或小於5分鐘內獲得多種經擴增之核酸產物。可由小於約10 ng之目標核酸起始來產生各經擴增之核酸產物。較佳地，可由小於約5 ng或小於約2 ng核酸、或小於約1 ng核酸、或小於約0.5 ng核酸、或小於約0.2 ng核酸、或小於約0.1 ng核酸、或小於約0.05 ng核酸、或小於約0.006 ng核酸起始來產生經擴增之核酸產物。

在其他實施例中，諸如在臨床或環境樣品中鑑定生物武器藥劑或在人類、植物及動物中診斷細菌、病毒或真菌感染，可由目標核酸之至少一個複本起始來產生經擴增之核 酸產物。例如，多重擴增反應之前，待分析之樣品可包含目標核酸之小於1000個複本(例如1-1000個複本)、小於400個複本、小於200個複本、小於100個複本、小於50個複本、小於30個複本、小於10個複本或1個複本。

另外，若基因組中之一個以上複本中存在目標核酸基因座，則可使用DNA之不足單一基因組等效物來進行擴增。

如熟習此項技術者可易於確定，在任何前述方法中，熱循環可進行預定週期數以實現目標核酸中之基因座的充分擴增。例如，預定週期數可介於約10與約50個週期之間且較佳介於約20與50個週期之間的範圍內。另外，在任何前述方法中，可同時擴增一或多個核酸之至少2個基因座。視所需應用而定，同時擴增大於4個、5至10個、10至20個、20至30個或約10至250個基因座。例如，為擴增STR基因座，10-20個基因座可為較佳的。

較佳地，藉由本發明之熱循環器(前述)使反應溶液之溫度循環。儘管可能藉由將模塊溫度設定為高於加熱步驟之所需溶液溫度且將模塊溫度設定為低於冷卻步驟之所需溶液溫度，藉由補償PCR溶液之滯後反應而使用商業模塊熱循環器用於快速熱循環，但當補償遲緩勻變反應所需之溫度設定點必須憑經驗確定時，此運作模式在實施上較為繁瑣。此外，由於仍藉由模塊進行反饋及控制且不對溶液溫度進行監控，因此分布之可重複性及再現性可受包括室溫變化之外界因素的影響。因此，溶液之溫度分布不可再現。

使用此處描述之方法，許多市售聚合酶可適合用於快速PCR應用。通常，核酸聚合酶具有至少100個鹼基/秒鐘之擴展速率。可用於PCR擴增之大量聚合酶包括嗜熱水生菌(Thermus aquaticus ，Taq)、強烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus ，Pfu)、伍斯氏火球菌(Pyrococcus woesei ，Pwo)、黃色棲熱菌(Thermas flavus ，Tfl)、嗜熱棲桿菌(Themus thermophilus ，Tth)、(Thermus litoris ，Tli)及海棲熱袍菌(Thermotoga maritime ，Tma)。該等酶、該等酶之修飾形式及酶之組合可購自包括Roche、Invitrogen、Qiagen、Strategene及Applied Biosystems之供應商。代表性酶包括PHUSION(New England Biolabs,Ipswich,MA)、Hot MasterTaq^TM (Eppendorf)、PHUSION Mpx(Finnzymes)、PyroStart(Fermentas)、KOD(EMD Biosciences)、Z-Taq(TAKARA)及CS3AC/LA(KlenTaq,University City,MO)。用於STR分型檢測的PCR擴增之廣泛使用酶為Taq聚合酶，且TaqGold變體係以Identifiler^TM 、Profiler^TM 及COfiler^TM 套組來供應。

在某些實施例中，此處提供之PCR條件可以高效率自人類目標核酸產生完整STR圖譜，儘管並不要求產生完整圖譜。自體染色體STR之完整圖譜可包含諸如牙釉質蛋白(amelogenin)、D8S1179、D21S11、D7S820、CFS1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA或其多種之基因座。其他STR基因座包括小型STR及Y-STR分 析。優化方案之標準包括產生完整圖譜、信號強度、動態範圍、基因座內信號強度平衡、PHR、不完全NTA、影子帶及總循環時間。

根據一實施例，使用SpeedSTAR酶及本發明之熱循環器的方案可將生物晶片及管反應之總循環時間分別降低至17.3及19.1分鐘以產生完整STR圖譜。在該方案中，變性狀態為約98℃歷時約4秒鐘，黏合狀態為約59℃歷時約15秒鐘，擴展狀態為約72℃歷時約7秒鐘且最終狀態為約70℃歷時約90秒鐘。

