JP7104730B2 - 連続的な増幅反応のための方法および装置 - Google Patents
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Description
適用なし。
適用なし。
本発明は、一般に、1以上の核酸の存在についてサンプルを解析するための方法に関し、より具体的には、多段階の核酸増幅反応(特に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR))を行うための方法に関する。
核酸増幅は、研究、医薬および産業において使用される多くの技術のきわめて重大な構成要素である。このような反応は、臨床および生物学の研究、感染病の検出および監視、変異の検出、癌マーカーの検出、環境モニタリング、遺伝的同定、生体防御の用途における病原体の検出などにおいて使用される。例えば、非特許文献1;非特許文献2。特に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、ウイルスおよび細菌の検出、ウイルス量の監視、癌患者における最小残存性疾患、血液供給スクリーニングなどを含め、全てのこれらの領域における用途が見出されている。例えば、非特許文献3;非特許文献4。PCRに関し、このような広範囲にわたる用途の主たる理由は、その使用の速さと容易さ(代表的には、標準的なキットと比較的単純かつ低コストの機器を用いて、数時間以内で行われる)、その感度(しばしば、サンプル中の20~30コピーの標的配列が検出され得る)、およびその頑健性(法医学サンプルまたは固定組織サンプルのような質の悪いサンプルまたは保存サンプルが容易に解析される)である。非特許文献5。
本発明は、流体的に閉じた反応システムにおいて、反応混合物の充填、増幅、および使用済み反応混合物の除去の連続したサイクルにより、単一の反応チャンバー内で複数の増幅反応を行うための方法および装置を提供する。特に、本発明は、サンプルの異なる部分から異なる標的ポリヌクレオチドの連続的な増幅を行うことによって、単一のサンプルから複数の標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にする。
本明細書中で使用される、核酸化学、生化学、遺伝学および分子生物学の用語および記号は、以下のようなその分野の標準的な論文および教科書に従う:例えば、KornbergおよびBaker,DNA Replication,第2版(W.H.Freeman,New York,1992);Lehninger,Biochemistry.第2版(Worth Publishers,New York,1975);StrachanおよびRead,Human Molecular Genetics,第2版(Wiley-Liss,New York,1999);Eckstein編,Oligonucleotides and Analogs:A Practical Approach(Oxford University Press,New York,1991);Gait編,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory,1989);など。
本発明の実施は、そうでないと示されない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学(組換え技術を含む)、細胞生物学、生化学および分析機器の従来の技術および説明を採用し得、これらは、当業者の技術の範囲内である。このような従来の技術としては、蛍光の測定、光学シグナルの収集、機器の制御、データ解析、電子工学、機械工学、流体の取り扱いなどが挙げられる。適切な技術の特定の例示は、本明細書において、以下に、実施例を参照してなされ得る。しかし、当然のことながら、他の等価な従来の手順も使用され得る。このような従来の技術および説明は、Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I巻~第IV巻)、Using Antibodies:A Laboratory Manual、Cells:A Laboratory Manual、PCR Primer:A Laboratory ManualおよびMolecular Cloning:A Laboratory Manual(全て、Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ならびに以下に引用される他の専門書およびガイドのような標準的な研究室のマニュアルにおいて見出され得る。
