JP7423696B2 - アッセイデバイス及びその使用方法 - Google Patents

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Description

（関連出願）
[0001] 本出願は、２０１７年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／５５２，５８８号に対する利益及び優先権を主張する。この仮出願は全体が援用により本願に含まれる。
[0002] 米国、カナダ、及び西ヨーロッパにおいて、感染病は人の死亡数の約７％を占めており、発展途上地域では、感染病は人の死亡数の４０％超を占めている。感染病は多種多様な臨床症状を引き起こす。一般的である明らかな症状には、発熱、肺炎、髄膜炎、下痢、及び出血を伴う下痢がある。これらの身体症状は、病因としていくつかの病原体を示唆すると共に別のものを排除するが、可能性のある様々な原因物質が残るので、明確な診断には多種多様なアッセイの実行が必要となることが多い。病原体を診断するための従来の微生物学的技法は数日又は数週間を要することがあり、多くの場合、適切な治療過程を遅らせることになる。
[0003] 近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）が、感染因子を迅速に診断するための選択法となっている。ＰＣＲは、感染病を診断するための迅速で感度の高い、かつ特異的な（specific）ツールとなり得る。しかしながら、一次診断手段としてＰＣＲを使用することの問題点は、いくつかの病理組織標本では多種多様な原因微生物もしくは原因ウイルスが存在し得ること、又は存在する微生物もしくはウイルスが低レベルであることである。多くの場合、ほとんどがネガティブであると予想される原因微生物又は原因ウイルスの各々に対して１つずつ大型パネルのＰＣＲアッセイを実行することは不可能である。この問題は、病原体の核酸が低濃度であり、充分な反応テンプレートを収集するため多量のサンプルが必要である場合に悪化する。場合によっては、考えられる全ての病因のアッセイを行うにはサンプルが不充分である。１つの解決策は、単一の反応で複数の標的について同時にサンプルをアッセイする「マルチプレックスＰＣＲ（multiplex PCR）」を実行することである。マルチプレックスＰＣＲはいくつかの系で有益であることがわかっているが、高レベル多重反応のロバスト性に関する欠点が存在し、複数の生成物の明確な分析は困難である。これらの問題を解決するため、アッセイを後に複数の二次ＰＣＲに分割することができる。一次生成物内に二次反応をネスト化することでロバスト性を増大させる。FilmArray（登録商標）（BioFire Diagnostics, LLC、ユタ州ソルトレークシティ）のような閉鎖系は、操作を軽減することによって汚染のリスクを抑える。
[0004] 本発明は、試験デバイスの自動化又は半自動化製造、試験デバイスのコスト、及びサンプルツーアンサー（sample-to-answer）の迅速化に関する様々な改良に対処する。
[0005] 本明細書に開示されるのは、核酸の迅速な増幅のための自己完結型反応容器（本明細書では「パウチ」又は「カード」と称する）、器具、システム、及び方法である。例示的な実施形態において、サンプル容器は、第２段階反応ゾーンに流体接続された第１段階チャンバを含むことができ、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応ウェルを備えている。本明細書に記載されているいくつかのサンプル容器の実施形態は、第１段階チャンバの上流に、一体型サンプル調製（ＩＳＰ：integrated sample preparation）ゾーン（本明細書ではサンプル溶解ゾーンとも称する）を含むことができ、これは、多種多様なサンプルタイプを受容すると共に、ユーザからの入力をほとんど又は全く用いることなくパウチ内での分析のためサンプルを調製するように構成されている。同様に、本明細書に記載されているパウチ又はカードは、サンプル調製、核酸増幅、及び分析のための試薬及び成分の全てを含むので、分析対象のサンプルをパウチ内に配置した後、ユーザからの追加の入力なしに器具内でパウチを動作させることができる。いくつかの自己完結型反応容器は、高度に自動化された方法による製造及び簡易な包装のために適合させることができる。いくつかの自己完結型反応容器（すなわちパウチ又はカード）は、可撓性部分、剛性部分、又は可撓性部分と剛性部分の組み合わせを有することができる。
[0006] 一実施形態において、自己完結型反応容器が記載される。自己完結型反応容器は、少なくとも、複数の第２段階反応ウェルを含む第２の反応ゾーンに流体接続された第１の反応ゾーンを含む。一実施形態において、第２の反応ゾーンは、第１のフィルム層、複数の第２段階反応ウェルが形成されているカード層、及び第２のフィルム層から製造することができる。一実施形態において、第１のフィルム層を複数の第２段階反応ウェルの第１の側の上に配置し、第２のフィルム層を複数の第２段階反応ウェルの反対側の第２の側の上に配置することができる。別の実施形態では、第２段階反応ゾーンは第２のフィルム層に接合された第３のフィルム層を含むことができる。自己完結型反応容器は更に、第１の反応ゾーンを第２の反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルに流体接続する充填チャネルを含む。一実施形態において、充填チャネルは少なくとも部分的に第２の層とカード層との間の空間として形成され、充填チャネルは更に、第２段階反応ゾーンにおけるウェル間の流体連通を抑制するように複数の第２段階反応ウェルの各々への入り組んだ流路を形成する。別の実施形態において、充填チャネルは部分的に第２及び第３のフィルム層の間の開いた空間として形成することができ、充填チャネルは更に、第２段階反応ゾーンにおけるウェル間の流体連通を抑制するように複数の第２段階反応ウェルの各々への入り組んだ流路を形成する。
[0007] 一実施形態において、各第２段階反応ウェルのための入り組んだ流路は、第２段階反応ウェルに隣接しているが位置合わせされていないカード層における切り欠きと流体連通している、第２段階反応ウェルに隣接しているが位置合わせされていない第２の層における開口を含むことができる。別の実施形態において、各第２段階反応ウェルのための入り組んだ流路は、第２段階反応ウェルに隣接しているが位置合わせされていない第２の層における開口を含み、この開口は、第２のフィルム層から第１の層に隣接したカード層における実質的に水平方向の切り欠きまで第２段階反応ウェルに隣接して延出しているカード層における実質的に垂直方向の切り欠きと流体連通しており、開口から実質的に垂直方向の切り欠きへの、更に第２段階反応ウェル内への流体導管を生成することができる。
[0008] 別の実施形態において、自己完結型反応容器が記載される。自己完結型反応容器は、少なくとも、複数の第２段階反応ウェルを含む第２の反応ゾーンに流体接続された第１の反応ゾーンと、第１の反応ゾーンを第２の反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルに流体接続する充填チャネルと、第１及び第２の反応ゾーンの間の充填チャネル内の希釈ウェルを含む希釈ゾーンと、を含む。希釈ウェルは、第１の反応ゾーンからの反応生成物の体積部分（volumetric portion）を受容し、体積部分を希釈媒質と組み合わせ、第２の反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルを充填するように構成されている。一実施形態において、希釈ゾーンは、希釈ウェルと流体連通している少なくとも１つの希釈ブリスタを更に含むことができ、少なくとも１つの希釈ブリスタは、希釈媒質を受容し、希釈媒質と体積部分を組み合わせ、第２の反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルを充填するように構成されている。一実施形態において、希釈媒質は製造時に自己完結型反応容器に加えることができる。同様に、自己完結型反応容器で使用するための他の乾燥及び液体の試薬及び成分を製造時にパウチに加えることができる。
[0009] 更に別の実施形態において、サンプルを分析するための方法が記載される。この方法は、（１）充填チャネルによって第２の反応ゾーンに流体接続された第１の反応ゾーンを含む自己完結型反応容器を提供するステップであって、第２の反応ゾーンは第１の複数の第２段階反応ウェル及び少なくとも第２の複数の第２段階反応ウェルを含む、ステップと、（２）第１の反応ゾーンにおいて第１の熱サイクリング反応を選択されたサイクル数だけ実行するステップと、（３）第１の反応ゾーンから第１のサンプルを取り出し、第１のサンプルを希釈剤と組み合わせ、第２の反応ゾーンの第１の複数の第２段階反応ウェルを充填するステップと、（４）第１の反応ゾーンにおいて第１の熱サイクリング反応を追加のサイクル数だけ実行するステップと、（５）第１の反応ゾーンから第２のサンプルを取り出し、第２のサンプルを希釈剤と組み合わせ、第２の反応ゾーンの第２の複数の第２段階反応ウェルを充填するステップと、（６）第２の反応ゾーンにおいて第２の熱サイクリング反応を実行するステップと、を含む。一実施形態において、第１の複数の第２段階反応ウェル及び第２の複数の第２段階反応ウェルは平行分析を試験するように構成できる。別の実施形態において、第１の複数の第２段階反応ウェル及び第２の複数の第２段階反応ウェルは異なる分析を試験するように構成できる。
[0010] 更に別の実施形態において、少なくとも第２のフィルム層に接合された第１のフィルム層から製造された自己完結型反応容器が記載される。自己完結型反応容器は、サンプル内に位置する細胞又は芽胞を溶解するために構成された一体型サンプル調製ゾーンと、製造時にフィルム層内に配置され、一体型サンプル調製ゾーンに流体接続された液体サンプル調製試薬パックと、一体型サンプル調製ゾーンに流体接続され、溶解させたサンプルから核酸を回収するために構成された核酸調製ゾーンと、核酸調製ゾーンに流体接続され、サンプルの第１段階増幅のために構成された第１段階反応ブリスタを含む第１段階反応ゾーンと、第１段階反応ゾーンに流体接続され、複数の第２段階反応ウェルを含む第２段階反応ゾーンと、を含む。各第２段階反応ウェルは、サンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている。一実施形態において、液体サンプル調製試薬パックは、サンプル溶解緩衝剤、サンプル溶解粒子、又はシリカでコーティングされた磁気ビーズのうち１つ以上を含み得る。
[0011] 一実施形態において、自己完結型反応容器は更に、製造時にフィルム層内に配置された、核酸調製ゾーン、第１段階反応ゾーン、又は第２段階反応ゾーンのうち１つ以上に流体接続された１つ以上の追加の液体試薬を含むことができる。一実施形態において、１つ以上の追加の液体試薬は、脱水又は乾燥試薬を含む１つ以上のブリスタに流体接続することができ、脱水又は乾燥試薬は、核酸調製ゾーン、第１段階反応ゾーン、又は第２段階反応ゾーンのうち１つ以上に対応する。一実施形態において、１つ以上の液体試薬は、核酸調製ゾーン、第１段階反応ゾーン、又は第２段階反応ゾーンのうち１つ以上において反応を実行するための液体試薬を含むことができる。一実施形態において、液体試薬及び／又は成分は、製造時に自己完結型反応容器のフィルム層の間に加えることができる。一実施形態において、液体試薬及び／又は成分は、製造時にフィルム層の間に配置された１つ以上の自己完結型試薬パケット（例えばフォイルパケット）として自己完結型反応容器に加えることができる。
[0012] 更に別の実施形態において、サンプル内の核酸を増幅する方法が提供される。この方法は、（１）少なくとも第２のフィルム層に接合された第１のフィルム層から製造された容器を提供することを含む。この容器は、（ｉ）サンプル内に位置する細胞、ウイルス、又は芽胞を溶解するために構成された一体型サンプル調製ゾーンと、（ｉｉ）製造時にフィルム層内に配置され、一体型サンプル調製ゾーンに流体接続された液体サンプル調製試薬と、（ｉｉｉ）一体型サンプル調製ゾーンに流体接続され、サンプルの第１段階増幅のために構成された第１段階反応ブリスタを含む第１段階反応ゾーンと、（ｉｖ）第１段階反応ゾーンに流体接続され、複数の第２段階反応ウェルを含む第２段階反応ゾーンと、を有する。各第２段階反応ウェルは、サンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている。方法は更に、（２）一体型サンプル調製ゾーンにサンプルを加え、サンプルを加えた後に一体型サンプル調製ゾーンを密封することを含み、サンプルを加えることは、一体型サンプル調製ゾーンにスワブ、液体、又は固体のサンプルのうち１つ以上を加えることを含む。方法は更に、（３）液体サンプル調製試薬パックの内容物を一体型サンプル調製ゾーンに注入し、サンプル内に細胞、ウイルス、又は芽胞が存在する場合はこれを溶解して溶解物を発生させることと、（４）溶解物から核酸を抽出し、抽出した核酸を第１段階反応ゾーンに移動させることと、（５）第１段階反応ゾーンにおける核酸を増幅条件下に置くことと、（６）核酸の一部を追加の第２段階増幅チャンバの各々に流体移動させることと、（７）追加の第２段階増幅チャンバにおいて第２段階増幅を実行することと、を含む。
[0013] 一実施形態において、一体型サンプル調製ゾーンには、多種多様なサンプルタイプ（例えば血液、鼻咽頭スワブ、痰、便等）を収集し、このサンプルを一体型サンプル調製チャンバに移送するためのサンプル収集デバイス（例えばスワブ）を提供することができるチャンバを含み得る。サンプル収集デバイスは、チャンバから取り出され、サンプルを収集するため使用され、ユーザからの入力をほとんど又は全く用いることなくパウチ内でサンプル調製及び分析を行うためチャンバに戻すことができる。同様に、容器は、サンプル調製、核酸増幅、及び分析のための試薬及び成分の全てを含むので、分析対象のサンプルを容器内に配置した後、ユーザからの追加の入力をほとんど又は全く用いることなく器具内で容器を動作させることができる。
[0014] 更に別の実施形態において、サンプルから核酸を抽出するための方法が開示される。この方法は、（ａ）多機能チャンバを含む可撓性容器を提供することであって、可撓性容器及び多機能チャンバはサンプル調製及び核酸回収のための試薬及び磁気粒子を内部に含む、ことと、（ｂ）サンプルを多機能チャンバ内に導入することと、（ｃ）磁気粒子の存在下で多機能チャンバ内に溶解物を発生させることと、（ｄ）溶解物から磁気粒子を隔離することにより、磁気粒子を用いて核酸を回収することと、を含む。一実施形態において、磁気粒子はシリカでコーティングされた磁気粒子を含み得る。一実施形態において、多機能チャンバは溶解粒子（例えばケイ酸ジルコニウムビーズ）も含む。一実施形態において、方法は更に、多機能チャンバにおいて第１段階マルチプレックス核酸増幅反応で核酸を増幅させることを含む。一実施形態において、多機能チャンバにおいて核酸を増幅させるステップは、磁気粒子及び／又は溶解粒子の存在下で又は非存在下で実行することができる。
[0015] 一実施形態において、可撓性容器は、多機能チャンバに流体接続された第２段階反応ゾーンを更に含む。第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応ウェルを含み、各第２段階反応ウェルは、サンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている。従って一実施形態において、この方法は、第１段階核酸増幅反応の一部を第２段階核酸増幅反応用の試薬と組み合わせて第２段階核酸増幅混合物を形成するステップと、第２段階反応ウェルの各々に第２段階核酸増幅混合物を充填するステップと、第２段階反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルにおいて第２段階核酸増幅反応を実行するステップと、を更に含む。
[0016] 一実施形態において、方法は、多機能チャンバにおいて少なくとも２つのステップを実行することを含み得る。これらのステップは、（１）溶解前にサンプル及び磁気ビーズを接触させることと、（２）磁気粒子の存在下で溶解物を発生させることと、（３）磁気粒子と核酸を結合することと、（４）溶解物から磁気粒子を隔離することと、（５）溶解物から隔離した磁気粒子に対して少なくとも１回の洗浄を実行することと、（６）第１段階核酸増幅反応において核酸を増幅させることと、を含む。
[0017] 更に別の実施形態において、微生物を同定するための方法が開示される。この方法は、微生物を含む疑いがある流体サンプルを取得するステップと、磁気粒子を収容している多機能チャンバを含む可撓性容器を提供することと、多機能チャンバに流体サンプルを加えることと、流体サンプルに熱及び力のうち少なくとも１つを加えることで溶解物を生じることにより多機能チャンバ内で溶解物を発生させるステップと、多機能チャンバ内で磁気粒子を用いて溶解物から核酸を回収するステップと、溶解粒子及び磁気粒子の存在下で多機能チャンバにおいて第１段階核酸増幅反応を実行して１つ以上のアンプリコンを発生させるステップと、アンプリコンを用いて微生物を同定するステップと、を含む。
[0018] 一実施形態において、微生物を同定する方法は更に、多機能チャンバに流体接続された第２段階反応ゾーンを更に含む可撓性容器を提供することと、第２段階反応ゾーン内にサンプルを導入することと、複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングを実行することと、を含む。第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応ウェルを含み、各第２段階反応ウェルは、アンプリコンのうち１つを更に増幅するために構成された１対のプライマーを含む。一実施形態において、方法は、同時熱サイクリングの前に、第１段階核酸増幅反応の一部を第２段階核酸増幅反応用の試薬と組み合わせて第２段階核酸増幅混合物を形成するステップと、第２段階反応ウェルの各々に第２段階核酸増幅混合物を充填するステップと、を更に含む。
[0019] 一実施形態において、微生物を同定する方法は更に、第２段階核酸増幅反応の後、異なる第２段階反応ウェルの各々において第２段階アンプリコンが存在する場合はこれを融解させ、これにより、異なる第２段階反応ウェルの各々の融解曲線を発生させることと、サンプル内に微生物が存在する場合はこれを同定することと、を含む。
[0020] 更に別の実施形態では、閉鎖系においてサンプルに対する核酸増幅を実行するための可撓性容器が開示される。この容器は、多機能チャンバを画定する第１の可撓性層及び第２の可撓性層と、第１の可撓性層及び第２の可撓性層の間に配置されると共に多機能チャンバに流体接続された第２段階反応ゾーンと、を含む。多機能チャンバ及び可撓性容器は、サンプル調製、核酸回収、及び第１段階核酸増幅反応のための、磁気粒子、任意選択的な溶解粒子、及び試薬を内部に含む。一実施形態において、第１段階核酸増幅反応はシングルプレックス反応（singleplex reaction）である。別の実施形態において、第１段階核酸増幅反応はマルチプレックス反応である。第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバを含み、各第２段階反応チャンバは、サンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている。
[0021] 一実施形態において、可撓性容器は、多機能チャンバと流体連通しているサンプル受容チャンバを更に含む。一実施形態において、サンプル受容チャンバは、サンプル受容チャンバ内に提供されているサンプル収集スワブを含む。一実施形態において、可撓性容器には、多機能チャンバと流体連通している１つ以上の試薬ブリスタが提供されている。一実施形態において、試薬ブリスタのうち１つ以上は流体充填試薬ブリスタである（例えば、サンプル溶解緩衝剤、磁気ビーズ洗浄緩衝剤、溶出緩衝剤、逆転写酵素、第１段階核酸増幅成分の混合物、又は第２段階核酸増幅成分の混合物のうち１つ以上）。一実施形態において、流体充填試薬ブリスタは可撓性容器の製造時に充填することができ、可撓性容器がエンドユーザによって使用されるまで内部に収容しておくことができる。
[0022] 更に別の実施形態において、サンプル内の核酸を増幅するための方法が開示される。この方法は、（ａ）磁気粒子を内部に含む多機能チャンバを含む可撓性容器を提供するステップと、（ｂ）多機能チャンバに流体サンプルを注入するステップと、（ｃ）多機能チャンバに熱及び力のうち少なくとも１つを加えることにより溶解物を発生させるステップと、（ｄ）溶解物から磁気粒子を隔離することにより、磁気粒子を用いて核酸を回収するステップと、（ｅ）磁気ビーズの存在下で多機能チャンバにおいて第１段階核酸増幅反応を実行するステップと、を含む。
[0023] 更に別の実施形態において、サンプルに対して核酸増幅を実行するためのシステムが開示される。このシステムは、可撓性容器を受容するように構成することができ、熱サイクリング器具を含む。一実施形態において、可撓性容器は、多機能チャンバを画定する第１の可撓性層及び第２の可撓性層と、第１の可撓性層及び第２の可撓性層の間に配置されると共に多機能チャンバに流体接続された第２段階反応ゾーンと、第１の可撓性層及び第２の可撓性層の間に形成された、多機能チャンバと流体連通している１つ以上の試薬ブリスタと、を含む。多機能チャンバ及び可撓性容器は、サンプル調製、核酸回収、及び第１段階核酸増幅反応のための、磁気粒子、任意選択的な溶解粒子、及び試薬を内部に含む。第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバを含み、各第２段階反応チャンバは、サンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは、複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている。一実施形態において、可撓性容器は更に、第２段階反応ゾーンにおける第２段階核酸増幅反応のための試薬及び成分を含む。一実施形態において、熱サイクリング器具は、器具内に可撓性容器を位置決めするためのレセプタクルと、器具内に位置決め可能であり、多機能チャンバ及び第２段階反応ゾーンのうち１つ以上を加熱及び／又は冷却するためのヒータ／クーラと、多機能チャンバにおいて溶解物を発生させるために構成された細胞溶解成分と、少なくとも１つ以上の試薬ブリスタ、多機能チャンバ、及び第２段階反応ゾーンの間で可撓性容器内の流体を移動させるために構成された流体移動コンポーネントと、を更に含む。一実施形態において、第１段階核酸増幅反応はシングルプレックス反応である。別の実施形態において、第１段階核酸増幅反応はマルチプレックス反応である。