在某些實施例中，至少10、20或30個多重PCR週期之總循環時間可介於約1分鐘至約90分鐘之範圍內。較佳地，至少10、20或30個多重PCR週期之總循環時間可介於約1分鐘至約90分鐘；或約1分鐘至約85分鐘；或約1分鐘至約80分鐘；或約1分鐘至約75分鐘；或約1分鐘至約70分鐘；或約1分鐘至約65分鐘；或約1分鐘至約60分鐘；或約1分鐘至約55分鐘；或約1分鐘至約50分鐘；或約1分鐘至約45分鐘；或約1分鐘至約40分鐘；或約1分鐘至約35分鐘；或約1分鐘至約30分鐘；或約1分鐘至約25分鐘；或約1分鐘至約20分鐘；或約1分鐘至約15分鐘；或約1分鐘至約10分鐘或約1分鐘至約5分鐘之範圍內。在其他實施例中，至少10、20或30個多重PCR週期之總循環時間係小於約90分鐘。較佳地，至少10、20或30個多重PCR週期之總循環時間係小於約89、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1分鐘。

本發明涵蓋一種包含一或多個微流體系統之整合生物晶片，其係用於進行核酸樣品以及至少一個其他樣品製劑內之多個基因座的多重PCR擴增，及/或同一生物晶片平台內之分析方法。例如，在生物晶片上之各微流體系統內(其各自具有入口至出口之流動方向)，該系統可包含多個反應室，其中該多個反應室之第一反應室與入口流體連通，且該多個反應室之最終反應室與出口流體連通，及至少一個微通道與各相鄰對之反應室沿流動方向流體連接。各微流體系統內之至少一個反應室可與生物晶片基板之接觸表面相距小於200 μm，以促進與本發明之熱循環器熱連通以用於在該反應室內進行多重PCR。

生物晶片之各微流體系統內的各剩餘反應室可適合於核酸提取、核酸純化、核酸雜交、核酸接合、PCR前核酸清除、PCR後清除、定序前清除、定序、定序後清除、分離及偵測、逆轉錄、逆轉錄前清除及/或逆轉錄後清除、電泳分離、核酸偵測。如本文中所用之術語"清除"意謂移除可干擾上文所列之任一反應室製程的反應組份(包括陰離子、陽離子、寡核苷酸、核苷酸、防腐劑、酶或抑制劑)。

以下實例說明本發明之特定實施例及其各種用途。其僅以說明性目的闡明，且不應視為限制本發明。

實例 實例1 常規熱循環器及微流體生物晶片

藉由使PCR反應溶液溫度快速、可控制且可重現地加熱及冷卻，使用如圖1A 中所示的本發明之熱循環器進行快速循環。此儀器接受16腔室微流體生物晶片且由安裝於高效率散熱片上之高輸出熱電冷卻器/加熱器組成。將16種PCR反應溶液之每一者置於微流體生物晶片之個別腔室中，藉由以夾持機制施加0.2 MPa之壓縮壓力使其與熱泵耦接。圖1B 展示16個樣品拋棄式塑料微流體生物晶片之照片。各PCR腔室為500 μm深及約1 mm寬，且容納7 μL之PCR反應溶液。

儀器及溫度分布

在以下實例中，以Eppendorf Mastercyler^TM ep梯度S(Eppendorf North America,Westbury,NY)進行所有管內之擴增反應。使用直接連接至模塊之127 μm直徑K型熱電偶感應器獲得上述儀器之模塊溫度分布。對於反應溶液分布而言，將127 μm直徑K型熱電偶感應器置於薄壁PCR管內之20 μL反應溶液中。以Omega HH506RA Multilogger溫度計組進行資料獲取以在100 Hz之速率獲取資料。

使用實例1之熱循環器，以16個樣品塑料生物晶片作為反應容器進行生物晶片中之擴增反應。藉由將熱電偶插入生物晶片內之感應室中來監控微流體生物晶片內之溶液溫度。

PCR反應混合組份及循環條件

以AmpFℓSTR® Profiler Plus® ID PCR擴增套組(Profiler Plus ID套組)(Applied Biosystems,Foster City,CA)，使用 9947A染色體組DNA(Promega,Madison,WI)作為模板進行多重PCR反應。用於擴增之聚合酶為Profiler Plus ID套組供應之AmpliTaq Gold® DNA聚合酶(TaqGold^TM )或其他聚合酶：SpeedSTAR HS DNA聚合酶(SpeedSTAR)(Takara BIO USA Inc.,Madison,WI)、KOD Hot Start DNA聚合酶(KOD)(EMD Biosciences Inc.,Gibbstown,NJ)或PyroStart^TM Fast PCR Master Mix(PyroStart)(Fermentas Inc.,Glen Burnie,MD)。使用來自Profiler Plus ID套組之標記多重引子組以及聚合酶特異性緩衝液及dNTP進行其他聚合酶之多重PCR。在0.2 mL薄壁PCR管(Eppendorf North America,Westbury,NY)中，使用Eppendorf Mastercyler^TM ep梯度S進行所有管PCR。在圖1A 之熱循環器中使用16個樣品生物晶片擴增所有生物晶片反應。

