JP6129921B2 - 閉鎖系の多段階核酸増幅反応 - Google Patents
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Description
本発明は、一つ以上の核酸の存在について試料を解析する系及び方法に関し、より具体的には、多段階核酸増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を閉鎖条件下で実施する系及び方法に関する。
核酸増幅反応は、多くの研究用途、医学用途及び工業用途にとって極めて重要である。当該反応は、臨床的及び生物学的研究、感染症の検出及びモニタリング、突然変異の検出、癌マーカーの検出、環境モニタリング、遺伝子による識別、生物兵器防衛用途における病原体の検出等に使用されている(例えば、非特許文献1;非特許文献2)。特に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、これら全ての領域において用途が見出されており、その用途には、ウイルス及び細菌の検出、ウイルス量のモニタリング、稀な及び/又は培養が困難な病原体の検出、生物兵器のおそれの迅速な検出、癌患者における最小の余病の検出、食品病原体試験、輸血用血液のスクリーニング等の用途が含まれる(例えば、非特許文献3;非特許文献4)。PCRに関して、このように広範に利用されている主要な理由は、その速度と使いやすさ(通常は、規格化されたキット、比較的簡単で低コストの機器を使用して数時間以内に実施される)、その感度(多くの場合、試料中の数十の標的配列を検出可能)、及びその頑健性(法医学試料等の低品質の又は保存された試料、又は固定組織試料が容易に解析される)である(非特許文献5)。
本明細書で使用される、核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び記号は、例えば、Kornberg and Baker,DNA Replication,Second Edition(W.H.Freeman,New York,1992);Lehninger,Biochemistry,Second Edition(Worth Publishers,New York,1975);Strachan and Read,Human Molecular Genetics,Second Edition(Wiley−Liss,New York,1999);Eckstein;Oligonucleotides and Analogs:A Practical Approach(Oxford University Press,New York,1991);Gait,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984);Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory,1989)等の、これらの分野における標準的論文及びテキストに従う。
t)等の織られたポリオレフィンフィルムが含まれる。
チャンバー、バルブ及び/又は通路を含む系内の液体が相互に通じており、この系の外部とは通じることができず、同様に、この系の外部の液体が、系の内部に含まれる液体とは通じることができないことを意味する。一態様では、流体的に閉じた系の容器、チャンバー、バルブ及び通路が100psi未満の範囲、別の態様では、50psi未満の範囲又は30psi未満の範囲に加圧されていることを、従来の作動条件が意味する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
ネステッド増幅反応を制御する方法であって、
第一段階増幅反応において、反応混合物中の蛍光指示薬の存在下で標的ポリヌクレオチドを増幅する工程であって、該蛍光指示薬は、該第一段階増幅反応における増幅産物の量に関連する光信号を生成することができる、工程;
該第一段階増幅反応において該蛍光指示薬の光信号をモニタリングする工程;及び、
該第一段階増幅反応の反応混合物の有効部分を自動的に分離し、該光信号が閾値に達するか、又は閾値を超えるときに第二段階増幅反応を開始する工程
を包含する、方法。
(項目2)
前記第一段階増幅反応の前記反応混合物が、流体的に閉じた反応系の第一反応チャンバー内にあり、前記自動的に分離する工程が、該第一段階の反応混合物の前記有効部分を第二反応チャンバーに流体的に移動させることを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記第一段階増幅反応の前記反応混合物が、流体的に閉じた反応系の第一反応チャンバー内にあり、前記自動的に分離する工程が、第一反応チャンバー内に残存する有効部分を除き、該第一段階の反応混合物を廃棄物レザバに流体的に移動させることを含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記第一反応チャンバーが、底部及び出口を有し、該出口は、前記第一段階の反応混合物が該出口を通じて前記廃棄物レザバに流体的に移動されるときにはいつでも、該第一段階の反応混合物の一定の容積が該第一反応チャンバーにおいて該出口よりも下に維持されているように、該底部よりも上に配置される、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記第一反応チャンバーにおいて維持されている前記容積は、前記有効部分を含む、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記有効部分が、少なくとも1分子の前記増幅産物を含むのに十分な前記反応混合物の容積である、項目3に記載の方法。