[0024] 一実施形態において、ヒータ／クーラは、サンプルの第１の部分を第１の温度に調整するための多機能チャンバの第１の部分に隣接した第１のヒータと、サンプルの第２の部分を第２の温度に調整するための多機能チャンバの第２の部分に隣接した第２のヒータと、を含み、第２の温度は第１の温度とは異なる。一実施形態において、ヒータ／クーラは、サンプルの各部分が同時にヒータの各々の制御下にくるように、サンプルの第２の部分を多機能チャンバの第１の部分に移動させながらサンプルの第１の部分を多機能チャンバの第２の部分に移動させるワイパ要素を更に含む。一実施形態において、ワイパ要素はサンプルの各部分を多機能チャンバの反対部分に繰り返し移動させてサンプルを熱サイクルさせる。一実施形態において、器具は更に平行移動機（translator）を含む。この平行移動機は、レセプタクル、可撓性容器、又はヒータ／クーラのうち少なくとも１つに機械的に結合されて、多機能チャンバ及び／又は第２段階反応ゾーンのうち少なくとも一部を、ヒータ／クーラの第１及び第２のヒータ要素に対して横方向に位置合わせすることで、この少なくとも一部が第１又は第２のヒータ要素のうち少なくとも１つの温度制御下にくるようにする。
[0025] 本明細書において、以下が記載される。
[0026]１．サンプル内の核酸を増幅するための方法であって、
多機能チャンバ及び多機能チャンバに流体接続された第１の反応ゾーンを含む容器を提供することであって、容器は、サンプル調製、核酸回収、及び第１段階核酸増幅反応のための磁気粒子及び試薬を内部に含み、磁気粒子及び試薬は多機能チャンバ又は第１の反応ゾーン又はそれら双方に流体接続されている、ことと、
サンプルを多機能チャンバに導入することと、
多機能チャンバにおいて少なくとも２つのステップを実行することであって、ステップは、
（１）溶解前にサンプル及び磁気ビーズを接触させることと、
（２）磁気粒子の存在下で溶解物を発生させることと、
（３）磁気粒子と核酸を結合することと、
（４）溶解物から磁気粒子を隔離することと、
（５）溶解物から隔離した磁気粒子に対して少なくとも１回の洗浄を実行することと、
（６）第１段階核酸増幅反応において核酸を増幅させることと、
を含む、少なくとも２つのステップを実行することと、
を含む方法。
[0027]２．多機能チャンバに溶解粒子が提供されている、条項１に記載の方法。
[0028]３．多機能チャンバにおいて実行されるステップは、
ステップ（１）及び（２）、
ステップ（１）、（２）、及び（３）、
ステップ（１）から（４）、
ステップ（２）及び（３）、並びに
ステップ（２）、（３）、及び（４）、
のグループから選択される、条項１又は２に記載の方法。
[0029]４．多機能チャンバにおいて実行されるステップは、
ステップ（３）及び（４）、
ステップ（３）、（４）、及び（５）、
ステップ（４）、（５）、及び（６）、並びに
ステップ（５）及び（６）、
のグループから選択される、条項１又は２に記載の方法。
[0030]５．ステップを実行することはステップ（３）を含み、ステップ（３）は更に、溶解物を発生させると共にサンプルに熱を加えることを含む、条項１から４のいずれかに記載の方法。
[0031]６．ステップを実行することはステップ（２）を含み、溶解物は核酸を磁気粒子に結合させるための条件下で発生される、条項１から５のいずれかに記載の方法。
[0032]７．ステップを実行することはステップ（２）を含み、溶解物は溶解温度で発生され、核酸は制御された温度で溶解物から回収され、溶解温度は４０から１００℃、好ましくは５０から１００℃、又はより好ましくは７０から１００℃の範囲内であり、制御された温度は溶解温度より低く、０から６０℃、好ましくは０から５０℃、又はより好ましくは０から４０℃の範囲内である、条項１から６のいずれかに記載の方法。
[0033]８．ステップを実行することはステップ（３）及び（４）を含み、ステップ（４）は、磁気粒子を多機能チャンバから第１の反応ゾーンへ移動させることを更に含み、
ステップを実行することはステップ（５）を含み、ステップ（５）は第１の反応ゾーンにおいて実行され、洗浄は、第１の反応ゾーン内に洗浄緩衝剤を注入することと、洗浄緩衝剤に磁気ビーズを分散させることと、磁気ビーズを再捕捉することと、洗浄緩衝剤を放出することと、を含み、
ステップを実行することはステップ（６）を含み、ステップ（６）は第１の反応ゾーンにおいて実行される、ことを更に含む、条項１又は２に記載の方法。
[0034]９．ステップ（３）及び（４）の実行後に溶解粒子は多機能チャンバ内に残っている、条項１から８のいずれかに記載の方法。
[0035]１０．ステップ（５）の後に第１の反応ゾーンに核酸増幅試薬を加えることを更に含み、ステップ（６）の前に溶出ステップは存在しない、条項１から９のいずれかに記載の方法。
[0036]１１．ステップを実行することはステップ（３）、（４）、及び（５）を含み、
ステップ（３）及び（４）は溶解物を廃棄物チャンバに放出することを更に含み、
ステップ（５）は多機能チャンバにおいて実行され、ステップ（５）は、多機能チャンバ内に洗浄緩衝剤を注入することと、洗浄緩衝材に磁気ビーズを分散させることと、磁気ビーズを再捕捉することと、洗浄緩衝剤を放出することとを含む、条項１から１０のいずれかに記載の方法。
[0037]１２．ステップ（６）は多機能チャンバにおける第１段階マルチプレックス核酸増幅反応であり、増幅ステップの前に溶出ステップは存在しない、条項１から１１のいずれかに記載の方法。
[0038]１３．容器は、多機能チャンバに流体接続された第２段階反応ゾーンを更に含み、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応ウェルを含み、各第２段階反応ウェルはサンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている、条項１から１２のいずれかに記載の方法。
[0039]１４．第２段階反応ゾーンは第１の反応ゾーンを介して多機能チャンバに流体接続されている、条項１から１３のいずれかに記載の方法。
[0040]１５．ステップを実行することはステップ（６）を含み、更に、第１段階核酸増幅反応の一部を第２段階核酸増幅反応用の試薬と組み合わせて第２段階核酸増幅混合物を形成することと、第２段階反応ウェルの各々に第２段階核酸増幅混合物を充填することと、第２段階反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルにおいて第２段階核酸増幅反応を実行して１つ以上のアンプリコンを発生させることとを含む、条項１から１４のいずれかに記載の方法。
[0041]１６．１つ以上のアンプリコンを用いて、１つ以上の微生物がサンプル内に存在する場合はこれを同定することを更に含む、条項１から１６のいずれかに記載の方法。
[0042]１７．可撓性容器は多機能チャンバと流体連通しているサンプル受容チャンバを更に含む、条項１から１６のいずれかに記載の方法。
[0043]１８．サンプルスワブを用いてサンプルを収集することと、スワブをサンプル受容チャンバ内に挿入することと、スワブが内部に入っているサンプル受容チャンバを密封することと、サンプル受容チャンバ内に注入されたサンプル溶解緩衝剤でサンプル受容チャンバ内のサンプルを分散させることと、サンプル及びサンプル溶解緩衝剤を多機能チャンバ内に移すこととを更に含む、条項１から１７のいずれかに記載の方法。
[0044]１９．サンプル調製、核酸回収、及び第１段階核酸増幅のための磁気粒子及び試薬は、１つ以上の流体充填試薬ブリスタに、１つ以上の乾燥試薬ブリスタに、又はそれらの組み合わせに提供される、条項１から１８のいずれかに記載の方法。
[0045]２０．ステップを実行することはステップ（２）を含み、更に、ステップ（２）の後に多機能チャンバ内の溶解粒子を溶解物から隔絶することを含む、条項１から１９のいずれかに記載の方法。
[0046]２１．ステップを実行することはステップ（３）を含み、更に、ステップ（３）の後に多機能チャンバ内の磁気粒子を隔絶することを含む、条項１から２０のいずれかに記載の方法。
[0047]２２．閉鎖系においてサンプルに対する核酸増幅を実行するための容器であって、
多機能チャンバを間に画定する第１の層及び第２の層を備え、容器には、サンプル調製、核酸回収、及び第１段階核酸増幅反応のための磁気粒子及び試薬が提供され、磁気粒子は、多機能チャンバに流体接続されているチャンバに提供されるか又は多機能チャンバに提供され、試薬は、多機能チャンバに流体接続されているチャンバに提供され、
容器は更に、
第１の層と第２の層との間に配置され、多機能チャンバに流体接続された第２段階反応ゾーンであって、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバを含み、各第２段階反応チャンバはサンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている、第２段階反応ゾーン、
を備える容器。
[0048]２３．多機能チャンバに細胞溶解成分及び磁気粒子が提供されている、条項２２に記載の容器。
[0049]２４．細胞溶解成分は溶解粒子又は溶解粒子を含む、条項２２から２３のいずれかに記載の容器。
[0050]２５．容器は多機能チャンバと流体連通しているサンプル溶解チャンバを更に含み、サンプル溶解チャンバに細胞溶解成分及び磁気粒子が提供され、多機能チャンバに磁気ビーズ洗浄成分及び第１段階核酸増幅成分が提供されている、条項２２から２４のいずれかに記載の容器。
[0051]２６．サンプル溶解チャンバと多機能チャンバとの間に位置決めされたフィルタを更に備える、条項２２から２５のいずれかに記載の容器。
[0052]２７．フィルタは、溶解粒子を保留すると共に磁気ビーズを通過させるような大きさの多孔度を有する、条項２２から２６のいずれかに記載の容器。
[0053]２８．チャネルがサンプル溶解チャンバと多機能チャンバを接続し、フィルタは第１の層と第２の層との間でチャネルと交差するように位置決めされている、条項２２から２７のいずれかに記載の容器。
[0054]２９．フィルタはチャネルよりも幅が広い、条項２２から２８のいずれかに記載の容器。
[0055]３０．チャネルがサンプル溶解チャンバと多機能チャンバとの間に延出し、フィルタはサンプル溶解チャンバにおいてチャネルに隣接して位置付けられている、条項２２から２９のいずれかに記載の容器。
[0056]３１．チャネルはサンプル溶解チャンバよりも小さく、フィルタはチャネルよりも幅が広い、条項２２から３０のいずれかに記載の容器。
[0057]３２．磁気粒子は核酸結合磁気粒子である、条項２２から３１のいずれかに記載の容器。
[0058]３３．多機能チャンバと流体連通しているサンプル受容チャンバを更に含む、条項２２から３２のいずれかに記載の容器。
[0059]３４．サンプル受容チャンバはサンプル収集スワブを含む、条項２２から３３のいずれかに記載の容器。
[0060]３５．サンプル収集スワブは細長い軸を含み、サンプル受容チャンバ及びスワブの細長い軸は、熱シールによって少なくとも部分的に融合させることができる化学的にコンパチブルな材料から製造される、条項２２から３４のいずれかに記載の容器。
[0061]３６．磁気粒子及び試薬は多機能チャンバと流体連通している１つ以上の試薬ブリスタに提供されている、条項２２から３５のいずれかに記載の容器。
[0062]３７．試薬ブリスタのうち１つ以上は流体充填試薬ブリスタであり、容器の製造時に充填される、条項２２から３６のいずれかに記載の容器。
[0063]３８．試薬ブリスタのうち１つ以上は試薬ブリスタ内に配置された乾燥試薬を含む、条項２２から３７のいずれかに記載の容器。
[0064]３９．試薬ブリスタと多機能チャンバとの間に開放可能シールを更に含む、条項２２から３８のいずれかに記載の容器。
[0065]４０．開放可能シールは破裂可能シールである、条項２２から３９のいずれかに記載の容器。
[0066]４１．開放可能シールは連結させたフィルムによるシールである、条項２２から４０のいずれかに記載の容器。
[0067]４２．自己完結型反応容器であって、
第２の反応ゾーンに流体接続された第１の反応ゾーンを備え、第２の反応ゾーンは、
第１の層、内部に複数の第２段階反応ウェルが形成されているカード層、及び第２の層を含み、
第１の層は複数の第２段階反応ウェルの第１の端部の上に配置されて第１の端部を密封し、第２の層は複数の第２段階反応ウェルの反対側の第２の側の上に配置されて第２の反対の側を密封し、
自己完結型反応容器は更に、
第１の反応ゾーンを第２の反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルに流体接続する充填チャネル、
を備え、充填チャネルは少なくとも部分的に第２の層とカード層との間の空間として形成され、充填チャネルは更に、第２段階反応ゾーンにおけるウェル間の流体連通を抑制するように複数の第２段階反応ウェルの各々への入り組んだ流路を形成する、自己完結型反応容器。
[0068]４３．充填チャネルは、カード層、第２の層、又はカード層と第２の層との組み合わせに形成されたチャネルを含み、充填チャネルは第２段階反応ウェルの全てを第１段階反応ゾーンに個別に流体接続する、条項４２に記載の自己完結型反応容器。
[0069]４４．第２の層に接合された第３の層を更に備え、第２の層は複数の第２段階反応ウェルに流体接続された複数の穿孔を有する穿孔層を含み、充填チャネルは第２及び第３の層の間の空間として形成されている、条項４２から４３のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0070]４５．各第２段階反応ウェルのための入り組んだ流路は、第２段階反応ウェルに隣接しているが位置合わせされていないカード層における切り欠きと流体連通している、第２段階反応ウェルに隣接しているが位置合わせされていない第２の層における開口を含む、条項４２から４４のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0071]４６．各第２段階反応ウェルのための入り組んだ流路は、第２段階反応ウェルに隣接しているが位置合わせされていない第２の層における開口を含み、開口は、第２のフィルム層から第１の層に隣接したカード層における実質的に水平方向の切り欠きまで第２段階反応ウェルに隣接して延出しているカード層における実質的に垂直方向の切り欠きと流体連通しており、開口から実質的に垂直方向の切り欠きへの、更に第２段階反応ウェル内への流体導管を生成する、条項４２から４５のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0072]４７．充填チャネルは熱シール可能である、条項４２から４６のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0073]４８．単一の熱シールが、充填チャネルから複数の第２段階反応ウェルまでの流れを密封すると共に第２段階反応ウェルを相互に密封する、条項４２から４７のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0074]４９．充填チャネルは、第１及び第２の反応ゾーンの間の充填チャネル内の希釈ウェルを含む希釈ゾーンを更に含み、希釈ウェルは、第１の反応ゾーンからの反応生成物の体積部分を受容し、体積部分を希釈媒質と組み合わせて組み合わせ体積部分を形成し、第２の反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルに組み合わせ体積部分を充填するように構成されている、条項４２から４８のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0075]５０．希釈ゾーンは希釈ウェルと流体連通している希釈ブリスタを更に含み、希釈ブリスタは、希釈媒質を受容し、希釈媒質と体積部分を組み合わせ、第２の反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルを充填するように構成されている、条項４２から４９のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0076]５１．自己完結型反応容器であって、
サンプル内に存在する細胞又は芽胞の溶解のために構成されたサンプル溶解ゾーンと、
サンプル溶解ゾーンに流体接続された第１の反応ゾーンであって、溶解させたサンプルから核酸を回収すると共に存在する核酸の第１段階増幅のために核酸構成された第１の反応ゾーンと、
第１の反応ゾーンに流体接続された第２段階反応ゾーンであって、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応ウェルを含み、各第２段階反応ウェルはサンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている、第２段階反応ゾーンと、
サンプル溶解ゾーン、第１の反応ゾーン、又は第２段階反応ゾーンのうち１つ以上に流体接続された複数の液体試薬ブリスタであって、製造時に液体試薬ブリスタ内に液体試薬が提供される、複数の液体試薬ブリスタと、
を備える自己完結型反応容器。
[0077]５２．サンプル溶解ゾーンに、サンプル内に位置する細胞又は芽胞を溶解するために構成された溶解粒子と、溶解物から核酸を回収するために構成された磁気ビーズと、が提供されている、条項５１に記載の自己完結型反応容器。
[0078]５３．サンプル溶解ゾーンに流体接続されている液体試薬ブリスタのうち１つ以上に、溶解粒子、磁気ビーズ、及び溶解緩衝剤が提供されている、条項５１から５２のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0079]５４．液体試薬ブリスタのうち１つの内部の液体試薬パックに液体試薬のうち１つが提供されている、条項５１から５３のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0080]５５．液体試薬パックは第１の層と第２の層との間に密封されたある体積の液体を含む、条項５１から５４のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0081]５６．第１の層又は第２の層のうち少なくとも１つはバリアフィルムを含む、条項５１から５５のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0082]５７．液体試薬ブリスタ内に配置された液体試薬と、サンプル溶解ゾーン、第１の反応ゾーン、又は第２段階反応ゾーンのうち１つ以上との間に、開放可能シールを更に含む、条項５１から５６のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0083]５８．開放可能シールは破裂可能シールである、条項５１から５７のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0084]５９．開放可能シールは連結させたフィルムによるシールである、条項５１から５８のいずれかに記載の自己完結型反応容器。
[0085]６０．サンプルに対して核酸増幅を実行するためのシステムであって、
反応容器であって、
多機能チャンバを間に画定する第１の層及び第２の層であって、第２段階反応ゾーンが第１の層と第２の層との間に配置されると共に多機能チャンバに流体接続され、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバを含み、各第２段階反応チャンバはサンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている、第１の層及び第２の層と、
第１の層と第２の層との間で多機能チャンバ及び第２段階反応ゾーンと流体連通して形成された１つ以上の試薬ブリスタであって、多機能チャンバに流体接続されたブリスタ内に又は多機能チャンバ内に磁気粒子が提供されている、１つ以上の試薬ブリスタと、
を含む反応容器と、
熱サイクリング器具であって、
器具内に可撓性容器を位置決めするためのレセプタクルと、
器具内に位置決め可能であり、多機能チャンバ及び第２段階反応ゾーンのうち１つ以上を加熱及び／又は冷却するためのヒータ／クーラと、
反応容器において溶解物を発生させるために構成された細胞溶解成分と、
少なくとも１つ以上の試薬ブリスタ、多機能チャンバ、及び第２段階反応ゾーンの間で可撓性容器内の流体を移動させるために構成された流体移動コンポーネントと、
を含む熱サイクリング器具と、
を備えるシステム。
[0086]６１．多機能チャンバに細胞溶解成分及び磁気粒子が提供されている、条項６０に記載のシステム。
[0087]６２．容器は多機能チャンバと流体連通しているサンプル溶解チャンバを更に含み、サンプル溶解チャンバに細胞溶解成分及び磁気粒子が提供され、多機能チャンバに磁気ビーズ洗浄成分及び第１段階核酸増幅成分が提供されている、条項６０から６１のいずれかに記載のシステム。
[0088]６３．器具は、多機能チャンバの一部において磁気ビーズを隔離するための、器具において展開可能な磁石を更に含む、条項６０又は６２に記載のシステム。
[0089]６４．ヒータ／クーラは、サンプルの第１の部分を第１の温度に調整するための多機能チャンバの第１の部分に隣接した第１のヒータと、サンプルの第２の部分を第２の温度に調整するための多機能チャンバの第２の部分に隣接した第２のヒータと、を含み、第２の温度は第１の温度とは異なる、条項６０から６３のいずれかに記載のシステム。