製備以下PCR反應混合物且用於熱循環：

標準TaqGold ^TM 反應：

標準TaqGold^TM 多重反應由25 μL反應體積中之9.55 μL Profiler Plus ID反應混合物、1 ng 9947A染色體組DNA、5 μL Profiler Plus ID引子組及2.25 U TaqGold^TM 組成。按照製造商推薦選擇循環條件(模塊溫度及時間)且設定為初始95℃歷時11 min(熱起始)，繼而為在94℃下1 min(變性)、在59℃下1 min(黏合)、在72℃下1 min(擴展)及在60℃下45 min之最終擴展的28個週期。

優化TaqGold ^TM 反應：

在含有3.82 μL Profiler Plus ID反應混合物、1 ng 9947A 染色體組DNA、2 μL Profiler Plus ID引子組及0.9 U TaqGold^TM 之10 μL反應體積中進行經優化以用於快速循環之TaqGold^TM 反應。將反應以在95℃下11 min、28個週期：在98℃下10 s；在59℃下45 s；在72℃下30 s及在72℃下15 min之最終擴展循環。

SpeedSTAR管反應：

用於管PCR之SpeedSTAR PCR混合組份為：10 μL反應體積中之2 μL Profiler Plus ID引子組、9947A染色體組DNA、1×快速緩衝液I(Takara BIO USA Inc.,Madison,WI)、200 μM dNTP及0.315 U SpeedSTAR。快速進行之循環條件經設定為：在95℃下1 min(酶活化)，繼而為在98℃下4 s、在59℃下15 s、在72℃下5 s及在72℃下1 min之最終擴展的28個週期。

SpeedSTAR生物晶片反應：

對於生物晶片PCR而言，7 μL反應混合物含有1.4 μL Profiler Plus ID引子組、9947A染色體組DNA、1×快速緩衝液I緩衝液、200 μM dNTP及0.42 U SpeedSTAR。循環參數經設定為在95℃下70 s，28個週期：在98℃下4 s、在59℃下15 s；在72℃下7 s及在70℃下1：30 min之最終擴展。

KOD反應：

以10 μL反應體積中之2 μL Profiler Plus ID引子組、1×KOD緩衝液(EMD Biosciences Inc.,Gibbstown,NJ)、200 μM dNTP、1 ng 9947A染色體組DNA、1.5 mM MgSO₄ 、 0.2 U KOD進行KOD擴增。循環條件為：在95℃下2 min，繼而為在98℃下4 s、在59℃下30 s、在72℃下10 s及在72℃下1 min之最終擴展的28個週期。

PyroStart反應：

具有1×最終濃度之PyroStart的反應混合物在10 μL反應中亦含有2 μL Profiler Plus ID引子組及1 ng 9947A染色體組DNA，且進行如下循環：在95℃下1 min及28個週期：在98℃下4 s；在59℃下20 s；在72℃下30 s，繼而為在72℃下1 min之最終擴展。

其他STR分型檢測套組之多重PCR：

以如上關於SpeedSTAR所述之反應條件，以Profiler Plus ID套組在管及生物晶片中測試SpeedSTAR以其他STR分型檢測套組(AmpFℓSTR® Identifiler®(Identifiler)、AmpFℓSTR® COfiler® PCR擴增套組(COfiler)(Applied Biosystems))產生完整STR圖譜之適用性。在該等反應中，Profiler Plus ID引子組由來自各套組之引子組置換。

再現性

以TaqGold^TM 及SpeedSTAR，使用1 ng 9947A染色體組DNA作為模板進行管及生物晶片中之再現性研究。對於管再現性而言，製備5種個別反應。在各自具有8個反應之3個生物晶片PCR運作中測定生物晶片再現性。

敏感性

使用以下量之9947A模板DNA進行SpeedSTAR擴增在管及生物晶片中之敏感性研究：管中：4 ng、2 ng、1.5 ng、 1 ng、0.5 ng、0.25 ng、0.125 ng、0.1 ng、0.05 ng、0.03 ng、0.02 ng、0.01 ng、0.006 ng；在生物晶片中：4 ng、2 ng、1.5 ng、1 ng、0.5 ng、0.25 ng、0.1 ng、0.05 ng、0.025 ng、0.02 ng、0.015 ng、0.01 ng、0.006 ng。一式兩份進行各模板水平之反應。

STR分離及偵測儀器

使用Network Biosystem Genebench-FX^TM 系列100(Pyzowski及Tan,Advances in Biochip-Based Analysis：A Rapid Field-Based Approach 59th Annual Meeting of the American Academy of Forensic Sciences(美國司法科學院第59界年會)San Antonio,TX,2007年2月19-24日)分離且偵測經擴增之產物。此儀器經開發且優化以特定用於STR分析。向2.7 μL各擴增產物中添加10.2 μL Hi-Di^TM 甲醯胺及0.1 μL Genescan 500 LIZ內部色帶標準(兩者均為Applied Biosystems,Foster City,CA)。在95℃下變性3 min且在冰上急速冷卻後，將樣品負載至分離晶片中且藉由施加350 V/cm電場歷時90秒鐘而以電泳方式移動至分離通道中。此後接著沿分離通道施加150 V/cm之電場以分離DNA片段。所有分離均在50℃下進行。

