CN112105747A - 用于验证核酸扩增测定的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

提供了用于测定系统的外部对照测试的系统、方法和仪器。

Description

用于验证核酸扩增测定的方法和系统
政府利益
本发明在由美国国立卫生研究院（U.S. National Institutes of Health）授予的HHSN272201600002C以及由美国国防部（U.S. Department of Defense）授予的W911QY-13-D-0080的政府支持下完成。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请
本申请要求于2018年1月30日提交的美国临时申请序列号U.S. 62/623,802的利益和优先权，所述美国临时申请整体引入本文作为参考。
背景
在美国、加拿大和西欧，传染病占人类死亡率的大约7%，而在发展中地区，传染病占人类死亡率的超过40%。传染病导致各种临床表现。常见的明显表现中有发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻和腹泻带血。虽然身体表现提示由一些病原体引起的疾病并且消除作为病因因子的其它病原体，但仍然存在各种潜在的致病因子，并且明确的诊断经常需要执行各种测定。用于鉴定临床标本中的病原体的传统微生物学技术可能花费几天或几周，经常延迟正确的治疗过程。
近年来，聚合酶链反应（PCR）已成为用于快速鉴定传染原的选择方法。PCR可以是诊断传染病的快速、灵敏且特定性的工具。然而，使用PCR作为主要诊断手段的挑战在于一些病理标本中存在的可能的致病性生物或病毒的多样化以及生物或病毒的低水平。运行PCR测定（对于每种可能的致病性生物或病毒一个PCR测定）的大型实验对象组经常是不切实际的，大多数所述PCR测定预计为阴性的。当病原体核酸为低浓度且需要大体积的样品以收集足够的反应模板时，该问题恶化。在一些情况下，没有足够的样品来测定所有可能的病因因子。一种解决方案是运行“多重PCR”，其中样品在单一反应中就多个靶同时进行测定。尽管多重PCR已在一些系统中证明为有价值的，但存在关于高水平多重反应的稳固性和难以明确分析多重产物的缺点。为了解决这些问题，随后可以将测定分成多重次级PCR。在初级产物内嵌套次级反应增加稳固性。封闭系统如FilmArray®（BioFire Diagnostics，LLC，Salt Lake City，UT）减少了处理，从而降低了污染风险。
质量控制（‘QC’）材料是必要的，以确保体外诊断（‘IVD’）系统正确运行。例如，QC材料在制造时在FilmArray测定袋上运行，以确认该袋根据规格制造，并且确认测定和器械正确地操作。根据1988年临床实验室改进修正案（Clinical Laboratory ImprovementAmendments of 1988）（CLIA），要求美国的临床实验室对收到的每个批次的测定运行所谓的外部对照材料（‘ECM’），其为测定阳性和阴性的，以确保每个批次中的IVD测定根据规范执行，并且确保实验室的程序对于检测预期通过IVD测定检测的生物是正确的。ECM还用于验证对新器械或维修器械以及新用户的测定性能。在大多数情况下，临床实验室已使用充分表征的阳性临床标本或掺料到已知阴性标本内的活病原体。尤其对于病原性生物，可以使用灭活的生物来配制ECM。在复杂性较低的实验室（例如医师办公室实验室）或者用于罕见或高病原性生物的测定中，合成核酸模板也可以用作ECM。许多其它行业的非临床实验室也运行对照材料，例如ECM。
技术问题
然而，这种方法的问题之一是生物和核酸阳性对照具有污染未来测定并产生假阳性的潜力。在扩增后，PCR反应混合物可以含有多达1011至1012个原始靶的拷贝。鉴于对于传染性病原体的基于PCR的测定对靶序列的<50个拷贝敏感的需要，这意味着~10-8 μL（大致上一滴的十亿分之一）的扩增后混合物含有足够的靶来污染后续扩增过程，并导致假阳性结果。避免此类携带污染或致使其无害是艰巨挑战。
来自产物携带的假阳性结果已困扰PCR测定许多年，并且针对这个问题的几种可能的解决方案已被提议且得到开发，例如，观察严格的方案、PCR产物的酶促或化学处理以致使其无法扩增、以及限制扩增水平。在照常规随后为临床上实践PCR的大多数实验室尝试的严格方案中有用于在PCR之前发生的那些活动（样品制备和试剂制备），以及用于涉及扩增和检测的那些活动的分开设施（且经常是人员）的使用。尽管现今广泛实施这种解决方案，但它在大多数机构中明显是非常不方便的。处理PCR产物以最小化或预防再扩增的化学和酶促方法包括尿嘧啶N-糖基化酶的使用，在其3'端处由核糖终止的PCR引物的使用，以及异补骨脂素的使用。虽然这些方法多少是有效的，但尚不清楚它们是否避免用于扩增前活动以及用于扩增和检测的分开设施的需要。
在生物或天然模板假阳性结果中，由于假阳性和实际阳性共享等同序列，假阳性经常无法与实际阳性区别开。在其中通过DNA解链鉴定阳性的情况下，生物或天然模板假阳性和实际阳性具有相同的解链点。因为生物或天然模板假阳性和实际阳性具有相同的序列和相同的物理特征，所以无法区别或查明假阳性的起源。此外，如果所讨论的实验室正在测试罕见或危险的病原体（例如埃博拉病毒），则假阳性可能是相当令人震惊的，并且可能错误地触发响应（例如隔离），如同受试者感染有真正的危险病原体一样。临床实验室传统上已使用生物或充分表征的临床阳性样品，其含有该生物用于诊断测试的验证和质量控制。如果待测试生物难以繁殖（例如，贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii））或是高致病性的（例如，埃博拉病毒），则这可能是问题，因为它们可能难以获得，或者如果它们可以获得，则它们可能需要生物安全3或4级防护。这对于大多数用户是不实际的。
另外，由于ECM被设计为确定测定是否工作并且它是否正确地鉴定真阳性临床标本，因此一般认为ECM应该是接近于测定的检测极限（LOD）的浓度，例如LOD的1-100×、5-50×或优选约2-10×。使用充分表征的阳性、灭活生物或合成核酸模板作为ECM，经常要求一定程度的样品制备和/或标准的等分，以便确保ECM中的每个标准都接近于测定的LOD。这一般意味着在实验室中需要高度熟练和受过训练的操作者来制备ECM，并且此类人员不一定在所有实验室（例如，在CLIA豁免的测试地点）可获得。标准的制备和等分也是标准和实验室空间污染的潜在渠道。如果实验室正在验证危险生物（例如，埃博拉病毒），则可能需要在3或4级防护设施中制备活生物ECM。再次，这对于大多数临床实验室是不实际的。
另外，充分表征的阳性、灭活生物和合成核酸模板可能需要特殊的贮存和处理（例如，在-80℃下贮存）。这使制造、运输和贮存成本更高，并且可能将测定验证和使用限制于具有适当冷链贮存的实验室。这并非在所有临床实验室，特别是CLIA豁免的医生办公室中是可行的。具有室温或升高的温度稳定性限制的ECM的使用较不昂贵，并且更广泛地应用。
相应地，现有的外部对照材料系统和方法存在许多缺点。
概述
问题的解决方案
本公开内容的实施方案用新型外部对照材料解决了本领域中的前述问题或其它问题中一个或多个。本文所述的外部对照材料包括一组阳性对照序列，其被改造为最小化检测到假阳性结果的可能性。每个阳性对照序列被设计为用与对应于每个阳性对照序列的测定中的测试序列相同的正向引物和反向引物进行扩增，但ECM中的每个阳性对照序列包括可与相应测试扩增子区别开的改造序列，以允许用户区别ECM和测试阳性。例如，ECM中扩增的阳性对照序列可以相对于相应的测试序列扩增子是解链转变的（melt-shifted）。改造的序列（即，ECM特异性序列）可以是合成序列或天然序列，只要它与原始病原体序列不同并且可检测地区别。另外，在一些说明性实施方案中，ECM中的阳性对照序列被设计为在多路复用环境（例如，高阶多路复用）中运行。在一个优选实施方案中，本文所述的ECM不含生物危害并且是非传染性的。同样地，它们不需要任何特殊处理或样品制备或等分，并且是室温稳定的。
本文描述的是：
1. 一种阳性对照材料，其包含：
具有在其中干燥的多个阳性对照序列的样品收集递送装置，所述阳性对照序列被配置为当添加流体时重悬浮，
其中每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为最小化获得假阳性结果，并且其中所述样品收集递送装置不含测试样品或者一个或多个测试序列，和
其中每个阳性对照序列的改造序列选择为具有与相应测试序列的解链温度不同和/或可区别的解链温度。
2. 条款1的阳性对照材料，其中每个阳性对照序列在高于或低于相应测试序列的解链窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。
3. 条款1或条款2中至少一个的阳性对照材料，其中存在在样品收集递送装置中干燥的约2至约10个阳性对照序列。
4. 条款1至3中一个或多个的阳性对照材料，其中存在在样品收集递送装置上或其中干燥的约2至约20个阳性对照序列。
5. 条款1至4中一个或多个的阳性对照材料，其中存在在样品收集递送装置上或其中干燥的约2至约30个阳性对照序列。
6. 条款1至5中一个或多个的阳性对照材料，其中存在在样品收集递送装置上或其中干燥的约2至约40个阳性对照序列。
7. 条款1至6中一个或多个的阳性对照材料，其中所述样品收集递送装置提供用于将阳性对照序列容易地转移至测定装置。
8. 条款1至7中一个或多个的阳性对照材料，其中所述样品收集递送装置是拭子。
9. 条款1至8中一个或多个的阳性对照材料，其中所述样品收集递送装置是小瓶，其包括具有用于接收流体的内部体积的小瓶主体、以及从所述小瓶主体的底表面的外部延伸离开的插管，所述插管被配置为将待分析的样品递送至多重测定装置。
10. 条款1至9中一个或多个的阳性对照材料，其中每个阳性对照序列进行改造，以在比每个相应的测试序列更高的温度或更低的温度下解链。
11. 一种使用阳性对照材料控制多重化PCR系统的方法，其包括以下步骤：
提供包括第一反应室的测定装置，所述第一反应室提供有用于多重化核酸扩增的多个引物，
在第一反应室中扩增多个阳性对照序列，以产生多个阳性对照扩增子，其中所述阳性对照材料不含测试样品，和
检测阳性对照扩增子，
其中检测到每个阳性对照扩增子指示多重化PCR系统正确地操作，和
其中由于在阳性对照序列中改造序列的存在，因此每个扩增的阳性对照序列在与其相应测试序列不同和/或可区别的温度下解链。
12. 条款11的方法，其中每个阳性对照序列在高于或低于相应测试序列的解链窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。
13. 条款11和/或条款12的方法，其中每个阳性对照序列及其相应的测试序列包含用于多个引物的相同的正向引物结合位点和反向引物结合位点，并且其中所述改造的序列在正向引物结合位点和反向引物结合位点之间。
14. 条款11至条款13中一个或多个的方法，其中所述扩增步骤包括在测定装置中扩增约2至约10个独特的阳性对照序列。
15. 条款11至条款14中一个或多个的方法，其中所述扩增步骤包括在测定装置中扩增约2至约20个独特的阳性对照序列。
16. 条款11至条款15中一个或多个的方法，其中所述扩增步骤包括在测定装置中扩增约2至约30个独特的阳性对照序列。
17. 条款11至条款16中一个或多个的方法，其中所述扩增步骤包括在测定装置中扩增约2至约40个独特的阳性对照序列。
18. 条款11至条款17中一个或多个的方法，所述测定装置进一步至少包括与第一反应室流体连接的第二反应室，所述第二反应室包含配置用于进一步扩增每个阳性对照序列的引物对，并且其中所述方法进一步包括进一步扩增所述阳性对照序列，其中所述进一步扩增步骤在所述检测步骤之前发生。
19. 条款11至条款18中一个或多个的方法，其中所述第二阶段反应室包括孔阵列，其中每个孔在其中具有至少一个引物对，用于进一步扩增每个阳性对照序列。
20. 条款11至条款19中一个或多个的方法，其中检测阳性对照扩增子包括观察关于每个阳性对照扩增子的DNA解链信号，其中所述DNA解链信号在与测试序列的解链温度相比不同和/或可区别的温度下，所述测试序列对应于每个阳性对照扩增子。
21. 条款11至条款20中一个或多个的方法，其进一步包括
提供包括第一反应室的第二测定装置，所述第一反应室提供有用于多重化核酸扩增的多个引物，
在第一反应室中扩增阴性样品，其中所述阳性对照材料不含测试样品，和
对于每个阳性对照扩增子检测阴性结果，和
其中对于每个阳性对照扩增子检测到阴性结果指示多重化PCR系统正确地操作。
22. 条款11至条款21中一个或多个的方法，其进一步包括在测定装置中包括具有多个阳性对照序列的至少一个测试序列。
23. 条款11至条款22中一个或多个的方法，其中所述阳性对照序列可以用于确定至少一个测试序列的浓度。
24. 一种用于多重化核酸扩增系统的测定装置，其包括：
多个阳性对照序列，和
测定装置中提供有多个引物的第一反应室，所述多个引物用于阳性对照序列和相应测试序列的多重扩增，
其中每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为最小化获得来自阳性对照序列的假阳性结果，
其中每个阳性对照序列结合第一反应室内的多个引物中的不同引物序列，和
其中所述第一反应室不含测试样品或测试序列。
25. 条款24的测定装置，其中所述引物与所述改造序列的非特异性结合是最小化的。
26. 条款24和/或条款25的测定装置，其中每个阳性对照序列具有与其相应测试序列不同和/或可区别的解链温度。
27. 条款24至条款26中一个或多个的测定装置，其中存在约2至约10个阳性对照序列。
28. 条款24至条款27中一个或多个的测定装置，其中存在约2至约20个阳性对照序列。
29. 条款24至条款28中一个或多个的测定装置，其中存在约2至约30个阳性对照序列。
30. 条款24至条款29中一个或多个的测定装置，其中存在约2至约40个阳性对照序列。
31. 条款24至条款30中一个或多个的测定装置，其进一步至少包括在测定装置中与第一反应室流体连接的第二反应室，所述第二反应室包含配置用于进一步扩增每个阳性对照序列和相应测试序列的引物对。
32. 一种检测多个引物对的方法，所述引物对被配置为在多重化核酸扩增系统内扩增多个测试序列，所述方法包括以下步骤：
提供包含多个阳性对照序列的阳性对照材料，每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为相对于相应的测试序列最小化观察到的假阳性结果，其中由于改造序列的存在，每个扩增的阳性对照序列在与其相应测试序列不同和/或可区别的温度下解链，
提供包括反应容器的测定装置，所述反应容器包含用于扩增每个阳性对照序列的多个引物，
在反应容器中扩增多个阳性对照序列，其中所述阳性对照材料不含测试样品或测试序列，和
检测反应容器中关于每个扩增的阳性对照序列的解链信号，
其中所述多个阳性对照序列各自的解链信号指示在反应容器中每个相应引物对的存在。
33. 条款32的方法，其中每个阳性对照序列及其相应的测试序列包含用于多个引物之一的相同的正向引物结合位点和反向引物结合位点，并且其中所述改造的序列在正向引物结合位点和反向引物结合位点之间。
34. 条款32和/或条款33的方法，其中所述扩增步骤包括在反应容器中同时扩增约2至约10个独特的阳性对照序列。
35. 条款32至条款34中一个或多个的方法，其中所述扩增步骤包括在反应容器中同时扩增约2至约20个独特的阳性对照序列。
36. 条款32至条款35中一个或多个的方法，其中所述扩增步骤包括在反应容器中同时扩增约2至约30个独特的阳性对照序列。
37. 条款32至条款36中一个或多个的方法，其中所述扩增步骤包括在反应容器中同时扩增约2至约40个独特的阳性对照序列。
38. 条款32至条款37中一个或多个的方法，其中所述阳性对照材料在配置用于装载到反应容器内的器皿中提供。