(項目7)
前記有効部分が、少なくとも100分子の前記増幅産物を含むのに十分な前記反応混合物の容積である、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記反応混合物が一定の容積を有し、前記有効部分が該反応混合物の容積の一定の割合であり、該割合が、0.5〜10%の範囲から選択される、項目3に記載の方法。
(項目9)
前記閾値が、多様なベースライン信号レベルであり、該多様性が、1.5〜25の範囲から選択される、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記閾値が、前記光信号によって規定される成長曲線の最大値、最小値、又はゼロ値に対応する、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記蛍光指示薬が、二本鎖DNAに特異的に結合するか、又は増幅生成物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド部分を含むインターカレーティング色素から選択される、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記増幅産物が、前記第一段階増幅反応における参照配列の増幅によって生成される、項目10に記載の方法。
(項目13)
前記増幅産物が、前記第一段階増幅反応における標的ポリヌクレオチドの増幅によって生成される、項目10に記載の方法。
(項目14)
試料中の一つ以上の標的ポリヌクレオチドの有無を検出する方法であって、
第一反応混合物中の第一段階増幅試薬を使用して、該試料由来の一つ以上の標的ポリヌクレオチドを流体的に閉じた反応系において増幅して、一つ以上の第一増幅産物を形成する工程であって、該第一段階増幅試薬は、各標的ポリヌクレオチドに対する開始プライマーを含む、工程;
該流体的に閉じた反応系において第一反応混合物の有効部分を単離する工程;
第二反応混合物中の第二段階増幅試薬を使用して、該有効部分中の該一つ以上の第一増幅産物を該流体的に閉じた反応系において増幅して、一つ以上の第二増幅産物を形成する工程であって、該第二段階増幅試薬は、該一つ以上の第一増幅産物のそれぞれに対する少なくとも一つの第二プライマーを含み、その結果、各第二プライマーはそのような第一増幅産物の開始プライマーに比例してそのような第一増幅産物中でネスト化される、工程;及び、
該一つ以上の第二増幅産物を検出して、該試料中の該一つ以上の標的ポリヌクレオチドの有無を決定する工程
を包含する、方法。
(項目15)
前記第一反応混合物が、流体的に閉じた反応系の第一反応チャンバー内にあり、前記単離工程が、該第一反応混合物の前記有効部分を第二反応チャンバーに流体的に移動させることを含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記第一反応混合物が、流体的に閉じた反応系の第一反応チャンバー内にあり、前記単離工程が、該第一反応チャンバー内に残存する有効部分を除き、該第一反応混合物を廃棄物レザバに流体的に移動させることを含む、項目14に記載の方法。
(項目17)
前記第一反応チャンバーが、底部及び出口を有し、該出口は、前記第一段階の反応混合物が該出口を通じて前記廃棄物レザバに流体的に移動されるときにはいつでも、該第一段階の反応混合物の一定の容積が該第一反応チャンバーにおいて該出口よりも下に維持されているように、該底部よりも上に配置される、項目16に記載の方法。
(項目18)
第一反応チャンバーにおいて維持されている前記容積が、前記有効部分を含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記有効部分が、少なくとも1分子の前記増幅産物を含むのに十分な前記第一反応混合物の容積である、項目16に記載の方法。
(項目20)
前記有効部分が、少なくとも100分子の前記増幅産物を含むのに十分な前記第一反応混合物の容積である、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記反応の第一混合物が一定の容積を有し、前記有効部分が該第一反応混合物の容積の一定の割合であり、該割合が、0.5〜10%の範囲から選択される、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記単離工程が、前記第一反応混合物中の一つ以上の増幅産物の一つと関連する蛍光指示薬からの光信号をモニタリングする工程であって、該光信号は、該増幅産物の量と単調に関連する、工程;及び該光信号が所定のレベル以上であるときにはいつでも、該第一反応混合物の前記有効部分を自動的に分離する工程を包含する、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記所定のレベルが、多様なベースライン信号レベルであり、該多様性が1.5〜25の範囲から選択される、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記第一段階増幅試薬及び前記第二段階増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応又はNASBA反応を実施するための試薬を含む、項目16〜23のいずれかに記載の方法。