資料分析

以GeneMarker^® HID STR人類鑑定軟體第1.51版(SoftGenetics LLC,State College,PA)來分析資料。將信號強度正規化為內部色帶標準且測定影子帶、不完全NTA以及PHR之百分數。藉由基因座內之較低信號強度等位基因 除以較高信號強度等位基因來計算PHR。藉由模板片段(-A)之信號強度除以腺苷酸化片段(+A)之信號強度來計算不完全NTA之水平。

實例2 習知PCR管及微流體生物晶片中熱循環儀器及反應溶液之溫度分布

在薄壁PCR管中使用商業熱循環器且在微流體生物晶片中使用實例1之熱循環器來進行擴增反應。對於管反應而言，使用Eppendorf Mastercyler^TM 。圖2A 展示使用習知STR循環方案在管中中28個熱循環之一者的模塊及反應溶液之溫度。Mastercycler^TM 加熱及冷卻系統係基於具有用於管插入之整合模塊的熱泵。時間及溫度設定點為在98℃下1分鐘用於變性、在59℃下1分鐘用於黏合及在72℃下1分鐘用於擴展。加熱模塊與反應溶液之溫度分布的比較展示溶液溫度相對於模塊溫度之反應滯後。所量測之模塊的加熱及冷卻速率為5.6℃/秒鐘及4.9℃/秒鐘，且所量測之溶液的加熱及冷卻速率為4.8℃/秒鐘及3.3℃/秒鐘。模塊使得溫度在14鐘秒內自擴展(72℃)過渡至變性(98℃)，但溶液歷時39秒鐘並未達成設定點溫度。對於模塊及溶液而言，變性與黏合步驟(59℃)之間的過渡分別耗時10及27秒鐘且黏合與擴展步驟之間的過渡分別耗時7及24秒鐘。

將快速循環條件下28個熱循環之一者的Eppendorf Mastercyler^TM 模塊及反應溶液之溫度分布展示於圖2B 中。時間及溫度設定點為在98℃下5秒鐘用於變性、在59℃下 15秒鐘用於黏合及在72℃下5秒鐘用於擴展。然而，溶液之延遲及衰減反應防止其達成所需設定點溫度。

亦測定使用快速循環條件本發明之熱循環器的28個熱循環之一者的熱泵及反應溶液之溫度分布(圖3 )。為確定反應溶液溫度，使用生物晶片內之感應室。時間及溫度設定點為在95℃下4秒鐘用於變性、在59℃下15秒鐘用於黏合及在72℃下7秒鐘用於擴展。所量測之熱泵的加熱及冷卻速率為21.5℃/秒鐘及21.7℃/秒鐘且所量測之反應溶液的加熱及冷卻速率為14.8℃/秒鐘及15.4℃/秒鐘。

因此，本發明之熱循環器能夠以比商業模塊基循環器快3至5倍之速率加熱及冷卻反應溶液。熱泵之擴展、變性與黏合步驟之間的過渡時間為1.7、2.1及0.7秒鐘且溶液之擴展、變性與黏合步驟之間的過渡時間為2.7、4.5及2.2秒鐘。本發明之熱循環器允許反應溶液比模塊基循環器快約7倍達到所需溫度，在快速循環條件下產生確定且受控之培育溫度及時間。

實例3 評估管內之PCR酶

評估大量聚合酶用於快速多重STR分析之潛在用途，且部分基於熱起始活化時間及擴展速率來選擇候選物。將與TaqGold^TM 之推薦條件相比經選擇用於實驗評估之4種聚合酶的報導特性提供於表1(A)中。

評估酶具有約15-200個核苷酸/秒鐘範圍內之報導擴展速率；一般而言，報導擴展速率係基於單重擴增且對於多重應用而言可稍微較低。

最初研究該等4種酶之管內PCR條件，目標在於在最小時間內獲致完整STR圖譜。對於所有反應而言，使用來自Profiler Plus ID套組之引子對及供應商推薦之緩衝液及酶濃度來擴增1 ng人類染色體組DNA，且使用Genebench-FX^TM 系列100將所得圖譜分離、偵測、量尺寸且定量。測定變性、黏合及擴展步驟之各種時間及溫度以得到信號強度適於STR解釋對於SpeedSTAR而言19.13分鐘至對於TaqGold^TM 而言71.7分鐘範圍之PCR擴增總時間[表1(B)]。本發明之方法條件允許比對於TaqGold^TM 所推薦之條件快2-10倍來進行擴增。

酶之法醫學相關效能的進一步評估包括信號強度、影子帶水平及不完全NTA及PHR[表1(B)]。使用Profiler Plus ID引子，所有酶均能夠進行高度多重擴增。SpeedSTAR、Pyrostart、KOD及優化TaqGold^TM 反應之信號強度均大致相同或高於使用標準TaqGold^TM PCR條件產生之彼等信號 強度。