39. 条款32至条款38中一个或多个的方法，其中所述检测步骤包括对于每个阳性对照序列使用与对于每个相应测试序列的解链窗口不同的解链窗口。
40. 条款32至条款39中一个或多个的方法，其中关于每个阳性对照序列的解链窗口为高于或低于相应测试序列的解链窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合。
41. 条款32至条款40中一个或多个的方法，其进一步包括
提供阴性对照样品，
提供第二反应容器，其包含用于扩增每个阳性对照序列的多个引物，
使阴性对照样品暴露于第二反应容器中的扩增条件，和
确定是否存在任何解链信号，
其中解链信号的存在指示污染。
42. 条款32至条款41中一个或多个的方法，其中在解链窗口中关于阳性对照序列之一的解链信号的存在指示由阳性对照序列或其扩增子的污染，并且在解链窗口中关于相应的测试序列之一的解链信号的存在指示由测试序列或其扩增子的污染。
43. 一种外部对照试剂盒，其包括
具有在其中干燥的多个阳性对照序列的样品收集小瓶，所述阳性对照序列被配置为当将流体加入样品收集小瓶中时重悬浮，其中每个阳性对照序列具有相对于相应的测试序列，并且可与相应的测试序列区别的转变解链温度，和
用于对器械进行编程的软件模块，以在多重化测定系统中扩增多个阳性对照序列，并且检测与相应的测试序列不同的阳性对照序列。
44. 条款43的试剂盒，其中每个阳性对照序列进行改造，以在比每个相应的测试序列更高的温度或更低的温度下解链。
45. 条款43和/或条款44的试剂盒，其中每个阳性对照序列在高于或低于相应测试序列的解链点窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。
46. 条款43至条款45中一个或多个的试剂盒，其中存在在样品收集小瓶中干燥的约2至约10个阳性对照序列。
47. 条款43至条款46中一个或多个的试剂盒，其中存在在样品收集小瓶中干燥的约2至约20个阳性对照序列。
48. 条款43至条款47中一个或多个的试剂盒，其中存在在样品收集小瓶中干燥的约2至约30个阳性对照序列。
49. 条款43至条款48中一个或多个的试剂盒，其中存在在样品收集小瓶中干燥的约2至约40个阳性对照序列。
50. 条款43至条款49中一个或多个的试剂盒，其中所述样品收集小瓶包括具有用于接收流体的内部体积的小瓶主体、以及从所述小瓶主体的底表面的外部延伸离开的插管，所述插管被配置为将待分析的样品递送至多重化测定。
51. 条款43至条款50中一个或多个的试剂盒，其中所述软件模块限定关于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链窗口，所述解链窗口不同于且可区别于关于每个扩增子的阳性扩增子解链窗口，所述扩增子衍生自对应于每个阳性对照序列的测试序列。
52. 条款43至条款51中一个或多个的试剂盒，其中所述软件模块被配置为查询关于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链转变窗口、以及关于衍生自测试序列的每个扩增子的阳性扩增子窗口，并且其中所述软件模块被进一步配置为区别阳性对照污染和生物或测试序列污染。
53. 一种用于多重化核酸扩增的系统，其包括：
多个阳性对照序列，
包括第一反应室的测定装置，所述第一反应室提供有用于多重化核酸扩增的多个引物，
器械，其配置为接收测定装置并且执行核酸扩增反应，以产生多个阳性对照扩增子，并且检测所述阳性对照扩增子，和
软件模块，其用于指示所述器械扩增多个阳性对照序列并且检测阳性对照扩增子，其中所述阳性对照序列扩增子具有至少一种可检测的序列特性，所述特性不同于和/或区别于相应的多个测试序列，
其中每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为最小化起因于阳性对照序列的假阳性，和
其中每个阳性对照序列结合测定装置内的多个引物的不同引物序列。
54. 条款53的系统，其中与每个相应的测试序列相比，每个阳性对照序列被改造为在更高的温度或更低的温度下解链。
55. 条款53和/或条款54的系统，其中每个阳性对照序列在高于或低于相应测试序列的解链窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。
56. 条款53至条款55中一个或多个的系统，其中所述系统包括约2至约10个阳性对照序列。
57. 条款53至条款56中一个或多个的系统，其中所述系统包括约2至约20个阳性对照序列。
58. 条款53至条款57中一个或多个的系统，其中所述系统包括约2至约30个阳性对照序列。
59. 条款53至条款58中一个或多个的系统，其中所述系统包括约2至约40个阳性对照序列。
60. 条款53至条款59中一个或多个的系统，其进一步包括具有在其中干燥的阳性对照序列的样品收集小瓶。
61. 条款53至条款60中一个或多个的系统，其中所述软件模块限定关于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链窗口，所述解链窗口不同于且可区别于关于每个扩增子的阳性扩增子解链窗口，所述扩增子衍生自对应于每个阳性对照序列的测试序列。
62. 条款53至条款61中一个或多个的系统，其中所述软件模块被配置为查询关于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链转变窗口、以及关于衍生自测试序列的每个扩增子的阳性扩增子窗口，以区别阳性对照污染和生物或测试序列污染。
63. 条款53至条款62中一个或多个的系统，所述测定装置进一步至少包括与第一反应室流体连接的第二反应室，所述第二反应室包含配置用于进一步扩增每个阳性对照序列的引物对。
64. 条款53至条款63中一个或多个的系统，其中所述第二反应室包括两个或更多个反应孔，其配置用于进一步扩增阳性对照序列，并且其中两个或更多个反应孔中的至少一个包括两个或更多个引物对，用于同时扩增两个或更多个阳性对照序列。
65. 条款53至条款64中一个或多个的系统，其中所述测定装置包括第一阶段反应室，其提供有用于阳性对照序列的多重扩增的多个引物，以及与第一阶段反应室流体连接的第二阶段反应室，其中所述第二阶段反应室包括孔阵列，其中每个孔在其中具有至少一个引物对，用于进一步扩增每个阳性对照序列。
66. 条款53至条款65中一个或多个的系统，其中所述孔阵列中的至少一个孔包括两个或更多个引物对，用于同时扩增两个或更多个阳性对照序列。
提供本概述以简化形式介绍选择的概念，所述概念在下文详述中进一步描述。本概述既不预期鉴定请求保护的主题的关键特点或必要特点，也不预期用作确定请求保护的主题的范围的帮助。
另外的特点和优点将在下述描述中阐述，并且部分根据描述将是显而易见的，或者可以通过本发明的实践来学习。借助于所附权利要求中特别指出的器械和组合，可以实现且获得特点和优点。这些和其它特点根据下述描述和所附权利要求将变得更加明显，或者可以通过如下文阐述的本发明的实践来学习。
附图简述
图1显示了可用于自包含PCR的柔性小袋。
图2是与图1的小袋一起使用的器械的分解透视图，包括图1的小袋。
图3显示了图2的器械的局部横截面视图，包括图2的气囊部件与图1的小袋。
图4显示了在图2的器械的一个说明性实施方案中使用的电动机。
图5显示了阳性ECM区段序列设计。
图6A显示了用于将样品装载到图1的小袋内的装载小瓶。
图6B显示了图6A的装载小瓶的分解图。
图7A和7B示出了在靶窗口内（图7B）的克里米亚-刚果出血热（CCHF）病毒的扩增（图7A）和扩增子解链（图7B）。
图7C和7D示出了在靶窗口外部（图7D）的CCHF1外部对照材料（ECM）的扩增（图7C）和扩增子解链（图7D）。
图7E示出了在ECM特异性解链窗口内部的CCHF1外部对照材料（ECM）的扩增子解链。
图8示出了多重化ECM混合物的解链；ECM混合物以第一阶段和第二阶段的多重形式进行扩增，并且在与图1中所示的小袋类似的小袋中解链。
图9A和9B示出了在与图1中所示的小袋类似的小袋中，多重化ECM混合物的扩增和扩增子解链。
图9C和9D以及9E和9F示出了关于图9A和9B的ECM混合物的各个扩增子的扩增曲线和解链曲线，其中关于ECM扩增子的解链体（melt）（图9D和9F）出现在关于相应天然序列的预计解链窗口的外部。
图10A和10B示出了关于埃博拉病毒的多重毒株的ECM的ECM扩增子的解链曲线；在与图1的小袋类似的小袋中，配置用于检测埃博拉的第二阶段孔包括用于扩增两种埃博拉毒株的引物组，其中ECM解链体彼此可区别并且在预计的解链窗口外部。
图11示出了关于间日疟原虫（Plasmodium vivax）和卵形疟原虫（Plasmodiumovale）的ECM的ECM扩增子的解链曲线；在与图1的小袋类似的小袋中，配置用于检测疟原虫属（Plasmodium）物种的第二阶段孔包括用于扩增两种间日疟原虫和卵形疟原虫的引物组，其中ECM解链体彼此可区别并且在预计的解链窗口外部。
详述
下文参考附图描述了示例性实施方案。许多不同的形式和实施方案是可能的，而不脱离本公开内容的精神和教导，并且因此公开内容不应被解释为限于本文阐述的示例性实施方案。相反，提供这些示例性实施方案使得本公开内容将是彻底和完整的，并且将本公开内容的范围传达给本领域技术人员。在附图中，为了清楚起见，可放大层和区域的尺寸和相对尺寸。在说明书自始至终，相同的参考数目指的是相同的元件。
除非另有定义，否则本文使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。将进一步理解，术语例如在通常使用的词典中定义的那些，应当被解释为具有与其在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应该以理想化或过度形式化的意义来解释，除非在本文中明确如此定义。本文的本发明描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不预期限制本发明。虽然本文仅描述了某些示例性材料和方法，但与本文描述的那些类似或等价的许多方法和材料可以用于本公开内容的实践中。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利或其它参考文献都整体引入作为参考。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
本公开内容的各个方面，包括装置、系统、方法等可以参考一个或多个示例性实现来说明。如本文使用的，术语“示例性”和“说明性”意指“充当示例、实例或说明”，并且不一定应该解释为比本文公开的其它实现优选或有利。另外，对本公开内容或本发明的“实现”或“实施方案”的提及包括对其一个或多个实施方案的具体提及，且反之亦然，并且预期提供说明性示例而不限制本发明的范围，所述本发明的范围由所附权利要求而不是下述描述指示。
应注意，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，对“分块”的提及包括一个、两个或更多个分块。类似地，除非内容和/或上下文另有明确说明，否则对多个指示物的提及应该被解释为包括单个指示物和/或多个指示物。因此，对“分块”的提及不一定需要多个此类分块。相反，应理解，不依赖于缀合；本文考虑了一个或多个分块。
如在本申请自始至终使用的，词语“可以”和“可能”以允许性意义（即，意味着具有潜力），而不是强制性意义（即，意味着必须）使用。另外，术语“包括（including）”、“具有（having）”、“涉及（involving）”、“含有（containing）”、“特征在于”、其变体（例如，“包括”（includes）、“具有（has）”、“涉及（involves）”、“含有（contains）”等）、以及如本文包括权利要求使用的类似术语，应为包容性和/或开放性的，应具有与词语“包含（comprising）”及其变体（例如“包含（comprise）”和“包含（comprises）”）相同的含义，并且不排除另外的未叙述的说明性元件或方法步骤。
如本文使用的，方向和/或任意术语，例如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“内”、“外”、“内部”、“外部”、“内在”、“外在”、“近端”、“远端”、“前面”、“背面”等等可以仅用于指示相对方向和/或取向，并且可以不在其它方面预期限制本公开内容，包括说明书、发明和/或权利要求的范围。
应理解，当元件被称为“联接”、“连接”或“响应”另一个元件或“在另一个元件上”时，它可以直接联接、连接、或响应另一个元件或在另一个元件上，或者也可以存在插入元件。相反，当元件被称为“直接联接”、“直接连接”或“直接响应”另一个元件或“直接在另一个元件上”时，不存在插入元件。
本发明构思的示例性实施方案在本文中参考横截面图示进行描述，所述横截面图示是示例性实施方案的理想化实施方案（和中间结构）的示意图。像这样，预期由于例如制造技术和/或公差与图示形状的变化。因此，本发明构思的示例性实施方案不应被解释为限于本文示出的区域的特定形状，而是包括例如起因于制造的在形状中的偏差。相应地，附图中示出的区域本质上是示意性的，并且它们的形状不预期示出装置的区域的实际形状，并且不预期限制示例性实施方案的范围。
应理解，尽管术语“第一”、“第二”等在本文中可以用于描述各种元件，但这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于区别一个元件与另一个元件。因此，“第一”元件可以被称为“第二”元件，而不脱离本实施方案的教导。
还应理解，本文描述的各种实现可以与所描述或公开的任何其它实现组合利用，而不脱离本公开内容的范围。因此，根据本公开内容的某些实现的产品、构件、元件、装置、仪器、系统、方法、过程、组合物和/或试剂盒可以包括、掺入或以其它方式包含本文公开的其它实现（包括系统、方法、仪器和/或类似物）中描述的性质、特点、部件、构件、元件、步骤和/或类似物，而不脱离本公开内容的范围。因此，对与一个实现有关的特定特点的提及不应被解释为仅限于在所述实现内的应用。
本文使用的标题仅用于组织目的，并不意味着用于限制说明书或权利要求的范围。为了便于理解，在可能时，相同的参考数目已用于指定附图共有的相同元件。此外，在可能时，在各个图中已使用了元件的相同编号。此外，特定元件的替代配置可以各自包括附加到元件编号的分开字母。
术语“约”在本文中用于意指大约、在大致或周围的区域。当术语“约”与数目范围结合使用时，它通过扩展在所述数目的之上和之下的边界来修改该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于将所述值之上和之下的数值修改5%的变化。当表达此类范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一个实施方案。应进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点并且独立于另一个端点均为有意义的。
如本文使用的，词语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
“样品”意指动物；来自动物的组织或器官；细胞（在受试者体内、直接取自受试者、或维持在培养物中或来自培养细胞系的细胞）；细胞裂解产物（或裂解产物级分）或细胞提取物；含有衍生自细胞、细胞材料或病毒材料（例如多肽或核酸）的一种或多种分子的溶液；或者含有非天然存在的核酸、药物或药剂以及药物加工前体（例如生物制品、药物、注射剂、生物反应器组分等）的溶液，其可以如本文所述进行测定。样品也可以是任何体液或排泄物（例如，但不限于血液、尿、粪便、唾液、泪、胆汁或脑脊髓液），其可能含有或不含有宿主或病原体细胞、细胞组分或核酸。样品也可以包括环境样品，例如但不限于土壤、水（淡水、废水等）、空气监测系统样品（例如，空气过滤介质中捕获的材料）、表面拭子和传染媒介（例如，蚊子、蜱、跳蚤等）。