(項目25)
前記蛍光指示薬が、二本鎖DNAに特異的に結合するか、又は前記第一反応混合物中の増幅生成物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド部分を含むインターカレーティング色素から選択される、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記一つ以上の増幅産物のうちの一つが、前記第一反応混合物における参照配列の増幅によって生成される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記流体的に閉じた反応系が微小流体デバイスである、項目24に記載の方法。
(項目28)
前記流体的に閉じた反応系が、
反応チャンバーであって、前記試料を含む試料レザバ、第一段階増幅試薬を含む第一反応物レザバ、及び第二段階増幅試薬を含む第二反応物レザバと選択的に流体連絡し、該レザバのそれぞれは流体的に閉じている、反応チャンバー;ならびに
ポンプであって、該試料及び該第一段階増幅試薬を該反応チャンバーに流体的に移動させるため;前記光信号が所定のレベル以上であるときにはいつでも、前記第一反応混合物の前記有効部分を自動的に分離するため;そして該有効部分中の前記一つ以上の第一増幅産物を増幅するために該反応チャンバーに該第二段階増幅試薬を流体的に移動させるために、回転バルブと作動的に関連した、ポンプ
を含む、項目24に記載の方法。
(項目29)
試料中の一つ以上の標的ポリヌクレオチドの有無を検出する方法であって、
反応チャンバーを提供する工程であって、該反応チャンバーは、廃棄物レザバ、試料を含む試料レザバ、第一段階増幅試薬を含む第一反応物レザバ、及び第二段階増幅試薬を含む第二反応物レザバと選択的に流体連絡し、該レザバのそれぞれは流体的に閉じている、工程;
試料レザバ由来の試料、及び第一反応物レザバ由来の第一段階増幅試薬を反応チャンバーに流体的に移動させる工程であって、その結果、該試料中に標的ポリヌクレオチドが存在するときにはいつでも、該第一段階増幅試薬が増幅反応において該試料と反応し、第一増幅産物を含む反応生成物が生成される、工程;
該反応チャンバー内に残存する有効部分を除き、該反応生成物を該廃棄物レザバに流体的に移動させる工程;
第二反応物レザバ由来の第二段階増幅試薬を該反応チャンバーに流体的に移動させる工程であって、その結果、該反応生成物中に該第一増幅産物が存在するときにはいつでも、該第二段階増幅試薬が増幅反応において該反応生成物の有効部分と反応し、第二増幅産物が生成される、工程;ならびに
該第二増幅産物を検出して、該試料中に該標的ポリヌクレオチドが存在するかどうかを決定する工程を包含する、方法。
(項目30)
前記第一段階増幅試薬との前記増幅反応が、所定のサイクル数の間実施されるポリメラーゼ連鎖であり、前記反応生成物を流体的に移動させる工程が、該増幅反応の所定のサイクル数の後に実施される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記増幅反応における前記所定のサイクル数が20〜50の範囲である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記反応生成物を流体的に移動させる工程が、前記第一増幅産物に関連する蛍光指示薬からの光信号をモニタリングする工程であって、該光信号は、該第一増幅産物の量と単調に関連する工程;及び該光信号が所定のレベル以上であるときにはいつでも、該反応生成物の前記有効部分を自動的に分離する工程、を包含する、項目29に記載の方法。
(項目33)
前記反応生成物が一定の容積を有し、前記有効部分が前記反応生成物の容積の一定の割合であり、該割合が0.5〜10%の範囲から選択される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記所定のレベルが多様なベースライン信号レベルであり、該多様性が1.5〜25の範囲から選択される、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記増幅反応がそれぞれポリメラーゼ連鎖反応又はNASBA反応である、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記蛍光指示薬が、二本鎖DNAに特異的に結合するか、又は増幅生成物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド部分を含むインターカレーティング色素から選択される、項目35に記載の方法。
(項目37)
試料中の一つ以上の標的ポリヌクレオチドの相対量を決定する方法であって、
一つ以上の標的ポリヌクレオチド、及び第一増幅反応中の少なくとも一つの参照配列を該試料において増幅して、標的ポリヌクレオチド及び参照配列それぞれの第一増幅産物を含む第一反応生成物を形成する工程であって、該第一増幅反応は、標的ポリヌクレオチド及び参照配列それぞれの開始プライマーを含む、工程;