[0090]６５．ヒータ／クーラは、サンプルの各部分が同時にヒータの各々の制御下にくるように、サンプルの第２の部分を多機能チャンバの第１の部分に移動させながらサンプルの第１の部分を多機能チャンバの第２の部分に移動させるワイパ要素に機械的に関連付けられている、条項６０から６４のいずれかに記載のシステム。
[0091]６６．ワイパ要素はサンプルの各部分を多機能チャンバの反対部分に繰り返し移動させてサンプルを熱サイクルさせる、条項６０から６５のいずれかに記載のシステム。
[0092]６７．器具は更に平行移動機を含み、平行移動機は、レセプタクル、可撓性容器、又はヒータ／クーラのうち少なくとも１つに機械的に結合されて、多機能チャンバ、第２段階反応ゾーン、又はこれら双方のうち少なくとも一部を、ヒータ／クーラの第１及び第２のヒータ要素に対して横方向に位置合わせすることで、多機能チャンバ又は第２段階反応ゾーンの少なくとも一部が第１又は第２のヒータ要素のうち少なくとも１つの温度制御下にくるようにする、条項６０から６６のいずれかに記載のシステム。
[0093]６８．器具は、少なくとも一部における流体サンプルを熱サイクルさせるため、少なくとも一部を第１のヒータ要素と、次いで第２のヒータ要素と、繰り返し位置合わせするように構成されている、条項６０から６７のいずれかに記載のシステム。
[0094]６９．アレイアセンブリであって、
アレイ内に配置された複数のウェルと、
複数のウェルの各々と流体連通している流体充填チャネルと、
を備え、アレイのウェルのうち少なくとも１つは、第１の直径を有する反応ウェルと、第２のより小さい直径を有するアレイアセンブリの第１の表面よりも下方にくぼんだサブウェルと、を含み、くぼんだサブウェルは流体充填チャネルに流体接続されていない、アレイアセンブリ。
[0095]７０．流体充填チャネルは複数のウェルの各々と流体連通している複数の分岐チャネルを含み、くぼんだサブウェルはその分岐チャネルに流体接続されていない、条項６９に記載のアレイ。
[0096]７１．サブウェルはアレイの第２の表面よりも下方にくぼんでおり、アレイの第２の表面は第１の表面の反対側である、条項６９から７０のいずれかに記載のアレイ。
[0097]７２．アレイをスポットするための方法であって、
アレイ内に配置された複数のウェルを含むアレイアセンブリを提供することであって、アレイアセンブリ及び複数のウェルは複数のウェルに試薬及び／又は反応成分をスポットする前に裏当て層を含まない、ことと、
スポット装置において、アレイアセンブリのウェルに対応するアレイに配置された複数のカニューレを含むスポットアセンブリに対してアレイアセンブリを位置決めすることであって、各カニューレは流体試薬貯蔵部に流体接続されている、ことと、
各カニューレの端部に流体の液滴を送出することと、
液滴とアレイのウェルを接触させて液滴をアレイアセンブリに移動させることと、
液滴から流体を蒸発させて、ウェル内に乾燥試薬を有するアレイアセンブリを生成することと、
を含む方法。
[0098]７３．スポット装置は、カニューレに対してアレイアセンブリを位置合わせするように位置決めされた位置合わせピン、止め具、フレーム、又はそれらの組み合わせを含む、条項７２に記載の方法。
[0099]７４．２つ以上のカニューレが同一の流体試薬貯蔵部に流体接続されている、条項７２から７３のいずれかに記載の方法。
[00100]７５．各カニューレが異なる流体試薬貯蔵部に流体接続されている、条項７２から７４のいずれかに記載の方法。
[00101]７６．送出するステップの前に、アレイアセンブリのウェルにカニューレを貫通させることを更に含み、
接触させるステップは、カニューレを後退させて液滴とアレイのウェルを接触させて液滴をアレイアセンブリに移動させることを含む、条項７２から７５のいずれかに記載の方法。
[00102]７７．送出するステップの前に、カニューレに対してアレイアセンブリを移動させてアレイアセンブリのウェルにカニューレを貫通させることを更に含み、
接触させるステップは、カニューレに対してアレイアセンブリを後退させて液滴とアレイのウェルを接触させて液滴をアレイアセンブリに移動させることを含む、条項７２から７６のいずれかに記載の方法。
[00103]７８．反応パウチを作製する方法であって、
条項７２から７７に記載の方法又はこれらのうち１項に従ってスポットされたアレイアセンブリを提供することと、
２つ以上のフィルム層の間に前もって形成されたポケット内にアレイアセンブリを挿入することと、
フィルム層をアレイアセンブリに密封してフィルム層をアレイアセンブリの上面及び下面に密封することと、
前もって形成されたポケットを密封することと、
を含む方法。
[00104]７９．２つ以上のフィルム層は、フィルム層の間にアレイを位置決めする前に積層され熱成形されて、１つ以上の反応ブリスタ、１つ以上の試薬ブリスタ、及び１つ以上のポケットから成る群から選択された画定エリアを画定する、条項７８に記載の方法。
[00105]８０．２つ以上のフィルム層は、フィルム層の間にアレイを位置決めした後に積層され熱成形されて、１つ以上の反応ブリスタ、１つ以上の試薬ブリスタ、及び１つ以上のポケットから成る群から選択された画定エリアを画定する、条項７８に記載の方法。
[00106]８１．アレイを流体であふれさせることができるように、アレイポケットは１つ以上の上流の流体ブリスタに流体接続されている、条項７８に記載の方法。
[00107]８２．アレイアセンブリはアレイアセンブリの各ウェルに流体接続された流体チャネルシステム及び真空チャネルシステムを含む、条項７８に記載の方法。
[00108]８３．反応容器であって、
反応容器を画定する第１の材料層及び少なくとも第２の材料層と、
第１及び第２の材料層の間に形成されたサンプル導入ブリスタ及び希釈ブリスタであって、希釈ブリスタはサンプル導入ブリスタに流体接続されている、サンプル導入ブリスタ及び希釈ブリスタと、
サンプル導入ブリスタに流体接続された１つ以上の反応ウェル及び希釈ブリスタに流体接続された１つ以上の反応ウェルと、
を含み、希釈ブリスタはサンプル導入ブリスタからのサンプルのアリコートの選択された希釈を行うように構成され、
１つ以上の反応ウェルはサンプルに対してアッセイを実行するための試薬を含む、反応容器。
[00109]８４．希釈ブリスタに、サンプル導入ブリスタに加えられたサンプルの選択された希釈を実行するように選択された体積の流体が提供されている、条項８３に記載の反応容器。
[00110]８５．反応容器は、ブリスタから選択された体積の流体を受容すると共にこれを選択された体積の希釈剤と組み合わせて希釈サンプルを作製するような大きさ及び寸法の体積希釈ウェルを更に含む、条項８３から８４のいずれかに記載の反応容器。
[00111]８６．反応容器は、ブリスタから選択された体積の流体を受容すると共にこれを選択された体積の希釈剤と組み合わせて希釈サンプルを作製するような大きさ及び寸法のチャネルを更に含む、条項８３から８５のいずれかに記載の反応容器。
[00112]８７．１つ以上の反応ウェルは同一の試薬を含む、条項８３から８６のいずれかに記載の反応容器。
[00113]８８．１つ以上の反応ウェルは異なる試薬を含む、条項８３から８７のいずれかに記載の反応容器。
[00114]８９．反応ウェルのうち少なくとも１つは、同一のサンプルブリスタに流体接続された２つ以上の同時充填可能サブウェルを備えた反応ウェルを含む、条項８３から８８のいずれかに記載の反応容器。
[00115]９０．サンプル導入ブリスタ及び希釈ブリスタ内のサンプルに基準を提供するための標準溶液に対するアッセイを実行するための試薬を含む１つ以上の反応ウェルに流体接続された既知の標準溶液ブリスタを更に備える、条項８３から９０のいずれかに記載の反応容器。
[00116]９１．アレイアセンブリであって、
アレイに配置された複数のウェルと、
複数のウェルの各々と流体連通している複数の分岐チャネルを含む流体充填チャネルと、
を備え、アレイのウェルのうち少なくとも１つは、同一の分岐チャネルに流体接続された２つ以上の同時充填可能サブウェルを備えた反応ウェルを含む、アレイアセンブリ。
[00117]９２．２つ以上のサブウェルの各々は別個の試薬を含む、条項９１に記載のアレイアセンブリ。
[00118]９３．サブウェル内の別個の試薬は、反応ウェルに流体が充填された場合に結合可能である、条項９１から９２のいずれかに記載のアレイアセンブリ。
[00119]９４．複数のウェルが内部に形成されたカード層を更に備える、条項９１から９３のいずれかに記載のアレイアセンブリ。
[00120]９５．反応容器を密封するための方法であって、
サンプル受容チャンバ及びサンプル受容ゾーンに流体接続された第１の反応ゾーンを含む反応容器を提供することと、
細長い軸を含むサンプル収集スワブを提供することと、
スワブをサンプル受容チャンバ内に挿入することと、
スワブの細長い軸と交差するようにサンプル受容チャンバにシールを適用してサンプル受容チャンバを密封することと、
を含む方法。
[00121]９６．シールは、サンプル受容チャンバ及びサンプル収集スワブの細長い軸をシールにおいて少なくとも部分的に融合させる熱シールである、条項９５に記載の方法。
[00122]９７．軸は非円形の断面を有する、条項９５から９６のいずれかに記載の方法。
[00123]９８．細長い軸と交差するように追加のシールを適用して、サンプル受容チャンバを第１の反応ゾーンに流体接続された複数のチャンバに分割することを更に含む、条項９５から９７のいずれかに記載の方法。
[00124]９９．サンプル受容チャンバ及びスワブの細長い軸は、熱シールによって少なくとも部分的に融合させることができる化学的にコンパチブルな材料から製造される、条項９５から９８のいずれかに記載の方法。
[00125] この概要は、以下で「発明を実施するための形態」において更に記載するいくつかの概念を簡略化した形態で紹介するために提示する。この概要は、特許請求される主題の重要な特徴（features）又は不可欠な特徴を識別することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲の決定に役立てるため用いることも意図していない。
[00126] 追加の特徴及び利点は、以下の記載において述べられ、記載から部分的に明らかになるか、又は本発明の実施によって獲得され得る。そのような特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される器具及び組み合わせによって実現及び取得できる。これら及びその他の特徴は、以下の記載及び添付の特許請求の範囲から充分に明らかになるか、又は以下で述べられる本発明の実施によって獲得できる。
[00127] 自己完結型ＰＣＲに有用な可撓性パウチを示す。 [00128] 図１のパウチを含み、図１のパウチと共に使用される器具の分解斜視図である。 [00129] 図２の袋コンポーネントと共に図１のパウチを示す。 [00130] 図２の器具の１つの例示的な実施形態で使用されるモータを示す。 [00131] 可撓性部分及び剛性部分を有するパウチの別の実施形態を示す。 [00132] 図５Ａのパウチの一部の、線Ｂ－Ｂに沿った断面図を示す。 [00133] 図５Ａのパウチの一部の、線Ｃ－Ｃに沿った断面図を示す。 [00134] 図５Ａのパウチ又は本明細書における様々な他の実施形態に含むことができる第２段階ＰＣＲアレイの概略図である。 [00135] アレイの１つのウェル及びこのウェルを充填するための一連のチャネルを示す、図６Ａのアレイの線Ｂ－Ｂに沿った切断図である。 [00136] 図６Ｂと同様であるが、アレイの１つのウェル及びこのウェルを充填するための代替的なシステムを示す。 [00137] 一体型サンプル調製容器及び１つ以上の流体試薬パケットを含む可撓性パウチの別の実施形態を示す。 [00138] 高密度アレイに含まれ得るウェルの切断図であり、標準大気圧条件のもとでウェルを充填することができる空気圧膨張チャンバを示す。 [00139] 高密度アレイに含まれ得るウェルの別の実施形態の切断図であり、標準大気圧条件のもとでウェルを充填することができる空気圧膨張チャンバを示す。 [00140] 高密度アレイに含めることができ、標準大気圧条件のもとで充填できる一連のウェルを示す。 [00140] 高密度アレイに含めることができ、標準大気圧条件のもとで充填できる一連のウェルを示す。 [00140] 高密度アレイに含めることができ、標準大気圧条件のもとで充填できる一連のウェルを示す。 [00140] 高密度アレイに含めることができ、標準大気圧条件のもとで充填できる一連のウェルを示す。 [00140] 高密度アレイに含めることができ、標準大気圧条件のもとで充填できる一連のウェルを示す。 [00141] 使用場所でのアレイ排気システムの一実施形態を示す第２段階アレイを示す。 [00142] 図１０Ａの一部の線Ｂ－Ｂに沿った断面図である。 [00143] 可撓性パウチの別の実施形態を示し、未使用のパウチを示す。 [00143] 可撓性パウチの別の実施形態を示し、サンプル収集のためスワブが使用されてパウチが密封された後の図１１Ａのパウチを示す。 [00144] 本明細書に例示されるパウチの１つ以上に含まれ得るブリスタ及び乾燥試薬ピルを示す。 [00145] 本明細書に記載されるパウチの１つ以上に含まれ得る液体試薬パケットの実施形態を示す。 [00146] 図１２Ａの一部の線Ｂ－Ｂに沿った断面図である。 [00147] 本明細書に記載されるパウチの１つ以上に含まれ得る液体試薬パケットの別の実施形態を示す。 [00148] 本明細書に記載されるパウチの１つ以上に含まれ得る液体試薬パケットの別の実施形態の断面図を示す。 [00149] 本明細書に記載されるパウチの１つ以上に含まれ得る一体型サンプル調製ブリスタ及び関連付けられたチャネルの断面図を示す。 [00150] 複数の個別に充填可能な第２段階反応ウェルアレイを有する第２段階アレイを示す。 [00151] 複数の個別に充填可能な第２段階反応ウェルアレイを有する第２段階アレイの別の実施形態を示す。 [00152] 図１４Ｂの第２段階アレイを、分析方法を実行するための一連の流体ブリスタにどのように接続できるかを示す概略図である。 [00153] ２つの反応ブリスタと、これらのブリスタ間のチャネル内に配置された吸収部材と、を有するパウチを概略的に示す。 [00154] 膨張状態の吸収部材の、図１５Ａの線Ｂ－Ｂに沿った切断図を示す。 [00154] 圧縮状態の吸収部材の、図１５Ａの線Ｂ－Ｂに沿った切断図を示す。 [00155] 可撓性パウチの別の実施形態と、このパウチと共に使用するために構成された器具の特徴部（feature）とを示す。 [00156] パウチの別の実施形態を示し、このパウチは、単一のコンパートメントにおけるサンプル調製、核酸回収、及び任意選択的な第１段階核酸増幅反応のための試薬及び成分を含む。 [00157] 一実施形態において、サンプルをパウチ内に導入するためスワブの取り出し及び挿入を行うためにサンプル導入チャンバが開放されている図１７Ｂのパウチを示す。 [00158] 可撓性パウチの更に別の実施形態を示し、この可撓性パウチは、サンプル調製、核酸回収、及び任意選択的にワイパサイクリングによる第１段階核酸増幅のための試薬及び成分を含む。 [00159] 図１７Ａから図１７Ｂのパウチのようなパウチに一体化することができるスワブの実施形態を斜視図で示す。 [00159] 図１７Ａから図１７Ｂのパウチのようなパウチに一体化することができるスワブの実施形態を一部分解図で示す。 [00160] 軸に媒質を含む全量ピペットを示す。 [00161] 軸にスワブ状繊維を含む全量ピペットを示す。 [00162] アレイウェル及びチャネルの構成を示す。 [00162] アレイウェル及びチャネルの構成を示す。 [00162] アレイウェル及びチャネルの構成を示す。 [00162] アレイウェル及びチャネルの構成を示す。 [00162] アレイウェル及びチャネルの構成を示す。 [00163] 多数の流体ゾーン及び２つのゾーンの間のフィルタを有する可撓性パウチを示す。 [00164] 図２１Ａのパウチに含まれるフィルタの断面図を示す。 [00165] パウチ内フィルタの代替的な実施形態を示す。 [00165] パウチ内フィルタの代替的な実施形態を示す。 [00166] アレイカードに含むことができるアレイウェルの切断図を示す。 [00167] アレイカードに含むことができるアレイウェルの別の実施形態の切断図を示す。 [00168] アレイカードに含むことができる２つの同時充填可能ウェルを備えたアレイウェルの平面図である。 [00168] アレイカードに含むことができる２つの同時充填可能ウェルを備えたアレイウェルの切断図である。 [00169] アレイのウェル内に化学物質（chemistry）をスポットするための方法を示す。 [00169] アレイのウェル内に化学物質をスポットするための方法を示す。 [00169] アレイのウェル内に化学物質をスポットするための方法を示す。 [00169] アレイのウェル内に化学物質をスポットするための方法を示す。 [00169] アレイのウェル内に化学物質をスポットするための方法を示す。 [00169] アレイのウェル内に化学物質をスポットするための方法を示す。 [00170] 本明細書に記載されている器具のうち１つ以上において１つ以上のパウチ実施形態と共に使用できる第１段階ＰＣＲのための代替的な加熱実施形態の分解図である。 [00171] 図２５の加熱フォーマットの上面図である。 [00172] 図２６の断面図であり、本開示の一実施形態に従って、ワイパがどのように流体充填ブリスタに接触できるかを示す。 [00172] 図２６の断面図であり、本開示の一実施形態に従って、ワイパがどのように流体充填ブリスタに接触できるかを示す。 [00172] 図２６の断面図であり、本開示の一実施形態に従って、ワイパがどのように流体充填ブリスタに接触できるかを示す。 [00172] 図２６の断面図であり、本開示の一実施形態に従って、ワイパがどのように流体充填ブリスタに接触できるかを示す。 [00173] 本開示の一実施形態に従って、本明細書に記載されている１つ以上のパウチ実施形態と共に使用できる、ワイパシステムと少なくとも２つの温度ゾーンを含むヒータとを組み込んだ熱サイクリング器具を示す。 [00173] 本開示の一実施形態に従って、本明細書に記載されている１つ以上のパウチ実施形態と共に使用できる、ワイパシステムと少なくとも２つの温度ゾーンを含むヒータとを組み込んだ熱サイクリング器具を示す。 [00174] 本明細書に記載されているパウチの１つ以上に含めることができる再水和ブリスタ及び乾燥試薬ピルを概略的に示す。 [00175] 図２９Ａのブリスタのような流体充填ブリスタを押し込むために使用できるデバイスを示す。 [00176] 図２９Ａのブリスタのような一連の流体充填ブリスタを押し込むために使用できるホイールデバイスを示す。 [00177] 図２８Ａ及び図２８Ｂの器具のプロトタイプを用いた増幅の結果を、標準的なプレートベースのサーモサイクラーを用いた増幅と比較して示す。 [00178] ブロックサーモサイクラー（円）及びプロトタイプのワイパブレードセットアップ（四角）において、第１段階ＰＣＲの異なる数のサイクルの実行から得られた第２段階ＰＣＲ Ｃｐのグラフを示す。 [00179] ２つのヒータを用いた３温度ＰＣＲプロトコルの加熱プロファイルを示す。伸長／変性ヒータ温度は実線で示され、アニーリングヒータ温度は破線で示され、サンプル温度は点線で示されている。 [00180] 第１段階増幅のために図２８Ａ及び図２８Ｂの器具と同様のプロトタイプの器具を用いたマルチプレックス増幅のＤＮＡ融解曲線を示す。第１段階増幅の後、Roche LC480リアルタイムＰＣＲ器具において、第２段階ＰＣＲ及び融解のため増幅生成物を希釈し増幅した。 [00181] 第２段階シングルプレックスＤＮＡ増幅反応のリアルタイムＤＮＡ増幅データを示す。第１段階ＰＣＲのためにRoche LC480リアルタイムＰＣＲ器具を使用した。第１段階ＰＣＲからの増幅生成物を、第２段階ＰＣＲマスター混合物を用いて希釈、混合し、第２段階増幅のために図５Ａのアレイ５０８１と同様のアレイに注入した。図２８Ａ及び図２８Ｂを参照して記載されている第２段階ＰＣＲ手順と同様の手順を用いて、増幅のための熱サイクリングを実行した。 [00182] 図３４の第２段階増幅のＤＮＡ融解曲線を示す。 [00183] 図２８Ａ及び図２８Ｂに示されている器具と同様の器具を用いた第１段階及び第２段階増幅の結果を示し、第２段階ＰＣＲアレイのウェルにおける蛍光の増大をサイクル数の関数として示す。 [00183] 図２８Ａ及び図２８Ｂに示されている器具と同様の器具を用いた第１段階及び第２段階増幅の結果を示し、図３８と共に、増幅されている生成物が正しい生成物であることを保証する融解実験の結果を示す、未処理の融解曲線である。 [00183] 図２８Ａ及び図２８Ｂに示されている器具と同様の器具を用いた第１段階及び第２段階増幅の結果を示し、図３７と共に、増幅されている生成物が正しい生成物であることを保証する融解実験の結果を示す、融解曲線の負の一次導関数（ｄＦ／ｄｔ）を示す。 [00184] 図２８Ａ及び図２８Ｂを参照して示されている手順と同様の熱サイクリング手順を用いて、アレイ５０８１又はアレイ６０００と同様のアレイの１又は複数のウェルにおける流体の温度応答を試験するように設計された一連の実験の結果を示し、８秒のサイクル時間（各温度で４秒のホールド（hold））を用いた温度応答を示す。 [00184] 図２８Ａ及び図２８Ｂを参照して示されている手順と同様の熱サイクリング手順を用いて、アレイ５０８１又はアレイ６０００と同様のアレイの１又は複数のウェルにおける流体の温度応答を試験するように設計された一連の実験の結果を示し、８秒のサイクル時間を用いた別の温度応答実験を示す。 [00184] 図２８Ａ及び図２８Ｂを参照して示されている手順と同様の熱サイクリング手順を用いて、アレイ５０８１又はアレイ６０００と同様のアレイの１又は複数のウェルにおける流体の温度応答を試験するように設計された一連の実験の結果を示し、４秒のサイクル時間（各温度で２秒のホールド）を用いた温度応答を示す。 [00184] 図２８Ａ及び図２８Ｂを参照して示されている手順と同様の熱サイクリング手順を用いて、アレイ５０８１又はアレイ６０００と同様のアレイの１又は複数のウェルにおける流体の温度応答を試験するように設計された一連の実験の結果を示し、２秒のサイクル時間（各温度で１秒のホールド）を用いた温度応答を示す。 [00185] サンプル受容チャンバ内に密封できるスワブ軸の一例の断面図を示す。 [00185] サンプル受容チャンバ内に密封できるスワブ軸の一例の断面図を示す。 [00185] サンプル受容チャンバ内に密封できるスワブ軸の一例の断面図を示す。 [00185] サンプル受容チャンバ内に密封できるスワブ軸の一例の断面図を示す。 [00186] スワブ軸と交差するように密封を行う前のサンプル受容チャンバ及びスワブ軸の断面図を示す。 [00186] スワブ軸と交差するように密封を行った後のサンプル受容チャンバ及びスワブ軸の断面図を示す。 [00187] 磁気シリカの存在下（－■－）及び非存在下（－□－）における増幅実験の蛍光トレースを示す。 [00187] 磁気シリカの存在下（－■－）及び非存在下（－□－）における増幅実験の蛍光トレースを示す。 [00188] 同一の容器における溶解及び磁気捕捉（－■－）と別々の溶解及び捕捉（－▲－）について、増幅実験の蛍光トレースを示す。 [00189] 別個の容器で溶解粒子及び磁気シリカビーズを使用した場合、磁気シリカビーズを使用するが溶解粒子を使用しない場合、同一の容器で溶解粒子及び磁気シリカビーズを使用する場合の、サケ精子ＤＮＡの回収を示す。 [00190] 別個の容器で溶解粒子及び磁気シリカビーズを使用した場合、磁気シリカビーズを使用するが溶解粒子を使用しない場合、同一の容器で溶解粒子及び磁気シリカビーズを使用する場合の、大腸菌溶解物からのＤＮＡの増幅である。 [00191] 磁気シリカビーズの存在下における、増幅中に反応チャンバ内でビーズを隔絶（sequester）しない場合のＰＣＲ実験の蛍光トレースを示す。 [00192] 磁気シリカビーズの存在下における、増幅中に反応チャンバ内でビーズを隔絶しない場合の、溶解粒子を用いた溶解後のＰＣＲ実験の蛍光トレースを示す。 [00193] 磁気シリカビーズの存在下及び非存在下でのＰＣＲ増幅の蛍光検出を示す。