如本文使用的，短语“核酸”指天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA还是RNA或DNA-RNA杂交体、单链或双链、有义或反义，其能够通过沃森-克里克碱基配对与互补核酸杂交。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物（例如BrdU）以及非磷酸二酯核苷间键合（例如肽核酸（PNA）或硫代二酯键合）。特别地，核酸可以包括但不限于DNA、RNA、mRNA、rRNA、cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何组合。
“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指具有限定序列的单链核酸分子，其可以与含有互补序列的第二核酸分子（“靶”）碱基配对。所得到的杂交体的稳定性取决于长度、GC含量和碱基配对发生的程度。碱基配对的程度受参数例如探针和靶分子之间的互补程度以及杂交条件的严格程度影响。杂交严格程度受参数例如温度、盐浓度和有机分子如甲酰胺的浓度影响，并且通过本领域技术人员已知的方法测定。探针、引物和寡核苷酸可以通过本领域技术人员众所周知的方法，放射性、荧光或非放射性地可检测标记。dsDNA结合染料可以用于检测dsDNA。应理解，“引物”特别配置为通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以如此配置或不如此配置。
“dsDNA结合染料”意指当与双链DNA结合时比与单链DNA结合或在溶液中游离时差异发荧光的染料，通常通过更强烈地发荧光。虽然提及了dsDNA结合染料，但应理解本文可以使用任何合适的染料，其中一些非限制性说明性染料描述于美国专利号7,387,887中，其引入本文作为参考。其它产生信号的物质可以用于检测核酸扩增和解链，示例性地酶、抗体等，如本领域已知的。
“特异性杂交”意指探针、引物或寡核苷酸在高严格条件下识别基本上互补的核酸（例如，样品核酸）并与其物理相互作用（即，碱基配对），并且基本上不与其它核酸碱基配对。
“高严格条件”通常意指在约解链温度（Tm）减5℃下（即，比探针的Tm低5°）下发生。在功能上，高严格条件用于鉴定具有至少80%序列同一性的核酸序列。
如本文使用的，术语‘规范序列’（术语‘共有序列’是同义词，并且也是本领域中常用的）指在序列比对中在每个位置处发现的最频繁核苷酸残基的计算次序。规范序列代表多重序列比对的结果，其中相关序列相互比较，并且计算相似的序列基序。本文所提及的实验对象组经常被设计为检测一组生物。对于实验对象组中的每种生物，该生物的已知变体通常在由实验对象组扩增的扩增子内具有一些序列差异。因此，对于大多数测定，提及一种病原体序列一般是不准确的，因为实验对象组中的每种病原体都代表紧密相关的序列变体的群体。因此，关于给定生物的扩增子代表在检测到的群体内的所有变体 – 即规范序列。虽然术语‘规范序列’一般可能是更准确的，但术语‘病原体序列’在本文中同义使用。尽管许多测定使用规范序列，但一些测定可以使用天然序列，特别是当对于特定靶序列在所包括的菌株之间存在很少变异时。术语‘规范序列’还意欲包括此类序列。
虽然PCR是本文实例中使用的扩增方法，但应理解使用引物的任何扩增方法都是合适的。此类合适的程序包括聚合酶链反应（PCR）；链置换扩增（SDA）；基于核酸序列的扩增（NASBA）；级联滚环扩增（CRCA）、DNA环介导的等温扩增（LAMP）；等温和嵌合引物引发的核酸扩增（ICAN）；基于靶的解旋酶依赖性扩增（HDA）；转录介导的扩增（TMA）等等。因此，当使用术语PCR时，它应理解为包括其它替代扩增方法。对于不含不连续循环的扩增方法，可以使用其中测量以循环、倍增时间或交叉点（Cp）进行的反应时间，并且可以添加其中在本文描述的实施方案中添加另外的PCR循环的另外反应时间。应理解可能需要相应地调整方案。
如本文使用的，术语“交叉点”（Cp）（或可替代地，循环阈值（Ct）、定量循环（Cq）或本领域中使用的同义术语）指对于给定的PCR产物（例如靶或内部标准），获得高于某个阈值的荧光信号所需的PCR循环数，如在实验上确定的。其中每个反应上升高于阈值的循环取决于在PCR反应开始时存在的靶（即反应模板）的量。阈值通常可以设置为其中可检测到高于背景荧光的产物的荧光信号的点；然而，可以采用其它阈值。作为设置略微任意的阈值的替代方案，可以通过计算在其下一阶、二阶或n阶导数具有其最大值的反应点来确定Cp，其确定在其下扩增曲线的曲率是最大的循环。美国专利号6,303,305中教导了说明性的衍生方法，所述美国专利整体引入本文作为参考。然而，只要对于待比较的所有反应使用相同的阈值，通常在何处或如何设置阈值不太重要。如本领域中已知的，也可以使用其它点，并且在本文讨论的任何方法中，任何此类点可以取代Cp、Ct或Cq。
虽然本文的各种实例提及人靶和人病原体，但这些实例仅是说明性的。本文描述的方法、试剂盒和装置可以用于检测和测序来自广泛多种样品，包括人、兽医、工业和环境的广泛多种核酸序列。
本文公开的各种实施方案使用独立的核酸分析小袋来测定样品中各种生物物质的存在，说明性地抗原和核酸序列，说明性地在单个封闭系统中。此类系统，包括小袋，用于装载此类小袋的方法和装置，以及用于与小袋一起使用的器械更详细地公开于美国专利号8,394,608；和8,895,295；以及美国专利公开号2014-0283945中，所述专利引入本文作为参考。然而，应理解，此类小袋仅是说明性的，并且本文讨论的核酸制备和扩增反应可以在如本领域已知的各种开放或封闭系统样品器皿中的任一种中执行，包括96孔板、其它配置的平板、阵列、转盘等等，使用各种核酸纯化和扩增系统，如本领域已知的。
虽然本文使用术语“样品孔”、“扩增孔”、“扩增容器”、“反应室”、“反应区”等等，但这些术语意欲涵盖如这些扩增系统中使用的孔、管和各种其它反应容器。在一个实施方案中，小袋可以是包括一个或多个反应容器或反应区的测定装置。在一个实施方案中，小袋可以是柔性容器。例如，小袋/柔性容器可以包括在两个或更多个柔性材料层之间形成的一个或多个样品孔、扩增孔、扩增容器、反应室、反应区等等。在一个实施方案中，小袋用于测定多种病原体。小袋可以包括用作样品孔的一个或多个泡罩，说明性地在封闭系统中。说明性地，可以在任选的一次性使用的小袋中执行各种步骤，包括核酸制备、初级大体积多重PCR、初级扩增产物的稀释和二次PCR，最后为任选的实时检测或扩增后分析例如解链曲线分析。此外，应理解，虽然可以在本发明的小袋中执行各个步骤，但对于某些用途可以省略一个或多个步骤，并且小袋配置可以相应地改变。
图1显示了可以在各种实施方案中使用，或者可以对于各种实施方案重新配置的说明性小袋510。小袋510类似于美国专利号8,895,295的图15，其中相同的项目编号相同。配件590提供有入口通道515a到515l，其也充当试剂贮存器或废物贮存器。说明性地，试剂可以在配件590中冷冻干燥并且在使用前再水合。泡罩522、544、546、548、564和566以及它们各自的通道514、538、543、552、553、562和565类似于美国专利号8,895,295的图15的相同编号的泡罩。图1的第二阶段反应区580类似于美国专利申请号8,895,295的那种，但高密度阵列581的第二阶段反应区582以稍微不同的图案排列。图1的高密度阵列581的更圆形图案消除了拐角处的孔，并且可以导致第二阶段孔582的更均匀填充。如所示，高密度阵列581提供有102个第二阶段孔582。小袋510适用于FilmArray®器械（BioFire Diagnostics，LLC，Salt Lake City，UT）。然而，应理解，小袋实施方案仅是说明性的。
虽然可以使用其它容器，但说明性地，小袋510可以由两层柔性塑料薄膜或其它柔性材料形成，所述其它柔性材料例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、其混合物、组合和层，其可以通过本领域已知的任何方法制备，所述方法包括挤出、等离子体沉积和层压。例如，每层可以由层压在一起的单一类型或多于一种类型的一层或多层材料组成。也可以使用具有铝层压结构的金属箔或塑料。其它阻隔材料是本领域已知的，其可以密封在一起以形成泡罩和通道。如果使用塑料薄膜，则可以说明性地通过热封将这些层粘合在一起。说明性地，该材料具有低核酸结合能力。
对于采用荧光监测的实施方案，优选吸光度足够低且在操作波长下自发荧光的塑料薄膜。可以通过测试不同的塑料、不同的增塑剂和复合比率以及不同厚度的薄膜来鉴定此类材料。对于具有铝或其它箔层压结构的塑料，待通过荧光检测装置读取的小袋的部分可以无需箔而留下。例如，如果在小袋510的第二阶段反应区580的第二阶段孔582中监测到荧光，则在孔582处的一个或两个层将无需箔而留下。在PCR的例子中，由约0.0048英寸（0.1219 mm）厚的聚酯（Mylar，DuPont，Wilmington DE）和0.001-0.003英寸（0.025-0.076mm）厚的聚丙烯薄膜组成的薄膜层压结构表现良好。说明性地，小袋510可以由能够透射大约80%-90%的入射光的透明材料制成。
在说明性实施方案中，通过在泡罩和通道上施加压力，说明性地气动压力，使材料在泡罩之间移动。相应地，在采用压力的实施方案中，小袋材料说明性地足够柔性，以允许压力具有所需效应。术语“柔性”在本文中用于描述小袋的材料的物理特征。术语“柔性”在本文中定义为易于通过本文使用的压力水平变形，而不破裂、破坏、开裂等等。例如，薄的塑料片，例如Saran™包装和Ziploc®袋，以及薄金属箔，例如铝箔，是柔性的。然而，即使在采用气动压力的实施方案中，仅泡罩和通道的某些区域需要是柔性的。此外，泡罩和通道的仅一侧需要是柔性的，只要泡罩和通道易于变形。小袋510的其它区域可以由刚性材料制成，或者可以用刚性材料强化。因此，应理解，当使用术语“柔性小袋”或“柔性样品容器”等等时，仅小袋或样品容器的一部分需要是柔性的。
说明性地，塑料薄膜可以用于小袋510。可以研磨或以其它方式切割金属片，示例性地铝或其它合适材料，以产生具有凸起表面图案的模具。当安装到气动压力机（说明性地A-5302-PDS，Janesville Tool Inc.，Milton WI）时，说明性地在195℃的操作温度下调节，气动压力机像印刷机一样工作，熔化模具仅在其中接触薄膜的塑料薄膜的密封表面。同样地，可以使用激光切割和焊接装置，将用于小袋510的塑料薄膜切割并焊接在一起。随着小袋510形成，各种组分，例如PCR引物（说明性地点在薄膜上并干燥）、抗原结合基底、磁珠和硅酸锆珠可以密封在各种泡罩内。用于样品处理的试剂可以在密封之前共同地或分开地点在薄膜上。在一个实施方案中，核苷酸三磷酸将（NTP）与聚合酶和引物分开点在薄膜上，基本上消除了聚合酶的活性，直到反应可以由含水样品水合。如果含水样品在水合之前已加热，则这为真正的热启动PCR创造了条件，并且减少或消除了对于昂贵的化学热启动组分的需求。在另一个实施方案中，组分可以以粉末或丸剂形式提供，并且在最终密封之前置于泡罩内。
小袋510可以以与美国专利号8,895,295中描述的那种类似的方式使用。在一个说明性实施方案中，将包含待测试样品（100 μl）和裂解缓冲液（200 μl）的300 μl混合物注入入口通道515a附近的配件590中的注入口（未示出），并且将样品混合物抽取到入口通道515a内。水也被注入到与入口通道515l相邻的配件590的第二注入口（未示出）内，并且经由配件590中提供的通道（未示出）分配，从而水合高达11种不同的试剂，所述试剂各自先前在入口通道515b到515l处以干燥形式提供。美国专利公开号2014/0283945中公开了用于注入样品和水合流体（例如水或缓冲液）的说明性方法和装置，所述美国专利公开已经在上文整体引入本文作为参考，尽管应理解，这些方法和装置仅是说明性的，并且将样品和水合流体引入小袋510内的其它方式也在本公开内容的范围内。这些试剂说明性地可以包括冷冻干燥的PCR试剂、DNA提取试剂、洗涤溶液、免疫测定试剂或其它化学实体。说明性地，所述试剂用于核酸提取、第一阶段多重PCR、多重反应的稀释、和第二阶段PCR试剂的制备以及对照反应。在图1所示的实施方案中，所有需要注入的是一个注入口中的样品溶液和另一个注入口中的水。注入后，可以密封两个注入口。关于小袋510和配件590的各种配置的更多信息，参见已经引入作为参考的美国专利号8,895,295。
在注入后，样品可以经由通道514从注入通道515a移动到裂解泡罩522。裂解泡罩522提供有珠或颗粒534，例如陶瓷珠或其它研磨元件，并且配置为使用在FilmArray®器械中提供的旋转叶片或桨叶，经由撞击用于涡旋。通过在裂解颗粒如硅酸锆（ZS）珠534的存在下，样品的摇动、涡旋、超声处理和类似处理的珠磨是形成裂解产物的有效方法。应理解，如本文使用的，术语例如“裂解（lyse）”、“裂解（lysing）”和“裂解产物”并不限于破裂细胞，相反此类术语包括非细胞颗粒例如病毒的破坏。
图4显示了珠击打电动机819，其包括叶片821，所述叶片821可以安装在图2中所示的器械800的支撑构件802的第一侧811上。叶片可以延伸穿过槽804以接触小袋510。然而，应理解，电动机819可以安装在器械800的其它结构上。在一个说明性实施方案中，电动机819是安装在支撑构件802上的Mabuchi RC-280SA-2865 DC Motor（Chiba，日本）。在一个说明性实施方案中，电动机以5,000至25,000 rpm，更说明性地10,000至20,000 rpm，且再更说明性地大约15,000至18,000 rpm转动。对于Mabuchi电动机，已发现7.2V提供足够的rpm用于裂解。然而，应理解，当叶片821撞击小袋510时，实际速度可能稍微慢一些。取决于所使用的电动机和桨叶，其它电压和速度可以用于裂解。任选地，可以将受控的小体积空气提供到与裂解泡罩522相邻的气囊822内。已发现，在一些实施方案中，用一个或多个小体积空气部分填充相邻气囊帮助在裂解过程期间定位和支撑裂解泡罩。可替代地，其它结构，说明性地裂解泡罩522周围的刚性或顺应性垫圈或其它保持结构，可以用于在裂解期间约束小袋510。还应理解，电动机819仅是说明性的，并且其它装置可以用于研磨、摇动或涡旋样品。在一些实施方案中，除机械裂解之外或代替机械裂解，还可以使用化学制品或热。
一旦样品材料已被充分裂解，样品就移动到核酸提取区，说明性地通过通道538、泡罩544和通道543到泡罩546，在其中样品与核酸结合物质，例如二氧化硅涂布的磁珠533混合。可替代地，磁珠533可以说明性地使用从入口通道515c-515e之一提供的流体进行再水合，然后通过通道543移动到泡罩544，然后通过通道538移动到泡罩522。允许混合物温育适当的时间长度，说明性地大约10秒至10分钟。位于与泡罩546相邻的器械内的可伸缩磁体从溶液中捕获磁珠533，形成抵靠泡罩546内表面的团块。如果温育在泡罩522中发生，则溶液的多重部分可能需要移动到泡罩546用于捕获。然后将液体移出泡罩546并且通过泡罩544返回并进入泡罩522内，所述泡罩522现在用作废物容器。来自注入通道515c至515e中的一个或多个的一种或多种洗涤缓冲液经由泡罩544和通道543提供至泡罩546。任选地，使磁体缩回，并且通过经由通道543从泡罩544和546来回移动珠来清洗磁珠533。一旦磁珠533被洗涤，就通过启动磁体将磁珠533重新捕获在泡罩546中，然后将洗涤溶液移至泡罩522。可以根据需要重复该过程，以从核酸结合磁珠533中洗涤裂解缓冲液和样品碎片。
在洗涤后，将贮存在注入通道515f中的洗脱缓冲液移至泡罩548，并且使磁体缩回。溶液经由通道552在泡罩546和548之间循环，打碎泡罩546中的磁珠533的团块，并且允许捕获的核酸与珠脱离并进入溶液内。再次启动磁体，捕获泡罩546中的磁珠533，并且将洗脱的核酸溶液移入泡罩548内。