該第一反応生成物の有効部分由来の一つ以上の標的ポリヌクレオチドの第一増幅産物を第二増幅反応において増幅して、各第一増幅産物の第二増幅産物を形成する工程であって、該第二増幅反応は、各標的ポリヌクレオチドの第二プライマーを含み、その結果、各第一増幅産物の各第二プライマーが、それらの開始プライマーに比例してそのような第一増幅産物においてネスト化される、工程;ならびに
該第二増幅反応の第二増幅産物と該第一増幅反応中の少なくとも一つの参照配列の増幅産物とを比較し、試料中の一つ以上の標的ポリヌクレオチドの相対量を決定する工程
を包含する、方法。
(項目38)
前記第一増幅反応及び前記第二増幅反応が流体的に閉じた反応系において実施される、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記第一増幅反応及び前記第二増幅反応がそれぞれリアルタイム増幅反応である、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記第二増幅反応における前記増幅工程が、少なくとも一つの前記第一増幅産物と関連する蛍光指示薬からの光信号をモニタリングする工程であって、該光信号は、そのような第一増幅産物の量と単調に関連する、工程;及び前記光信号が所定のレベル以上であるときにはいつでも、前記反応生成物の前記有効部分を自動的に分離する工程、を包含する、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記反応生成物が一定の容積を有し、前記有効部分が該反応生成物の容積の一定の割合であり、該割合が、0.5〜10%の範囲から選択される、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記所定のレベルが多様なベースライン信号レベルであり、前記多様性が1.5〜25の範囲から選択される、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記増幅反応がそれぞれポリメラーゼ連鎖反応又はNASBA反応である、項目42に記載の方法。
(項目44)
ネステッド増幅反応を実施するための流体的に閉じた反応系であって、
反応チャンバーであって、試料レザバ、廃棄物レザバ、第一段階増幅試薬を含む第一反応物レザバ、及び第二段階増幅試薬を含む第二反応物レザバと選択的に流体連絡し、該レザバのそれぞれが流体的に閉じている、反応チャンバー;ならびに
ポンプであって、該ポンプは、該試料レザバ中の試料、及び該第一段階増幅試薬を該反応チャンバーに流体的に移動させるため;反応混合物の有効部分を単離するため;及び該第二段階増幅試薬及び該有効部分を該反応チャンバーに流体的に移動させるために回転バルブと作動的に関連し、ここで第一増幅反応は該反応混合物中に一つ以上の第一増幅産物を形成するために実施され、第二増幅反応は、一つ以上の第二増幅産物を形成するために実施される、ポンプ
を含む、反応系。
(項目45)
前記ポンプが前記反応混合物の前記有効部分を単離するときにはいつでも、前記反応チャンバー内に残存する前記有効部分を除き、該反応混合物が廃棄物レザバに流体的に移動される、項目44に記載の流体的に閉じた反応系。
(項目46)
前記反応チャンバーが、底部及び出口を有し、該出口は、前記反応混合物が該出口を通じて前記廃棄物レザバに流体的に移動されるときにはいつでも、該反応混合物の一定の容積が前記第一反応チャンバーにおいて該出口よりも下に維持されているように、該底部よりも上に配置され、該容積は前記有効部分を含む、項目45に記載の流体的に閉じた反応系。
(項目47)
少なくとも一つの前記第一増幅産物と関連する一つ以上の蛍光指示薬からの一つ以上の光信号を収集するために前記反応チャンバーと作動的に関連した一つ以上の検出器をさらに含み、該一つ以上の光信号はそれぞれ、該第一増幅産物のうちの一つの量と単調に関連する、項目46に記載の流体的に閉じた反応系。
(項目48)
マイクロプロセッサをさらに含み、該マイクロプロセッサは、前記一つ以上の光信号の値をモニタリングするため;及び該光信号の少なくとも一つの値が所定のレベル以上あるときにはいつでも、前記反応混合物の有効部分を単離するように前記ポンプ及び前記回転バルブを作動させるために、該ポンプ、該回転バルブ、及び前記一つ以上の検出器と作動的に関連する、項目47に記載の流体的に閉じた反応系。
(項目49)
反応容器であって、
液体を含むための反応チャンバー;
入口チャネルによって該反応チャンバーに接続される入口;
出口チャネルによって該反応チャンバーに接続される出口;及び、
該反応チャンバー内の保持部材であって、該保持部材は該反応チャンバー内の該液体の規定の容積を維持するように配置されており、該液体の残り部分は該出口チャネルを通じて該反応チャンバーから排出される、保持部材
を含む、反応容器。
(項目50)
前記反応容器が、
前記反応チャンバーの側壁を規定する硬質なフレーム;及び、
該反応チャンバーの反対側の主壁を形成するために該硬質なフレームの反対側に取り付けられた第一及び第二のポリマーフィルム
をさらに含む、項目49に記載の反応容器。
(項目51)
前記主壁のそれぞれが各熱表面に適合するのに十分に可撓性である、項目50に記載の反応容器。