[00194] 以下で添付図面を参照して例示的な実施形態について記載する。本開示の精神及び教示から逸脱することなく多くの異なる形態及び実施形態が可能であるので、本開示は本明細書に述べられる例示的な実施形態に限定されるものと解釈するべきではない。これらの例示的な実施形態は、本開示が網羅的かつ完全であるように、かつ本開示の範囲を当業者に伝えるように提供される。図面において、層及び領域の大きさ及び相対的な大きさは明確さのために誇張される場合がある。本記載全体を通して、同様の参照番号は同様の要素を指す。
[00195] 他の規定がある場合を除いて、本明細書で用いられる全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。更に、一般的に使用される辞書で定義されるような用語は、本出願及び関連技術の文脈における意味と一致する意味を有すると解釈するべきであり、本明細書で明示的に規定される場合を除いて理想化された意味又は過度に形式的な意味に解釈するべきでないことは理解されよう。本明細書における本発明の記載で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的だけのものであり、本発明を限定することは意図されない。本明細書に記載されるものと同様又は同等の多くの方法及び物質が本開示の実施において使用可能であるが、本明細書ではいくつかの例示的な物質及び方法のみを記載する。
[00196] 本明細書で言及される全ての公報、特許出願、特許、又は他の引例は、全体が援用により本願に含まれる。用語に矛盾がある場合は、本明細書が支配する。
[00197] デバイス、システム、方法等を含む本開示の様々な態様は、１つ以上の例示的な実施を参照して説明され得る。本明細書で用いる場合、「典型的な（exemplary）」及び「例示的な（illustrative）」という用語は、「例、インスタンス、又は例示として機能すること」を意味し、本明細書に開示される他の実施よりも優先される又は有利であると必ずしも解釈するべきではない。更に、本開示又は本発明の「実施（implementation）」又は「実施形態（embodiment）」という場合は、その１つ以上の実施形態に対する具体的な言及を含み、その逆も同様であり、以下の記載でなく添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定することなく説明のための例を与えることが意図される。
[00198] 本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、内容上明らかに他の意味が規定される場合を除いて複数の言及を含むことに留意するべきである。従って、例えば「タイル（a tile）」という場合は、１つ、２つ、又はそれ以上のタイルを含む。同様に、複数の指示対象に対する言及は、内容上及び／又は文脈上明らかに他の意味が規定される場合を除いて、単一の指示対象及び／又は複数の指示対象を含むと解釈するべきである。従って、「タイル（tiles）」という場合は、必ずしも複数のそのようなタイルを必要としない。活用とは無関係に、本明細書では１つ以上のタイルが想定されることは認められよう。
[00199] 本出願全体を通して、「～できる（can）」及び「～し得る（may）」が使用される場合、これは強制の意味（すなわち「～しなければならない（must）」を意味する）でなく、許容の意味（すなわち「～する可能性がある（having the potential to）」を意味する）で用いられる。更に、「含んでいる（including）」、「有している（having）」、「伴っている（involving）」、「含有している（containing）」、「～によって特徴付けられる（characterized by）」という用語、それらの変形（例えば「含む（includes）」、「有する（has）」、「伴う（involves）」、「含有する（contains）」等）、及び、特許請求項を含めて本明細書で使用される同様の用語は、包含的である及び／又はオープンエンドであるものとし、「備えている（comprising）」という言葉及びその変形（例えば「備える（comprise、comprises）」と同じ意味を有するものとし、例えば、言及されていない追加の要素又は方法ステップを除外しない。
[00200] 本明細書で使用される場合、「上部（top）」、「下部（bottom）」、「左（left）」、「右（right）」、「上（up）」、「下（down）」、「上方（upper）」、「下方（lower）」、「内（inner）」、「外（outer）」、「内側（internal）」、「外側（external）」、「内部（interior）」、「外部（exterior）」、「近位（proximal）」、「遠位（distal）」、「前方（forward）」、「後方（reverse）」等の方向の用語及び／又は任意の用語は、単独で用いて相対的な方向及び／又は方位を示すことができ、明細書、発明、及び／又は特許請求の範囲を含む本開示の範囲を限定することは意図されない場合がある。
[00201] ある要素が別の要素に「結合されている」、「接続されている」、又は別の要素に「応じる」、又は別の要素「の上にある」という場合、この要素は、別の要素に直接結合されるか、接続されるか、応じるか、もしくは上にある可能性があり、又は介在する要素も存在する可能性があることは理解されよう。これに対して、ある要素が別の要素に「直接結合されている」、「直接接続されている」、「直接応じる」、又は「直接上にある」という場合、介在する要素は存在しない。
[00202] 本発明の概念の例示的な実施形態について、例示的な実施形態の理想的な実施形態（及び中間構造）の概略図である断面図を参照して本明細書で説明する。このため、例えば製造技法及び／又は公差の結果として、図示された形状からのばらつきが予想される。従って、本発明の概念の例示的な実施形態は本明細書に示される領域の特定の形状に限定されると解釈するべきではなく、例えば製造の結果として生じる形状の逸脱を含む。従って、図面に示された領域は性質上概略的であり、それらの形状はデバイスの領域の実際の形状を示すことは意図されず、例示的な実施形態の範囲を限定することも意図されない。
[00203] 様々な要素を記述するため、本明細書において「第１の」、「第２の」等の用語を使用できるが、これらの要素はこれらの用語によって限定されないことは理解されよう。これらの用語は単に１つの要素を別のものから区別するために用いられる。従って、本実施形態の教示から逸脱することなく、「第１の」要素は「第２の」要素と呼ばれる可能性がある。
[00204] また、本明細書に記載される様々な実施は、本開示の範囲から逸脱することなく、記載又は開示される他の任意の実施と組み合わせて利用できることは理解されよう。従って、本開示のいくつかの実施に従った生成物、部材、要素、デバイス、装置、システム、方法、プロセス、組成物、及び／又はキットは、本開示の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される他の実施（システム、方法、装置等を含む）に記載された特性、特徴、コンポーネント、部材、要素、ステップ等を含むか、組み込むか、又は他の方法で備えることができる。このため、１つの実施に関する特定の特徴に対する言及は、この実施内での適用のみに限定されると解釈するべきではない。
[00205] 本明細書で使用される見出しは、整理の目的のためだけのものであり、記載の範囲又は特許請求の範囲を限定するために用いることは意図されない。理解を容易にするため、可能な場合は複数の図に共通する同様の要素を示すために同様の参照番号を用いている。更に、可能な場合は様々な図において要素に同様の番号付けを用いている。更に、特定の要素の代替的な構成はそれぞれ、要素番号に付随した別個の文字を含み得る。
[00206] 本明細書で用いる場合、「約（about）」という用語は、ほぼ、～の領域内、概ね、又はおおよそを意味する。「約」という用語は、ある数値範囲と共に使用される場合、明記された数値よりも上及び下に境界を広げることによってその範囲を限定する。一般に、本明細書では「約」という用語を用いて、数値が５％大きく又は小さく限定される。そのような範囲が表された場合、別の実施形態は、一方の特定の値から及び／又は他方の特定の値までを含む。同様に、値の前に「約」を用いることでその値が近似値として表された場合、その特定の値が別の実施形態を形成することは理解されよう。更に、各範囲の終点は他の終点との関連で及び他の終点とは独立しての双方において重要であることは理解されよう。
[00207] 本明細書で用いる場合、「又は（or）」という言葉は、特定のリスト内のいずれか１つのメンバを意味し、そのリスト内のメンバの任意の組み合わせも含む。
[00208] 「サンプル」は、動物、ヒト動物を含むがこれには限定されない動物からの組織もしくは器官、細胞（対象（例えばヒト又は非ヒト動物）内のもの、対象から直接取得されたもの、もしくは培養中に維持されているか培養細胞株からの細胞）、細胞溶解物（もしくは溶解物画分）もしくは細胞抽出物、細胞、細胞物質、もしくはウイルス物質（例えばポリペプチドもしくは核酸）に由来する１つ以上の分子を含有する溶液、又は、非自然発生の核酸を含有する溶液を意味し、本明細書で記載されるようにアッセイされる。また、サンプルは、宿主もしくは病原体の細胞、細胞成分、又は核酸を含有する場合も含有しない場合もある任意の体液又は排出物（例えば、限定ではないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁、又は脳脊髄液）であり得る。また、サンプルは、限定ではないが、土、水（新鮮な水、廃水等）、空気モニタリングシステムサンプル（例えばエアフィルタろ過剤で捕捉された物質）、表面のスワブ、及び媒介生物（例えば蚊、ダニ、ノミ等）を含む、環境サンプルも含み得る。
[00209] 本明細書で用いる場合、「核酸」という言葉は、自然発生又は合成のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指し、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、一本鎖又は二本鎖、センス又はアンチセンスにかかわらず、ワトソンクリック塩基対合によって相補的核酸に対するハイブリダイゼーションが可能なものである。また、本発明の核酸は、ヌクレオチド類似体（例えばＢｒｄＵ）及び非リン酸ジエステルインターヌクレオシド（internucleoside）結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はチオジエステル（thiodiester）結合）も含み得る。特に、核酸は、限定はないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
[00210] 「プローブ」、「プライマー」、又は「オリゴヌクレオチド」は、相補配列（「標的」）を含有する第２の核酸分子に対して塩基対合できる定義された配列の一本鎖核酸分子を意味する。得られるハイブリッドの安定性は、発生する塩基対合の長さ、ＧＣ含量、及び程度に依存する。塩基対合の程度は、プローブと標的分子との相補性の程度及びハイブリダイゼーション条件の厳密さの程度のようなパラメータに影響される。ハイブリダイゼーションの厳密さの程度は、温度、塩濃度、及びホルムアミド等の有機分子の濃度のようなパラメータに影響され、当業者に既知の方法によって決定される。プローブ、プライマー、及びオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法により、放射能によって、蛍光によって、又は非放射性に、検出可能に標識することができる。ｄｓＤＮＡ結合色素を用いてｄｓＤＮＡを検出することができる。「プライマー」は特にポリメラーゼによって拡張されるように構成されるのに対し、「プローブ」又は「オリゴヌクレオチド」はそのように構成される場合もそうでない場合もあることは理解されよう。
[00211] 「ｄｓＤＮＡ結合色素」は、二本鎖ＤＮＡに結合された場合、一本鎖ＤＮＡに結合された場合又は溶液中で遊離している場合とは異なるように蛍光を発する、通常はより強く蛍光を発する色素を意味する。ｄｓＤＮＡ結合色素に言及するが、本明細書において任意の適切な色素を使用できることは理解されよう。そのいくつかの非限定的な例示の色素は、援用により本願に含まれる米国特許第７，３８７，８８７号に記載されている。核酸の増幅及び融解を検出するために他の信号生成物質を用いることも可能であり、例としては、当技術分野において既知の酵素、抗体等がある。
[00212] 「特異的にハイブリダイゼーションする」は、プローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチドが、極めて厳密な条件下で実質的に相補的な核酸（例えばサンプル核酸）を認識して物理的に相互作用（すなわち塩基対合）し、かつ、他の核酸とは実質的に塩基対合しないことを意味する。
[00213] 「極めて厳密な条件」は、典型的に、ほぼ融解温度（Ｔｍ）マイナス５℃（すなわちプローブのＴｍよりも５°低い）で発生することを意味する。機能上、極めて厳密な条件は、少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を同定するため用いられる。
[00214] 「溶解粒子」は、細胞、ウイルス、芽胞、及びサンプル内に存在し得る他の様々な物質の溶解のための粒子もしくはビーズを意味する。様々な例ではケイ酸ジルコニウム（「Ｚｒ」）又はセラミックビーズを用いるが、ガラス及び砂溶解粒子を含む他の溶解粒子も既知であり、この用語の範囲内である。「細胞溶解成分」という用語は、溶解粒子を含み得るが、当技術分野において既知の化学的溶解のための成分のような他の成分も含むことができる。
[00215] ＰＣＲは本明細書の例において使用される増幅方法であるが、プライマーを使用するいかなる増幅方法も適切であり得ることは理解されよう。そのような適切な手順には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ：strand displacement amplification）、核酸塩基配列増幅（ＮＡＳＢＡ：nucleic acid sequence-based amplification）、カスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ：cascade rolling circle amplification）、ＤＮＡのループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ：loop-mediated isothermal amplification）、等温キメラプライマー核酸増幅（ＩＣＡＮ：isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid）、標的ベースヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ：target based-helicase dependent amplification）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ：transcription-mediated amplification）等が含まれる。従って、ＰＣＲという用語を使用する場合、他の代替的な増幅方法を含むことが理解されよう。個別サイクルなしの増幅方法では、複数のサイクル、倍加時間、又はクロッシングポイント（Ｃｐ：crossing point）で測定が行われる反応時間を使用することができ、本明細書に記載される実施形態では追加のＰＣＲサイクルが加えられる追加の反応時間を加えることができる。これに応じてプロトコルを調整する必要があり得ることは理解されよう。
[00216] 本明細書における様々な例は人の標的及び人の病原体に言及するが、これらの例は単に説明のためのものである。本明細書に記載される方法、キット、及びデバイスを用いて、人のサンプル、家畜サンプル、工業サンプル、及び環境サンプルを含む、多種多様なサンプルから多種多様な核酸配列を検出及び配列決定することができる。
[00217] 本明細書に開示される様々な実施形態は、自己完結型の核酸分析パウチを用いて、例えば単一の閉鎖系における抗原及び核酸配列のような様々な生物学的物質の存在についてサンプルをアッセイする。パウチ及びこのパウチと共に使用される器具を含むそのようなシステムは、米国特許第８，３９４，６０８号、第８，８９５，２９５号、及び米国特許出願第２０１４－０２８３９４５号に、更に詳しく開示されている。これらは援用により本願に含まれる。しかしながら、そのようなパウチは単なる例示であり、本明細書で検討される核酸の調製及び増幅反応は、当技術分野において既知である様々な核酸の精製及び増幅システムを用いて、９６ウェルプレート、他の構成のプレート、アレイ、カルーセル等を含む、当技術分野において既知の様々な開放系又は閉鎖系のサンプル容器のいずれにおいても実行できることは理解されよう。「サンプルウェル」、「増幅ウェル」、「増幅容器」等という用語を本明細書で用いるが、これらの用語は、これらの増幅システムで使用されるウェル、チューブ、及び他の様々な反応容器を包含することが意図される。一実施形態では、パウチを用いて複数の病原体のアッセイを行う。パウチは、例示的に閉鎖系においてサンプルウェルとして使用される１つ以上のブリスタを含み得る。例として、任意選択的に使い捨て可能なパウチ内で様々なステップを実行することができる。様々なステップは、核酸調製、一次大容量（primary large volume）マルチプレックスＰＣＲ、一次増幅生成物の希釈、及び、任意選択的なリアルタイム検出又は融解曲線分析のような増幅後分析で終わる二次ＰＣＲを含む。更に、本発明のパウチ内で様々なステップを実行できるが、特定の用途ではそれらのステップの１つ以上が省略され、それに応じてパウチ構成が変更され得ることは理解されよう。本明細書における多くの実施形態は第１段階増幅のためにマルチプレックス反応を使用するが、これは単なる例示であり、いくつかの実施形態では第１段階増幅がシングルプレックスであり得ることは理解されよう。１つの説明のための例において、第１段階シングルプレックス増幅はハウスキーピング遺伝子を標的とし、第２段階増幅は同定のためにハウスキーピング遺伝子における差を使用する。従って、様々な実施形態では第１段階マルチプレックス増幅について検討するが、これが単なる例示であることは理解されよう。
[00218] 図１は、様々な実施形態において使用できるか又は様々な実施形態のために再構成できる例示的なパウチ５１０を示す。パウチ５１０は米国特許第８，８９５，２９５号の図１５と同様であり、同様の品目には同じ番号が付けられている。装備品５９０には入口チャネル５１５ａ～５１５ｌが設けられ、これらは試薬貯蔵部又は廃棄物貯蔵部としても機能する。例示的に、試薬は装備品５９０内で凍結乾燥させ、使用前に再水和することができる。ブリスタ５２２、５４４、５４６、５４８、５６４、及び５６６は、それぞれチャネル５１４、５３８、５４３、５５２、５５３、５６２、及び５６５を備え、米国特許第８，８９５，２９５号の図１５と同じ番号のブリスタと同様である。図１の第２段階反応ゾーン５８０は米国特許第８，８９５，２９５号のものと同様であるが、高密度アレイ５８１の第２段階ウェル５８２は多少異なるパターンに配列されている。図１の高密度アレイ５８１のより円形のパターンでは角部のウェルがないので、第２段階ウェル５８２のいっそう均一な充填が可能となる。図示のように、高密度アレイ５８１は１０２の第２段階ウェル５８２を備えている。パウチ５１０は、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）器具（BioFire Diagnostics, LLC、ユタ州ソルトレークシティ）で使用するのに適している。しかしながら、このパウチの実施形態が単なる例示であることは理解されよう。