将来自注入通道515g的第一阶段PCR主混合物与泡罩548中的核酸样品混合。任选地，通过经由通道553迫使混合物在548和564之间来混合混合物。在几个混合循环之后，溶液包含在泡罩564中，在其中提供第一阶段PCR引物的团块，对于每个靶的至少一组引物，并且执行第一阶段多重PCR。如果存在RNA靶，则可以在第一阶段多重PCR之前或同时执行RT步骤。FilmArray®器械中的第一阶段多重PCR温度循环说明性地执行15-20个循环，尽管根据具体应用的要求，其它水平的扩增可能是期望的。如本领域已知的，第一阶段PCR主混合物可以是各种主混合物中的任一种。在一个说明性实例中，第一阶段PCR主混合物可以是US2015/0118715中公开的任何化学物质，所述专利引入本文作为参考，用于与每个循环花费20秒或更少的PCR方案一起使用。
在第一阶段PCR已进行所需数目的循环后，可以将样品稀释，说明性地通过迫使大部分样品回到泡罩548内，在泡罩564中仅留下少量，并且从注入通道515i添加第二阶段PCR主混合物。可替代地，可以将来自515i的稀释缓冲液移至泡罩566，然后通过在泡罩564和566之间来回移动流体，与泡罩564中的扩增样品混合。如果需要的话，可以使用来自注入通道515j和515k的稀释缓冲液重复稀释几次，或者可以保留注入通道515k说明性地用于测序或用于其它PCR后分析，然后将来自注入通道515h的第二阶段PCR主混合物添加到一些或全部稀释的扩增样品中。应理解，可以通过改变稀释步骤的数目，或通过在与稀释缓冲液或第二阶段PCR主混合物混合之前改变丢弃的样品百分比来调节稀释水平，所述第二阶段PCR主混合物包含用于扩增的组分，说明性地聚合酶、dNTP和合适的缓冲液，尽管其它组分可能是合适的，特别是对于非PCR扩增方法。如果需要的话，样品和第二阶段PCR主混合物的这种混合物可以在移动到第二阶段孔582之前在泡罩564中预热，用于第二阶段扩增。此类预热可以避免在第二阶段PCR混合物中热启动组分（抗体、化学或其它）的需要。
说明性的第二阶段PCR主混合物是不完整的，缺少引物对，并且102个第二阶段孔582中的每一个预加载有特异性PCR引物对。如果需要的话，第二阶段PCR主混合物可以缺少其它反应组分，并且这些组分也可以预加载在第二阶段孔582中。每个引物对可以与第一阶段PCR引物对相似或相同，或者可以嵌套在第一阶段引物对内。样品从泡罩564移动到第二阶段孔582完成PCR反应混合物。一旦填充了高密度阵列581，就通过任何数目的手段将个别第二阶段反应密封在它们各自的第二阶段泡罩中，如本领域已知的。在已经引入作为参考的美国专利号8,895,295中讨论了填充和密封高密度阵列581而无交叉污染的说明性方法。说明性地，高密度阵列581的孔582中的各种反应同时或个别地进行热循环，说明性地使用一个或多个Peltier装置，尽管用于热循环的其它装置是本领域已知的。
在某些实施方案中，第二阶段PCR主混合物含有dsDNA结合染料LCGreen® Plus（BioFire Diagnostics，LLC），以生成指示扩增的信号。然而，应理解，该染料仅是说明性的，并且可以使用其它信号，包括其它dsDNA结合染料和荧光、放射性、化学发光、酶促等等标记的探针，如本领域已知的。可替代地，阵列581的孔582可以无需信号而提供，其中结果通过后续处理报告。
当气动压力用于移动小袋510内的材料时，在一个实施方案中，可以采用“气囊”。气囊组件810，其一部分在图2-3中示出，包括容纳多个可充气气囊822、844、846、848、864和866的气囊板824，所述气囊各自可以个别地充气，说明性地通过压缩气体源。因为气囊组件810可以经受压缩气体并且多次使用，所以气囊组件810可以由比小袋更坚韧或更厚的材料制成。可替代地，气囊822、844、846、848、864和866可以由用垫圈、密封件、阀和活塞紧固在一起的一系列板形成。其它布置也在本发明的范围内。可替代地，阵列或机械致动器和密封件可以用于密封通道，并且指导泡罩之间的流体运动。在WO 2018/022971中详细描述了可能适合本文所述的器械的机械密封件和致动器的系统，所述专利整体引入本文作为参考。
次级PCR反应的成功取决于由多重第一阶段反应生成的模板。通常，使用高纯度的DNA执行PCR。方法例如苯酚提取或商业DNA提取试剂盒提供了高纯度的DNA。通过小袋510处理的样品可能需要调整以补偿较不纯的制剂。PCR可以被生物样品的组分抑制，这是潜在的障碍。说明性地，热启动PCR、更高浓度的Taq聚合酶、MgCl2浓度中的调节、引物浓度中的调节和佐剂（例如DMSO、TMSO或甘油）的添加任选地可以用于补偿较低的核酸纯度。虽然纯度问题可能更多是第一阶段扩增的关注，但应理解，也可以在第二阶段扩增中提供类似的调节。
当将小袋510放置在器械800内时，将气囊组件810压靠在小袋510的一个面上，使得如果特定的气囊膨胀，则压力将迫使液体从小袋510中的相应泡罩中流出。除对应于小袋510的许多泡罩的气囊之外，气囊组件810可以具有另外的气动致动器，例如气囊或气动驱动的活塞，对应于小袋510的各种通道。图2-3显示了说明性的多个活塞或硬密封件838、843、852、853、862和865，其对应于小袋510的通道538、543、552、553、562和565，以及密封件871、872、873、874，其最小化进入配件590内的回流。当启动时，硬密封件838、843、852、853、862和865形成夹管阀，以夹断且关闭相应的通道。为了将液体约束在小袋510的特定泡罩内，硬密封件在来回泡罩的通道上被启动，使得致动器充当夹管阀以将通道关闭。说明性地，为了在不同的泡罩中混合两个体积的液体，密封连接通道的夹管阀致动器被启动，并且泡罩上方的气动气囊被交替加压，迫使液体来回通过连接泡罩的通道，以混合在其中的液体。夹管阀致动器可以具有各种形状和尺寸，并且可以配置成一次夹断多于一个通道。虽然本文讨论了气动致动器，但应理解，考虑了向小袋提供压力的其它方式，包括各种机电致动器，例如线性步进电动机，电动机驱动的凸轮，由气动、液压或电磁力驱动的刚性桨叶，辊，摇臂，以及在某些情况下，旋塞弹簧。另外，除施加垂直于通道轴线的压力之外，还存在可逆或不可逆地关闭通道的各种方法。这些包括将袋子扭转跨越通道，热封，轧制致动器以及密封在通道中的各种物理阀，例如蝶形阀和球阀。另外，小型Peltier装置或其它温度调节器可以放置在通道附近，并且设定在足以冷冻流体的温度，有效地形成密封。另外，虽然图1的设计适于定位在每个泡罩和通道上的致动器元件特征性的自动化器械，但也考虑了致动器可以保持静止，并且小袋510可以这样过渡，使得少量致动器可以用于几个加工站，包括样品破坏、核酸捕获、第一和第二阶段PCR、以及用于小袋510的其它应用的加工站例如免疫测定和免疫PCR。作用于通道和泡罩的辊可以证明在其中小袋510在工位之间平移的配置中特别有用。因此，尽管在当前公开的实施方案中使用气动致动器，但当术语“气动致动器”在本文中使用时，应理解，可以使用其它致动器和提供压力的其它方式，取决于小袋和器械的配置。
返回到图2，每个气动致动器经由阀899连接到压缩空气源895。虽然图2中仅显示了几个软管878，但应理解，每个气动配件经由软管878连接到压缩气体源895。压缩气体源895可以是压缩机，或者可替代地，压缩气体源895可以是压缩气体气筒，例如二氧化碳筒。如果需要便携性，则压缩气筒是特别有用的。其它压缩气体源也在本发明的范围内。类似的气动控制可以在图1-4的实施方案中提供，用于控制小袋510中的流体，或者可以提供其它致动器、伺服器等等。
器械800的几个其它部件也连接到压缩气体源895。安装在支撑构件802的第二侧814上的磁体850说明性地使用经由软管878来自压缩气体源895的气体展开和缩回，尽管移动磁铁850的其它方法是本领域已知的。磁体850位于支撑构件802中的凹部851中。应理解，凹部851可以是穿过支撑构件802的通道，使得磁体850可以接触小袋510的泡罩546。然而，取决于支撑构件802的材料，应理解，凹部851不需要一直延伸穿过支撑构件802，只要当磁体850展开时，磁体850足够接近以在泡罩546处提供足够的磁场，并且当磁体850完全缩回时，磁体850不显著影响泡罩546中存在的任何磁珠533。虽然提及了缩回磁体850，但应理解，可以使用电磁体，并且可以通过控制通过电磁体的电流来启动和停用电磁体。因此，虽然本说明书讨论了撤回或缩回磁体，但应理解这些术语足够宽泛，以掺入撤回磁场的其它方式。应理解，气动连接可以是气动软管或气动空气歧管，因此减少了所需的软管或阀数目。应理解，在图12-16的实施方案中可以使用类似的磁体和用于激活磁体的方法。
气动活塞阵列869的各种气动活塞868也经由软管878连接到压缩气体源895。虽然仅显示了将气动活塞868连接到压缩气体源895的两个软管878，但应理解气动活塞868各自连接到压缩气体源895。显示了十二个气动活塞868。
一对温度控制元件安装在支撑件802的第二侧814上。如本文使用的，术语“温度控制元件”指向样品添加热或从样品中去除热的装置。温度控制元件的说明性实例包括但不限于加热器、冷却器、珀尔帖装置、电阻加热器、感应加热器、电磁加热器、薄膜加热器、印刷元件加热器、正温度系数加热器及其组合。温度控制元件可以包括多重加热器、冷却器、珀尔帖等。在一个方面，给定的温度控制元件可以包括多于一个类型的加热器或冷却器。例如，温度控制元件的说明性实例可以包括珀尔帖装置，连同施加到珀尔帖的顶面和/或底面的分开的电阻加热器。尽管在说明书自始至终使用术语“加热器”，但应理解，其它温度控制元件可以用于调整样品的温度。
如上文讨论的，第一阶段加热器886可以定位于加热且冷却泡罩564的内容物，用于第一阶段PCR。如图2中可见的，第二阶段加热器888可以定位于加热且冷却小袋510的阵列581的第二阶段泡罩582的内容物，用于第二阶段PCR。然而，应理解，这些加热器也可以用于其它加热目的，并且如对于特定应用适当的，可以包括其它加热器。
如上文讨论的，虽然在两个或更多个温度之间热循环的珀尔帖装置对于PCR是有效的，但在一些实施方案中可能期望将加热器维持在恒定温度下。说明性地，这可以通过消除转变加热器温度所需的时间超过转变样品温度所需的时间用于减少运行时间。另外，此类布置可以改善系统的电效率，因为仅需要热循环较小的样品和样品容器，而不需要大得多的（更多热质量）珀尔帖装置。例如，器械可以包括相对于小袋定位以完成热循环的多重加热器（即，两个或更多个），其温度设置用于例如退火、延伸、变性。两个加热器对于许多应用可能是足够的。在各种实施方案中，加热器可以移动，小袋可以移动，或者流体可以相对于加热器移动，以完成热循环。说明性地，加热器可以线性地、以环状布置等等布置。合适加热器的类型已在上文参考第一阶段PCR进行讨论。
当需要荧光检测时，可以提供光学阵列890。如图2中所示，光学阵列890包括光源898，说明性地经过滤的LED光源、经过滤的白光或激光照射以及照相机896。照相机896说明性地具有多个光电探测器，其各自对应于小袋510中的第二阶段孔582。可替代地，照相机896可以拍摄含有所有第二阶段孔582的图像，并且图像可以被分成对应于每个第二阶段孔582的分开视野。取决于配置，光学阵列890可以是静止的，或者光学阵列890可以放置在附接到一个或多个电动机的移动器上，并且移动以从每个个别第二阶段孔582获得信号。应理解，其它布置也是可能的。例如，在一些实施方案中，第二阶段加热器可以在小袋510中与图2中所示的那种相对的侧上。此类取向仅是示例性的，并且可以由器械内的空间约束来确定。假设第二阶段反应区580在光学透明材料中提供，则光检测器和加热器可以在阵列581的任一侧上。
如所示的，计算机894控制压缩空气源895的阀899，并且因此控制器械800的所有气动装置。另外，器械中的许多气动系统在其它实施方案中可以替换为机械致动器、压力施加手段等等。计算机894还控制加热器886和888，以及光学阵列890。这些部件中的每一个都是电连接的，说明性地经由电缆891，尽管其它物理或无线连接也在本发明的范围内。应理解，计算机894可以容纳在器械800内或者可以在器械800外部。此外，计算机894可以包括控制一些或所有组件的内置电路板，并且还可以包括外部计算机，例如台式或膝上型PC，以接收且展示来自光学阵列的数据。可以提供界面，说明性地键盘界面，包括用于输入信息和变量例如温度、循环时间等的键。说明性地，还提供了显示器892。例如，显示器892可以是LED、LCD或其它此类显示器。
其它现有技术器械教导了在密封的柔性容器内的PCR。参见例如，美国专利号6,645,758、6,780,617和9,586,208，其引入本文作为参考。然而，包括在密封的PCR容器内的细胞裂解可以改善易用性和安全性，特别是如果待测试的样品可能含有生物危害。在本文所示的实施方案中，来自细胞裂解以及所有其它步骤的废物保留在密封的小袋内。尽管如此，应理解，可以取出小袋内容物用于进一步测试。
图2显示了可以与小袋510一起使用的说明性器械800。器械800包括支撑构件802，其可以形成壳体的壁或安装在壳体内。器械800还可以包括第二支撑构件（未示出），其任选地可相对于支撑构件802移动，以允许小袋510的插入和撤回。说明性地，一旦小袋510已插入到器械800内，盖子可以覆盖小袋510。在另一个实施方案中，两个支撑构件可以是固定的，其中小袋510通过其它机械手段或通过气动压力固定就位。
在说明性实例中，加热器886和888安装在支撑构件802上。然而，应理解，这种布置仅是说明性的，并且其它布置也是可能的。说明性的加热器包括如本领域已知的珀尔帖和其它块加热器、电阻加热器、电磁加热器和薄膜加热器，以热循环泡罩864和第二阶段反应区580的内容物。具有气囊822、844、846、848、864、866的气囊板810，硬密封件838、843、852、853，以及密封件871、872、873、874形成气囊组件808，其可以说明性地安装在可移动支撑结构上，所述可移动支撑结构可以朝向小袋510移动，使得气动致动器与小袋510接触放置。当小袋510插入器械800内并且可移动支撑构件朝向支撑构件802移动时，小袋510的各种泡罩处于与气囊组件810的各个气囊和组件808的各种密封件相邻的位置，使得气动致动器的启动可以迫使来自小袋510的一个或多个泡罩的液体，或者可以形成具有小袋510的一个或多个通道的夹管阀。在图3中更详细地示出了小袋510的泡罩和通道与组件808的气囊和密封件之间的关系。
质量控制（'QC'）材料对于确保系统的适当性能是必需的，所述系统例如图1中所示的小袋510和图2中所示的器械800。每批小袋（如小袋510）一般都需要在制造时用阳性和阴性QC混合物进行QC测试，以确认小袋根据规格制造，它们不含污染，并且确认测定和器械正确地操作。各个分批和整个小袋批次基于其性能可以通过或未通过QC。
临床实验室和其它实验室也用外部对照材料（‘ECM’）运行QC测试。实验室运行ECM出于与在制造时运行QC材料的原因略微不同的原因。临床实验室一般由认证机构如CLIA要求在提供新测试用于临床使用之前进行验证。同样地，运行ECM以验证测定的性能匹配制造商的要求，验证测定的新批次的性能，验证在新用户的手中或当引入新器械/维修器械时的测定性能，并且检测在样品的处理和测试中的系统故障和/或突出问题。尽管本文提及临床实验室，但应理解，临床实验室是本公开内容的主题的用户的一个说明性实例，并且许多领域中的实验室运行对照材料例如ECM。应理解，本公开内容并不意欲限于临床实验室。
ECM一般是一个或一组匹配的测定阳性和阴性，其可以同时或接近同时运行，以验证测定的性能匹配制造商的要求、或验证批次中的测定不含污染。通常，ECM是已充分表征的临床样品，其已知对于测定设计为检测其的一种或多种病原体呈阳性，掺料到已知阴性临床样本内的活生物或灭活生物或者合成核酸模板。