關於不完全NTA，SpeedSTAR與PyroStart以及優化TaqGold^TM 反應顯示比標準TaqGold^TM 反應高出多達3倍之水平。對於大多數等位基因而言，水平降至低於15%解釋臨限值。如下文所論述，彼等具有較高不完全NTA水平之等位基因可減少至低於15%解釋臨限值。KOD聚合酶具有3'-5'核酸外切酶活性且不產生具有A懸垂物之片段；因此，所有等位基因均比其等位基因梯對應物短1個核苷酸。

對於優化TaqGold^TM 、SpeedSTAR及PyroStart反應所觀測到之影子帶相對水平與標準TaqGold^TM 反應所產生之影子帶範圍類似；以KOD產生之影子帶範圍稍微高於標準TaqGold^TM 之影子帶。

實例4a 在管及生物晶片內使用SpeedSTAR聚合酶之快速PCR方案

基於以上提供之結果，選擇SpeedSTAR聚合酶以用於在生物晶片中進一步評估，目標在於最小化總循環時間及實現滿足信號強度、PHR、不完全NTA及影子帶解釋要求的完整STR圖譜。

使用SpeedSTAR在微流體16個樣品生物晶片中於本發明之熱循環器上擴增的時間及溫度設定點為在95℃下70秒鐘用於熱起始活化，繼而為28個週期：在95℃下4秒鐘用於變性、在59℃下15秒鐘用於黏合及在72℃下7秒鐘用於擴展。進行在72℃下90秒鐘之最終擴展，總方案時間為17.3 分鐘。在19.13分鐘內進行在Eppendorf Mastercycler中之管反應，其包含設定為初始活化時間為在95℃下1分鐘，28個週期：在98℃下4秒鐘、在59℃下15秒鐘及在72℃下5秒鐘，繼而為在72℃下1分鐘之最終擴展的模塊時間及溫度。

圖4A及4B 展示以前述SpeedSTAR循環條件在(圖4A )7 μL生物晶片及(圖4B )10 μL管反應中使用0.5 ng DNA所產生的STR圖譜，且表2提供使用標準方案來自SpeedSTAR生物晶片及管反應以及管內TaqGold^TM 的所有Profiler Plus ID等位基因之信號強度。0.5 ng SpeedSTAR生物晶片反應之信號強度比1 ng標準TaqGold^TM 反應平均高出約2倍，儘管0.5 ng SpeedSTAR管反應之信號強度與TaqGold^TM 反應之信號強度平均大致相同。

實例4b 管及生物晶片內使用SpeedSTAR聚合酶之快速PCR的等位基因表徵

為表徵來自實例4a之快速PCR反應的產物，進行PHR、不完全NTA及影子帶之定量。使用SpeedSTAR聚合酶之生 物晶片及管反應展示與TaqGold^TM 反應相比更多之基因座內峰高不平衡。生物晶片反應內產生之等位基因的PHR係介於0.70與0.95之間，且在管內大致相同；所有均符合可接受之解釋準則。使用SpeedSTAR之反應具有比對於標準TaqGold^TM 反應所測定之彼等低約10%之PHR。類似地，使用SpeedSTAR之生物晶片及管反應中之大多數等位基因的不完全NTA水平大致相同(2.0及10.6%)；兩者均比TaqGold^TM 對照反應高出約2倍。例外之處在於D3S1358等位基因之不完全NTA，其在具有SpeedSTAR時比具有TaqGold^TM 時高出4.8至7倍；甚至在此情況下，對於SpeedSTAR酶而言，不完全NTA之水平低於12%。最後，使用SpeedSTAR之生物晶片與管基反應中的影子帶水平係介於約6.0與14.1%之間，比標準TaqGold^TM 管反應平均高出約1.6倍。

使用0.5 ng模板DNA之微流體生物晶片反應產生比彼等使用1 ng模板之標準TaqGold^TM 反應的信號強度高出約2倍之信號強度。此結果表明生物晶片中之SpeedSTAR酶與習知反應中之TaqGold^TM 酶的作用效率類似；生物晶片中之DNA濃度為管中濃度之約1.8倍，此對應於信號強度增大2倍。相反，快速管基反應比對照TaqGold^TM 反應效率低；產物產率降低約40%可能為在將商業熱循環器用於快速熱循環時所產生之不良循環圖譜的結果。甚至在此情況下，信號強度完全高於解釋所需之水平且可藉由將每個週期之擴展時間增加數秒鐘而顯著增加(資料未展示)。生物晶片 及管中快速PCR反應之信號強度的可重複性及再現性與習知反應中之彼等類似。

快速生物晶片及管反應之基因座內等位基因信號強度展示與TaqGold^TM 反應相比較高程度之不平衡。基因座內信號強度平衡受包括引子濃度、黏合溫度及時間以及基因座分子量之多種因素影響。用於該等實驗之STR擴增套組具有一組對於TaqGold^TM 酶及推薦循環方案而言經優化之引子濃度。可藉由調節擴增反應中所用之引子濃度來改變基因座之信號強度(Henegariu等人 ，Biotechniques 1997,23,504-11)。