(項目52)
前記側壁のうちの少なくとも二つが光透過性を備えており、互いに角度オフセットしている、項目50に記載の反応容器。
(項目53)
前記反応チャンバーが、該前記反応チャンバーの深さ及び幅が少なくとも4:1の比率を有するような幅及び深さを有し、該反応チャンバーの深さが2mm未満である、項目49に記載の反応容器。
(項目54)
多段階反応を実施するための装置であって、
少なくとも第一チャネル及び第二チャネルがその中に形成されている本体;ならびに
該本体から延びる反応容器を含み、該反応容器は、
液体を含むための反応チャンバー;
入口チャネルによって該反応チャンバーに接続される入口;
出口チャネルによって該反応チャンバーに接続される出口;及び
該反応チャンバー内の保持部材であって、該保持部材は反応チャンバー内の液体の規定の容積を維持するように配置されており、該液体の残りの部分は出口チャネルを通じて反応チャンバーから排出される、保持部材
を含み、
該容器の入口は、該本体内の第一チャネルと接続されており、該容器の出口は、該本体内の該第二チャネルと接続されている、装置。
(項目55)
前記本体が更に排出口を含み、該排出口は、前記液体が前記入口及び前記第一チャネルを通じて前記反応チャンバーに流入するときにはいつでも、前記第二チャネルからガスを放出するために、該第二チャネルと流体連絡している、項目54に記載の装置。
(項目56)
前記本体内の前記第一チャネル中の液体を、前記反応容器の入口を通じて前記反応チャンバーに流れさせるための差圧源を更に含む、項目54に記載の装置。
(項目57)
ネステッド増幅反応の性能を制御するためのコンピュータによる実行用のプログラムを具現化するコンピュータ読み取り可能な製品であって、該プログラムが、
(a)第一段階増幅反応からの光信号の値を読み取る工程であって、該光信号は該第一段階増幅反応の増幅産物の濃度と単調に関連し、該光信号の値は直近の値を有する、工程;(b)該光信号の値からベースライン信号レベルを決定する工程;
(c)該光信号の値から所定のレベルを計算する工程;
(d)該所定の値を該光信号の直近の値と比較する工程;
(e)該光信号の直近の値が該所定のレベル以上であるときにはいつでも、第二段階増幅反応を開始する工程;及び、
(f)該第二段階の反応が開始するまで、工程(d)及び(e)を繰り返す工程のための命令を含む、コンピュータ読み取り可能な製品。
(項目58)
前記所定のレベルを計算する工程が、1.5〜25の範囲から選択される係数を前記ベースライン信号レベルに乗じて、該所定のレベルを得ること、又は前記光信号の値から増幅産物の成長曲線の指標値を計算して、該所定の値を得ることを含む、項目57に記載のコンピュータ読み取り可能な製品。
(項目59)
前記第一段階増幅反応及び前記第二段階増幅反応が、それぞれポリメラーゼ連鎖反応又はNASBA反応である、項目58に記載のコンピュータ読み取り可能な製品。
(項目60)
前記ネステッド増幅反応が流体的に閉じた反応系において実施され、前記第二段階増幅反応を開始する工程が、流体的に閉じた反応系において前記第一段階増幅反応の反応混合物の有効部分を単離すること、及び流体的に閉じた反応系において該有効部分と該第二段階増幅反応の反応物とを混合すること、のための命令を生成する工程を包含する、項目59に記載のコンピュータ読み取り可能な製品。
(項目61)
試料中の一つ以上の標的ポリヌクレオチドを増幅する方法であって、
第一反応混合物中の第一段階増幅試薬を使用して、該試料由来の一つ以上の標的ポリヌクレオチドを流体的に閉じた反応系において増幅して、一つ以上の第一増幅産物を形成する工程であって、該第一段階増幅試薬は、各標的ポリヌクレオチドに対する第一プライマーを含む、工程;
該流体的に閉じた反応系において該第一反応混合物の有効部分を単離する工程;及び、
第二反応混合物中で第二段階増幅試薬を使用して、該有効部分中の一つ以上の増幅産物を該流体的に閉じた反応系において増幅して、一つ以上の第二増幅産物を形成する工程であって、該第二段階増幅試薬は、該一つ以上の第一増幅産物のそれぞれの少なくとも一つの第二プライマーを含み、その結果、各第二プライマーがそのような第一増幅産物の第一プライマーに比例してそのような第一増幅産物中でネスト化される、工程
を包含する、方法。
(項目62)
前記第一反応混合物が、流体的に閉じた反応系の第一反応チャンバー内にあり、前記単離工程が、該第一反応チャンバー内に残存する有効部分を除き、該第一反応混合物を廃棄物レザバに流体的に移動させることを含む、項目61に記載の方法。
(項目63)
前記第一反応チャンバーが、底部及び出口を有し、該出口は、前記第一段階の反応混合物が該出口を通じて前記廃棄物レザバに流体的に移動されるときにはいつでも、該第一段階の反応混合物の一定の容積が該第一反応チャンバーにおいて該出口よりも下に維持されているように、該底部よりも上に配置される、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記第一反応チャンバー内に維持される前記容積が、前記有効部分を含む、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記有効部分が、少なくとも1分子の前記増幅産物を含むのに十分な前記第一反応混合物の容積である、項目63に記載の方法。