然而，生物和合成产生的核酸阳性对照具有污染未来测定并产生假阳性的潜力。例如，在扩增后，PCR反应混合物可以含有多达1011至1012个原始靶扩增子的拷贝。同样地，临床标本和生物原种可能含有1011至1012个或更多个模板拷贝/ml。来自这些来源操纵的污染风险与逃逸扩增子几乎一样严重或一样严重。鉴于对于传染性病原体的基于PCR的测定对靶序列的<50个拷贝敏感的需要，这意味着~10-8 μL（大致上一滴的十亿分之一）的扩增后混合物含有足够的靶来污染后续扩增过程，并导致假阳性结果。避免此类携带污染或致使其无害是艰巨挑战。
本文公开的是ECM（‘阳性对照材料’是一类ECM），其包括一组阳性对照序列和匹配的测定阴性。阳性对照序列进行改造，以最小化由于后续测定被ECM污染而检测到假阳性结果的可能性。另外，本文公开的阳性对照序列允许用户区别由生物、包括测试生物的测试样品、衍生自测试生物的测试序列、或天然扩增子的测定污染与由阳性对照序列本身的污染。本文所述的每个阳性对照核酸（例如，DNA或RNA）区段含有由对于一种测定特异性的引物识别且扩增的序列。例如，FilmArray® Respiratory Panel（RP）EZ测试一组14种呼吸道病毒和细菌病原体。RP EZ是呼吸实验对象组（RP）的CLIA豁免版本。CLIA豁免测试如RP EZ可能是用于本文描述的ECM的良好候选物，因为CLIA豁免测试设计为由这样的人员来运行，所述人员不一定具有技术训练，并且因此不一定有资格用于制备或操纵活生物标准。同样地，CLIA豁免测试的场所不一定配备有活生物标准的安全或适当的冷链贮存。然而，应理解，CLIA豁免测试只是本公开内容对于其可能是适当的一种示例性类型的测试。根据本文公开内容的产物可能在跨越多重行业的许多环境中是适当的。
用于RP EZ实验对象组的ECM可以包括由内部引物和外部引物识别且扩增的阳性对照序列，所述引物特异性针对RP EZ实验对象组中的14种不同的呼吸道病毒和细菌病原体中的每一种。ECM序列可以各自包括在外部引物序列的任一侧上的大约10-50（例如25）个碱基对的规范病原体序列，加上关于外部和内部正向和反向引物对的规范病原体序列。然而，应理解，可以使用一步PCR或引物在两步PCR中可以是相同的，在这种情况下，可能仅需要一对引物序列。与生物和天然核酸阳性对照形成对比，本文所述的ECM的两个最里面的引物识别位点内部的原始规范病原体序列替换为不同于原始规范病原体序列的ECM特异性序列。ECM特异性序列可以是合成序列或天然序列，只要它与原始规范病原体序列不同且可检测地区别。
在图5中示出了用于设计ECM区段的方案的实例。在一个实施方案中，当生物序列被重新设计以制备ECM时，关于外部第一阶段PCR引物（5012和5016）和内部第二阶段引物（5014和5018）的结合位点保持基本上不变，但内部引物5014和5018内部的原始病原体序列5024全部或部分替换为阳性ECM特异性序列5010。在说明性实施方案中，ECM特异性序列5010用改造的非天然序列替换内部引物5014和5018内部的整个病原体序列5024。然而，在其它实施方案中（未示出），改造的阳性ECM特异性序列5010可以仅替换病原体序列的一部分，或可以加入病原体序列中。在说明性实施方案中，包含内部引物5014和5018以及阳性ECM特异性序列5010的阳性ECM扩增子5020，具有相对于包含内部引物5014和5018以及病原体序列5024的测试扩增子的改进的解链点。
在一个实施方案中，本文描述的ECM的引物内区域可以替换为合成序列，所述合成序列通过一种或多种物理手段可容易地区别于天然序列。例如，可以用合成序列改变阳性对照的每个天然引物内序列，所述合成序列改变所得到的扩增子的变性特征（Tm）。结果，每个阳性对照序列通过实验对象组中的一组引物对进行扩增（一些实验对象组分析物可能通过多重测定进行查询，需要多重ECM区段以完全测试与该分析物相关的所有引物的存在），但所得到的ECM扩增子是解链转变的，并且优选地在关于病原体扩增子的靶温度解链窗口内未检测到。
如例如图7B和7D中所示，起因于病原体序列的扩增子群体在测定特异性窗口中解链（图7B），而ECM特异性扩增子在关于相应病原体序列的窗口外部的不同温度下解链（图7D）。图7E示出了在由ECM特异性器械软件模块限定的ECM特异性解链窗口中的ECM扩增子的解链检测。在一个实施方案中， ECM特异性插入物可以设计为相对于相应病原体序列的Tm窗口，将ECM特异性扩增子的解链温度窗口上升或下降至少+/-2℃。在另一个实施方案中，ECM特异性扩增子可以在高于或低于相应病原体序列的Tm窗口约2-14℃、2-13℃、2-12℃、2-11℃、2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-14℃、3-13℃、3-12℃、3-11℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-14℃、4-13℃、4-12℃、4-11℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。在一个优选实施方案中，ECM特异性插入物可以设计为相对于相应病原体序列的Tm窗口，将ECM特异性扩增子的解链温度窗口上升或下降至少+/-2℃、至少+/-3℃、或至少+/-4℃。在对于测定的实验对象组设计的通常ECM中，平均Tm转变可能为约+/-6-9℃，其中一些Tm转变在约+/-2℃（例如~2.2-2.5℃）的范围内，而其它转变可能大得多，为约+/-13-14℃（例如~12.8℃）。
本文所述的阳性对照材料中的阳性ECM特异性序列可以用于多重扩增测定中的验证，其中阳性ECM特异性序列可以暴露于约1至40个（例如30个）或更多个不同的引物组。结果，在多重扩增试验中，在改造的ECM特异性序列与引物之间可能存在巨大的交叉反应潜力。在改造的阳性ECM特异性序列之间也可能存在巨大的交叉反应潜力。为了最小化交叉反应，例如但不限于自身相互作用（例如，环形成、二聚化）、与阳性ECM特异性插入序列的引物结合、以及在内部位点处的起始，广泛地筛选关于阳性ECM特异性插入序列的潜在序列。然而，本发明人发现，如果2至40个（例如30个）或更多个不同的外部和内部引物组针对长随机化序列（例如，约1000个碱基对）进行筛选，则基于当前计算能力的比对系统通常失败。为了克服这点，较短的序列（例如，约200 bp）仅针对外部引物进行比对，以鉴定具有最低限度相互作用的关于改造的ECM特异性序列的初始候选物。然而，应了解，计算能力中的增加很可能允许外部引物和内部引物针对较长的序列进行比对。另外，某些DNA序列基序似乎具有较少的交叉引物相互作用，提示它们在自然界中较不常见。例如，CCXCCX/TTXTTX或CCCXCCCX/TTTXTTTX。不均匀的间隔最小化不需要的自身相互作用。例如，GCGCGCGC可以以许多方式相互作用，而GGGCGGGC则不能。一旦发现具有很少的引物相互作用的候选物，就可以通过对序列的靶向修饰来消除个别不需要的引物相互作用。
另外，一些测定具有相对高的解链温度，而其它测定具有相对低的解链温度。因此，可能需要多重ECM特异性序列，其可以根据需要在温度中上下移动解链。最终的解链温度是至少内部引物和ECM特异性插入序列的组合。外部引物和内部引物是固定的，因此每个测定可能需要评估多重ECM特异性插入序列。因此，可以对于每个引物组提供多重ECM特异性插入序列，以便评价解链转变。执行在计算机芯片上（In silico）的解链实验，以计算候选ECM扩增子（即，内部引物 + ECM特异性插入物）的解链转变，以确定候选物是否在相应测试扩增子的解链窗口外部。用这种方法，也可以避免异常的解链行为（例如，肩部）。
一旦最小化潜在的交叉反应，并且在计算机芯片上表征候选ECM扩增子的解链行为，在这种情况下，本发明人发现有限数目的ECM特异性插入序列可以用于改造具有高和低解链特征的ECM扩增子。例如，对于给定的测定实验对象组，可以评价2或3或4或5或6个或更多个（例如3个）低熔点的标准化ECM插入物，以及2或3或4或5或6个或更多个（例如3个）高熔点的标准化ECM插入物。当然，应了解，由于引物和测试序列中的差异，ECM插入序列和ECM扩增子的设计是测定特异性的。因此，对于给定的实验对象组，可能需要更多或更少的低熔点的标准化ECM插入物和高熔点的标准化ECM插入物。
申请人出于多种原因正在开发这些阳性对照。例如，1）允许客户和其它最终用户执行实验室验证，而无需获得且测试需要生物安全3和4级防护的罕见临床标本或分析物，2）降低可以起因于由传统外部对照材料的实验室污染的假阳性结果的风险，所述外部对照材料包括生物或衍生自测试样品中测定的相同生物的材料，3）本文所述的ECM可以这样进行改造，使得它们是室温稳定的，并且4）ECM可以是预制备的，以免用户操纵高浓度原种和临床标本（降低区域污染的风险）。ECM和病原体的检测是相互排斥的。
因此，在一个实施方案中，本文公开了使用阳性对照材料控制多重化PCR系统的方法。该方法包括以下步骤：提供包括第一反应室的测定装置，所述第一反应室提供有用于多重化核酸扩增的多个引物；在第一反应室中扩增多个阳性对照序列，以产生多个阳性对照扩增子，并且检测所述阳性对照扩增子，其中所述阳性对照材料不含测试样品。在一个实施方案中，不含测试样品意指阳性对照材料不含测试生物，也不含来自测试生物的天然序列。如本文所述，对照扩增子可以“衍生自”测试序列，只要引物结合位点可以具有与测试生物相同的序列，但在阳性对照材料的正向引物和反向引物（例如内部引物）之间的序列可以是整体或部分合成的，或者改造为不同于且可区别于天然测试序列。在一个方面，检测到每个阳性对照序列（例如，在反应中由阳性对照序列生成的扩增子）指示多重化PCR系统正确地操作。在另一个方面，由于阳性对照序列中改造序列的存在，每个扩增的阳性对照序列在与其相应测试序列不同的温度下解链。在另外一个方面，可以在测定装置中或在分开的容器中检测关于每个扩增的阳性对照序列的解链信号。
在一个实施方案中，每个阳性对照序列包括改造的序列，其被配置为最小化观察到假阳性结果的可能性。即，改造的序列不同于且可区别于天然测试序列。因此，即使发生来自阳性对照序列的污染和扩增，此类污染和扩增也可容易地区别于测试序列，并且不导致假阳性结果。在一个实施方案中，每个阳性对照序列及其相应的测试序列具有与规范序列相同的正向引物结合位点和反向引物结合位点，并且其中所述改造的序列在正向引物结合位点和反向引物结合位点之间。在一个实施方案中，包括阳性对照序列的阳性对照材料不含测试样品、衍生自测试样品的测试序列、生物（即，该测定设计为检测其的测试生物）或测试测定。即，阳性对照材料一般不在测试序列或测试生物的存在下运行，尽管在某些实施方案中可以这样做。在任何情况下，因为由于阳性对照序列中改造序列的存在，每个扩增的阳性对照序列在与其相应测试序列不同温度下解链，因此阳性对照序列应该可容易地区别于测试序列扩增子。在一个实施方案中，阳性对照序列扩增子（又名ECM特异性扩增子）可以在高于或低于相应测试序列的Tm窗口约2-14℃、2-13℃、2-12℃、2-11℃、2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-14℃、3-13℃、3-12℃、3-11℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-14℃、4-13℃、4-12℃、4-11℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。
在一个实施方案中，扩增步骤包括同时扩增容器中的1-40个或更多个独特的阳性对照序列，例如约2至约10、约3至约20、约4至约30、约5至约40个阳性对照序列、约1至约40个阳性对照序列、或前述范围的任何组合。因为阳性对照序列设计用于多重扩增，所以应了解，改造的序列这样进行设计，使得它们彼此或与反应混合物中的引物序列不交叉反应。即，改造的序列不引入新的引物结合位点，并且正向和反向外部和内部引物结合位点是反应混合物中唯一的引物结合位点。同样地，改造的序列这样进行设计，使得它们不包括自互补区域。
如果多重化核酸扩增系统中的测定适当地制造，并且用于执行扩增反应的器械和检测系统正确地工作，则应该检测到所有阳性对照扩增子。因此，在另一个实施方案中，公开了在多重化核酸扩增系统内检测多个引物的方法。该方法包括以下步骤：提供包含多个阳性对照序列的阳性对照材料，提供包含用于扩增每个阳性对照序列的多个引物的反应容器，在反应容器中扩增多个阳性对照序列，其中所述阳性对照材料不含测试样品（或类似物），并且检测反应容器中关于每个扩增的阳性对照序列的解链信号。检测到关于每个阳性对照序列的解链是存在假定在反应中的每个引物的正面确认。因此，在一个方面，多个阳性对照序列各自的解链信号指示在反应容器中每个相应引物对的存在。在一个实施方案中，多个阳性对照序列以接近测定的检测极限（LOD）的水平提供。预混合且预稀释为含有以选择浓度的选择阳性对照序列的预制备的阳性对照材料，可以消除稀释且组合许多病原体的需要。所提供的每个阳性对照序列包括改造的序列，其被配置为相对于相应的测试序列最小化观察到的假阳性结果。由于改造序列的存在，每个扩增的阳性对照序列在与其相应测试序列不同的温度下解链。
如在先前的实施方案中，由于改造序列的存在，每个扩增的阳性对照序列在与其相应测试序列不同的温度下解链。然而，每个阳性对照序列及其相应的测试序列包含相同的正向引物结合位点和反向引物结合位点，并且其中所述改造的序列在正向引物结合位点和反向引物结合位点之间。在一个实施方案中，扩增步骤包括同时扩增反应容器中的1-40个或更多个阳性对照序列，例如约2至约10、约3至约20、约4至约30、约5至约40个阳性对照序列、约1至约40个阳性对照序列、或前述范围的任何组合。
在一个类似的实施方案中，公开了用于多重化核酸扩增的测定装置。该测定装置包括在测定装置中的第一反应室，所述第一反应室提供有用于多个阳性对照序列的多重扩增的多个引物，其中每个阳性对照序列对应于一个测试序列，并且其中每个阳性对照序列和每个测试序列可以在第一反应室中用相同的引物进行扩增。在一个实施方案中，多个阳性对照序列可以在测定装置中提供，或者它们可以通过用户在使用时或接近使用时加入测定装置中。每个阳性对照序列包括改造的序列，其被配置为最小化获得起因于被阳性对照序列污染的假阳性结果。每个阳性对照序列结合第一反应室内的多个引物的不同引物序列。尽管测定装置包括用于对应于阳性对照序列的测试序列的多重扩增的多个引物，但第一反应室不含测试样品。即，阳性对照序列通常预期与相应的测试序列组分开运行，所述测试序列可以衍生自测试样品。然而，应了解，由于阳性对照序列和病原体/测试序列用相同的引物进行扩增，并且它们具有可以区别的解链，因此阳性对照和测试样品可以在相同多重反应中运行。然而，应了解，在相同反应中运行阳性对照和测试样品可能在阳性对照和测试样品的扩增之间产生引物竞争。然而，在相同反应中运行阳性对照和测试样品可以用于单个反应中的PCR定量。例如，在任何测试样品中，很可能存在一些不存在的生物。然而，与那些不存在的生物相对应的阳性对照序列存在于ECM中，并且以已知浓度添加。此类阳性对照应该以已知速率扩增，且无引物竞争。因此，与不存在的生物相对应的阳性对照序列可以用作PCR反应效率的参考、以及整体反应中的模板分子起始浓度的参考。即使存在待测试的所有生物，阳性对照序列也可以用作PCR反应效率的参考、以及整体反应中的模板分子起始浓度的参考，因为阳性对照序列以已知浓度添加。在一个实施方案中，测定装置进一步至少包括在测定装置中的第二反应室，其与第一反应室流体连接。第二反应室包括引物对，其配置用于进一步扩增每个阳性对照序列和相应的测试样品。