預期信號強度與用於快速生物晶片及管反應之模板水平之間的關係為信號強度通常隨模板而增加。所有等位基因在4 ng之高模板水平下(其產生信號強度大於12000 RFU之等位基因)均觀測到良好峰形態。在0.03 ng及0.03 ng以下之模板水平下，出現某些等位基因漏失。當以有限數目之模板DNA股在產生隨機擴增之溶液中進行擴增反應時，觀測到此效應(Walsh等人 ，PCR Methods Appl. 1992,1,241-250)。在0.006 ng之模板水平下，高信號強度等位基因及低信號強度等位基因的易於可偵側信號之存在證明與Genebench-FX^TM 系列100分離及偵測相關聯的快速生物晶片及管反應之高敏感性，證明此系統用於低複本數分析之效用。總而言之，此資料亦表明本發明之快速PCR方法及熱循環器及Genebench儀器具有高模板動態範圍。

實例4c 快速PCR反應中之DNA模板水平及等位基因特徵

圖5A及5B 中提供模板DNA對在(圖5A )生物晶片及(圖5B )管反應中使用SpeedSTAR聚合酶之快速PCR反應的信號強度之作用。經選擇用於分析之等位基因為牙釉質蛋白，在STR圖譜及FGA 23及24及D7S820 10及11中具有最高信號水平之等位基因，在圖譜中具有最低信號水平之等位基因。當SpeedSTAR生物晶片與管反應中之DNA模板水平自0.006 ng增加至4 ng時，所有等位基因之信號強度均增加。在0.006 ng之模板水平下，觀測到對於生物晶片而言111RFU之牙釉質蛋白峰信號強度及對於管反應而言58 RFU之牙釉質蛋白峰信號強度。在4 ng之模板水平下，對於生物晶片可見12680 RFU之信號強度且對於管反應可見5570 RFU之信號強度。兩種反應類型中所觀測之所有等位基因均展示良好峰形態。

對於快速生物晶片反應(圖6A )而言，對於0.05至4.0 ng範圍內之模板水平，PHR係在0.6與1.0之間。對於低於0.05 ng之模板水平，PHR降低直至0.025 ng，當出現等位基因漏失之情況，則觀測到零之PHR。對於快速管反應而言觀測到類似結果，儘管其通常顯示比生物晶片反應(圖6B )稍微較低之PHR。對於生物晶片反應而言，在2.0 ng及2.0 ng以下之模板水平下，不完全NTA之水平為15%或更低。對於管反應而言，不完全NTA水平在1 ng之模板水平下超過15%且顯著增加4 ng。

生物晶片與管反應之間的兩種主要差異為反應溶液之溫 度分布及模板與聚合酶之相對濃度。當更多聚合酶可用時，不完全NTA之水平降低。對於生物晶片反應而言，實驗資料展示在0.5-4.0 ng之DNA模板範圍內，當SpeedSTAR聚合酶之量自0.3 U增加至1.2 U時，不完全NTA之水平降低約50%(圖7A及7B )。快速生物晶片及管反應之影子帶水平相對恆定且對於所有等位基因而言在0.25-4.0 ng之模板水平範圍內通常小於15%(圖8A及8B )。

若反應本身產生滿足法醫學解釋準則之可控告資料，則STR擴增反應之速度僅係相關的。FBI具有用於STR解釋之通用準則，且個別實驗室設定在基於其驗證研究可認為圖譜可接受之前必須滿足之臨限值(Holt等人 ，J.Forensic Sci. 2002,47(1)，第66-96頁；LaFountain等人 ，J.Forensic Sci. ,2001,46(5),1191-8)。

本文中所提供之條件可產生滿足該等準則之快速STR圖譜。生物晶片及管反應中0.5 ng模板之PHR符合規定要求0.6或0.6以上之水平且與先前報導結果一致之解釋準則(Leclair等人 ，J.Forensic Sci. 2004,49,968-80)。對於較高DNA模板量而言，PHR保持相對恆定，但低於1 ng TaqGold^TM 反應之彼等PHR。對於低複本數而言，歸因於隨機波動而藉由擴增來控制PHR。

不完全NTA之水平係基於聚合酶使所有STR擴增子完全腺苷酸化之能力。對於習知擴增而言，此伴隨將"豬尾狀輸出端(pigtail)"連接至引子且增加最終擴展時間。本文所述之0.5 ng生物晶片及管反應的不完全NTA水平在解釋準 則之內。

不完全NTA之水平隨DNA模板增加而增加(DNA與聚合酶之比率增加的結果)且可藉由增加聚合酶之量、每個週期之擴展時間及最終擴展時間而降低。後兩種方法因增加反應時間而不完全適合於快速多重擴增。增加聚合酶濃度係有效的且與快速PCR相容。影子帶為在擴展期間DNA股滑移之結果(Walsh等人 ，Nucleic Acids Res. 1996,24(14),2807-12)。此處對於0.5 ng生物晶片及管反應所述之影子帶水平在解釋準則之內且亦符合先前引用之報導。如所預期，影子帶水平似乎與DNA模板水平無關。