[00219] 他の容器を使用してもよいが、例示としてパウチ５１０は、２層の可撓性プラスチックフィルム又は他の可撓性材料で形成することができる。材料は例えば、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、それらの混合物、組み合わせ、及び層であり、パウチ５１０は、押し出し成形、プラズマ堆積、及び積層を含む当技術分野において既知の任意のプロセスによって作製できる。例えば各層は、単一のタイプ又は２つ以上のタイプの材料の１つ以上の層を積層したもので構成できる。また、アルミニウム積層を用いた金属フォイル又はプラスチックも使用できる。ブリスタ及びチャネルを形成するように密封できる他のバリア材料も当技術分野において既知である。プラスチックフィルムを用いる場合、これらの層は、例示的に熱シールによって接合することができる。例示的に、材料は低い核酸結合能と低いタンパク結合能を有する。
[00220] 蛍光による監視を用いる実施形態では、動作波長において吸収度及び自家蛍光が充分に低いプラスチックフィルムが好適である。そのような材料は、様々なプラスチック、様々な可塑剤、及び複合比、更にはフィルムの様々な厚さを試験することによって特定できる。アルミニウム又は他のフォイル積層を用いるプラスチックでは、蛍光検出デバイスによって読み取られるパウチの部分はフォイルなしにしておくことができる。例えば、パウチ５１０の第２段階反応ゾーン５８０の第２段階ウェル５８２で蛍光が監視される場合、ウェル５８２における一方又は双方の層をフォイルなしにしておく。ＰＣＲの例では、約０．００４８インチ（０．１２１９ｍｍ）厚さのポリエステル（デラウェア州ウイルミントンDupont社のMylar）及び０．００１～０．００３インチ（０．０２５～０．０７６ｍｍ）厚さのポリプロピレンフィルムから成るフィルム積層物が良好に機能する。例示的に、パウチ５１０は、入射光の約８０～９０％を透過することができる透明材料で作製される。
[00221] 例示的な実施形態では、ブリスタ及びチャネルに対して例えば空気圧等の圧力を加えることによって、ブリスタ間で物質を移動させる。従って、圧力を用いる実施形態では、圧力によって所望の効果を達成できるように、パウチ材料は例えば充分に可撓性である。本明細書で用いる場合、「可撓性」という用語はパウチ材料の物理的特性を表す。本明細書において「可撓性」という用語は、亀裂、破損、細かいひび割れ等を生じることなく本明細書で使用される圧力レベルによって容易に変形可能なものと規定される。例えば、Saran（商標）ラップ及びZiploc（登録商標）バッグ等の薄いプラスチックシート、並びにアルミニウムフォイル等の薄い金属フォイルは可撓性である。しかしながら、空気圧を用いる実施形態であっても、可撓性である必要があるのはブリスタ及びチャネルの特定の領域のみである。更に、ブリスタ及びチャネルが容易に変形可能である限り、可撓性である必要があるのはブリスタ及びチャネルの一方側のみである。パウチ５１０の他の領域は、剛性材料で作製するか又は剛性材料で補強することが可能である。従って、「可撓性パウチ」又は「可撓性サンプル容器」等の用語を使用する場合、そのパウチ又はサンプル容器の一部のみが可撓性である必要があることは理解されよう。
[00222] 例示として、パウチ５１０にはプラスチックフィルムが使用される。例えばアルミニウム又は他の適切な材料の金属シートを圧延又は他の方法で切断して、隆起面パターンを有するダイを生成することができる。例えば１９５℃の動作温度に調節した空気プレス（例えばウイスコンシン州ミルトンJanesville Tool Inc.のA-5302-PDS）に取り付けた場合、空気プレスは印刷機と同様に作用し、ダイがプラスチックフィルムと接触している箇所だけでフィルムのシール面を溶融させる。同様に、パウチ５１０に用いられる１又は複数のプラスチックフィルムを、レーザ切断及び溶接デバイスを用いて切断し溶接することも可能である。ＰＣＲプライマー（例えばフィルム上にスポットして乾燥させる）、抗原結合物質、磁気ビーズ、及びケイ酸ジルコニウムビーズのような様々な成分を、パウチ５１０を形成する際に様々なブリスタ内に密封することができる。サンプル処理のための試薬を、一括して又は個別に、密封前にフィルム上にスポットすることができる。一実施形態では、ポリメラーゼ及びプライマーとは別にヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）をフィルム上にスポットすることで、反応物が水性サンプルにより水和されるまでポリメラーゼの活性を基本的に排除する。水和前に水性サンプルが加熱された場合、これは真のホットスタートＰＣＲのための条件を生成し、高価な化学ホットスタート成分の必要性を低減させるか又は排除する。別の実施形態では、成分を粉末又はピル形態で提供し、最終的な密封の前にブリスタ内に配置することができる。
[00223] パウチ５１０は、米国特許第８，８９５，２９５号に記載されたものと同様に使用することができる。１つの例示的な実施形態では、試験対象のサンプル（１００μｌ）及び溶解緩衝剤（２００μｌ）を含む３００μｌの混合物を、装備品５９０の入口チャネル５１５ａの近くの注入ポート（図示せず）に注入して、このサンプル混合物を入口チャネル５１５ａ内に引き入れる。また、装備品５９０の入口チャネル５１５ｌに隣接した第２の注入ポート（図示せず）に水を注入し、装備品５９０に設けられたチャネル（図示せず）を介して分配させることにより、入口チャネル５１５ｂ～５１５ｌに前もって乾燥形態で提供されている最大で１１の異なる試薬を水和させる。サンプル及び水和流体（例えば水又は緩衝剤）を注入するための例示的な方法及びデバイスは、援用により全体が本願に含まれる米国特許出願第２０１４－０２８３９４５号に開示されているが、これらの方法及びデバイスは単なる例示であり、パウチ５１０内にサンプル及び水和流体を導入する他の方法も本開示の範囲内であることは理解されよう。これらの試薬は例えば、凍結乾燥ＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄液、免疫測定試薬、又は他の化学物質を含み得る。例示として試薬は、核酸抽出、第１段階マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックス反応物の希釈、及び第２段階ＰＣＲ試薬の調製、並びに対照反応のためのものである。図１に示されている実施形態では、注入する必要があるものは、一方の注入ポートのサンプル溶液と他方の注入ポートの水だけである。注入後、これら２つの注入ポートを密封してもよい。パウチ５１０及び装備品５９０の様々な構成の更なる詳細については、すでに援用により本願に含めた米国特許第８，８９５，２９５号を参照のこと。
[00224] 注入後、サンプルを注入チャネル５１５ａからチャネル５１４を介して溶解ブリスタ５２２内へ移動させることができる。溶解ブリスタ５２２は、セラミックビーズ又は他の研摩要素のようなビーズ又は粒子５３４が提供されており、FilmArray（登録商標）器具内に設けられた回転ブレード又はパドルを用いた詰め込みによってボルテックスを行うように構成されている。ケイ酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ５３４等の溶解粒子の存在下でサンプルの振とう、ボルテックス、超音波処理、及び同様の処理を行うことによるビーズ粉砕（bead-milling）は、溶解物を形成する効果的な方法である。本明細書で用いる場合、「溶解」、「溶解している」、及び「溶解物」等の用語は細胞を破裂させることに限定されず、そのような用語がウイルスのような非細胞粒子の破壊を含むことは理解されよう。別の実施形態では、援用により全体が本願に含まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４４３３３号に記載されているような往復運動するか又は交互に移動するパドルを用いたパドルビーターを、この実施形態及び本明細書に記載されている他の実施形態において溶解のために使用してもよい。
[00225] 図４は、図２に示されている器具８００の支持部材８０２の第１の側８１１に搭載され得るブレード８２１を含むビーズ破砕（bead beating）モータ８１９を示す。ブレードは、スロット８０４を貫通してパウチ５１０に接触することができる。しかしながら、モータ８１９を器具８００の他の構造に搭載してもよいことは理解されよう。１つの例示的な実施形態において、モータ８１９は、支持部材８０２に搭載されたMabuchi RC-280SA-2865DCモータ（日本国千葉県）である。１つの例示的な実施形態において、モータは５，０００～２５，０００ｒｐｍで、更に例示的には１０，０００～２０，０００ｒｐｍで、更に例示的には約１５，０００～１８，０００ｒｐｍで回転する。Ｍａｂｕｃｈｉモータでは、７．２Ｖが溶解に充分なｒｐｍを与えることがわかっている。しかしながら、ブレード８２１がパウチ５１０に衝突している場合、実際の速度は多少遅くなり得ることは理解されよう。使用されるモータ及びパドルに応じて、他の電圧及び速度を溶解のために用いることも可能である。任意選択的に、溶解ブリスタ５２２に隣接した袋８２２内へ、制御された少量の空気を提供してもよい。いくつかの実施形態では、隣接した袋に１以上の少量の空気を部分的に充填すると、溶解プロセス中の溶解ブリスタの位置決め及び支持に役立つことがわかっている。あるいは、例えば溶解ブリスタ５２２の周りで剛性のもしくは柔軟なガスケット又は他の保持構造のような他の構造を用いて、溶解中にパウチ５１０を拘束することも可能である。また、モータ８１９は単なる例示であり、サンプルの粉砕、振とう、又はボルテックスのために他のデバイスも使用できることは理解されよう。いくつかの実施形態では、機械的溶解に加えて又はその代わりに、化学物質又は熱を用いることも可能である。
[00226] 一度サンプル物質が充分に溶解したら、サンプルを核酸抽出ゾーンへ移動させる。例えばサンプルを、チャネル５３８、ブリスタ５４４、及びチャネル５４３を介してブリスタ５４６へ移動させ、このゾーン内で、シリカでコーティングされた磁気ビーズ５３３のような核酸結合物質とサンプルを混合する。あるいは、磁気ビーズ５３３を、例えば入口チャネル５１５ｃ～５１５ｅのうち１つから提供された流体を用いて再水和し、次いでチャネル５４３を介してブリスタ５４４へ、次いでチャネル５３８を介してブリスタ５２２へ移動させてもよい。混合物は、例示的に約１０秒～１０分までの適切な時間長にわたってインキュベートさせる。器具内でブリスタ５４６に隣接して配置された格納式磁石が、溶液から磁気ビーズ５３３を捕捉することで、ブリスタ５４６の内面にペレットを形成する。ブリスタ５２２内でインキュベーションが行われる場合は、捕捉のために溶液の複数部分をブリスタ５４６へ移動させる必要があり得る。次いで液体をブリスタ５４６から出し、ブリスタ５４４を介してブリスタ５２２内へ戻す。ブリスタ５２２はこの時点で廃棄物の容器として使用される。注入チャネル５１５ｃ～５１５ｅの１つ以上からの１以上の洗浄緩衝剤が、ブリスタ５４４及びチャネル５４３を介してブリスタ５４６に与えられる。任意選択的に、磁石は引っ込められ、ブリスタ５４４及び５４６間でチャネル５４３を介して磁気ビーズ５３３を往復移動させることによってビーズが洗浄される。一度磁気ビーズ５３３が洗浄されたら、磁石の活性化によって磁気ビーズ５３３をブリスタ５４６内で再び捕捉し、次いで洗浄液をブリスタ５２２に移動させる。このプロセスを必要に応じて繰り返して、核酸結合磁気ビーズ５３３から溶解緩衝剤及びサンプル残屑を洗浄することができる。
[00227] 洗浄の後、注入チャネル５１５ｆに保管された溶出緩衝剤をブリスタ５４８に移動させ、磁石を引っ込める。溶液はチャネル５５２を介してブリスタ５４６と５４８との間で循環して、ブリスタ５４６内の磁気ビーズ５３３のペレットを破壊し、捕捉した核酸をビーズから分離させて溶液内に入れる。磁石を再び活性化して、ブリスタ５４６内の磁気ビーズ５３３を捕捉し、溶出核酸溶液をブリスタ５４８に移動させる。
[00228] 注入チャネル５１５ｇからの第１段階ＰＣＲマスター混合物が、ブリスタ５４８内で核酸サンプルと混合される。任意選択的に、この混合物は、チャネル５５３を介して５４８と５６４との間で混合物を移動させることによって混合される。いくつかの混合サイクル後、溶液はブリスタ５６４内に収容され、ここで、各標的に少なくとも１つのプライマーセットで第１段階ＰＣＲプライマーのペレットが提供され、第１段階マルチプレックスＰＣＲが実行される。ＲＮＡ標的が存在する場合、第１段階マルチプレックスＰＣＲの前に又はこれと同時に逆転写（ＲＴ：reverse transcription）ステップが実行され得る。FilmArray（登録商標）器具における第１段階マルチプレックスＰＣＲ温度サイクリングは例示的に１５～２０サイクル実行されるが、特定の用途の要件に応じて他の増幅レベルが望ましい場合もある。第１段階ＰＣＲマスター混合物は、当技術分野において既知の様々なマスター混合物のうち任意のものとすればよい。１つの例示的な例において、第１段階ＰＣＲマスター混合物は、１サイクル当たり２０秒以下を要するＰＣＲプロトコルと共に用いるため、援用により本願に含まれる米国特許出願公開第２０１５／０１１８７１５号に開示された化学物質のいずれかとすればよい。
[00229] 第１段階ＰＣＲの所望の数のサイクルを行った後、例えば、サンプルのほとんどをブリスタ５４８に戻してブリスタ５６４内に少量だけを残し、注入チャネル５１５ｉから第２段階ＰＣＲマスター混合物を追加することによって、サンプルを希釈することができる。あるいは、希釈緩衝剤を５１５ｉからブリスタ５６６へ移し、次いで流体をブリスタ５６４と５６６との間で往復移動させることによってブリスタ５６４内の増幅サンプルと混合させることができる。所望の場合、注入チャネル５１５ｊ及び５１５ｋからの希釈緩衝剤を用いて希釈を数回繰り返すことができ、又は、注入チャネル５１５ｋはシークエンシングもしくは他のＰＣＲ後分析のために取っておき、注入チャネル５１５ｈから第２段階ＰＣＲマスター混合物を希釈増幅サンプルの一部又は全部に追加することができる。希釈ステップ数を変更することによって、又は、希釈緩衝剤もしくは第２段階ＰＣＲマスター混合物との混合前に廃棄されるサンプルの割合を変更することによって、希釈レベルを調整できることは理解されよう。第２段階ＰＣＲマスター混合物は、例えばポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び適切な緩衝剤のような増幅用の成分を含むが、特に非ＰＣＲ増幅方法では他の成分も適切であり得る。所望の場合、サンプルと第２段階ＰＣＲマスター混合物のこの混合物を、第２段階の増幅のため第２段階ウェル５８２へ移動させる前にブリスタ５６４内で予熱してもよい。このような予熱は、第２段階ＰＣＲ混合物におけるホットスタート成分（抗体、化学物質、又は他のもの）の必要性をなくすことができる。
[00230] 一実施形態では、例示的な第２段階ＰＣＲマスター混合物は不完全であり、プライマー対を含まず、１０２の第２段階ウェル５８２の各々に特定のＰＣＲプライマー対が予め投入されている。他の実施形態では、マスター混合物は他の成分（例えばポリメラーゼ、Ｍｇ２＋等）を含まない場合があり、含まれない成分をアレイに予め投入しておくことができる。所望の場合、第２段階ＰＣＲマスター混合物は他の反応成分を含まない場合があるので、これらの成分も第２段階ウェル５８２に予め投入しておくことができる。各プライマー対は第１段階ＰＣＲプライマー対と同様もしくは同一であるか、又は第１段階プライマー対内にネスト化することができる。ブリスタ５６４から第２段階ウェル５８２へのサンプル移動によってＰＣＲ反応混合が完成する。一度高密度アレイ５８１が充填されたら、当技術分野において既知のように任意の数の手段によって個々の第２段階反応物をそれぞれの第２段階ブリスタ内に密封する。二次汚染を生じることなく高密度アレイ５８１を充填して密封する例示的な方法は、すでに援用により本願に含めた米国特許第８，８９５，２９５号で検討されている。例示的に、高密度アレイ５８１のウェル５８２内の様々な反応物は、例えば１つ以上のペルチェ素子によって同時に又は個別に熱サイクリングを行うが、熱サイクリングのための他の手段も当技術分野において既知である。
[00231] いくつかの実施形態において、第２段階ＰＣＲマスター混合物は、増幅を示す信号を発生させるためのｄｓＤＮＡ結合色素LCGreen（登録商標）Plus（BioFire Diagnostics, LLC）を含む。しかしながら、この色素は単なる例示であること、及び他の信号を使用できることは理解されよう。例えば、当技術分野において既知のように、蛍光、放射能、化学発光、酵素等によって標識される他のｄｓＤＮＡ結合色素及びプローブを使用できる。あるいは、信号を用いることなくアレイ５８１のウェル５８２を提供し、以降の処理によって結果を報告することも可能である。
[00232] 空気圧を用いてパウチ５１０内の物質を移動させる場合、一実施形態では「袋」を使用することができる。袋アセンブリ８１０は、一部が図２から図３に示されており、複数の膨張可能袋８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、及び８６６を収容した袋プレート８２４を含む。これらの袋の各々は、例えば圧縮ガスソースによって個々に膨張可能である。袋アセンブリ８１０は圧縮ガスが与えられ、複数回使用される可能性があるので、パウチよりも強靭かつ厚い材料で作製され得る。あるいは、袋８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、及び８６６は、ガスケット、シール、バルブ、及びピストンと共に固定された一連のプレートから形成してもよい。他の構成も本発明の範囲内である。あるいは、アレイ又は機械的アクチュエータ及びシールを用いて、チャネルを密封し、ブリスタ間の流体の移動を誘導することも可能である。本明細書に記載される器具のために適合され得る機械的シール及びアクチュエータのシステムは、すでに援用により本願に含めたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４４３３３号に詳しく記載されている。
[00233] 二次ＰＣＲ反応の成功は、マルチプレックス第１段階反応によって発生したテンプレートに左右される。典型的に、ＰＣＲは高い純度のＤＮＡを用いて実行される。フェノール抽出のような方法、又は市販のＤＮＡ抽出キットは、高い純度のＤＮＡを与える。パウチ５１０によって処理されるサンプルは、純度の低い調製を補償するため便宜を図る必要があり得る。ＰＣＲは、潜在的な障害である生物サンプルの成分によって阻害される可能性がある。例えば、ホットスタートＰＣＲ、タックポリメラーゼ（Taq polymerase）酵素の高濃度化、ＭｇＣｌ２濃度の調整、プライマー濃度の調整、阻害剤に耐性のある遺伝子操作酵素の追加、及びアジュバント（ＤＭＳＯ、ＴＭＳＯ、又はグリセロール等）の追加を任意選択的に用いることで、低い核酸純度を補償できる。純度の問題は第１段階増幅に関連が深い可能性があるが、第２段階増幅においても同様の調整を実行できることは理解されよう。
[00234] パウチ５１０が器具８００内に配置された場合、袋アセンブリ８１０はパウチ５１０の一面に押圧されるので、ある特定の袋が膨張すると、圧力によってパウチ５１０内の対応するブリスタから液体が押し出される。袋アセンブリ８１０は、パウチ５１０のブリスタの多くに対応する袋に加えて、パウチ５１０の様々なチャネルに対応する袋又は空気圧駆動ピストンのような追加の空気圧式アクチュエータも有し得る。図２から図３は、パウチ５１０のチャネル５３８、５４３、５５３、及び５６５に対応する例示的な複数のピストン又はハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、及び８６５、並びに装備品５９０への逆流を最小限に抑えるシール８７１、８７２、８７３、及び８７４を示す。ハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、及び８６５は、活性化されると、対応するチャネルを締め付けて閉じるピンチバルブを形成する。パウチ５１０のある特定のブリスタ内に液体を閉じ込めるには、そのブリスタへのチャネル及びそのブリスタからのチャネル上のハードシールを活性化して、それらのチャネルを締め付けて閉じるピンチバルブとしてアクチュエータを機能させる。例えば、異なるブリスタ内の２つの液体体積を混合するには、これらを接続しているチャネルを密封しているピンチバルブアクチュエータを活性化し、これらのブリスタ上の空気袋を交互に加圧して、これらのブリスタを接続しているチャネルを介して液体を往復移動させることで内部の液体を混合させればよい。ピンチバルブアクチュエータは様々な形状及び大きさとすることができ、一度に２つ以上のチャネルを締め付けるように構成できる。本明細書では空気圧式アクチュエータについて検討するが、パウチに圧力を与える他の方法も想定されることは理解されよう。他の方法には、リニアステッパモータ、モータ駆動カムのような様々な電気機械式アクチュエータ、空気圧、水圧、又は電磁力で駆動される剛性パドル、ローラ、ロッカアーム、場合によってはコックばね（cocked spring）等が含まれる。更に、チャネルの軸に対して垂直な圧力を加えること以外にも、可逆的又は不可逆的にチャネルを閉じる様々な方法がある。これらには、チャネルを横切るように袋をねじること、熱シール、アクチュエータを回転させること、並びに、バタフライバルブ及びボールバルブのようなチャネル内に密封された様々な物理バルブが含まれる。更に、小さいペルチェ素子又は他の温度調節器をチャネルに隣接して配置し、流体を凍結させるのに充分な温度に設定することで、実質的にシールを形成してもよい。また、図１の設計はブリスタ及びチャネルの各々に対して位置決めされたアクチュエータ要素を特徴とする自動化器具のために適合されているが、アクチュエータを不動の状態に維持すると共にパウチ５１０を移動させて、サンプル破壊、核酸捕捉、第１段階及び第２段階ＰＣＲ、並びに免疫測定及び免疫ＰＣＲのようなパウチ５１０の他の用途を含む処理ステーションのいくつかに対して少数のアクチュエータを使用できることも想定される。ステーション間でパウチ５１０を平行移動させる構成では、チャネル及びブリスタに作用するローラが特に有用である可能性がある。従って、ここに開示される実施形態では空気圧式アクチュエータを使用するが、「空気圧式アクチュエータ」という用語を本明細書で用いる場合、パウチ及び器具の構成に応じて他のアクチュエータ及び圧力を与える他の方法も使用できることは理解されよう。