在一个实施方案中，公开了用于多重化核酸扩增的系统，其被配置为使用本文所述的阳性对照材料和阴性对照材料。该系统包括阳性对照材料，其包括可以用作测定阳性的多个阳性对照序列，以及阴性对照材料，其可以用作所有测定的阴性对照，包括第一反应室的测定仪器，所述第一反应室提供有用于每个阳性对照序列的多重化核酸扩增（或用于相应的测试序列组的扩增）的多个引物，配置为接收测定仪器并且执行核酸扩增反应的器械，以产生多个阳性对照扩增子，并且检测所述阳性对照扩增子，以及软件模块，其用于指示器械扩增多个阳性对照序列并且检测阳性对照扩增子。在一个实施方案中，软件模块还可以指示器械正在运行阴性对照材料，并且不应该检测到阳性对照序列或测试序列的扩增。当用系统中包括的引物进行扩增时，阳性对照序列各自具有至少一种可检测特性，其不同于和区别于相应的多个测试序列各自的至少一种可检测特性。在一个实施方案中，阳性对照扩增子的解链转变区别于对应于每个阳性对照扩增子的测试扩增子的解链转变。每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为最小化起因于阳性对照序列的假阳性，并且每个阳性对照序列结合测定装置内的多个引物的不同引物序列。
在一个实施方案中，该系统可以包括软件模块，所述软件模块可以被配置为至少部分地对器械进行重新编程或重新设定用途，以告知该器械在测定装置中正在运行阳性对照材料，并且阳性对照材料不同于测试样品（例如，包括通常在测定装置中检测到的一种或多种生物或生物衍生核酸的样品）。例如，软件模块可以限定关于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链转变窗口，所述解链转变窗口不同于且可区别于衍生自测试序列的每个扩增子的阳性扩增子窗口，所述测试序列对应于每个阳性对照序列。本文所述的阳性对照序列的优点之一在于阳性对照污染可以被追踪，并且与生物污染区别开。因此，在另一个实施方案中，软件模块被配置为查询关于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链转变窗口、以及关于衍生自测试序列的每个扩增子的阳性扩增子窗口，以区别阳性对照污染和生物污染。同样地，软件模块可以被配置为至少部分地对器械进行重新编程或重新设定用途，以告知该器械正在运行阴性对照样品，并且阴性运行不同于阳性对照材料或测试样品。一般而言，阴性对照样品应该对于来自阳性对照材料的所有扩增子是阴性的，并且对于测试样品序列是阴性的，以便使系统评分真阴性结果。
在前述实施方案中，阳性对照材料（例如，预制备的ECM）中的每个阳性对照序列包括改造的序列，其被配置为相对于相应的测试序列最小化观察到假阳性结果的可能性。每个阳性对照序列结合测定仪器内的多个引物的不同引物序列，引物与改造序列的非特异性结合是最小化的，并且每个阳性对照序列具有与其相应测试序列不同的解链温度 – 即与每个相应的测试序列相比，更高的温度或更低的温度。在一个实施方案中，前述阳性对照材料可以包括1-40个或更多个阳性对照序列，例如约2至约10、约3至约20、约4至约30、约5至约40个阳性对照序列、约1至约40个阳性对照序列、或前述范围的任何组合。
在一个实施方案中，具有本文所述的阳性对照序列的阳性对照材料包括两种对照：一种阳性对照混合物和一种阴性对照混合物。如先前讨论的，阳性对照混合物被设计为检测测定中所有引物和试剂的存在，并且确认测定和器械根据规格工作。阴性对照混合物被设计为确认测定在制造时未被任何可扩增的序列污染，并且它在实验室中未被阳性对照序列或测试序列污染。在一个实施方案中，阴性对照混合物可以基本上不含核酸（即，无阳性对照序列且无测试序列），但另外含有阳性对照混合物的所有组分（缓冲液、盐、稳定剂等），或者可以省略一种或多种组分（即，缓冲剂、盐、稳定剂等）。在另一个实施方案中，可以生成阴性对照，其含有看起来与阳性对照相似的不可扩增的序列。例如，阴性对照中引物结合位点的序列可能是混乱的或以其它方式进行改造，使得它们不能被引物‘识别’，并且因此不能进行扩增。在此类情况下，ECM特异性序列（图5中的5010）可以是相同的。因此，尽管提供了在本文所述的系统中不能进行扩增或检测的真阴性，但此类阴性对照更类似于实际测试或阳性对照材料，因为反应的组分（例如缓冲液、引物、聚合酶等）暴露于阴性对照，所述阴性对照基本上类似于阳性对照序列或测试序列。然而，阴性对照混合物可以是任何干燥的材料或液体材料（例如，无核酸的水），只要它既不含阳性对照序列也不含测试序列。
在一个实施方案中，阳性对照混合物和阴性对照混合物可以各自以一次性使用的形式提供，以最小化交叉污染的机会。例如，阳性对照混合物和阴性对照混合物可以各自以干燥形式在例如隔垫小瓶中提供，所述隔垫小瓶可以允许用户使阳性对照混合物和阴性对照混合物再水合，其方式最小化或消除交叉污染，并且最小化在使用后阳性对照混合物或阴性对照混合物的释放。在一个实施方案中，该系统可以包括小瓶，所述小瓶被配置用于将样品递送（例如注入）到测定仪器（例如小袋）。在一个实施方案中，小瓶可以是在其中具有阳性对照序列的一次性使用的装置，使得阳性对照序列可以递送至测定仪器，伴随通过用户的最低限度处理和操纵。一般而言，以一次性使用的形式包装阳性对照材料，并且最小化通过用户的处理和操纵，最小化交叉污染的风险。同样地，由于阳性对照材料可以例如在隔垫小瓶中进行干燥，因此阳性对照材料可以在环境温度下运送且贮存于例如湿度受控的包装中，伴随很小的损坏风险。在一个实施方案中，阳性对照材料是DNA模板，其相对于RNA模板一般是更稳定的。
虽然在本文中使用术语“小瓶”，但应了解，阳性对照材料可以以其它形式提供给用户，所述其它形式被配置用于将阳性对照材料递送到测定仪器内，而不脱离本公开内容的精神。例如，阳性对照材料可以在递送装置中或在其上干燥地提供，所述递送装置例如移液管、拭子或另一种吸收性构件，其可以插入样品递送组件中的流体内，用于注入到测定仪器内。在另一个实施方案中，具有阳性对照材料的递送装置可以直接插入测定仪器内。在一个实施方案中，阳性对照材料可以以这样的方式嵌入递送装置中或在其上，以便最小化在转移至测定仪器时的污染。在一个实施方案中，阳性对照材料在递送装置中或在其上干燥地提供，从而允许室温贮存。在一个具体实例中，阳性对照混合物和阴性对照混合物可以各自在样品小瓶中预包装地提供，所述样品小瓶可以被配置用于将样品注入到FilmArray小袋，如图1的小袋510内。
在图6A和6B中显示了说明性的样品小瓶650。样品小瓶650由顶表面662、小瓶主体654和插管655组成，其布置类似于许多插管式注射器。在这个说明性实施方案中，样品小瓶650提供有附着至顶表面662的密封件657、以及用于延伸穿过顶表面662用于密封主体654的盖658，而不是在许多插管式注射器中发现的活塞。在说明性实施方案中，密封件657是可剥离的密封件，其可以通过操作者剥掉。然而，应理解，密封件可以具有各种不同的配置，例如螺旋盖或易碎密封件，如本领域已知的。可替代地，可以省略分开的密封件，并且样品小瓶650可以提供有封闭小瓶主体654的盖658，从而要求操作者在使用之前打开盖658。另外，仅在样品小瓶650由样品缓冲液或其它流体预装载地提供时，或者在小瓶主体654需要在使用之前保持与外部环境密封，例如以维持阳性对照混合物或阴性对照混合物的完整性时，才需要使用任何类型的密封件。在一个可替代实施方案中，样品小瓶650可以是空置的，而无密封件656，并且操作者将倒入、移液、插入拭子、舀取固体或半固体材料、或者以其它方式将流体和/或其它材料转移通过顶表面662中的开口657且进入小瓶主体654内。
如所示的，底盖664提供有六角形部分666，其可以被配置为配合到美国专利公开号2014/0283945的图16的602处所示的六角形样品小瓶接收器内，所述美国专利公开已经在上文整体引入本文作为参考。尽管部分666和样品小瓶接收器在说明性实施方案中是六边形的，但应理解，可以使用其它形状，并且可以提供六边形或其它配合或互锁的形状，以帮助操作者去除底盖664。可替代地，操作者可以通过其它手段去除底盖664，例如使用两只手从小瓶主体654拧下底盖664。底盖664可以压入配合到小瓶主体654上，螺纹旋入小瓶主体654上，或以其他方式附着至小瓶主体654。
在说明性实施方案中，底盖664提供有底座648，由此插管655的底端659延伸到底座648内。说明性地，插管655的底端659紧密地配合到底座648内，使得底座648提供在插管655的开放底端659周围的气密密封件。任选地，在底盖664和小瓶主体654之间提供通风口649。
在一个实施方案中，过滤器646可以说明性地定位于小瓶主体654的底表面668处或附近。过滤器646可以通过O形环或类似结构在644附近固定在原地。然而，应理解，过滤器646可以通过粘合剂、通过焊接、通过压入配合就位、或通过其它手段固定在原地，如本领域已知的。当将插管655插入样品注入开口663内，并且将样品吸入小袋510内时，当样品材料被拉动通过过滤器646且进入插管655内时，它被过滤。虽然过滤材料的选择取决于样品类型和粒度，但用于各种生物样品的合适过滤器包括Pall 100 μm Absolute UltipleatPolypropylene Melt Blown Media和Millipore 80 μm Polypropylene Net Filter。大多数注射器式过滤器设计为排除一定大小的生物，从而从滤液中去除这些生物。与此类预先存在的过滤器不同，基于其排除粪便、土壤、粉末等中发现的较大微粒，同时允许直径大约60 μm或更小的靶生物（例如细菌、病毒、原生动物和真菌生物）通过过滤器的能力，来选择这些说明性过滤器。另外，说明性的过滤材料是惰性的（即，不结合生物或核酸），并且对堵塞是相对抗性的。应理解，这些说明性过滤器对于包括原生动物作为靶生物（至多约60 μm）的样品进行选择。由于一些小袋配置可能仅测试较小的靶，因此可能需要具有较小孔径的过滤器，例如对于细菌和真菌具有1-10 μm孔径的过滤器，并且如果仅检测病毒颗粒，则小于1 μm孔径的过滤器。当然，较大孔径的过滤器仍然可以用于过滤较小的靶。此类过滤器对于具有大量颗粒物（例如土壤、粪便和粉末）的样品类型可能是特别有用的，所述颗粒物可能堵塞流体系统。进一步地，应理解，孔径基于待过滤的材料进行选择，并且其它孔径在本发明的范围内。注射小瓶的其它非限制性实施方案可以在美国专利公开号2014/0283945中发现，所述美国专利公开已经在上文整体引入本文作为参考。
当将样品缓冲液或另一种流体加入样品小瓶650中，并且将插管655插入样品注入开口663内，并且将流体吸入小袋510内时，样品小瓶650中的阳性对照混合物或阴性对照混合物重悬浮，并且由流体吸入。在一个实施方案中，试剂盒可以包括阳性对照混合物和阴性对照混合物。在一个实施方案中，每种阳性对照混合物是合成DNA序列库，其能够在测定中通过引物和试剂进行扩增。在一个实施方案中，阳性对照序列的浓度应该接近测定系统的临床相关水平的较低范围。在一个实施方案中，阳性对照材料可以以与临床样品相同的方式在测定装置（例如小袋510）中进行加工。相对于与其它FilmArray实验对象组一起使用的冷藏且冷冻的液体外部对照材料，注射小瓶内包含的室温稳定的阳性对照的使用简化且允许外部对照的更简单使用。每种个别包装的、即用型阳性对照混合物或阴性对照混合物可以分开地进行加工，其方式密切地反映对于临床样品加工概述的相同过程。每种阳性对照混合物或阴性对照混合物预期用于一次性使用。
相应地，在一个实施方案中，本公开内容包括阳性对照材料，其包括插管式注射小瓶（参见例如，如图6A和6B中所示的样品小瓶650）。插管式注射小瓶包括具有用于接收流体的内部体积的小瓶主体，以及从小瓶主体的底表面外部延伸离开的插管，所述插管具有第一端和第二端，所述插管的第一端与小瓶主体的底表面邻近，以及多个阳性对照序列，其设置在插管式注射小瓶中（例如，在其上或在其中干燥），并且被配置为当将流体加入小瓶主体中时重悬浮。在另一个实施方案中，阳性对照材料可以以水合的即用型形式在插管式小瓶中提供。每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为最小化假阳性结果的发生，并且其中所述收集小瓶中不含测试样品。在一个实施方案中，本公开内容可以包括也在插管式小瓶中提供的阴性对照材料。本文在上文更详细地讨论了关于阴性对照混合物的几种可能的组合物。
在一个实施方案中，每个阳性对照序列具有与相应的测试序列不同的解链温度。在一个实施方案中，每个阳性对照序列进行改造，以在比对应于每个测试序列的每个测试序列更高的温度或更低的温度下解链。在其中每个阳性对照序列在分开的孔中解链的实施方案中，所述分开的孔例如但不限于例如图1和3中所示的阵列580的各个孔582，应理解，阳性对照序列无需具有与在其它孔中解链的其它阳性对照序列不同的解链温度。
在前述阳性对照材料中，在插管式注射小瓶中可以干燥1-40个或更多个阳性对照序列，例如约2至约10、约3至约20、约4至约30、约5至约40个阳性对照序列、约1至约40个阳性对照序列、或前述范围的任何组合。
在另一个实施方案中，公开了外部对照试剂盒。外部对照试剂盒可以包括样品收集装置（例如，小瓶、拭子等等），所述样品收集装置具有在其中或在其上干燥的、包括多个阳性对照序列的阳性对照混合物，以及用于对仪器进行编程的软件模块，以在多重化测定系统中扩增多个阳性对照序列，并且检测与相应测试序列不同的阳性对照序列。阳性对照序列可以以干燥的形式提供，所述干燥的形式被配置为当将流体加入样品收集装置中时重悬浮，或者阳性对照序列可以以水合的即用型形式提供。每个阳性对照序列进行改造，以在比每个相应的测试序列更高的温度或更低的温度下解链。在一个实施方案中，外部对照试剂盒还可以包括阴性对照混合物，当阴性对照混合物以与阳性对照混合物相同的方式进行加工时，该阴性对照混合物被设计为对于阳性对照序列和相应的测试序列两者均为阴性的。在一个实施方案中，用于对仪器进行编程的软件模块可以被配置为以与阳性对照相同的方式加工阴性对照，并且将阴性结果评估为对于阳性对照序列和相应的测试序列两者均为阴性的。
在前述外部对照试剂盒中，阳性对照混合物可以含有1-40个或更多个阳性对照序列，例如约2至约10、约3至约20、约4至约30、约5至约40个阳性对照序列、约1至约40个阳性对照序列、或前述范围的任何组合。
在试剂盒的一个实施方案中，软件模块可以被配置为至少部分地对器械进行重新编程或重新设定用途，以告知该器械正在运行阳性对照材料，并且阳性对照材料不同于测试样品。例如，软件模块可以限定关于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链转变窗口，所述解链转变窗口不同于且可区别于衍生自测试序列的每个扩增子的阳性扩增子窗口，所述测试序列对应于每个阳性对照序列。本文所述的阳性对照序列的优点之一在于：阳性对照污染可以与生物污染或衍生自生物的核酸的污染不同地检测，并且阳性对照污染可以与生物污染不同地进行追踪。因此，在另一个实施方案中，软件模块被配置为查询关于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链转变窗口、以及关于衍生自测试序列的每个扩增子的阳性扩增子窗口，以区别阳性对照污染和得自或衍生自生物的污染。例如，如果正在运行阴性ECM样品，则软件模块可以指示仪器查询生物解链窗口和转变的ECM解链窗口，以鉴定并报告ECM阳性污染和得自生物的阳性污染。因此，用户可以完成其自身的风险分析，并且适当地应对污染。在一个实施方案中，该试剂盒可以包括用于执行外部对照材料验证的用户说明书。
相应地，本公开内容的实施方案提供了超过现有系统的众多优点。
实施例
下述实施例预期说明本发明的实施方案，而不预期限制说明书或所附权利要求的范围。例如，尽管下述实施例具体涉及FilmArray系统，并且具体涉及FilmArray GlobalFever测定，但应了解，这仅是说明性的，并且本申请和实施例中描述的ECM概念可以应用于其它平台和其它分子测定。
申请人已开发了特殊类型的阳性对照（即，外部对照材料（ECM）），作为处于开发中的FilmArray Global Fever（GF）实验对象组（BioFire Defense，LLC）的质量控制。这些阳性对照开发用于至少两个原因：1）允许客户使用FilmArray Global Fever Panel来执行实验室验证，而无需获得且测试需要生物安全3和4级防护的罕见临床标本或分析物，以及2）降低可以起因于由传统外部对照材料的实验室污染的假阳性结果的风险，所述外部对照材料衍生自通过FilmArray GF Panel测定的相同病原体。ECM和病原体的检测在FilmArray软件分析中是相互排斥的。另外，ECM阳性对照设计为室温稳定的，其简化了制造、运送和贮存，并且ECM可以伴随通过用户的最低限度操纵和制备进行制备。