實例4d 可重複性及再現性研究

藉由在3個PCR生物晶片中進行24個相同PCR反應且藉由進行5個相同管反應，評估使用SpeedSTAR聚合酶之快速生物晶片(表3A)及管(表3B)反應的可重複性及再現性。對於生物晶片反應而言，信號強度之置信值(CV)在17%至24%之範圍內且對於管反應而言在15%至34%之範圍內。標準TaqGold^TM 反應之CV在6%與21%之間。

與關於標準TaqGold^TM 反應所觀測之5%至10%範圍相比，PHR之CV對於生物晶片而言高達14%且對於管反應而言高達21%。生物晶片反應中不完全NTA之CV係在6%與28%之間變化且對於管反應而言係在2%至13%之間變化。又，該等變化類似於關於標準TaqGold^TM 反應所觀測之4%至28%的範圍。生物晶片中影子帶之CV為4%至9%，在管內為2%至6%且亦類似於關於標準TaqGold^TM 反應所觀測之4%-13%的範圍。

實例4e 與其他市售STR套組之相容性

使用上述相同快速生物晶片及管條件，使用來自COfiler^TM 及Identifiler^TM 套組之引子組評估一系列樣品。圖9A及9B 展示使用該等引子組，使用本發明之熱循環 器、SpeedSTAR酶及本文所述之方案實現完整圖譜。各自亦適合於該等市售套組。儘管實現完整圖譜，但仍觀測到基因座之信號強度的不平衡。

實例5 以熱循環器快速定序

熱循環儀器及方法亦可應用於快速DNA定序反應。在此快速熱循環器之實施例中，儀器及生物晶片與PCR所用之儀器及生物晶片相同。不同反應溶液、聚合酶及循環溫度適用於定序反應。目前市售之定序反應耗時49分鐘(對於GE Amersham DYEnamic^TM ET Terminato Cycle Sequencing Kit而言)及2.25小時(對於AB Big Dye V3.1而言)。使用NetBio熱循環器，以習知試劑使得定序反應時間可減少至21分鐘。

已使用本文中揭示之熱循環器及包含16個色帶之生物晶片實現快速定序。晶片之最終反應體積為7 μL。以來自GE Healthcare之DYEnamic^TM ET Terminator Cycle Sequencing Kit按照製造商之方案設定半強度定序反應。因此，按比例縮小所有體積以容納7 μL最終體積。反應模板為0.1 pmol具有343 bp片段尺寸之枯草芽孢桿菌(B.subtilus )。

證明3種循環方案，第一種方案由30個週期(在95℃下20 s、在50℃下15 s及在60℃下60 s)組成(總循環時間為51.7 min)，第二種方案由30個週期(在95℃下5 s、在50℃下15 s及在60℃下30 s)組成(總循環時間為29 min)且第三種方案由30個週期(在95℃下5 s、在50℃下10 s及在60℃下20 s) 組成(總循環時間21.6 min)。以乙醇沈澱清除各定序反應且在Genebench FX Series 100上分離。3種循環方案的用於定序343 bp PCR產物之平均PHRED計分分別為282、287及279；證明可在晶片中在小於22 min內實現343 bp產物之定序。圖10展示快速DNA定序方案之DNA序列。

一般而言，使用本文所述之系統及方法進行一或多種核酸之生物晶片基多重擴增具有關於在薄壁管中且使用目前商業化熱循環單元運作之反應而言，在顯著更短之總反應時間內提供經擴增之核酸產物的優勢。

圖1A為本發明之熱循環器的實施例之照片。

圖1B為展示用於圖1A所示熱循環器之16色帶微流體生物晶片之實施例的照片。

圖2A為展示本文所述之標準STR循環方案之一個熱循環(總循環時間：145.1分鐘)的模塊及反應溶液之溫度分布的圖表。

圖2B為展示本文所述之快速循環方案之一個熱循環(總循環時間：19.56分鐘)的模塊及反應溶液之溫度分布的圖表。

圖3為展示使用快速循環條件(總循環時間：17.3分鐘)之本發明熱循環器的一個熱循環之熱泵及反應溶液的溫度分布之圖表。

圖4A為展示根據本發明使用0.5 ng模板DNA之生物晶片反應中所產生之STR圖譜的圖表。

圖4B為展示根據本發明使用0.5 ng模板DNA之管反應中所產生之STR圖譜的圖表。

圖5A為展示生物晶片反應中之DNA模板水平對信號強度之作用的圖表。

圖5B為展示管反應中DNA模板水平對信號強度之作用的圖表。

圖6A為展示生物晶片反應中DNA模板水平對雜合峰高比率(PHR)之作用的圖表。

圖6B為展示管反應中DNA模板水平對PHR之作用的圖表。

圖7A為展示生物晶片反應中DNA模板水平對非模板核苷酸添加(NTA)之作用的圖表。

圖7B為展示管反應中DNA模板水平對NTA之作用的圖表。

圖8A為展示生物晶片反應中DNA模板水平對影子帶(stutter)之作用的圖表。

圖8B為展示管反應中DNA模板水平對影子帶之作用的圖表。

圖9A為展示使用1 ng模板DNA以COfiler^TM 引子組所產生之生物晶片(上圖)及管反應(下圖)圖譜的圖表。

圖9B為展示使用1 ng模板DNA以Identifiler^TM 引子組所產生之生物晶片(上圖)及管反應(下圖)圖譜的圖表。

圖10為展示如實例5中所述定序反應之實施例的圖譜之圖表。

Claims (29)