[00235] 図２に戻ると、各空気圧式アクチュエータはバルブ８９９を介して圧縮空気ソース８９５に接続されている。図２にはいくつかのホース８７８のみが図示されているが、各空気圧部品がホース８７８を介して圧力ガスソース８９５に接続されていることは理解されよう。圧縮ガスソース８９５はコンプレッサとするか、あるいは圧縮ガスソース８９５は二酸化炭素ボンベのような圧縮ガスボンベとすればよい。圧縮ガスボンベは、携帯性が望まれる場合は特に有用である。他の圧縮ガスソースも本発明の範囲内である。本明細書に記載されるパウチ内の流体移動の制御のため、同様の空気圧式制御を例えば図２８Ａ及び図２８Ｂの器具に提供すること、又は他のアクチュエータやサーボ等を提供することも可能である。
[00236] また、器具８１０のいくつかの他のコンポーネントも圧縮ガスソース８９５に接続されている。支持部材８０２の第２の側８１４に搭載される磁石８５０は、例えばホース８７８を介した圧縮ガスソース８９５からのガスを用いて展開及び後退させるが、磁石８５０を移動させる他の方法も当技術分野では既知である。磁石８５０は、支持部材８０２のくぼみ８５１に置かれている。磁石８５０がパウチ５１０のブリスタ５４６に接触できるように、くぼみ８５１は支持部材８０２を貫通する通路であり得ることは理解されよう。しかしながら、磁石８５０が展開された場合に磁石８５０がブリスタ５４６に充分な磁界を与えるため充分に近付き、かつ、磁石８５０が引っ込められた場合に磁石８５０がブリスタ５４６内に存在する磁気ビーズ５３３に大きな影響を及ぼさないならば、支持部材８０２の材料に応じて、くぼみ８５１が支持部材８０２全体を貫通する必要はないことは理解されよう。格納式の磁石８５０に言及しているが、電磁石を使用することも可能であり、電磁石を流れる電流を制御することによって電磁石を活性化及び非活性化できることは理解されよう。従って、本明細書では磁石の後退又は格納について検討するが、これらの用語は磁界を後退させる他の方法を組み込むように充分に広義であることは理解されよう。空気接続部は空気ホース又は空気マニホルド（pneumatic air manifold）とすることができ、これによって必要なホース又はバルブの数を減らせることは理解されよう。同様の磁石及び磁石を活性化させるための方法が図２８Ａ及び図２８Ｂの実施形態で使用され得ることは理解されよう。
[00237] また、空気圧ピストンアレイ８６９の様々な空気圧ピストン８６８もホース８７８を介して圧縮ガスソース８９５に接続されている。２つのホース８７８のみが空気圧ピストン８６８を圧縮ガスソース８９５に接続しているものとして図示されているが、空気圧ピストン８６８の各々が圧縮ガスソース８９５に接続されていることは理解されよう。１２の空気圧ピストン８６８が図示されている。
[00238] 支持８０２の第２の側８１４に１対の温度制御要素が搭載されている。本明細書で用いる場合、「温度制御要素」という用語は、サンプルに熱を加えるか又はサンプルから熱を取り除くデバイスを指す。温度制御要素の説明のための例は、限定ではないが、ヒータ、クーラ、ペルチェ素子、抵抗ヒータ、誘導ヒータ、電磁ヒータ、薄膜ヒータ、印刷要素ヒータ、正温度係数ヒータ、及びそれらの組み合わせを含む。温度制御要素は、複数のヒータ、複数のクーラ、複数のペルチェ素子等を含み得る。一態様において、所与の温度制御要素は２種以上のヒータ又はクーラを含み得る。例えば、温度制御要素の説明のための例は、ペルチェ素子であって、この素子の上面及び／又は下面に別個の抵抗ヒータを備えたものを含み得る。本明細書全体を通して「ヒータ」という用語を使用するが、サンプルの温度を調整するために他の温度制御要素を使用できることは理解されよう。
[00239] 上記で検討したように、第１段階ヒータ８８６は、第１段階ＰＣＲのためブリスタ５６４の内容物を加熱及び冷却するように位置決めできる。図２に示されているように、第２段階ヒータ８８８は、第２段階ＰＣＲのためパウチ５１０のアレイ５８１の第２段階ブリスタ５８２の内容物を加熱及び冷却するように位置決めできる。しかしながら、特定の用途に合わせて適宜、これらのヒータは他の加熱目的にも使用できること、及び他のヒータも含まれ得ることは理解されよう。
[00240] 上記で検討したように、２つ以上の温度間で熱サイクルするペルチェ素子がＰＣＲには有効であるが、いくつかの実施形態ではヒータを一定温度に維持することが望ましい場合がある。例えば、これを用いると、サンプル温度の遷移に必要な時間以外のヒータ温度の遷移に必要な時間を排除することによって実行時間を短縮できる。また、このような構成は、小さいサンプル及びサンプル容器を熱サイクルさせるだけでよく、はるかに大きい（熱質量が大きい）ペルチェ素子についてはその必要がないので、システムの電気効率を向上させることができる。例えば器具は複数（すなわち２つ以上）のヒータを含み、これらのヒータは、例えばアニーリング、伸長、変性のための温度に設定し、パウチに対して位置決めして熱サイクリングを達成することができる。多くの用途では２つのヒータで充分である可能性がある。様々な実施形態において、ヒータを移動させるか、パウチを移動させるか、又は流体をヒータに対して移動させることで、熱サイクリングを実行できる。例えばヒータは、線形や円形等に配列すればよい。適切なヒータのタイプについては、第１段階のＰＣＲを参照してすでに上記で検討した。
[00241] 蛍光検出が望ましい場合、光学アレイ８９０を提供することができる。図２に示されているように、光学アレイ８９０は、例示的にフィルタＬＥＤ光源、フィルタ白色光、又はレーザ照明である光源８９８と、カメラ８９６と、を含む。カメラ８９６は例えば複数の光検出器を有し、各光検出器はパウチ５１０内の第２段階ウェル５８２に対応する。あるいは、カメラ８９６が第２段階ウェル５８２の全てを含む像を撮影し、この像を第２段階ウェル５８２の各々に対応した別個のフィールドに分割してもよい。構成に応じて、光学アレイ８９０は不動とするか、又は１つ以上のモータに取り付けた移動部（mover）に配置して移動させることで各第２段階ウェル５８２から信号を取得してもよい。他の構成も可能であることは理解されよう。図１８に示されている第２段階のヒータの実施形態は、図２に示されているものに対してパウチ５１０の反対側にヒータを提供する。このような配向は単なる例示であり、器具内の空間的な制約によって決定すればよい。第２段階反応ゾーン５８０が光学的に透明な材料で設けられているならば、光検出器及びヒータはアレイ５８１のいずれの側にも配置できる。
[00242] 図示のように、コンピュータ８９４は圧縮空気ソース８９５のバルブ８９９を制御し、従って器具８００の空気力学の全てを制御する。更に、他の実施形態では、器具における空気圧システムの多くを機械的アクチュエータや圧力適用手段等によって置換してもよい。コンピュータ８９４は、ヒータ８８６及び８８８、並びに光学アレイ８９０も制御する。これらのコンポーネントの各々は、例示的にケーブル８９１を介して電気的に接続されているが、他の物理的接続又は無線接続も本発明の範囲内である。コンピュータ８９４は、器具８００内に収容されるか又は器具８００に外部にあり得ることは理解されよう。更にコンピュータ８９４は、コンポーネントのいくつか又は全てを制御する内蔵回路ボードを含み、また、光学アレイからのデータを受信し表示するためのデスクトップ又はラップトップＰＣのような外部コンピュータも含み得る。例えばキーボードインタフェースのようなインタフェースを提供することができ、これは、温度やサイクル時間のような情報及び変数を入力するためのキーを含む。例示的に、ディスプレイ８９２も提供されている。ディスプレイ８９２は、例えばＬＥＤ、ＬＣＤ、又は他のそのようなディスプレイとすればよい。
[00243] 従来技術において既知である他の器具は、密封された可撓性容器内でのＰＣＲを教示している。例えば、米国特許第６，６４５，７５８号、第６，７８０，６１７号、及び第９，５８６，２０８号を参照のこと。これらは援用により本願に含まれる。しかしながら、密封されたＰＣＲ容器内に細胞溶解を含むことは、特に試験対象のサンプルがバイオハザードを含み得る場合、使いやすさ及び安全性を向上させることができる。本明細書に例示される実施形態において、細胞溶解から及び他の全てのステップからの廃棄物は、密封されたパウチ内に留まる。しかしながら、更に試験を行うためパウチ内容物を取り出す可能性があることは理解されよう。
[00244] 図２に戻ると、器具８００は、ケーシングの壁を形成するか又はケーシング内に搭載することができる支持部材８０２を含む。器具８００は第２の支持部材（図示せず）も含むことができ、これは任意選択的に、パウチ５１０の挿入及び引き抜きを可能とするように支持部材８０２に対して移動可能である。例示的に、一度パウチ５１０が器具８００に挿入されたら、パウチ５１０を蓋で覆ってもよい。別の実施形態では、双方の支持部材は固定されており、パウチ５１０は他の機械手段によって又は空気圧によって所定位置に置くことができる。
[00245] 例示的な器具８００において、ヒータ８８６及び８８８は支持部材８０２に搭載されている。しかしながら、この配置は単なる例示であり、他の配置も可能であることは理解されよう。例示的なヒータは、当技術分野において既知の、ペルチェ素子及び他のブロックヒータ、抵抗ヒータ、電磁ヒータ、及び薄膜ヒータを含み、ブリスタ８６４及び第２段階反応ゾーン５８０の内容物を熱サイクルする。袋８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、８６６を備えた袋プレート８１０、ハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、及びシール８７１、８７２、８７３、８７４は、袋アセンブリ８０８を形成し、これを例えばパウチ５１０の方へ移動できる可動支持構造に搭載することで、空気圧式アクチュエータをパウチ５１０に接触した状態に配置できる。パウチ５１０を器具８００に挿入し、可動支持部材を支持部材８０２の方へ移動させた場合、パウチ５１０の様々なブリスタは袋アセンブリ８１０の様々な袋及びアセンブリ８０８の様々なシールに隣接した位置にあるので、空気圧式アクチュエータを活性化すると、パウチ５１０のブリスタの１つ以上から液体が移動するか、又はパウチ５１０の１つ以上のチャネルに対するピンチバルブが形成され得る。パウチ５１０のブリスタ及びチャネルとアセンブリ８０８の袋及びシールとの関係は、図３に更に詳しく示されている。
自己完結型反応容器
[00246] 図５Ａは、パウチ５０００（本明細書では「科学カード」とも称する）の別の例示的な実施形態を示す。このパウチ５０００は、様々な実施形態で使用することができ、又は、ＰＣＲ、微生物試験、もしくは多種多様な他の試験向けに、本明細書に記載される様々な実施形態のため再構成することができる。パウチ５０００は、援用により本願に含まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１８７４８号に記載されている器具、又は多種多様な他の器具における使用のために構成できる。図５Ａの例示的なパウチ５０００は、サンプル調製、核酸増幅、及び検出を実行できる多数のゾーン又はブリスタを含む。例示的なパウチ５０００は、増幅及び分析対象の核酸を含むサンプルがパウチ５０００内に導入されるサンプル調製ブリスタ５００５と、第１段階ＰＣＲブリスタ５０１０と、第２段階ＰＣＲの前に第１段階ＰＣＲからの生成物の一部を測定するための体積希釈ウェル５０１５と、多数の個別反応ウェル５０８２を含む第２段階ＰＣＲアレイ５０８１と、を含む。体積ウェル５０１５はブリスタ５０２０及び５０２５に流体結合することができ、ここで第２段階ＰＣＲ用の試薬が導入されて希釈ウェル５０１５の内容物と混合される。従って、第１段階核酸増幅反応（例えばＰＣＲ反応）の生成物の特定の体積（例えば１～５μｌ）を体積希釈ウェル５０１５に分注し、特定の体積の希釈剤（例えば１００μｌ）と組み合わせることで、第２段階ＰＣＲ反応のアレイを充填する前に第１段階ＰＣＲ増幅のいっそう精密な希釈を達成できる。一例においては、ブリスタ５０２０と５０２５との間で体積ウェル５０１５の内容物と第２段階ＰＣＲ用の試薬を繰り返し混合することにより、第２段階ＰＣＲ用のサンプルを調製できる。第２段階アレイ５０８１は廃棄物容器５０３５に流体接続することができる。あるいは、ブリスタ５０１０をサンプル調製と第１段階ＰＣＲの双方のために使用し、ブリスタ５００５を例えば１又は複数のサンプル調製廃棄物のための廃棄物容器として使用してもよい。他の構成も可能である。
[00247] ブリスタ５００５、５０１０、５０２０、及び５０２５、希釈ウェル５０１５、及び第２段階アレイ５０８１は、チャネル５０５０ａ～５０５０ｅによって流体接続することができる。サンプル及び試薬は、入口チャネル５０４０ａ～５０４０ｆ及び入口ポート５０４５ａ～５０４５ｆを介してパウチ５０００に投入できる。これらの入口ポートは、剥がして再び使えるもの、壊れやすいもの、セルフシール、キャップ付きのもの、熱シール可能なもの、使い捨てのもの（ｏｎｅ－ｗａｙ）、又は当技術分野において既知である他のタイプの入口ポートとすればよい。あるいはパウチ５０００は、パウチ５０００内にサンプル及び試薬を導入するため、図１の装備品５９０と同様の形態のデバイスを装着してもよい。更にパウチ５０００は、装備品又は同様の構造内に脱水（例えば凍結乾燥）試薬を含み、これをパウチの使用前に適切な水和緩衝剤で水和させてもよい。更に別の実施形態では、パウチ５０００内に液体試薬を提供することができる。
[00248] 一実施形態において、パウチ５０００は、パウチ５０００を形成するように密封された多数の材料層（同一材料の層、又は異なるタイプの材料の層）から製造することができる。図５Ｂ及び図５Ｃに、線Ｂ－Ｂ及び線Ｃ－Ｃに沿った切断図が示され、パウチ５０００の異なる部分を製造するために使用できる材料層が例示されている。図５Ｂに示されているパウチ５０００の一領域では、例示的なパウチ５０００は、第１のフィルム層５０９０を第２のフィルム層５０９８に接合することから製造できる。層５０９０及び５０９８は、限定ではないが例えば接着剤、熱及び圧力、音波溶接、又はレーザ溶接のような、当技術分野において既知である従来の手段によって接合できる。また、図５Ｂは、フィルム層５０９０と５０９８との間に開いたエリアを残し、開口に沿って密封したマージンでこの開いたエリアの境界を画定することによって、ブリスタ又はチャネル（例えばチャネル５０４０ｃ）をパウチ５０００に形成できることを示す。図５Ａ及び図５Ｂに例示的な溶接部が５０８４で示されている。図５Ｃは、第２段階アレイ５０８１のウェルを形成するために使用できる厚いカード材料を含むパウチ５０００の別の領域を示す。例示的なパウチ５０００のこの領域は、第１のフィルム層５０９０、感圧接着層５０９２、カード層５０９４、第２の感圧接着層５０９６、及び第２のフィルム層５０９８から製造できる。１つの説明のための例では、第２段階アレイ５０８１のウェル５０８２はカード層５０９４に形成することができる。図５Ｂに示されているように、フィルム層（例えばフィルム層５０９０及び５０９８）の間に開いた空間を残すことによってチャネル（例えばチャネル５０４０ｃ）及びブリスタ（例えばブリスタ５００５）を形成することの代わりに、カード５０９４層を拡大し、このカード層５０９４に適切な切り欠きを作製することによって、ブリスタ及び／又はチャネルを形成してもよい。同様に、第１又は第２の感圧接着層５０９２及び５０９６のいずれかに適切な切り欠きを作製することによってチャネル５０５０ａ～５０５０ｅ及び入口チャネル５０４０ａ～５０４０ｆを形成してもよい。他の構成も可能であることは認められよう。例示的なブリスタエリアは可撓性であるが、カード層５０９４は任意選択的に可撓性を低くして剛性とすることができ、この場合も可撓性サンプル容器の一部であり得ることは理解されよう。従って、「可撓性パウチ」は特定のゾーンにおいてのみ可撓性であればよいことは理解されよう。この代わりに又はこれに加えて、フィルム層５０９０よりも上方又はフィルム層５０９８よりも下方に、別のフィルム層、管類、又は剛性層を追加し、これらの層を共に溶接し、これらの層の間に開いたブリスタエリア及びチャネルを残すことによって、ブリスタエリア間にフローチャネルを形成してもよい。
[00249] 他の材料も使用され得るが、パウチ５０００のフィルム層は例えば、図１に記載されているパウチ５１０と同様の可撓性プラスチックフィルム又は他の可撓性材料から形成できる。例えばパウチ５０００は、限定ではないが、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、それらの組み合わせ、混合物、及び積層層のような材料から製造することができ、押し出し成形、プラズマ堆積、及び積層を含む当技術分野において既知の任意のプロセスによって作製できる。カード層５０９４に同様の材料（例えばポリカーボネート）を使用してもよい。また、アルミニウム積層を用いた金属フォイル又はプラスチックを含む他の材料も使用できる。ブリスタ及びチャネルを形成するように密封できる他のバリア材料も当技術分野において既知である。プラスチックフィルムを用いる場合、これらの層は、例示的に熱シール又はレーザ溶接によって接合することができる。例示的に、材料は低い核酸結合能と低いタンパク結合能を有する。蛍光検出が用いられる場合、パウチの適切なエリアで（例えば第２段階アレイの近傍において）光学的に透明な材料を使用することができる。
[00250] パウチ５０００は、パウチ５１０について上述したのと同様に、及び／又は米国特許第８，８９５，２９５号に記載されているのと同様に使用できる。再び図５Ａを参照して、パウチを充填し、サンプルを調製し、第１段階ＰＣＲを実行し、第２段階ＰＣＲを実行するための、２つの代替的なシーケンスを説明する。第１の例示的な方法では、サンプル調製と第１段階ＰＣＲを別個のブリスタで実行することができる。これを本明細書では「３ゾーン方法」と呼ぶ。３つのゾーンは、サンプル調製、第１段階ＰＣＲ、及び第２段階ＰＣＲである。「３ゾーン方法」及び「２ゾーン方法」を記載する以下の例では、パウチ５０００がパウチの一実施形態であること、及び、他のパウチ構成（例えば図１のパウチ５１０、図７のパウチ７０００、図１１Ａ及び図１１Ｂのパウチ１００００、図１７Ａ及び図１７Ｂのパウチ３９００、図１７Ｃのパウチ４０００、又は図２８Ａのパウチ２１０００）を３ゾーン及び／又は２ゾーン方法に適合できることは認められよう。
[00251] 第１のステップでは、充填チャネル５０４０ａを介してブリスタ５００５にサンプルを注入する。一実施形態では、ブリスタ５００５内で、本明細書の他の箇所で詳しく記載されるワイピングシステムを用いて、細胞やウイルス等を溶解することができる。あるいは細胞溶解は、限定ではないが、超音波処理デバイス、ビーズビーター、パドルビーターのような代替的な溶解デバイスを用いて、又は化学的溶解によって実行できる。任意選択的に、溶解を促進するため、本明細書の他の箇所で詳しく記載されるヒータアセンブリの１つ以上のヒータ要素によってサンプルを（例えば約７０～９０℃に）加熱してもよい。溶解の後、熱電クーラ要素（すなわちペルチェ素子）によってサンプルを約０℃～約２０℃の範囲内の温度（例えば約１０～１５度）に冷却して、例えばシリカでコーティングされた磁気ビーズによる核酸回収を促進することができる。他のクーラ要素には、限定ではないが、流体又はガス熱交換要素、ファン冷却ヒートシンク、ヒートパイプ、凝縮ユニット等が含まれる。
[00252] 溶解物から核酸を回収する際に用いるため、充填チャネル５０４０ａ又は５０４０ｂを介してブリスタ５００５に磁気ビーズを注入することができる。あるいは、溶解前に、溶解対象の細胞、溶解粒子、磁気ビーズ、溶解緩衝剤等を、一緒に又は連続的にブリスタ５００５に注入するか、又は使用前に磁気ビーズをブリスタ５００５内に提供しておくことができる。例示的に、磁気ビーズと溶解物を低温で（例えばヒータのうち１つの温度を調整することによって、約０～１０℃の範囲内で）混合することができる。一度磁気ビーズと溶解物が充分な時間にわたって完全に混合されたら、例示的に器具内に提供されている磁石を用いてブリスタ５００５内で磁気ビーズを収集し、使用済み溶解物はチャネル５０４０ｂを介して液体廃棄所に送出することができる。次いで、充填チャネル５０４０ａを介して洗浄緩衝剤を注入できる。洗浄緩衝剤と磁気ビーズを低温で（例えば約０～１０℃の範囲内で）混合することができる。磁気ビーズを再び収集し、使用済み洗浄緩衝剤はチャネル５０４０ｂを介して液体廃棄所に流すことができる。洗浄サイクルは少なくとも１回以上繰り返すことができる。洗浄の後、充填チャネル５０４０ａを介してブリスタ５００５に溶出緩衝剤を（任意選択的に、第１段階ＰＣＲプライマーも）注入することができる。任意選択的に、溶出緩衝剤（及び第１段階ＰＣＲプライマー）と磁気ビーズを、例えば１つ以上のヒータの制御下で、高温で（例えば約７０～９０℃で）混合することができる。溶解及び／又は洗浄中の加熱及び冷却は単なる例示であり、いくつかの実施形態では、これらのステップ中に温度を調節する必要がないことは理解されよう。また、溶解及び／又は洗浄中の温度の制御は、本明細書に記載される他のパウチ実施形態又は他のサンプル容器を組み込んでいる方法に含めてもよいことは理解されよう。
[00253] 第１段階ＰＣＲのため、充填チャネル５０４０ｃを介してブリスタ５０１０に、ＰＣＲマスター混合物（例えばポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び当技術分野において既知である他の増幅成分）を注入することができる。磁気ビーズからの溶出液を導入する前に、ＰＣＲマスター混合物を（例えば約５７℃に）加熱することによって、物理的な「ホットスタート」を実行できる。ブリスタ５００５において、磁気ビーズを再び収集し、チャネル５０５０ａを介してブリスタ５０１０に溶出液を送出することができる。