(項目66)
前記有効部分が、少なくとも100分子の前記増幅産物を含むのに十分な前記第一反応混合物の容積である、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記反応の第一混合物が一定の容積を有し、前記有効部分が、該第一反応混合物の該容積の一定の割合であり、該割合が、0.5〜10%の範囲から選択される、項目63に記載の方法。
(項目68)
前記単離工程が、前記第一反応混合物中の前記一つ以上の増幅産物の一つと関連する蛍光指示薬からの光信号をモニタリングする工程であって、該光信号は、該増幅産物の量と単調に関連する、工程;及び該光信号が所定のレベル以上であるときにはいつでも、該第一反応混合物の前記有効部分を自動的に分離する工程、を包含する、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記所定のレベルが多様なベースライン信号レベルであり、前記多様性が1.5〜25の範囲から選択される、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記第一段階増幅試薬及び前記第二段階増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応又はNASBA反応を実施するための試薬を含む、項目69に記載の方法。
(項目71)
一つ以上のRNA配列を増幅する方法であって、
第一反応混合物中の逆転写酵素を使用して、一つ以上のRNA配列を流体的に閉じた反応系において転写して、一つ以上の相補的な一本鎖DNA配列を形成する工程;
該流体的に閉じた反応系において該第一反応混合物の第一有効部分を単離する工程;及び、
第二反応混合物中の第一段階増幅試薬を使用して、該第一有効部分中の該一つ以上の相補的な一本鎖DNA配列を該流体的に閉じた反応系において増幅して、一つ以上の第一増幅産物を形成する工程であって、該第一段階増幅試薬は、該相補的な一本鎖DNA配列のそれぞれの開始プライマーを含む、工程
を包含する、方法。
(項目72)
前記第一反応混合物が、前記の流体的に閉じた反応系の反応チャンバー内にあり、前記第一有効部分を単離する工程が、該反応チャンバー内に残存する該第一有効部分を除き、該第一反応混合物を廃棄物レザバに流体的に移動させることを含む、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記第一反応チャンバーが、底部及び出口を有し、該出口は、前記第一段階の反応混合物が該出口を通じて前記廃棄物レザバに流体的に移動されるときにはいつでも、該第一段階の反応混合物の残留容積が前記第一反応チャンバーにおいて該出口よりも下に維持されているように、該底部よりも上に配置され、該残留容積が前記第一有効部分を含む、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記第一反応混合物が一定の容積を有し、前記有効部分が、該第一反応混合物の該容積の一定の割合であり、該割合が、0.5〜20%の範囲から選択される、項目72に記載の方法。
(項目75)
前記流体的に閉じた反応系において前記第二反応混合物の第二有効部分を単離する工程;及び、
第三反応混合物中の第二段階増幅試薬を使用して、該第二有効部分中の一つ以上の第一増幅産物を該流体的に閉じた反応系において増幅して、一つ以上の第二増幅産物を形成する工程であって、該第二段階増幅試薬は、該一つ以上の第一増幅産物のそれぞれに対する少なくとも一つの第二プライマーを含み、その結果、各第二プライマーがそのような第一増幅産物の前記開始プライマーに比例してそのような第一増幅産物中でネスト化される、工程
をさらに包含する、項目74に記載の方法。
(項目76)
前記第二反応混合物が、前記流体的に閉じた反応系の反応チャンバー内にあり、前記第二有効部分を単離する工程が、該反応チャンバー内に残存する該第二有効部分を除き、該第二反応混合物を廃棄物レザバに流体的に移動させることを含む、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記第二反応混合物が、前記出口を通じて前記廃棄物レザバに流体的に移動され、該第二反応混合物の残留容積が、該出口より下で前記反応チャンバー中に維持されており、該残留容積が前記第二有効部分を含む、項目76に記載の方法。
(項目78)
前記第二反応混合物が一定の容積を有し、前記第二有効部分が該第二反応混合物の容積の一定の割合であり、該割合が、0.5〜20%の範囲から選択される、項目77に記載の方法。
(項目79)
ネステッド増幅反応の性能を制御するためのコンピュータによる実行用のプログラムを具現化するコンピュータ読み取り可能な製品であって、該プログラムは、
(a)第一段階増幅反応からの光信号の値を読み取る工程であって、該光信号は第一段階増幅反応の増幅産物の量又は濃度と関連する、工程;
(b)閾値交差が発生したかどうかを該光信号の値から決定する工程;及び
(c)該閾値交差が発生した場合、第二増幅反応を開始する工程
のための命令を含む、コンピュータ読み取り可能な製品。
(項目80)