1. 一種用於同時擴增核酸溶液中之至少10個及至多250個基因座的方法，其包含：於包含於一或多個反應室中之單一溶液中，將包含待擴增之一或多種目標核酸模板的樣品與至少10個及至多250個不同的引子對接觸，各引子對雜交至所欲擴展之該至少10個及至多250個基因座中之一者，該溶液中進一步包含：(i)一或多種緩衝液；(ii)一或多種鹽；(iii)核酸聚合酶；及(iv)核苷酸；及在約4℃-150℃/秒鐘之加熱及冷卻速率下，且在擴展、變性與黏合步驟之間的過渡時間最小化下，依次使各反應室中該核酸溶液的溫度在變性狀態、黏合狀態與擴展狀態之間熱循環預定週期數，以在各反應室中得到至少10個及至多250個擴增之基因座。
2. 如請求項1之方法，其中該核酸溶液係存在於生物晶片中。
3. 如請求項1之方法，其中該核酸溶液係存在於薄壁管中。
4. 如請求項1之方法，其中在小於約97分鐘內產生該5個或5個以上擴增之基因座。
5. 如請求項1之方法，其中在小於約45分鐘內產生該等擴 增之基因座。
6. 如請求項1之方法，其進一步包含在該依次熱循環之前：將該一或多種反應溶液加熱至適於該等核酸聚合酶之熱起始活化的第一溫度；及將該一或多種反應溶液保持在該第一溫度，歷時適於該等核酸聚合酶之熱起始活化的第一時間段。
7. 如請求項6之方法，其中該第一時間段係小於約90秒鐘。
8. 如請求項6之方法，其中該第一溫度為約90℃至約99℃。
9. 如請求項6之方法，其中該熱循環係藉由熱循環器來提供，該熱循環器包含熱感應器及溫度控制元件(TCE)，藉此該熱感應器提供反饋至TCE以將該溶液設定或維持在所需溫度。
10. 如請求項5之方法，其中該核酸聚合酶具有至少100bp/秒鐘之擴展速率。
11. 如請求項5之方法，其中各反應室具有小於約100μL之體積。
12. 如請求項5之方法，其中各反應室係與熱循環器隔開小於約200μm。
13. 如請求項5之方法，其中各核酸溶液包含一種目標核酸之約1至約1000個複本。
14. 如請求項5之方法，其中該核酸聚合酶為SpeedSTAR、 PHUSION、Hot MasterTaq^TM 、PHUSION Mpx、PyroStart、KOD、Z-Taq或CS3AC/LA。
15. 如請求項5之方法，其中各擴增之核酸產物的分析滿足法醫學解釋準則。
16. 如請求項5之方法，其中該變性狀態為在約95℃歷時約4秒鐘。
17. 如請求項5之方法，其中該黏合狀態為在約59℃歷時約15秒鐘。
18. 如請求項5之方法，其中該擴展狀態為在約72℃歷時約7秒鐘。
19. 如請求項5之方法，其中該最終狀態為在約70℃歷時約90秒鐘。
20. 如請求項5之方法，其中該一或多種反應溶液以約10至約50℃/秒鐘之第一冷卻速率自變性狀態冷卻至黏合狀態。
21. 如請求項5之方法，其中該一或多種反應溶液以約10至約50℃/秒鐘之第一加熱速率自黏合狀態加熱至擴展狀態。
22. 如請求項5之方法，其中該一或多種反應溶液以約10至約50℃/秒鐘之第二加熱速率自擴展狀態加熱至變性狀態。
23. 如請求項5之方法，其中在約10至約90分鐘內獲得該一或多種擴增之核酸產物。
24. 如請求項5之方法，其中各反應溶液包含約0.005至約10 ng之目標核酸。
25. 如請求項5之方法，其中該目標核酸包含人類核酸、微生物核酸或病毒核酸。
26. 如請求項5之方法，其中同時擴增10至250個基因座。
27. 如請求項26之方法，其中該等基因座包含牙釉質蛋白(amelogenin)、D8S1179、D21S11、D7S820、CFS1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA或其多種。
28. 如請求項5之方法，其中該預定週期數係在約10與約50個週期之間。
29. 如請求項5之方法，其中一或多個薄壁反應管包含該一或多個反應室。