背景和意义
FilmArray Global Fever Panel正在开发中，以检测来自患有急性发热病（AFI）的个体的样品中的病原体，以进行来自全血标本的19种测试，以鉴定引起AFI的病原体（表1）。
表1. 通过FilmArray GF Panel检测到的病原体
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质量控制用于确保IVD系统的适当性能。此处所述的ECM预期作为实验室质量控制，以验证FilmArray GF Panel小袋的两个PCR阶段中病原体测定引物的存在。阳性对照使用对于GF Panel阵列中包含的所有测定待“检测”的合成DNA。阴性对照不含核酸，并且成功运行对于实验对象组上的所有测定将是“未检测到的”。这些对照并不预期替换内部FilmArrayGlobal Fever Panel小袋对照（过程对照和第二阶段PCR阵列对照）。
说明性的GF Panel Control Kit设计为当在FilmArray系统上评估临床样品时，减轻对照污染或误用的风险。每个阳性ECM DNA序列产生的特征性解链温度（Tm）值不同于由相应的病原体扩增子产生的值。通过设计，即使当被污染时，当使用GF Panel全血方案时也并未检测到阳性GF Panel ECM，并且相反，当使用阳性对照方案时，并未检测到扩增的病原体特异性核酸。在一个实施方案中，在实际污染的情况下，阴性对照方案可以检测到病原体扩增子和阳性ECM对照两者。因此，当运行阴性对照方案时的阳性检测可以向用户提供有关污染源的信息。通过修饰用于每种ECM核酸的内部引物之间的序列，当在FilmArray器械中运行相同的GF Panel小袋和相同的方案时，相对于预计的GF Panel靶扩增子，扩增子的Tm值转变为更高或更低的Tm值（例如，至少2-6℃）。ECM特异性小袋模块软件将预计的转变Tm值检测为来自引物和ECM扩增子，从而提供必要的外部阳性对照来评估FilmArraySystem的性能。另外，ECM序列的修饰减轻可能的污染事件，并且不在临床样品中引起假阳性。在操作者允许阳性GF Panel ECM污染患者样品的极少数情况下，ECM序列Tm值通过GFPanel全血小袋方案无法检测到，其中不同的Tm窗口用于检测扩增的病原体序列。
在这个说明性实施方案中，对照试剂盒可以含有阳性对照和阴性对照，尽管应理解，可以根据需要提供这些对照之一或两者。每个阳性对照是对于GF Panel引物反应性的合成DNA靶库，其可以在改良的样品FilmArray Injection Vial（FAIV）内风干。说明性地，尽管可以使用不同的水平，但ECM浓度可以接近测定LOD的较低范围（例如，测定检测极限（LOD）的1-100×，5-50×，优选约10×）。由于ECM以类似于用于临床样品加工的方式进行加工，因此用户通常无需进行再培训或专门培训以运行ECM。在这个说明性实例中，注射小瓶内包含的室温稳定的干燥ECM的使用，简化且允许相对于冷藏且冷冻的液体外部对照材料，外部对照的更简单使用，尽管应理解，可以使用冷藏或冷冻材料，并且此类材料可以在如本文所述的注射小瓶中提供，或可以分开提供。说明性地，FilmArray Global Fever（GF）Control Kit的每个个别包装的即用型对照分开进行加工，并且预期用于一次性使用。用户只需要使阳性对照或阴性对照水合，伴随最低限度的处理。
如上文讨论的，图6A和6B中示出了FilmArray Injection Vial 650的实例。阳性ECM对照可以在一个小瓶中干燥，而阴性对照可以作为第二个小瓶提供。
Global Fever（GF）Panel Control Kit说明性地提供用于用作外部阳性和阴性测定质量控制，以监测体外实验室核酸测试程序用于在FilmArray 2.0系统上执行的FilmArray Global Fever（GF）Panel上定性检测以下的性能：炭疽杆菌、土拉弗朗西斯菌、钩端螺旋体属物种、肠炎沙门氏菌副伤寒甲型血清变种、肠炎沙门氏菌伤寒血清变种、鼠疫耶尔森菌、基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、登革热病毒（血清型1、2、3和4）、埃博拉病毒、拉沙病毒、马尔堡病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、利什曼原虫属物种和疟原虫属物种（包括恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫的物种分化）。
Global Fever（GF）Panel Control Kit是由缓冲液和稳定剂中的干燥合成DNA组成的替代对照材料，以干燥形式在FilmArray Injection Vial中提供，所述FilmArrayInjection Vial直接与GF Panel一起使用。GF Panel Control Kit可以由两个对照小瓶组成：阳性对照小瓶和阴性对照小瓶。阳性对照中的DNA包括DNA区段，以评价上文列出的FilmArray Global Fever（GF）Panel中每种个别测定的存在。阴性对照中可能不存在DNA，或者在一些实施方案中，阴性对照可能含有无法通过GF实验对象组引物进行扩增的DNA。在任何情况下，Global Fever（GF）Panel Control Kit都不含任何生物危害，并且是100%非传染性的。
FilmArray Global Fever系统
FilmArray Global Fever小袋是一次性封闭系统，其贮存用于样品制备、逆转录、聚合酶链反应（PCR）和检测的所有必需试剂，以便分离、扩增且检测来自单个临床全血样本内的多重病原体或来自外部对照材料的核酸。用户在小袋（类似于图1的小袋510）的一侧上注入来自一个小瓶的水合溶液，并且将来自另一个小瓶的与样品缓冲液组合的样品或外部对照材料注入到小袋的另一侧内。然后，用户将小袋放到FilmArray器械（类似于图2的器械800）内，并且启动自动化运行。
在运行期间，FilmArray系统：
通过搅动（珠串珠化）来裂解样品。
使用磁珠技术提取并纯化来自样品的所有核酸。
通过以下执行嵌套多重PCR：
首先执行单个、大体积、高度多重化的第一阶段PCR反应（PCR1）。
然后执行多个、单重、第二阶段PCR反应（PCR2），以扩增PCR1产物内的序列。
使用终点解链曲线数据，以在FilmArray Global Fever阵列上检测并生成关于每种靶的结果。
过程对照
两种过程对照包括在每个小袋中：
1. RNA过程对照
RNA Process Control测定靶向粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）基因组中的特异性序列。粟酒裂殖酵母在每个GF Panel小袋的样品注入端口内进行冷冻干燥。当注入样品时，粟酒裂殖酵母再水合，并且与样品一起进入小袋。粟酒裂殖酵母核酸连同来自患者样品的核酸一起被提取，纯化且测试。关于RNA Process Control的阳性结果指示，所有过程（核酸提取、逆转录、PCR和解链分析）都成功地完成。
2. PCR2对照
PCR2 Control测定检测DNA靶，所述DNA靶连同相应的引物一起在阵列的一个或多个孔内进行干燥。阳性结果指示PCR2是成功的。
在这个说明性系统中，两个对照测定均必须为阳性用于测试运行通过。如果对照失败，则应该使用新的小袋重新测试样品。对于有效运行，这些集成对照在测试样本和ECM时必须为阳性。
本文所述的说明性外部对照试剂盒与这些过程对照是分开的。应理解，除过程对照之外，还可以提供本文提供的外部对照试剂盒。
器械软件
器械软件具有两个主要功能。首先是控制器械，而其次是收集、查看、贮存且分析测试数据。说明性软件由基础软件和实验对象组特异性小袋模块组成，所述模块可以无需更新核心软件而添加。小袋模块含有实验对象组特异性样品方案、分析和报告元件。特异性小袋模块安装在独立于基础软件的系统上，使得新小袋模块的添加可以无需更改基础软件而完成。这种方法允许在将新试剂小袋加入系统方面的灵活性，伴随干扰先前释放的试剂小袋的可忽略不计的风险。
说明性的Global Fever Panel小袋模块可以包括三个Global Fever Panel特异性样品方案，用于供操作者选择。当测试临床血液样本时，选择“GF血液”方案。当测试来自Global Fever（GF）Panel Control Kit的阳性对照时，选择“GF阳性对照”方案，而当检测阴性对照时，选择“GF阴性对照”方案。在阴性对照中，除了RNA过程对照和PCR2对照（其在每一个FilmArray小袋中都设计为阳性的）之外，所有检测都应该为阴性。为了检测阴性对照中衍生自ECM或测试生物的可能污染，阴性对照方案可以设计为查询转变的ECM解链窗口和相应的生物解链窗口两者。因此，如果存在的话，则可以检测到污染及其来源（ECM或生物/测试扩增子），并且用户可以执行其自身的风险分析。然而，应理解，单个对照方案可以用于运行阳性对照和阴性对照，其中阴性对照仅在阳性对照解链窗口中输出阴性结果。这些样品方案各自在物理上等同地操纵Global Fever Panel小袋。Tm数据分析对于对照方案是不同的，并且ECM测试的解释由软件自动执行，提供外部对照通过或失败结果。通过具体结果页标签和分开的对照试剂盒，减轻将对照运行与临床样品运行混淆的风险。
FilmArray Global Fever（GF）Panel Control Kit
FilmArray Global Fever（GF）Control Kit含有由合成DNA区段组成的替代对照材料。阳性对照和阴性对照可以在Film Array Injection Vial（FAIV）中提供，或以另一种易于使用的一次性使用的形式提供（例如，在隔垫小瓶中湿润或干燥地提供，使得可以通过隔垫添加水性介质使对照再水合，并且同样地，通过隔垫提取而无污染），或者可以分开提供用于装载到GF小袋内。阳性对照通过在缓冲液和稳定剂的非传染性溶液中稀释并悬浮纯化的合成DNA进行制造，所述纯化的合成DNA可以在FAIV中干燥地提供。每个阳性对照DNA区段含有通过内部引物和外部引物识别且扩增的序列，所述引物特异性针对一个Global FeverPanel测定，加上在外部引物序列的任一侧上的大约25个碱基对的病原体序列。另外，每个阳性对照DNA区段的两个最里面的引物识别位点内部的原始病原体序列已替换为合成序列（即，ECM插入物），所述合成序列改变了内部扩增子的变性特征（Tm）。
在Global Fever实验对象组的情况下，发现两个最里面的引物识别位点内部的病原体序列可以替换为几个序列之一。如本文其它地方讨论的，ECM插入物最初通过鉴定在插入物与实验对象组引物组之间具有最低限度交叉反应或无交叉反应的序列来设计，然后鉴定导致更高或更低解链点的序列。例如，已经具有高解链点的扩增子可以将其内部引物序列替换为低解链点的插入物，以便生成具有在测试序列解链窗口外部的降低解链点的ECM扩增子。类似地，已经具有低解链点的扩增子可以将其内部引物序列替换为高解链点的插入物，以便生成具有在测试序列解链窗口外部的升高解链点的ECM扩增子。
作为设计过程的结果，每个阳性对照DNA区段通过一组Global Fever Panel测定引物进行扩增（一些GF Panel分析物通过多重测定进行查询，需要多重DNA区段，以充分测试与该分析物相关的所有引物的存在），但在靶温度解链窗口内未检测到。阴性对照可以不含缓冲液、稳定剂、核酸等，或者阴性对照可以通过在FAIV中干燥不含DNA的缓冲液和稳定剂的相同非传染性溶液来制备。FilmArray Global Fever（GF）Panel Control Kit可以按照生物安全1级实践安全地进行处理。
用于客户验证的对照材料
临床诊断实验室一般由认证机构要求在提供测试用于临床使用之前执行新测试的验证。对于FDA批准的测试，实验室必须验证系统性能是否与由制造商描述的那种一致。另外，还要求实验室在将其用于临床测试之前，验证每个新操作者以及试剂测试试剂盒的批次和/或运送的性能。这些验证测试通常用充分表征的临床样品或商购可得的生物原种执行。对于检测罕见或选择因子的测试，有限的测试材料可用性可能成为完成测试系统的适当验证的障碍。
由本文讨论的合成靶核酸组成的阳性对照材料和阴性对照材料可以用于验证各种测试，例如Global Fever Panel测定的性能。在说明性实例中，外部对照材料设计为在Global Fever Panel小袋中扩增，产生与来自GF Panel分析物的扩增子相比，具有特征性和不同Tm的扩增子。当操作者希望运行阳性对照或阴性对照时，选择阳性或阴性（分别地）对照样品方案，而不是血液样品方案。对照样品方案类似于血液样品方案，因为所有小袋操作都是等同的，但软件使用不同的Tm窗口来分析数据。因此，仅在选择正确的阳性对照模块时，Global Fever Panel阳性对照才通过，并且不导致假阳性诊断结果。类似地，如果选择了阳性对照模块，则Global Fever Panel临床标本导致运行失败。这极大地降低了由于被阳性对照材料污染的假阳性风险。虽然提及的是FilmArray Global Fever Panel，但应理解，类似的测试可以用作用于其它单重测定和多重测定的对照材料，以及在除FilmArray系统外的平台上使用。
例如，图7A和7B示出了在靶窗口内（图7B）的来自克里米亚-刚果出血热病毒（CCHF）的扩增子的扩增（图7A）和基于解链的检测，导致阳性测试结果。相比之下，图7C和7D示出了合成CCHF1外部对照材料（ECM）的扩增（图7C）和解链（图7D）。CCHF1 ECM将扩增（图7C），但在关于测试扩增子的靶窗口外部解链（图7D），导致阴性测试结果。图7E示出了类似于7D的解链，除了检测窗口转变至ECM特异性解链窗口以产生阳性ECM结果之外。
图8示出了整个GF ECM混合物的扩增和解链结果，所述GF ECM混合物包括大约40个扩增子。如图8中可见的，一些扩增子具有在78ºC下或更低的解链峰，而其它扩增子具有在84ºC下或更高的解链峰。所有扩增子都具有从靶Tm转变至少2℃（例如，+/-2至6℃）的解链峰，或更高或更低。图9A和9B示出了关于登革热病毒1、登革热病毒2.1、登革热病毒2.2、登革热病毒3和登革热病毒4的ECM的扩增（图9A）和解链（图9B）。图9C-9F示出了用于两个登革热测定的ECM扩增子的扩增（图9C和9E）和解链（图9D和9F），两者均在其分别预计的解链窗外部。
ECM提供了程序，所述程序允许实验室以时间和资源有效方式测试Global FeverPanel，以满足实验室验证要求，同时最小化关于污染的潜力。实验室可以使用ECM用于系统如FilmArray GF Panel系统的初始实验室验证。另外，在使用新的发货或新批次的试剂盒之前、当存在新的操作者时、以及在系统的更换或重大预防性维护之后，建议用外部对照的评估。
除前述之外，Global Fever（GF）实验对象组设计为检测一些病毒的多重变体。因为这些变体的共检测是出乎意料的，所以对于这些变体特异性的引物可以共同点在第二阶段阵列的单个孔中，并且仍然允许检测靶。GF实验对象组中的组合测定为：
Ebola Bundi + Ebola Tai Forest 埃博拉1
Ebola Reston + Ebola Sudan 埃博拉2
间日疟原虫+ 卵形疟原虫 间日/卵形疟原虫