[00254] 一実施形態では、図１８から図２１に示されると共にＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１８７４８号（すでに援用により本願に含めた）に記載されているワイパシステムの回転移動を用いて、例示的に２つのヒータの温度制御下で、ブリスタ５０１０内で第１段階ＰＣＲを実行することができる。あるいは、第１段階ＰＣＲの熱サイクリングを実行するため、ヒータアセンブリ又はパウチ５０００を平行移動させることで、ブリスタ５０１０を、２つの異なる温度（例えばアニーリング温度と変性温度）の２つの異なるヒータを含むヒータアセンブリのうち一方のヒータの制御下に置き、次いで他方のヒータの制御下に置くことができる。第１段階ＰＣＲの間、ブリスタ５０１０内へ及びブリスタ５０１０外へ通じるチャネルは、例示的に図２及び図３を参照して記載されたものと同様のハードシールを用いて閉鎖できる。いくつかの実施形態では、体積低減プロトコル（volume reduction protocol）を利用することによって、パウチにおける第１段階ＰＣＲを加速できる可能性がある。例えば体積低減プロトコルは、ブリスタ５０１０内で初期体積（例えば～１００μＬ）を用いてＰＣＲのいくつかの（例えば５～１０の）サイクルを実行し、ブリスタ５０１０の体積の約半分をパージし、ＰＣＲのいくつかの（例えば５～１０の）サイクルを更に実行し、再びブリスタ５０１０の体積の約半分をパージすることを含み得る。液体の体積を低減させると、より大きい体積に比べ、熱質量が低減すると共に熱サイクルを迅速に実行できるので、体積低減はＰＣＲ反応のサイクル時間を短縮することができる。
[00255] 第１段階ＰＣＲの充分な数のサイクル（例えば２０～３０サイクル）の後、第１段階ＰＣＲ混合物の少量のサンプル（例えば～１．５μＬ）を、チャネル５０５０ｂを介して希釈ウェル５０１５に送出することができる。チャネル５０５０ｃ～５０５０ｅは閉鎖することができる。例示的に、希釈ウェル５０１５が適切な少量のサンプルのみを受容できるように希釈ウェル５０１５を適切な小さい体積で形成することによって、希釈に用いられる第１段階ＰＣＲ混合物の体積を制御できる。チャネル５０４０ｅを介してブリスタ５０２５に第２段階ＰＣＲマスター混合物を注入することにより、第２段階ＰＣＲ用の混合物を調製することができる。シールチャネル５０５０ｂ及び５０５０ｅを閉鎖し、シール５０５０ｃ及び５０５０ｄを開放し、ブリスタ５０２５及び５０２０並びにウェル５０１５の間の混合によってウェル５０１５内のサンプルをマスター混合物と混合することで、第１段階ＰＣＲ生成物を第２段階ＰＣＲのために希釈することができる。ブリスタ５０２０及び５０２５並びにウェル５０１５は、第２段階ＰＣＲ混合物の完了前に、物理的な「ホットスタート」のため混合前又は混合中に加熱することができる（すなわち、第２段階ウェルの各々にプライマーが含まれる場合）。次いでチャネル５０５０ｅを開放し、シール５０５０ｃ及び５０５０ｄを閉鎖して、第２段階ＰＣＲ混合物を第２段階ＰＣＲアレイ５０８１内へ移送すればよい。別の実施形態では、パウチ５０００は、ウェル５０１５並びにブリスタ５０２５及び５０２０の下流かつアレイ５０８１の上流に、１つ以上の追加の希釈ウェル及び混合ブリスタセットを含み得る。例えば、高濃度の第１段階ＰＣＲプライマー又は極めて高濃度の生成物を用いるいくつかの実施形態では、第１段階プライマー及び生成物を、１つの希釈ウェルで達成できるよりも高度に希釈することが望ましい場合がある。例示的に、本明細書の他の箇所で詳しく記載されるようにヒータアセンブリを前後に平行移動させることによって、アレイ５０８１における第２段階ＰＣＲのための熱サイクリングを達成できる。
[00256] 第２の例示的な方法では、サンプル調製及び第１段階ＰＣＲを同一のブリスタで実行することができる。これを本明細書では「２ゾーン方法」と呼ぶ。この場合、サンプル調製及び第１段階ＰＣＲが１つのゾーンで実行され、第２段階ＰＣＲが第２のゾーンで実行される。第１のステップでは、充填チャネル５０４０ｃを介してブリスタ５０１０にサンプルを注入することができる。一実施形態では、ブリスタ５０１０内で、本明細書の他の箇所で詳しく記載されるワイピングシステムを用いて、細胞やウイルス等を溶解することができる。あるいは細胞溶解は、限定ではないが、超音波処理デバイス、ビーズビーター、パドルビーターのような代替的な溶解デバイスを用いて、又は化学的溶解によって実行できる。溶解を促進するため、本明細書の他の箇所で詳しく記載されるヒータアセンブリの１つ以上のヒータ要素によってサンプルを高温に（例えば約７０～９０℃に）加熱してもよい。溶解の後、任意選択的に、熱電クーラ要素（すなわちペルチェ素子）によってサンプルを低温に（例えば、限定ではないが～約０℃から約１０℃等、周囲温度未満の温度に）冷却してもよい。
[00257] 溶解物から核酸を回収するため、充填チャネル５０４０ｃを介してブリスタ５０１０に磁気ビーズを注入することができる。一実施形態では、溶解後に磁気ビーズと溶解物を低温で（例えば約０～１０℃の範囲内の温度で）混合することができる。別の実施形態では、溶解対象の細胞、溶解緩衝剤、磁気ビーズ、及び、任意選択的な溶解粒子を組み合わせて、一緒にブリスタ５０１０に注入して、溶解と核酸捕捉を実質的に同時に実行してもよい。一度磁気ビーズと溶解物が充分な時間にわたって完全に混合されたら、磁石を用いてブリスタ５０１０内で磁気ビーズを収集し、使用済み溶解物はチャネル５０５０ａを介してブリスタ５００５（すなわちこの例では液体廃棄物ブリスタ）液体廃棄所に送出することができる。次いで、充填チャネル５０４０ｃを介してブリスタ５０１０に洗浄緩衝剤を注入できる。任意選択的に、洗浄緩衝剤と磁気ビーズを低温で（例えば約０～１０℃の範囲内の温度で）混合することができる。磁気ビーズを再び収集し、使用済み洗浄緩衝剤をブリスタ５００５に流すことができる。所望の場合、洗浄サイクルは少なくとも１回以上繰り返すことができる。洗浄の後、ブリスタ５０１０に溶出緩衝剤（及び第１段階のＰＣＲプライマー）を注入することにより、ビーズから核酸を溶出させることができる（任意選択的に、例えば約７０～９０℃の高温で）。磁気ビーズ及び（存在する場合は）残りの溶解粒子をブリスタ５０１０の上流半分に収集し、チャネル５０５０ａを介して廃棄物ブリスタ５００５に送出することができる。上記で検討したように、溶解及び／又は洗浄中の加熱及び冷却は単なる例示であり、いくつかの実施形態では、これらのステップ中に温度を調節する必要がないことは理解されよう。
[00258] 第１段階のＰＣＲのために、ワイパシステムをセットし、第１段階ＰＣＲマスター混合物をチャネル５０４０ｄに注入し、真のホットスタートが望ましい場合は任意選択的に高温（例えば約５７℃）に保持することができる。第１段階ＰＣＲマスター混合物をブリスタ５０１０内でプライマー及びテンプレートと混合し、上述のように第１段階ＰＣＲを実行すればよい。
[00259] 第１段階ＰＣＲの後、プロトコルは、「３ゾーン方法」について上述したのと同様に第２段階ＰＣＲに進むことができる。
[00260] 蛍光検出が望ましい場合、光学アレイを提供することができる。光学アレイは、例示的にフィルタＬＥＤ光源、フィルタ白色光、又は照明である光源と、カメラと、を含み得る。カメラは例えば複数の光検出器を有し、各光検出器はパウチ５０００のアレイ５０８１内の第２段階ウェルに対応する。あるいは、カメラが第２段階ウェルの全てを含む像を撮影し、この像を第２段階ウェルの各々に対応した別個のフィールドに分割してもよい。構成に応じて、光学アレイは不動とするか、又は１つ以上のモータに取り付けた移動部に配置して移動させることで各第２段階ウェルから信号を取得してもよい。他の構成も可能であることは理解されよう。
[00261] ここで図６Ａを参照すると、第２段階ＰＣＲに使用することができるウェルのアレイ６０００が詳細に示されている。アレイ６０００は、スタンドアロンのアレイとするか、又はアレイ５０８１の一部のようなより大きいアレイの一部として含めることができる。アレイ６０００は、個々のウェル６００２、６００４、６００６、６００８、及び６０１０を含む。ウェル６００２、６００４、６００６、６００８、及び６０１０の各々を、第２段階ＰＣＲ反応のために使用できる。例示された実施形態では、ウェル６００２、６００４、６００６、６００８、及び６０１０は、充填チャネル６０１２に流体接続されている。各ウェルを充填するため、充填チャネル６０１２に孔６０１４、６０１６、６０１８、６０２０、及び６０２２が形成されている。一実施形態において、第２段階アレイのウェル（例えばウェル６００２、６００４、６００６、６００８、及び６０１０）は、充填チャネル６０１２からウェル内への流体の引き込みを容易にするため部分真空下に置くことができる。一実施形態において、ウェル６００２、６００４、６００６、６００８、及び６０１０は、６０２４で示された領域内に又はこの領域周辺にシール（例えば熱シール）又は圧力を加えることによって、充填チャネル６０１２から密封し、かつ相互に密封することができる（すなわちウェル間のクロストークを防止できる）。従って、６０２４で示された領域に単一のシールを適用して、ウェル６００２、６００４、６００６、６００８、及び６０１０をチャネル６０１２から遮断し、かつ相互に遮断することで、ウェル間のクロストークを防止できる。図６Ｂ及び図６Ｃに、アレイ６０００及びウェルを充填するための流路の断面構造が示されている。また、アレイ６０００は、充填チャネル６０１２に関連付けられた５つのウェル６００２、６００４、６００６、６００８、及び６０１０によって示されているが、これよりも多数又は少数の反応ウェルを充填チャネルに関連付けられること、及び、複数の充填チャネルを複数のウェルクラスタに流体接続できることは認められよう。複数のアレイ６０００を組み合わせて用いることで、より大きいアレイを生成してもよい。
[00262] ここで図６Ｂ及び図６Ｃを参照すると、図６Ｂは図６Ａの線Ｂ－Ｂに沿って示された断面図であり、図６Ｃはウェル充填システムの異なる実施形態を示す代替的な実施形態である。図６Ｂ及び図６Ｃに断面で示されているアレイ６０００の一部は、図５Ｃに示したものと同様の層で構成され、アレイ６０００はアレイ５０８１でなく図５Ａに示されているパウチ５０００の一部として含められることに留意するべきである。図６Ｂに示されているウェル６００６ｂは、第１のフィルム層６０３０ｂ、第２のフィルム層６０３２ｂ、接着層６０３４ｂ、ウェル６００６ｂが画定され得る第１の側面又は端部６０５０ｂ及び第２の側面又は端部６０５１ｂを有するカード層６０３６ｂ、第２の接着層６０３８ｂ、及び第３の（外側）フィルム層６０４０ｂによって画定できる。図６Ｃに示されているウェル６００６ｃは、極めて類似しており、第１のフィルム層６０３０ｃ、第２のフィルム層６０３２ｃ、接着層６０３４ｃ、ウェル６００６ｃが形成され得る第１の側面又は端部６０５０ｃ及び第２の側面又は端部６０５１ｃを有するカード層６０３６ｃ、第２の接着層６０３８ｃ、及び第３の（外側）フィルム層６０４０ｃによって画定できる。図６Ｂと図６Ｃの重要な違いは、ウェル６００６ｂ及び６００６ｃが周囲の層にどのように形成され、どのように充填され得るかである。
[00263] 図６Ｂにおいて、第１及び第２のフィルム層６０３０ｂ及び６０３２ｂの間に液体が流れることができるギャップを残すことにより、充填チャネル６０１２ｂを形成できる。図６Ｃは、第１及び第２のフィルム層６０３０ｃ及び６０３２ｃの間にギャップを残すことにより形成された同様の充填チャネル６０１２ｃを示す。これらの充填チャネルは、アレイ周囲で第１及び第２のフィルム層を密封する溶接ライン６０２６ｂ又は６０２６ｃによって画定できる。どのようにこれらの溶接を行うかを示す一例が、図６Ａにおいて、充填チャネル６０１２及びウェル周囲の空間を画定する外側溶接部６０２６ａ及び内側溶接部６０２６ｂを含む溶接領域６０２６で図示されている。図６Ｂにおいて、第２のフィルム層６０３２ｂ及び第１の接着層６０３４ｂに選択的な切り欠きを作製することにより、充填孔６０１８ｂを形成できる。図６Ｃにおいて、第１の接着層６０３４ｃの対応する切り欠きに隣接している第２のフィルム層６０３２ｃの選択的な切り欠きを作製することにより、充填孔６０１８ｃを形成できる。充填孔６０１８ｂ及び６０１８ｃは第２段階反応ウェル６００６ｂ及び６００６ｃに隣接しているが、位置合わせされていない。すなわち充填孔６０１８ｂ及び６０１８ｃは、第２段階反応ウェル６００６ｂ及び６００６ｃに流体接続されているが、第２段階反応ウェル６００６ｂ及び６００６ｃに対してずれている。すなわち充填孔６０１８ｂ及び６０１８ｃは、第２段階反応ウェル６００６ｂ及び６００６ｃに重なっていない。
[00264] 図６Ｂにおいて、カード層６０３６ｂに切り欠き６０４２ｂを作製し、第２の接着層６０３８ｂに切り欠き６０４４ｂを作製することによって、ウェル６００６ｂを充填するためウェルの周囲及び上方を流れるウェル充填チャネルを形成できるが、これらのチャネルを形成する他の方法も可能である。図６Ｂのウェル充填チャネルの設計は、例えばウェル間のクロストーク又は二次汚染を低減するのに役立ち得る。その理由は、ウェル６００６ｂに出入りする流路が何度も曲がりくねっている、すなわち流路が入り組んでいるからである。クロストーク又は二次汚染を低減させる他の間接的な経路も想定されており、それらのいくつかは本明細書の他の実施形態において、例えば図８Ａ、図８Ｂ、図１７Ａ、及び図１７Ｂ（例えばらせん形ウェル充填経路３９３０を参照のこと）、及び図２０Ａから図２０Ｅに示されていることは理解されよう。プライマーは通常はウェル６００６ｂのようなアレイウェルにスポットされるので、アンプリコンは主にウェル内で見出されるはずである。従って、切り欠き領域６０４２ｂ及び６０４４ｂは、ウェル間のアンプリコン及びプライマーの漏れ（すなわちクロストーク）を最小限に抑えるように機能できる。更に、層６０３０ｂ及び６０３２ｂによって形成され、充填孔６０１８ｂを含むチャネル６０１２ｂは、インサイチュで（in situ）で容易に密封されて、１又は複数のウェルに対するアクセスを実質的に阻止する。例えば、充填孔６０１８ｂ及びウェル６００６ｂに対するアクセスは、例示的に熱シールデバイスによって密封するか、又は例示的に図６Ａの６０２４に隣接した領域で膨張する袋による圧力、もしくはアレイ６０００の全体もしくは一部に対する圧力によって密封することができる。図６Ｃにおいて、ウェル充填チャネル６０１８ｃはウェル６００６ｃに直接流れ込んでおり、充填孔６０１８ｃをウェル６００６ｃに流体接続する第１の接着層６０３４ｃの切り欠き６０４６ｃを作製することによって形成できる。図６Ｃの充填設計も一般にウェル間のクロストークを抑制することが予想される。しかしながら図６Ｃの設計は、例示的に、圧力のみよりも良好な密封を提供し得る熱シールデバイスを用いて密封することができる。
[00265] ここで図７を参照すると、パウチ７０００の別の実施形態が示されている。パウチ７０００は図５Ａのパウチ５０００と同様であり、同様に使用することができる。パウチ７０００とパウチ５０００との違いは、限定ではないが、内蔵試薬再水和溶液（例えば水又は緩衝剤）と溶解緩衝剤を提供すること、及び一体型サンプル調製チャンバを提供することを含む。例えば脱水試薬（例えば磁気ビーズ、ＰＣＲ成分等）の再水和を目的とする試薬再水和溶液の代わりに、パウチ７０００のいくつかの実施形態は、すぐに使える（ready-to-use）液体試薬を含み、これを製造時にパウチに含めることができる。パウチ７０００は、サンプル混合、サンプル調製、（必要な場合）技術者による入力や操作なしのパウチ内での試薬再水和のようなステップを実行するために構成されているので、パウチ７０００及び同様のパウチは使いやすい。使いやすさは例えば、米国のＦＤＡや他の国の規制機関による試験の規制に大きな影響を及ぼし得る。例えばＦＤＡによって、試験が非常に簡単なのでエラーのリスクがほとんどないと判定された場合、試験はほとんどの臨床検査室改善修正法案（ＣＬＩＡ：Clinical Laboratory Improvement Amendments）要件を免除される可能性がある。パウチ７０００は、本明細書で詳しく記載される器具８００又は器具１２００のような器具における使用向けに構成することができる。
[00266] パウチ７０００は、反応ゾーンや流路チャネル等を形成するように接合されている２つ以上の材料層（例えば本明細書の他の箇所で記載されるプラスチックフィルム層）から製造できる。パウチ７０００は一体型サンプル調製（ＩＳＰ）ゾーン７００５を含み、これは、分析対象のサンプル（例えば、未知の細胞及び／又は病原体を含む疑いがあるサンプル）を受容し、第１段階及び第２段階の核酸増幅を用いる核酸増幅及び分析のためにサンプルを調製するよう構成されている。例示されている実施形態において、ＩＳＰゾーン７００５はチャネル７００９を介して一体型流体ブリスタ７００１に流体接続されている。一実施形態において、一体型流体ブリスタ７００１は、パウチ材料層間に形成されて製造時に流体が充填された開放可能シール（例えば連結させたフィルムによるシール（tacked together film seal）又は破裂可能シール（burstable seal））を有する流体充填ブリスタとすればよい。一実施形態において、一体型流体ブリスタ７００１はある体積（例えば２００μｌ）の溶解緩衝剤を収容することができ、これは、例えばサンプル水和及び／又は溶解を促進するためサンプルと共にＩＳＰゾーン７００５に導入することができる。
[00267] 一実施形態において、パウチ７０００は、チャネル７００８を介して一連の試薬ウェル７０４５ａ～７０４５ｋに流体接続されている内蔵ブリスタ７００２も含むことができる。内蔵ブリスタ７００２は、ある体積（例えば８００μｌ）の試薬再水和溶液（例えば精製水）を含むことができ、これは、チャネル７００８及び試薬ウェル７０４５ａ～７０４５ｋに導入されて、そこで脱水試薬を再水和するか又は高濃度試薬を希釈することができる。試薬ウェル７０４５ａ～７０４５ｋには入口チャネル７０４６ａ～７０４６ｄが設けられ、これらは、任意選択的にフローチャネル７００８に沿った試薬ウェル間の流れと共に使用されて、パウチ７０００の様々なサンプル調製ゾーン及び反応ゾーン内に試薬を導入することができる。４つの入口チャネル７０４６ａ～７０４６ｄのみが図示されているが、追加の入口チャネルが想定されること、及び複数の試薬ウェルをパウチ７０００の様々なブリスタに接続できることは理解されよう。一実施形態において、試薬ウェル７０４５ａ～７０４５ｋは、図１に示されている装備品５９０と同様の構造に配置することができる。別の実施形態において、試薬ウェル７０４５ａ～７０４５ｋは、パウチの材料層に形成された（例えば熱成形された）ブリスタ又はウェルを含むことができる。そのような試薬ブリスタの説明のための例が図１１Ａ及び図１１Ｂに示されており、以下で図１１Ｃ及び図１２Ａから図１２Ｄを参照して、乾燥試薬ブリスタ及び液体試薬ブリスタの具体例を詳しく検討する。例示的に試薬ウェル７０４５ａ～７０４５ｋは、使用前に再水和させことができる凍結乾燥試薬（例えば乾燥粉末及び／又は凍結乾燥試薬ピル）を含むか、又は試薬ウェル７０４５ａ～７０４５ｋは、液体試薬、又は乾燥試薬と液体試薬の組み合わせを含み得る。
[00268] 例示されている実施形態において、ＩＳＰゾーン７００５は、パウチ７０００の製造に使用される材料層に形成する（例えば熱成形する）ことができるサンプル注入ポート７００３に隣接している。一実施形態においてサンプル注入ポートは、液体サンプル、サンプルスワブ、固体又は半固体のサンプル等のＩＳＰゾーン７００５への投入を容易にする逆円錐形とすることができる。他の形状及び構成も本開示の範囲内である。更にＩＳＰゾーン７００５は、ＩＳＰゾーン７００５にサンプルが投入された後に密封できる密封可能ゾーン７００４を含む。例えば密封可能ゾーン７００４は、プラスチック袋タイプのジッパーシール、剥がして再び使える接着片、熱シール、又は別のシールを用いて密封できる。一実施形態では、ＩＳＰゾーン７００５内で、限定ではないが超音波処理デバイス、ビーズビーター、パドルビーターのような溶解デバイスを用いて、又は化学的溶解によって、細胞やウイルス等を溶解することができる。溶解を促進するため、サンプルを（例えば約７０～９０℃に）加熱してもよい。一実施形態では、細胞溶解を改善するため、ＩＳＰゾーン７００５に溶解粒子（例えばケイ酸ジルコニウム又は金属ビーズ）を含ませてもよい。そのようなビーズは、製造時にＩＳＰゾーン７００５に含ませるか、又は下流ブリスタ（例えばブリスタ７００６又は７００７）から、試薬ブリスタ（例えばブリスタ７０４５ａ）から、又はサンプルと共に、ＩＳＰゾーン７００５に導入することができる。
[00269] 溶解物から核酸を回収するため、シリカでコーティングされた磁気ビーズをＩＳＰゾーン７００５に投入することができる。そのようなビーズは、製造時にＩＳＰゾーン７００５に含ませるか、又は下流ブリスタ（例えばブリスタ７００６又は７００７）から、もしくは試薬ウェル７０４５ａ～７０４５ｋのうち１つからＩＳＰゾーン７００５に導入すればよい。ビーズが下流ブリスタから導入される場合、磁気ビーズを、例示的に試薬ウェルのうち１つから提供される流体を用いて又は溶解物によって再水和させ、次いでチャネル７０５０ｂ又は７０５０ｄを介してチャネル７０５０ａへ、更にＩＳＰゾーン７００５へ移動させることができる。図１及び図２を参照して本明細書で詳しく説明したように、磁気ビーズ及び溶解物は充分な時間期間にわたって混合させ、次いで器具内の磁石の活性化によって磁気ビーズを捕捉して、少なくとも１つの洗浄ステップのためにブリスタ７００６又は７００７に移動させ、その後、捕捉した核酸を磁気ビーズから溶出させることができる。
[00270] 本明細書に記載されている様々なパウチと同様、パウチ７０００は、第１段階ＰＣＲブリスタ７０１０と、第２段階ＰＣＲの前に第１段階ＰＣＲからの生成物の一部を測定するための体積希釈ウェル７０１５と、多数の個別反応ウェル７０８２を含む第２段階ＰＣＲアレイ７０８１と、を含む。第１段階ＰＣＲブリスタ７０１０及び第２段階ＰＣＲアレイ７０８１は、本明細書の他の箇所で記載されるように、第１及び第２段階のＰＣＲのために使用することができる。