一局面では、本発明の連続的な増幅反応は、同じサンプルからの異なる標的ポリヌクレオチドの複数の別個の増幅であり、これは、流体的に閉じた反応システムの同じ反応チャンバーにおいて行われる。本発明の特徴は、流体的に閉じた条件下で、単一のサンプルの部分を反応チャンバー内に計量して供給することである。一局面では、別個の増幅において使用されるサンプルの部分は、容量が等しくても、等しくなくてもよく、そして、使用される複数の部分は、全サンプルを含み得る(すなわち、サンプルのアリコートであり得る)か、または、サンプルの一部を含み得る(すなわち、サンプルのアリカント(aliquant)であり得る)。本発明のための個々の増幅反応をもたらすための慣用的な設計上の選択を行うことに関して、定義の節における引用により示されるような文献には、当業者を支援するための豊富なガイダンスが存在し、そして、この設計上の選択としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:(i)各段階のサイクル数または持続時間;(ii)増幅サイクルが自動制御下である場合、現在の反応を終結させ、そして、次の反応へと進行させることを決定するための所定のシグナルレベルの選択;(iii)連続した各反応に含められるサンプルの相対的な割り当て;(iv)各増幅反応において検出される標的ポリヌクレオチドの数および素性;(v)各増幅反応のためのプライマーの長さおよび配列;(vi)参照配列が各反応において増幅されるべきかどうか;(vii)各増幅反応において使用されるインジケーターのタイプ;(viii)例えば、2つの増幅反応:PCR-PCR、NASBA-NASBA、PCR-NASBAについて、同種の増幅反応が各段階において実行されるべきかどうか、など。通常、増幅反応は、連続したPCR反応または連続したNASBA反応のいずれかであり、そして、従来の反応条件下で行われる。通常、ある配列の増幅反応の各々において、同じインジケーターが使用される。
一局面では、本発明は、開ループ制御下、または、特定の反応パラメーターのリアルタイム測定に基づく閉ループ制御下のいずれかで、連続した増幅反応を自動的に終結および/または開始させるための方法を提供する。開ループ制御の実施形態では、増幅反応は、例えば、単純に反応混合物を反応チャンバーから取り除き、サンプルの有効な部分を適切な増幅試薬と混合して新しい反応混合物を形成し、この新しい反応混合物を反応チャンバー内に充填し、そして、時間の決まった温度のプログラムを選択して増幅反応を行うことによって、所定のサイクル数または所定の反応時間にわたり行われ、その後、反応が終結される。必要に応じて、現在の反応混合物が反応チャンバーから除去され、そして、廃液レザバへと移された後に、反応チャンバーをすすいで、チャンバー内に残存する微量の現在の反応混合物をさらに除去し得る。このようなすすぎは、洗浄溶液を洗浄溶液レザバから反応チャンバーへと移動させ、そして、その反応チャンバー内の洗浄溶液を廃液レザバへと移動させるか、または、廃液レザバへとすすぐ1以上のサイクルを行うことによって達成される。洗浄溶液は水であっても、先の増幅反応から残った物質により生成される擬似シグナルを低減させる目的で加えられる、界面活性剤、ヌクレアーゼなどのような他の試薬と混合された水であってもよい。
本発明の方法は、試薬を隔離し、試薬および反応生成物を反応の内外で移動させ、温度を制御し、そして、反応生成物を検出するための、異なるエンジニアリングアプローチに基づく種々のシステムおよび装置によって実行され得る。システムの選択は、多くの要因に依存し、これらの要因としては、サンプルもしくは検体の利用可能性、サンプルもしくは検体の形状、サンプルもしくは検体が有する危険性もしくは感染の程度、携帯性に対する希望、用いられる増幅反応の性質、どの程度多いサンプルをアッセイする必要があるかなどが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法を実行するために使用され得る例示的なシステムとしては、Christelら、米国特許第6,369,893号およびDority、米国特許第6,374,684号に開示されるような、マイクロプロセッサの制御下の回転弁およびピストン型流体ポンプを用いる流体的に閉じた反応システム;Schnipelskyら、米国特許第5,229,297号;およびFindlayら、Clin.Chem.,39:1927-1933(1993)に開示されるような、反応チャンバーおよび検出ステーションを通してサンプル、反応物および生成物を機械的に駆動するための柔軟な試薬レザバを持つ、閉じた使い捨てのキュベット;定義の節において引用した参考文献において開示され、さらに、Shojiら、Appl.Biochem.Biotechnol.,41:21-34(1993)およびJ.Micromech.Microeng.,4:157-171(1994);McCormickら、Anal.Chem.,69:2626-2630(1997);Chengら、Topics Curr.Chem.,194:215-231(1998);Staveら、米国特許第6,663,833号;Neriら、米国特許第5,714,380号;Northrupら、米国特許第5,589,136号などに開示されるような微小流体デバイスが挙げられる。このようなシステムは、反応物、サンプルおよび反応生成物を、レザバと反応チャンバーとの間で、制御された様式で流体的に移動させ得る。すなわち、このようなシステムは、直接的な様式の液体移動力(liquid-moving force)の下、液体溶液中で反応物、サンプル、反応生成物などを動かす。液体移動力としては、多様な種類のポンプまたは圧縮ガスレザバ、動電学的ポンプなどにより生成される差次的な圧力が挙げられる。