对于内部质量控制，可以独立地拆分且测试用于多点孔的多重质量控制混合物。可替代地，可以通过使用从扩增子解链转变的两种模板，使得它们在预计的解链窗口外部且彼此不同，用一种ECM混合物检测多点孔中的引物。图10A示出了在埃博拉1测定中关于ECM扩增子的示例性解链曲线，而图10B示出了在埃博拉2测定中关于ECM扩增子的示例性解链曲线。如可见的，解链是可区别的，并且在靶解链窗口（灰色框）外部。应注意，一起测试的两个外部对照模板可以在相同方向上转变（图10A），或者一个可以转变为低于靶的温度，而另一个转变为高于靶的温度（图10B），条件是两个模板均具有可彼此区别且可与病原体靶区别的解链。应理解，虽然两个模板显示为多重化的，但可以使用更多的模板，仅受限于用于区别不同解链的系统分辨率。类似地，图11示出了间日/卵形疟原虫测定中关于ECM扩增子的解链曲线。如可见的，解链是可区别的，并且在解链窗口（灰色框）外部。
阳性对照水平
在捕获系统（试剂、器械、操作者和环境）变动的一种方法中，使用了有效的质量控制，其接近监测测定的检测极限（LoD），但并不如此接近于LoD使得假阴性可能发生，促成延迟的患者结果报告和/或不必要地花费时间进行故障排除。可以考虑对照和小袋批次变化性，因为对照浓度最终确定为最小化假阴性结果。先前的数据提示，18-20个循环的交叉点值（Cp）代表了关于FilmArray Global Fever Panel测定的LoD的大约10×。
结论
尽管前述详述提及了具体的示例性实施方案，但本公开内容可以以其它具体形式体现，而不脱离其精神或基本特征。相应地，所述实施方案在所有方面仅被视为说明性而非限制性的。例如，相关领域并且掌握了本公开内容的技术人员将想到的，在本文中描述和/或示出的本发明特点的各种取代、变更和/或修改，以及在本文中描述和/或示出的原理的另外应用，可以对所描述和/或示出的实施方案进行，而不脱离如由所附权利要求限定的本发明的精神和范围。虽然提及的是FilmArray系统和Global Fever Panel，但这仅是说明性的，并且如本文所述的外部对照材料可以开发用于其它系统。
权利要求中叙述的限制应基于权利要求中采用的语言来广义地解释，并且并不限于在前述详述中描述的具体实例，所述实例应被解释为非排他性和非穷举性的。落入权利要求的等价含义和范围内的所有变化都应包含在其范围内。
还应了解，某些实施方案的各种特点可以与本公开内容的其它实施方案相容、组合、包括在其中和/或并入其内。例如，根据本公开内容的某些实施方案的系统、方法和/或产品可以包括、并入或以其它方式包含在所公开和/或描述的其它实施方案中描述的特点。因此，相对于本公开内容的具体实施方案的某些特点的公开内容不应解释为将所述特点的应用或包括限制于具体实施方案。另外，除非特点在特定实施方案中描述为需要，否则在各个实施方案中描述的特点可以是任选的，并且可以不包括在本公开内容的其它实施方案中。此外，除非特点描述为需要与其组合的另一个特点，否则本文的任何特点可以与本文公开的相同或不同实施方案的任何其它特点组合。

Claims (66)

1.一种阳性对照材料，其包含：
具有在其中干燥的多个阳性对照序列的样品收集递送装置，所述阳性对照序列被配置为当添加流体时重悬浮，
其中每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为最小化获得假阳性结果，并且其中所述样品收集递送装置不含测试样品或者一个或多个测试序列，和
其中每个阳性对照序列的改造的序列选择为具有与相应测试序列的解链温度不同的解链温度。
2.权利要求1的阳性对照材料，其中每个阳性对照序列在高于或低于相应测试序列的解链窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。
3.权利要求1的阳性对照材料，其中存在在所述样品收集递送装置中干燥的约2至约10个阳性对照序列。
4.权利要求1的阳性对照材料，其中存在在所述样品收集递送装置上或其中干燥的约2至约20个阳性对照序列。
5.权利要求1的阳性对照材料，其中存在在所述样品收集递送装置上或其中干燥的约2至约30个阳性对照序列。
6.权利要求1的阳性对照材料，其中存在在所述样品收集递送装置上或其中干燥的约2至约40个阳性对照序列。
7.权利要求1的阳性对照材料，其中所述样品收集递送装置提供用于将阳性对照序列容易地转移至测定装置。
8.权利要求7的阳性对照材料，其中所述样品收集递送装置是拭子。
9.权利要求7的阳性对照材料，其中所述样品收集递送装置是小瓶，其包括具有用于接收流体的内部体积的小瓶主体、以及从所述小瓶主体的底表面的外部延伸离开的插管，所述插管被配置为将待分析的样品递送至多重测定装置。
10.权利要求1的阳性对照材料，其中每个阳性对照序列进行改造，以在比每个相应的测试序列更高的温度或更低的温度下解链。
11.一种使用阳性对照材料控制多重化PCR系统的方法，其包括以下步骤：
提供包括第一反应室的测定装置，所述第一反应室提供有用于多重化核酸扩增的多个引物，
在第一反应室中扩增多个阳性对照序列，以产生多个阳性对照扩增子，其中所述阳性对照材料不含测试样品，和
检测所述阳性对照扩增子，
其中检测到每个阳性对照扩增子指示多重化PCR系统正确地操作，和
其中由于在阳性对照序列中改造序列的存在，因此每个扩增的阳性对照序列在与其相应测试序列不同的温度下解链。
12.权利要求11的方法，其中每个阳性对照序列在高于或低于相应测试序列的解链窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。
13.权利要求11的方法，其中每个阳性对照序列及其相应的测试序列包含用于多个引物的相同的正向引物结合位点和反向引物结合位点，并且其中所述改造的序列在正向引物结合位点和反向引物结合位点之间。
14.权利要求11的方法，其中所述扩增步骤包括在测定装置中扩增约2至约10个独特的阳性对照序列。
15.权利要求11的方法，其中所述扩增步骤包括在测定装置中扩增约2至约20个独特的阳性对照序列。
16.权利要求11的方法，其中所述扩增步骤包括在测定装置中扩增约2至约30个独特的阳性对照序列。
17.权利要求11的方法，其中所述扩增步骤包括在测定装置中扩增约2至约40个独特的阳性对照序列。
18.权利要求11的方法，所述测定装置进一步至少包括与第一反应室流体连接的第二反应室，所述第二反应室包含配置用于进一步扩增每个阳性对照序列的引物对，并且其中所述方法进一步包括进一步扩增所述阳性对照序列，其中所述进一步扩增步骤在所述检测步骤之前发生。
19.权利要求18的方法，其中所述第二阶段反应室包括孔阵列，其中每个孔在其中具有至少一个引物对，用于进一步扩增每个阳性对照序列。
20.权利要求11的方法，其中检测阳性对照扩增子包括观察对于每个阳性对照扩增子的DNA解链信号，其中所述DNA解链信号在与测试序列的解链温度相比不同的温度下，所述测试序列对应于每个阳性对照扩增子。
21.权利要求11的方法，其进一步包括
提供包括第一反应室的第二测定装置，所述第一反应室提供有用于多重化核酸扩增的多个引物，
在第一反应室中扩增阴性样品，其中所述阳性对照材料不含测试样品，和
对于每个阳性对照扩增子检测阴性结果，和
其中对于每个阳性对照扩增子检测到阴性结果指示多重化PCR系统正确地操作。
22.权利要求11的方法，其进一步包括在测定装置中包括具有多个阳性对照序列的至少一个测试序列。
23.权利要求22的方法，其中所述阳性对照序列可以用于确定至少一个测试序列的浓度。
24.一种用于多重化核酸扩增系统的测定装置，其包括：
多个阳性对照序列，和
测定装置中提供有多个引物的第一反应室，所述多个引物用于阳性对照序列和相应测试序列的多重扩增，
其中每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为最小化获得来自阳性对照序列的假阳性结果，
其中每个阳性对照序列结合第一反应室内的多个引物中的不同引物序列，和
其中所述第一反应室不含测试样品或测试序列。
25.权利要求24的测定装置，其中所述引物与所述改造序列的非特异性结合是最小化的。
26.权利要求24的测定装置，其中每个阳性对照序列具有与其相应测试序列不同的解链温度。
27.权利要求24的测定装置，其中存在约2至约10个阳性对照序列。
28.权利要求24的测定装置，其中存在约2至约20个阳性对照序列。
29.权利要求24的测定装置，其中存在约2至约30个阳性对照序列。
30.权利要求24的测定装置，其中存在约2至约40个阳性对照序列。
31.权利要求24的测定装置，其进一步至少包括在测定装置中与第一反应室流体连接的第二反应室，所述第二反应室包含配置用于进一步扩增每个阳性对照序列和相应测试序列的引物对。
32.一种检测多个引物对的方法，所述引物对被配置为在多重化核酸扩增系统内扩增多个测试序列，所述方法包括以下步骤：
提供包含多个阳性对照序列的阳性对照材料，每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为相对于相应的测试序列最小化观察到假阳性结果，其中由于改造序列的存在，每个扩增的阳性对照序列在与其相应测试序列不同的温度下解链，
提供包括反应容器的测定装置，所述反应容器包含用于扩增每个阳性对照序列的多个引物，
在反应容器中扩增多个阳性对照序列，其中所述阳性对照材料不含测试样品或测试序列，和
检测反应容器中对于每个扩增的阳性对照序列的解链信号，
其中所述多个阳性对照序列各自的解链信号指示在反应容器中每个相应引物对的存在。
33.权利要求32的方法，其中每个阳性对照序列及其相应的测试序列包含用于多个引物之一的相同的正向引物结合位点和反向引物结合位点，并且其中所述改造的序列在正向引物结合位点和反向引物结合位点之间。
34.权利要求32的方法，其中所述扩增步骤包括在反应容器中同时扩增约2至约10个独特的阳性对照序列。
35.权利要求32的方法，其中所述扩增步骤包括在反应容器中同时扩增约2至约20个独特的阳性对照序列。
36.权利要求32的方法，其中所述扩增步骤包括在反应容器中同时扩增约2至约30个独特的阳性对照序列。
37.权利要求32的方法，其中所述扩增步骤包括在反应容器中同时扩增约2至约40个独特的阳性对照序列。
38.权利要求32的方法，其中所述阳性对照材料在配置用于装载到反应容器内的器皿中提供。
39.权利要求32的方法，其中所述检测步骤包括对于每个阳性对照序列使用与对于每个相应测试序列的解链窗口不同的解链窗口。
40.权利要求39的方法，其中对于每个阳性对照序列的解链窗口为高于或低于相应测试序列的解链窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合。
41.权利要求32的方法，其进一步包括
提供阴性对照样品，
提供第二反应容器，其包含用于扩增每个阳性对照序列的多个引物，
使阴性对照样品暴露于第二反应容器中的扩增条件，和
确定是否存在任何解链信号，
其中解链信号的存在指示污染。
42.权利要求41的方法，其中对于阳性对照序列之一在解链窗口中的解链信号的存在指示由阳性对照序列或其扩增子的污染，并且对于相应的测试序列之一在解链窗口中的解链信号的存在指示由测试序列或其扩增子的污染。
43.一种外部对照试剂盒，其包括
具有在其中干燥的多个阳性对照序列的样品收集小瓶，所述阳性对照序列被配置为当将流体加入样品收集小瓶中时重悬浮，其中每个阳性对照序列具有相对于相应的测试序列，并且可与相应的测试序列区别的转变解链温度，和
用于对器械进行编程的软件模块，以在多重化测定系统中扩增多个阳性对照序列，并且检测与相应的测试序列不同的阳性对照序列。
44.权利要求43的试剂盒，其中每个阳性对照序列进行改造，以在比每个相应的测试序列更高的温度或更低的温度下解链。
45.权利要求43的试剂盒，其中每个阳性对照序列在高于或低于相应测试序列的解链点窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。
46.权利要求43的试剂盒，其中存在在样品收集小瓶中干燥的约2至约10个阳性对照序列。
47.权利要求43的试剂盒，其中存在在样品收集小瓶中干燥的约2至约20个阳性对照序列。
48.权利要求43的试剂盒，其中存在在样品收集小瓶中干燥的约2至约30个阳性对照序列。
49.权利要求43的试剂盒，其中存在在样品收集小瓶中干燥的约2至约40个阳性对照序列。
50.权利要求43的试剂盒，其中所述样品收集小瓶包括具有用于接收流体的内部体积的小瓶主体、以及从所述小瓶主体的底表面的外部延伸离开的插管，所述插管被配置为将待分析的样品递送至多重化测定。
51.权利要求43的试剂盒，其中所述软件模块限定对于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链窗口，所述解链窗口不同于对于衍生自对应于每个阳性对照序列的测试序列的每个扩增子的阳性扩增子解链窗口。
52.权利要求51的试剂盒，其中所述软件模块被配置为查询对于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链转变窗口、以及对于衍生自测试序列的每个扩增子的阳性扩增子窗口，并且其中所述软件模块被进一步配置为区别阳性对照污染和生物或测试序列污染。
53.一种用于多重化核酸扩增的系统，其包括：
多个阳性对照序列，
包括第一反应室的测定装置，所述第一反应室提供有用于多重化核酸扩增的多个引物，
器械，其配置为接收测定装置并且执行核酸扩增反应，以产生多个阳性对照扩增子，并且检测所述阳性对照扩增子，和
软件模块，其用于指示所述器械扩增多个阳性对照序列并且检测阳性对照扩增子，其中所述阳性对照序列扩增子具有至少一种可检测的序列特性，所述特性不同于相应的多个测试序列，
其中每个阳性对照序列包含改造的序列，其被配置为最小化起因于阳性对照序列的假阳性，和
其中每个阳性对照序列结合测定装置内的多个引物的不同引物序列。
54.权利要求53的系统，其中与每个相应的测试序列相比，每个阳性对照序列被改造为在更高的温度或更低的温度下解链。
55.权利要求53的系统，其中每个阳性对照序列在高于或低于相应测试序列的解链窗口约2-10℃、2-9℃、2-8℃、2-7℃、2-6℃、2-5℃、2-4℃、2-3℃、3-10℃、3-9℃、3-8℃、3-7℃、3-6℃、3-5℃、3-4℃、4-10℃、4-9℃、4-8℃、4-7℃、4-6℃、4-5℃或其任何组合的范围内的温度下的解链窗口中解链。
56.权利要求53的系统，其中所述系统包括约2至约10个阳性对照序列。
57.权利要求53的系统，其中所述系统包括约2至约20个阳性对照序列。
58.权利要求53的系统，其中所述系统包括约2至约30个阳性对照序列。
59.权利要求53的系统，其中所述系统包括约2至约40个阳性对照序列。
60.权利要求53的系统，其进一步包括具有在其中干燥的阳性对照序列的样品收集小瓶。
61.权利要求53的系统，其中所述软件模块限定对于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链窗口，所述解链窗口不同于对于衍生自对应于每个阳性对照序列的测试序列的每个扩增子的阳性扩增子解链窗口。
62.权利要求61的系统，其中所述软件模块被配置为查询对于衍生自每个阳性对照序列的每个扩增子的解链转变窗口、以及对于衍生自测试序列的每个扩增子的阳性扩增子窗口，以区别阳性对照污染和生物或测试序列污染。
63.权利要求53的系统，所述测定装置进一步至少包括与第一反应室流体连接的第二反应室，所述第二反应室包含配置用于进一步扩增每个阳性对照序列的引物对。
64.权利要求63的系统，其中所述第二反应室包括两个或更多个反应孔，其配置用于进一步扩增阳性对照序列，并且其中两个或更多个反应孔中的至少一个包括两个或更多个引物对，用于同时扩增两个或更多个阳性对照序列。
65.权利要求63的系统，其中所述测定装置包括第一阶段反应室，其提供有用于阳性对照序列的多重扩增的多个引物，以及与第一阶段反应室流体连接的第二阶段反应室，其中所述第二阶段反应室包括孔阵列，其中每个孔在其中具有至少一个引物对，用于进一步扩增每个阳性对照序列。
66.权利要求65的系统，其中所述孔阵列中的至少一个孔包括两个或更多个引物对，用于同时扩增两个或更多个阳性对照序列。
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