前記閾値交差が発生したかどうかを決定する工程が、一つ以上の前記光信号の値が、ノイズをベースとする閾値、ユーザーが定義する閾値、又は初期設定の閾値を超えたかどうかを決定することを含む、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記閾値交差が発生したかどうかを決定する工程が、前記光信号の値によって規定される成長曲線の導関数が、最大、最小、又はゼロであるかどうかを決定することを含む、項目79に記載の方法。
(項目82)
前記ネステッド増幅反応が流体的に閉じた反応系において実施され、前記第二段階増幅反応を開始する工程が、該流体的に閉じた反応系において前記第一段階増幅反応の反応混合物の有効部分を単離する工程、及び該流体的に閉じた反応系において該有効部分と前記第二段階増幅反応の反応物とを混合する工程、のための命令を生成する工程を包含する、項目79に記載のコンピュータ読み取り可能な製品。
(項目83)
試料中の一つ以上の標的ポリヌクレオチドの有無を検出する方法であって、
第一段階増幅試薬を含む反応チャンバーを提供する工程であって、該反応チャンバーが、廃棄物レザバ、試料を含む試料レザバ、及び第二段階増幅試薬を含む第二反応物レザバと選択的に流体連絡されており、該レザバのそれぞれが流体的に閉じている、工程;
該試料レザバ由来の試料を該反応チャンバーに流体的に移動させる工程であって、その結果、該試料中に標的ポリヌクレオチドが存在する場合に、該第一段階増幅試薬が増幅反応において該試料と反応し、第一増幅産物を含む第一反応生成物が生成される、工程;
該反応チャンバー内に残存する該第一反応生成物の有効部分を除き、該第一反応生成物を該廃棄物レザバに流体的に移動させる工程;
該第二反応物レザバ由来の該第二段階増幅試薬を反応チャンバーに流体的に移動させる工程であって、その結果、該第一反応生成物中に該第一増幅産物が存在するときにはいつでも、該第二段階増幅試薬が増幅反応において該第一反応生成物の有効部分と反応し、第二増幅産物が生成される、工程;及び、
該試料中に標的ポリヌクレオチドが存在するかどうかを決定するために該第二増幅産物を検出する工程
を包含する、方法。
本発明は、多段階増幅反応を、特に流体的に閉じた条件で実施する系、方法及び装置に関する。一態様では、第一(又は前の)反応混合物の一部を単離して、それを第二(又は後の)反応混合物において試料又は検体として使用し、それによって第一反応成分が第二反応中にて及ぼす可能性がある妨害作用を実質的に回避することを可能にする、流体的に閉じた系において、本発明の方法が実施される。前記態様では、本発明の系、方法及び装置が、ネステッドプライマーの使用に基づく多段階の増幅を可能にする任意の増幅反応によって使用される場合がある。
PCRに関して前述の通り、ネステッド増幅反応は、前の段階の増幅産物が、前に生成された増幅産物中の少なくとも一つの内部位置に結合する新しいプライマー又はプライマー対を使用した次の段階の試料となる多段階反応である。ネステッド増幅反応の各段階においては、増幅反応は従来の方法で処理される。ネステッド増幅反応における個々の増幅反応を連続するための設計上の選択には、(i)各段階のサイクル数又は時間、(ii)第二段階の反応の試料として供給するための第一段階の反応混合物の有効部分のサイズ、(iii)第二段階のプライマーについての内部結合部位の選択、(iv)参照配列が各段階で増幅されるかどうか、(v)各段階で同じ種類の増幅反応が実行できるかどうか、例えば、PCR−PCR、NASBA−NASBA、PCR−NASBA等の二段階ネステッド増幅反応が含まれる。通常、ネステッド増幅反応は、連続的なPCR又は連続的なNASBA反応であり、従来の反応条件下で実施される。
本発明の方法は、試薬を隔離し、試薬を移動し、及び反応生成物を反応系へ出入りさせ、温度を制御し及び反応生成物を検出するための種々の工学的方法に基づく、種々の系及び装置によって実施することができる。系の選択は、試料又は検体の有効性、試料又は検体の形態、試料又は検体により引き起こされる危険又は感染力、可搬性の要求性、使用される増幅反応の性質等を含むが、これらに限定されない多くの要因によって決まる。本発明の方法を実施するために使用することのできる具体的な系には、米国特許第6,369,893号(Christel et al.)及び米国特許第6,374,684号(Dority)に開示されるような、マイクロプロセッサ制御の下で、回転バルブ及びピストン方の流体ポンプを使用する、流体的に閉じた反応系;米国特許第5,229,297号(Schnipelsky et al.);及びFindlay et al.,Clin.Chem.,39:1927−1933(1993)に開示されるような、試料、反応物及び生成物を、反応チャンバー及び検出装置を通じて機械的に駆動するための柔軟な試薬レザバを有する、閉鎖された使い捨てのキュベット;以下の参考文献、即ちShoji et al.,Appl.Biochem.Biotechnol.,41:21−34(1993)及びJ.Micromech.Microeng.,4:157−171(1994);McCormick et al.,Anal.Chem.,69:2626−2630(1997);Cheng et al.,Topics Curr.Chem.,194:215−231(1998);米国特許第6,663,833号(Stave et al.);米国特許第5,714,380号(Neri et