しばしば、例えば、患者の検体における標的遺伝子の測定した発現レベルが正常範囲内であるかどうかを決定することを試みる場合、異なるアッセイからの読出しを比較することが望ましい。特に、医療上の用途において、しばしば、患者のサンプルからのアッセイ結果を参照サンプルからのアッセイ結果と比較することが望まれる。このような比較は、標的ポリヌクレオチドに関連するシグナルの、同じサンプルからの参照配列もしくは内部標準に関連するシグナルの比を決定することによって容易になされる。このことは、標的ポリヌクレオチドについての値が、他のサンプルもしくは検体からの値に対して比較されることを可能にする。内部標準、そして特に、参照配列の使用および選択は、以下の参考文献(参考として援用される)に示されるように、当業者に周知である:Radonicら、Biochem.Biophys.Res.Comm.313:856-862(2004);Bustin,J.Mol.Endoccrinol.,29:23-39(2002);Hoorfarら、J.Clin.Microbiol.,42:1863-1868(2004)など。参照配列に関連するシグナルまたは値もまた、複数の参照配列から測定されたシグナルまたは値の関数(例えば、平均)であり得ることが理解される。
標的ポリヌクレオチドを含むサンプルまたは検体は、本発明での使用のための広範な種々の供給源(細胞培養物、動物もしくは植物の組織、患者の生検、環境的サンプルなどが挙げられる)に由来し得る。サンプルは、従来の技術(代表的には、サンプルまたは検体が取ってこられた供給源に依存する)を用いて本発明のアッセイのために調製される。
メチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)を検出するための、同じ反応チャンバー内での連続した増幅反応 この実施例において、MRSAについての標準的なPCRアッセイ(例えば、Warrenら、J.Clinical Microbiology,42:5578-5581(2004)を参照のこと、本明細書中に参考として援用される)を用いる2つの試験を行った。両方の試験は、Cepheid製のGENEXPERTTM増幅システム(米国特許第6,713,297号;同第6,403,037号;同第6,374,684号;同第6,369,893号を含め、種々の米国特許に開示される、これらの特許は本明細書中に参考として援用される)において行った。第一の試験において、一連の2つのPCRサイクルを、間にすすぎの工程を入れて、同じ反応チャンバーにおいて行った。第一のサイクルにおいて、全ての試薬は、予測可能なシグナルを生成したPCRのために与えたものであり、そして、第二のサイクルにおいて、緩衝液のみを反応チャンバー内に充填した。第二の試験において、第二のサイクルにおいて、全ての試薬を、第一のサイクルと同様に与えた点を除いて、第一の試験と同じ手順を行った。両方の試験において、システムは、以下の工程を行うようにプログラムした:(i)反応チャンバーに第一の反応混合物を充填する工程、(ii)反応チャンバーにおいて第一のPCRを行う工程、(iii)反応チャンバーから反応混合物を空にする工程、(iv)洗浄溶液で反応チャンバーをすすぐ工程[(iva)反応チャンバーにTET緩衝液を充填する工程および(ivb)反応チャンバーからTET緩衝液を空にする工程により実行される]、(v)反応チャンバーを空気でパージし、反応チャンバーを加熱する工程;(vi)反応チャンバーに第二の反応混合物[第一の試験においては、単にTET緩衝液のみであった]を充填する工程;および、(vii)反応チャンバー内で第二のPCRを行う工程。反応混合物(第一の試験における第一の反応混合物、ならびに、第二の試験における第一および第二の反応混合物)は、同一の組成を有した。
同じ反応チャンバーにおいて連続的に行った2つの増幅反応によるMRSAの検出:非凍結乾燥試薬 この実施例において、異なる標的配列を増幅する2つのPCRを同じ反応チャンバーにおいて連続して行う2つの試験を行った。2つの試験において変更した唯一のパラメーターは、反応を行う順番であった。各試験を2連で行った。実施例1と同様に、ここでもMRSAの標的配列を用いた。この実施例に関して、以下の2つの反応混合物を調製した:第一の反応混合物(MM1)は、MRSA遺伝子、mecA(Alexa 647プローブ(A647)で標識)およびSPA(テトラメチルローダミンプローブ(TxR)で標識)ならびに内部コントロールBG(Alexa 532プローブ(A532)で標識)を含み;そして、第二の反応混合物(MM2)は、MRSA遺伝子、orfH(フルオレセインプローブ(FMA)で標識)および内部コントロールBG(この場合は、テトラメチルローダミンプローブ(TxR)で標識)を含む。第一および第二の反応混合物のさらなる詳細を、それぞれ、表2および3に示す。
同じ反応チャンバーにおいて連続的に行った2つの増幅反応によるMRSAの検出:凍結乾燥試薬 この実施例において、各順序の反応における両方のPCRに凍結乾燥試薬を用いたこと、そして、MRSA DNAおよびBG DNAの濃度が10倍低かったことを除いて、実施例2と実質的に同じ試験を行った。これらの試験と並行して、HOTMASTERTMポリメラーゼインヒビター(Eppendorf AG,Hamburg,Germany)を含めることまたは除外することの影響もまた調べた。(HOTMASTERTMインヒビターは、温度依存性の様式でポリメラーゼの結合を阻害し、その結果、低い温度では伸長が阻止される)。内部コントロール配列であるBGについての反復実験の結果を図5A(反応1)および図5B(反応2)に示す。両方の反応が、明確に検出可能なシグナルをもたらし、BGの相対的な増幅は、凍結乾燥試薬の使用により大きく改善された。
空気でパージし、そして加熱することによる、反応チャンバーの気泡の除去 上述のように、連続した増幅反応の間の反応チャンバー内の気泡の形成は、特に、増幅生成物が光学シグナルにより検出される場合、システムの性能を低下させ得る。気泡は、第一(または先)の反応後に反応チャンバーに残る反応混合物の膜に起因して形成されるものと考えられる。この実施例では、反応チャンバー内の気泡の形成を排除するために、反応混合物を除去した後で、反応チャンバーに次の反応混合物を補充前に、パージおよび/または加熱の工程を実行した。このような工程は、図6A~6F(擬似(mock))および図6G~6H(実際)に列挙されるプログラムの下、Cepheid製のGENEXPERTTM増幅システムを用いる、連続した擬似逆転写酵素反応とPCR(すなわち、RT-PCR)および実際のRT-PCRについて実行した。反応は、試薬がプローブもプライマーも酵素も含まないという意味で「擬似」であった。
Claims (6)
- 複数の連続的な増幅反応を制御する方法であって、該方法は、以下:
(a)反応チャンバーを提供する工程であって、ここで、反応チャンバーが、廃液レザバ、サンプルを含有するサンプルレザバ、および異なる標的ポリヌクレオチドを検出するための増幅試薬を各々含有する複数の試薬レザバに選択的に流体的に連絡している、工程;
(b)サンプルレザバからのサンプルの一部と複数の試薬レザバの1つからの標的ポリヌクレオチドについての増幅試薬を混合することにより、反応チャンバーに反応混合物を充填する工程;
(c)該反応混合物において、インジケーターの存在下で、標的ポリヌクレオチドを増幅する工程であって、該インジケーターは、該増幅反応における該標的ポリヌクレオチドの単位複製配列の量に関連する光学シグナルを生成し得る、工程;
(d)該反応混合物中の該インジケーターの該光学シグナルを監視する工程;
(e)該光学シグナルが所定のレベルに到達するかもしくは該所定のレベルを超える度に、該反応チャンバーから廃液レザバへ該反応混合物を自動的に除去し、そして、該反応チャンバーにサンプルレザバからのサンプルの別の部分および複数の試薬レザバの別の1つからの別の標的ポリヌクレオチドについての増幅試薬を含む次の反応混合物を充填する工程;および
(f)該複数の連続的な増幅反応が行われるまで、工程(c)~(e)を繰り返す工程
を包含する、方法。 - 前記複数の連続的な増幅反応が、サンプルから前記標的ポリヌクレオチドを増幅し、そして、工程(b)の反応混合物の各々は、該サンプルの一部と増幅試薬とを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(e)の各々は、廃液レザバと反応チャンバーを流体的に連絡させる工程および前記光学シグナルが前記所定のレベルに到達したかもしくは該所定のレベルを超えた後に、前記反応混合物を廃液レザバへと流体的に移動させる工程を包含する、請求項2に記載の方法。
- 工程(e)の各々は、前記反応混合物を除去した後に前記反応チャンバーを洗浄溶液ですすぎ、そして、該洗浄溶液を前記廃液レザバへと流体的に移動させる工程を包含する、請求項3に記載の方法。
- 工程(e)の各々は、前記反応チャンバーから前記反応混合物を除去する工程の後でありかつ、前記次の反応混合物を充填する工程の前に、該反応チャンバー内に空気を入れて、該反応チャンバーをDNAの変性温度以上の温度まで加熱する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記反応チャンバーをDNAの変性温度以上の温度まで加熱する工程の後に、該反応チャンバーをDNAのアニーリング温度まで冷却する工程をさらに包含する、請求項5に記載の方法。
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