al.);米国特許第5,589,136号(Northrup et al.)等に定義され、更に開示されるような、微小流体デバイスが含まれる。当該系は、制御された様式で、容器と反応チャンバーとの間で、反応物、試料及び反応生成物を流体移動することができる。即ち、当該系は、直接的に液体−原動力の下、容器中で試薬、試料、反応生成物等を移動する。液体−原動力には、多くの種類のポンプ又は圧縮ガス容器、電気運動ポンプ等によって生成される圧力差が含まれる。
しばしば、患者における標的遺伝子の測定した発現レベルが正常範囲内であるかどうかを決定することを試みる場合等、異なるアッセイからの読み出した情報を比較することが好ましい。特に、医学用途においては、基準試料の結果と、患者試料からのアッセイ結果とを比較することが好ましい。当該比較は、同じ試料からの参照配列に関連するシグナルに対する標的ポリヌクレオチドに関連するシグナルの比を決定することによって容易に実施される。これは、その他の試料又は検体からの値に対する、標的ポリヌクレオチドについての値を比較することを可能にする。内標準、特に、参照配列の使用及び選択は、本明細書に参考文献として組み入れられる、以下の文献、即ち、Radonic et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,313:856−862(2004);Bustin,J.Mol.Endoccrinol.,29:23−39(2002);Hoorfar et al.,J.Clin.Microbiol.,42:1863−1868(2004)等に反映されたように、当業者にとって周知である。参照配列に関連するシグナル又は値は、例えば、複数の参照配列から測定されたシグナル又は値の平均となる場合もあることが理解される。
本発明で使用される、標的ポリヌクレオチドを含む試料又は検体は、細胞培養物、動物又は植物組織、患者の生検、環境の試料等を含む、種々の源から由来する。本発明のアッセイのための試料は、通常、試料又は検体を取得した源によって決まる、従来の技術を使用して調製される。
Claims (11)
- ネステッド増幅反応を制御する方法であって、
第一段階増幅反応において、反応混合物中の蛍光指示薬の存在下で標的ポリヌクレオチドを増幅する工程であって、該蛍光指示薬は、該第一段階増幅反応における増幅産物の量に関連する光信号を生成することができる、工程;
該第一段階増幅反応において該蛍光指示薬の光信号をモニタリングする工程;
該光信号が閾値に達するか、又は閾値を超えるときに該第一段階増幅反応の反応混合物の有効部分を自動的に分離する工程;
該第一段階増幅反応の反応混合物の有効部分に第二段階試薬を導入し、第二段階反応混合物を生成する工程;及び
第二段階増幅反応を開始する工程
を包含し、ここで、該第一段階増幅反応の該反応混合物が反応系の第一反応チャンバー内にあり、該自動的に分離する工程が、(1)該第一段階の反応混合物の該有効部分を第二反応チャンバーに流体的に移動させること、または、(2)該第一反応チャンバー内に残存する有効部分を除き、該第一段階の反応混合物を廃棄物レザバに流体的に移動させることを含む、方法。 - 前記第一反応チャンバーが、底部及び出口を有し、該出口は、前記第一段階の反応混合物が該出口を通じて前記廃棄物レザバに流体的に移動されるときにはいつでも、該第一段階の反応混合物の一定の容積が該第一反応チャンバーにおいて該出口よりも下に維持されているように、該底部よりも上に配置される、請求項1に記載の方法。
- 前記第一反応チャンバーにおいて維持されている前記容積は、前記有効部分を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記有効部分が、少なくとも1分子の前記増幅産物を含むのに十分な前記反応混合物の容積である、請求項1に記載の方法。
- 前記有効部分が、少なくとも100分子の前記増幅産物を含むのに十分な前記反応混合物の容積である、請求項4に記載の方法。
- 前記反応混合物が一定の容積を有し、前記有効部分が該反応混合物の容積の一定の割合であり、該割合が、0.5〜10%の範囲から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記閾値が、多様なベースライン信号レベルであり、該多様性が、1.5〜25の範囲から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記閾値が、前記光信号によって規定される成長曲線の最大値、最小値、又はゼロ値に対応する、請求項1に記載の方法。
- 前記蛍光指示薬が、二本鎖DNAに特異的に結合するか、又は増幅生成物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド部分を含むインターカレーティング色素から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記増幅産物が、前記第一段階増幅反応における参照配列の増幅によって生成される、請求項8に記載の方法。
- 前記増幅産物が、前記第一段階増幅反応における標的ポリヌクレオチドの増幅によって生成される、請求項8に記載の方法。
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