[00271] 体積ウェル７０１５は、例示的にブリスタ７０２０及び７０２５である１つ以上のブリスタに流体結合することができ、ここで、第２段階ＰＣＲ用の試薬が導入されて希釈ウェル７０１５の内容物と混合される。一例においては、ブリスタ７０２０と７０２５との間で体積ウェル７０１５の内容物と第２段階ＰＣＲ用の試薬を繰り返し混合することにより、第２段階ＰＣＲ用のサンプルを調製できる。ブリスタ７００５、７０１０、７０２０、及び７０２５、希釈ウェル７０１５、及び第２段階アレイ７０８１は、チャネル７０５０ａ～７０５０ｈによって流体接続することができる。例示されている実施形態において、第２段階アレイ７０８１のウェル７０８２は、図６ａに示されている充填チャネル６０１２と同様に機能する分岐充填チャネル７０１２を介してチャネル７０５０ｈに流体接続されている。アレイ７０８１は分岐充填チャネル７０１２と共に示されているが、例えば、限定ではないがらせん形、蛇行形、図６Ａに示されているものと同様のクラスタ等、他の充填チャネル構成も使用できることは認めらよう。
[00272] 一実施形態において、パウチ７０００は、パウチ７０００を形成するように密封された多数の材料層（同一材料の層、又は異なるタイプの材料の層）から製造することができる。他の材料も使用され得るが、パウチ７０００のフィルム層は例えば、図１に示されているパウチ５１０と同様の可撓性プラスチックフィルム又は他の可撓性材料から形成できる。例えばパウチ７０００は、限定ではないが、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、それらの組み合わせ、混合物、及び積層層のような材料から製造することができ、押し出し成形、プラズマ堆積、及び積層を含む当技術分野において既知の任意のプロセスによって作製できる。また、アルミニウム積層を用いた金属フォイル又はプラスチックを含む他の材料も使用できる。ブリスタ及びチャネルを形成するように密封できる他のバリア材料も当技術分野において既知である。プラスチックフィルムを用いる場合、これらの層は、例示的に熱シール又はレーザ溶接によって接合することができる。例示的に、材料は低い核酸結合能と低いタンパク結合能を有する。第２段階アレイは、本明細書の他の箇所で検討されるようなカード材料を用いて製造できる。蛍光検出が用いられる場合、パウチの適切なエリアで（例えば第２段階アレイの近傍において）光学的に透明な材料を使用することができる。
[00273] いくつかの実施形態において、第２段階アレイのウェルは、第２段階ＰＣＲにおいて流体によるウェルの充填を容易にするため部分真空下に置くことができる。一般にこれは、製造時から、使用時にサンプルパウチの周りのパッケージを開くまで、パウチが部分真空下で保管されることを意味し得る。図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａから図９Ｅ、図１０Ａ及び図１０Ｂは、第２段階アレイにおける信頼性の高いウェル充填を可能としながら真空保管の代わりに使用できる第２段階アレイ構成を示す。以下で詳しく検討されるように、図８Ａ及び図８Ｂは、エリア８０５０ａ及び８０５０ｂを含む第２段階アレイのウェルの切断図を示す。これらのエリアは、空気及び余分な流体をウェル８００６ａ及び８００６ｂから逃がすことで、パウチ及びアレイを真空下に維持する必要なく、流体が充填チャネル８０１２ａ及び８０１２ｂからウェル内に流れることを可能とする。本明細書の他の箇所で詳しく検討されるように、図１０Ａ及び図１０Ｂは、例示的に液体充填チャネルに形成することができる真空経路を含むアレイを概略的に示す。これは、例えば器具においてパウチ内でアッセイを実行している間にインサイチュでアレイを部分真空に引くことができる。
[00274] ここで図８Ａ及び図８Ｂを参照すると、ウェル充填システムの２つの設計の断面図が示されている。これらの図は図６Ｂ及び図６Ｃに示された図と同様である。図８Ａに示されているウェル８００６ａは、第１のフィルム層８０３０ａ、第２のフィルム層８０３２ａ、接着層８０３４ａ、ウェル８００６ａが形成され得るカード層８０３６ａ、第２の接着層８０３８ａ、及び第３の（外側）フィルム層８０４０ａから製造できる。図８Ｂに示されているウェル８００６ｂは、極めて類似しており、第１のフィルム層８０３０ｂ、第２のフィルム層８０３２ｂ、接着層８０３４ｂ、ウェル８００６ｂが形成され得るカード層８０３６ｂ、第２の接着層８０３８ｃ、及び第３の（外側）フィルム層８０４０ｂから製造できる。
[00275] 図８Ａにおいて、第１及び第２のフィルム層８０３０ａ及び８０３２ａの間に液体が流れることができるギャップを残すことにより、充填チャネル８０１２ａを形成できる。図８Ｂは、第１及び第２のフィルム層８０３０ｂ及び８０３２ｂの間にギャップを残すことにより形成された同様の充填チャネル８０１２ｂを示す。第１の接着層８０３４ｂの対応する切り欠きに隣接している第２のフィルム層８０３２ｂの選択的な切り欠きを作製することにより、充填孔８０１８ｂを形成できる。
[00276] 図８Ａにおいて、切り欠き８０４２ａ及び切り欠き８０４４ａを通ってウェル８００６ａ内へ流入するウェル充填チャネルを通る液体の流れによって加圧され得るウェル８００６ａ内の空気は、カード層８０３６ａ及び第２の接着層８０３８ａに切り欠きを作製することで形成されたチャンバ８０５０ａに逃げることができる。図８Ｂにおいて、充填孔８０１８ｂ及び切り欠き８０４６ｂを通ってウェル８００６ｂ内へ流入するウェル充填チャネルを通る液体の流れによって加圧され得るウェル８００６ｂ内の空気は、カード層８０３６ｂに切り欠きを作製することで形成されたチャンバ８０５０ｂに逃げることができる。８０５０ａ及び８０５０ｂのような空気逃しチャンバはそれぞれ１つのウェルに接続されて図示されているが、いくつかの実施形態では、そのような空気逃しチャンバを複数の隣接したウェルに接続してもよいことは理解されよう。同様に、８０５０ａ及び８０５０ｂのような空気逃しチャンバは止まり穴として示されているが、いくつかの実施形態では、空気逃し経路を他の層に接続し、更には外気又は真空源に接続してもよいことは理解されよう。図６Ｂから図６Ｃはパウチ５０００に関連付けて示され、図８Ａから図８Ｂはパウチ７０００に関連付けて示されているが、本明細書に記載されている第２段階ウェルは本明細書に記載された様々なパウチにおいて使用することができ、特定の用途の必要によってのみ限定されることは理解されよう。
[00277] ここで図９Ａから図９Ｅを参照すると、本明細書に記載されている様々な科学カード又はパウチで使用される第２段階ウェルの別の実施形態が示されている。例示的に真空なしで充填できるウェル９００４ａ～９００４ｃが図示されている。ウェル９００４ａ～９００４ｃは、第１のプラスチック層に形成することができ、例示的に第２段階増幅用のプライマー対をスポットし、次いでウェルの開放端部を第２のプラスチック層で覆うことができる。次いでウェル９００４ａ～９００４ｃを平坦化し、これにサポート層を提供することができる。サポート層はウェルを取り囲み、とりわけ使用中にウェルが再び平坦化するのを防止できる。
[00278] 図９Ａに示されている実施形態では、第１のフィルム層９００２（例えば熱可塑性ポリマー層）にウェル９００４ａ～９００４ｃを形成する（例えば熱成形する）ことができる。形成の後、ウェル９００４ａ～９００４ｃに第２段階ＰＣＲ用のプライマーをスポットすることができ（概略的に９００５ａ～９００５ｃで示されている）、これは例示的に、第１のフィルム層９００２が上下逆さまである間に実行される。一実施形態において、ウェルを形成するための設備（fixture）は、ウェル形成時にプライマーをスポットするための流体接続部を含み得る。図９Ｂに示されている第２のステップでは、第１のフィルム層９００２に第２のフィルム層９００６を接合する（例えばレーザ溶接する）ことができる。一実施形態において、第２のフィルム層９００６は単一のフィルム層とすることができ、第２段階ウェル９００４ａ～９００４ｃに対応する充填孔９０２０ａ～９０２０ｃがフィルム層に形成されている。別の実施形態では、第２のフィルム層９００６は１つ以上の層から形成することができ、第２段階ウェル９００４ａ～９００４ｃを充填すると共に好ましくはウェル間のクロストークを防止するための、１又は複数の充填チャネル、充填孔、及びその他の任意選択的な流れ構造を備えている。
[00279] 図９Ｃに示されている第３のステップでは、図９Ａで形成されたウェル９００４ａ～９００４ｃを設備９００８によって実質的に平坦に圧縮することができる。平坦化の後、図９Ｄに示されているように、蛍光データ獲得中のウェル間の光学的クロストークを防止するため、不透明とすることができる層９０１０をウェル間に追加できる。一実施形態において、不透明層９０１０は、剛性又は半剛性材料（例えばアレイ５８１又は５０８１を製造するために使用される厚いカード材料）から製造することができ、アレイのウェルが第２段階ＰＣＲサイクリングで充填された後に再び平坦化することから保護できる。図９Ｄはウェル形成及び平坦化の後に不透明層９０１０を追加することを示すが、不透明層９０１０をウェル形成又は平坦化の前に追加してもよいことは認められよう。一実施形態において、不透明層９０１０は、反射性材料（例えばアルミめっきマイラー（aluminized Mylar）のようなフォイル又は金属化プラスチック材料）から製造できる。例えば反射性材料は、ウェル間の光学的クロストークを防止しながら、個々のウェル内に反射を与えて光学信号を増大させることができる。いくつかの実施形態では、剛性又は半剛性の層に加えて反射性材料を追加できる。同様に、反射性材料はウェル形成及び／又は平坦化の前又は後に追加することができる。
[00280] 一実施形態では、図９Ｅに例示された実施形態に示されているように、以前に平坦化したウェル９００４ａ～９００４ｃを、流体を充填することによって再膨張させることができる。平坦化したウェル内には閉じ込められた空気が実質的に存在しないので、例示的にウェル９００４ａ～９００４ｃを弱い圧力で充填することによって、アレイを部分真空下に置くことなくウェル９００４ａ～９００４ｃを充填することが可能である。本明細書に記載されている方法の１つ以上に従った核酸増幅のため、ウェル９００４ａ～９００４ｃを熱サイクルさせることができる。
[00281] 図１０Ａ及び図１０Ｂは、パウチを部分真空下で製造及び保管することなく充填できる第２段階アレイ１１０００の別の実施形態を示す。第２段階アレイ１１０００は、図６Ａに示されている第２段階アレイ６０００と同様である。部分的に溶接ライン１１０２６によって画定される第２段階アレイ１１０００は、第２段階ウェル１１００２、１１００４、１１００６、１１００８、及び１１０１０を含み、これらの各々は、特定の第２段階プライマー対が提供され、第２段階ＰＣＲ用の成分（例えば、第１段階ＰＣＲからの希釈生成物、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等）を充填し、本明細書の他の箇所で詳しく記載されるように、第２段階分析のため熱サイクルさせることができる。第２段階ウェルは充填チャネル１１０１２から充填可能であり、充填チャネル１１０１２は、各第２段階ウェルに関連付けられている充填孔１１０１４、１１０１６、１１０２８、１１０２０、及び１１０２２、並びに流体ビア１１０５２ａ～１１０５２ｅと流体連通している。充填チャネルに一体的に形成され、充填孔、ビア、及び第２段階ウェルの各々と流体連通しているのは、例示的な真空経路１１０５０である。真空経路１１０５０は、アレイから離れているパウチの一部に配置され得るポート１１０５１と流体連通している。一実施形態において、ポート１１０５１は、前もって形成するか又はインサイチュで形成して真空経路への流体アクセスを提供できる開口１１０５１ａを含み得る。例示的に、開口１１０５１ａは層１１０３０又は１１０３２のいずれかに形成できる。例えば真空経路１１０５０を用いて、（例えばパウチ動作中に器具内の真空ポンプによって）インサイチュで第２段階ウェルを部分真空に引くことで、パウチを真空下で製造又は保管する必要をなくすことができる。一実施形態において、真空チャネル１１０５０は例示的に、真空源に接続できるパウチ上の遠隔真空ハブに接続することができる。
[00282] ここで図１０Ｂを参照すると、充填チャネル１１０１２及び真空経路１１０５０の断面が示されている。図示されている実施形態において、充填チャネル１１０１２は、１１０２６においてエッジで接合された（例えば熱溶接又はレーザ溶接された）２つのフィルム層１１０３０及び１１０３２の間の開いた空間として形成されている。例示的に、真空経路１１０５０は、層１１０３０又は１１０３２の一方又は双方におけるサブチャネルとして形成できる。図示されている実施形態において、真空経路１１０５０は、チャネル１１０１２を開放した状態に保持すると共に、充填孔、ビア、及び第２段階ウェルを真空経路１１０５０及びポート１１０５１を介して真空源に接続するように設計されたアーチ形状を有する。真空チャネル１１０５０が存在しなかったら、チャネル１１０１２に真空が与えられた場合にチャネルは閉じる（「kiss」shut）傾向があり、第２段階アレイ１１０００の排気を防ぐ可能性がある。一実施形態において、真空チャネル１１０５０は、熱成形設備を用いて（例えば適切な形状に作られた熱「デボス加工（debossing）」ワイヤ）、層のうち１つに形成することができる。他の実施形態では、成形、レーザエッチング、ジューログラフィ（xurography）等によって真空チャネル１１０５０を形成できる。図１０Ｂに示されているように、熱成形されたチャネルの一例である真空経路１１０５０は、プラスチック層に形成されたチャネルを含む。好ましくはチャネル１１０５０は、真空によって第２段階ウェルから空気を引くことができるようにプラスチックを支持すると共にチャネルを開いた状態に保持するアーチ形状を有する。しかしながら、例えばポート１１０５１の近傍かつアレイウェルから離れた真空経路１１０５０上に熱シールを適用することで層１１０３０及び１１０３２を接合することにより、真空経路１１０５０を密封してもよい。
[00283] 一実施形態では、器具において、第２段階アレイに対して少なくとも１～１５０ミリバール（例えば２～１０ミリバール、より好ましくは２～５ミリバール）の真空を１０～１２０秒間引くことができる。真空を引いた後、真空チャネルを密封し（例えば熱シール）、真空をポート１１０５１で開放し、これによってアレイのウェルを部分真空下に置くことができる。上述したものと同様の真空チャネルを備えたプロトタイプのアレイでの実験によって、インサイチュで真空を引くことは、真空下でパウチを製造し保管することと少なくとも同程度に効果的であり、おそらくはそれよりも効果的であり得ることが示されている。
[00284] ここで図１１Ａ及び図１１Ｂを参照すると、パウチ１００００の別の実施形態が示されている。パウチ１００００は、本明細書に記載されている他のパウチと同様に使用することができる。パウチ１００００は、図７のＩＳＰゾーン７００５と同様の一体型サンプル調製（ＩＳＰ）ゾーン１０００５を含む。ＩＳＰゾーン１０００５は、（血液、痰、便、唾液、土等からの）サンプル収集に使用できる吸収チップ１００７０を備えたスワブ１００６０を含む。使用時、ＩＳＰゾーン１０００５を１０００３で開き（例えば破って開くか又はシールを開くことによって）、サンプル収集のためスワブ１００６０を取り出すことができる。収集の後、スワブ１０００５をＩＳＰゾーン１０００５に再び挿入し、図１１Ｂに示されているように分割ライン１００６５で折ることができる。図１１Ｂに示されている一実施形態において、ＩＳＰゾーン１０００５は、サンプル調製の完了前にＩＳＰ１０００５を密封するため使用できるシール１０００４（例えばジッパーシール、剥がして再び使えるシール、ねじ蓋シール等）を含み得る。あるいは、サンプル調製の完了前に容器を密封するためＩＳＰゾーン１０００５に熱シール等を適用することも可能である。任意選択的に、シール１０００４の位置でＩＳＰゾーン１０００５を密封するため、パウチ１００００を動作させるよう構成された器具に熱シールバーを提供してもよい。
[00285] サンプル調製及び別のサンプル処理のため、パウチ１００００は内蔵の流体貯蔵部１０００１及び１０００２ａ～１０００２ｅを含む。一実施形態において、流体貯蔵部は製造時に、あるいはパウチ使用前にユーザによって充填することができる。一実施形態において、流体貯蔵部１０００１はサンプル溶解緩衝剤１００５７及びサンプル溶解成分１００５６を含むことができる。サンプル溶解成分１００５６は、サンプル溶解物からの核酸回収に使用できるサンプル溶解粒子（例えばケイ酸ジルコニウムビーズ）及び／又はシリカでコーティングされた磁気ビーズを含み得る。図示されている実施形態において、流体貯蔵部１０００１は、ＩＳＰゾーン１０００５から貯蔵部１０００１の内容物を分離する、剥がして再び使えるシール又は壊れやすいシールのような開放可能シール１００７５を含む。一実施形態において、開放可能シール１００７５はパウチ製造中に据え付けられる破裂可能シールとするか、又は、パウチ１００００を製造するため使用されるフィルム層は相互に多少の自然の親和性を持っていて緩く接合する傾向があり得るので、チャネルにおいて連結させたフィルム層によってシール１００７５を形成することも可能である。例えば、フィルムを一時的に（例えば剥がせるように）接合するのには充分であるが層を溶融して永久的な接合を形成するには不充分な熱をフィルム層に加える（例えば加熱ローラの間に通す）ことにより、フィルム層を連結させることができる。このシール及び本明細書で検討される他のシールは、当技術分野において既知のように、剥がして再び使えるシール、壊れやすいシール、連結シール、使い捨てシール、圧力シール、又は他のシールとすればよい。
[00286] 使用時、貯蔵部１０００１の内容物１００５６及び１００５７を、サンプル溶解のためＩＳＰゾーン１０００５に移すことができる。貯蔵部１０００１の内容物１００５６及び１００５７は、ユーザによって貯蔵部１０００１を手作業で操作することによりＩＳＰゾーン１０００５に移すことができる。又は、器具は圧力適用デバイスを含むことができ、これによって、パウチ１００００を器具に挿入した後に貯蔵部１０００１の内容物１００５６及び１００５７を移すことも可能である。
[00287] 溶解及び核酸回収は、本明細書の他の箇所で前述したように（スワブ１００６０の存在下で）進めることができる。一実施形態において、溶解及び核酸回収は同時に進めることができる（すなわち、溶解粒子及び磁気ビーズを一緒にＩＳＰゾーン１０００５に導入できる）。別の実施形態において、試薬ブリスタ１００４５ａは磁気ビーズの「ピル」１００５５ａを含み、これを、溶解前、溶解中、又は溶解後に、チャネル１００７７ａを介してＩＳＰゾーン１０００５に投入することができる。磁気ビーズ１００５５ａのピルは、圧力によって形成するか又は溶ける材料で提供することができ、例えば剥がして再び使えるシール又は破裂可能な壊れやすいシール１００７６ａを開くことにより、流体貯蔵部１０００２ａからの流体１００５８ａで再水和することによって、ＩＳＰゾーン１０００５内に導入できる。更に別の実施形態では、磁気ビーズを貯蔵部１０００１に含ませ、ピル１００５５ａはプロテアーゼやヌクレアーゼ阻害剤のような別の溶解又は細胞調整試薬を含むことができる。他の組み合わせも想定されており、試薬ブリスタ１００４５ａ及び他のブリスタに提供される１又は複数の成分はピル以外の形態でブリスタに提供され得ることは理解されよう。
[00288] 本明細書の他の箇所で記載されるように、磁気ビーズは、関連付けられた器具内に提供された作動可能磁石によってＩＳＰゾーン１０００５から捕捉し回収することができる。洗浄及び溶出のため、磁気ビーズをブリスタ１０００６及び／又は１０００７に移送できる。試薬ブリスタ１００４５ｂ及び１００４５ｃに示されている洗浄試薬ピル１００５５ｂ及び１００５５ｃ（例えば、限定ではないがｐＨが約４～５であるクエン酸ナトリウム等の酸性緩衝剤成分）は、シール１００７６ｂを開くことで貯蔵部１０００２ｂからの流体１００５８ｂによって再水和することができ、この再水和した試薬を、チャネル１００７７ｂを介してブリスタ１０００６及び１０００７に導入することができる。パウチ１００００は、２回の洗浄に使用され得る試薬ピル１００５５ｂ及び１００５５ｃと共に図示されているが、パウチが１回のみの洗浄又は３回以上の洗浄のための試薬を含み得ることは認められよう。同様に、試薬ピル１００５５ｂ及び１００５５ｃは、１、２、３、又はそれ以上の洗浄ステップのために再水和して使用され得る。また、パウチ１００００は、試薬ブリスタ１００４５ｄ内に、磁気ビーズから核酸を溶出させるため使用できる溶出試薬ピル１００５５ｄも含む。一実施形態において、溶出試薬ピルは緩衝成分を含むことができ、再水和された場合にｐＨが約８～９である緩衝剤を生成する。別の実施形態において溶出試薬ピルは、ｐＨが約８～９である緩衝成分と、第１段階ＰＣＲ反応の１つ以上の成分（例えばｄＮＴＰ、Ｍｇ、ＢＳＡ等）を含み得る。例えば剥がして再び使えるシールを開くか又は壊れやすいシール１００７６ｃを破り、チャネル１００７７ｃを介して溶出試薬を導入することで、貯蔵部１０００２ｃ内の流体１００５８ｃによってピル１００５５ｄを再水和できる。本明細書の他の箇所で記載されるように、洗浄及び溶出のため、作動可能磁石を用いて磁気ビーズを捕捉することができる。
[00289] また、パウチ１００００は、第１段階ＰＣＲブリスタ１００１０と、第２段階ＰＣＲの前に第１段階ＰＣＲからの生成物の一部を測定するための体積希釈ウェル１００１５と、多数の個別反応ウェル１００８２を含む第２段階ＰＣＲアレイ１００８１と、を含む。第１段階ＰＣＲ用の試薬は、試薬ブリスタ１００４５ｅ内の試薬ピル１００５５ｅに含めることができる。試薬ピル１００５５ｅは、破裂可能シール１００７６ｄ及びチャネル１００７７ｄを介して貯蔵部１０００２ｄ内の流体１００５８ｄによって再水和することができる。体積ウェル１００１５はブリスタ１００２０及び１００２５に流体結合することができ、ここで、第２段階ＰＣＲ用の試薬が導入されて希釈ウェル１００１５の内容物と混合される。第２段階ＰＣＲ用の試薬は、試薬ブリスタ１００４５ｆ内の試薬ピル１００５５ｆに含めることができる。試薬ピル１００５５ｆは、破裂可能シール１００７６ｆ及びチャネル１００７７ｆを介して貯蔵部１０００２ｆ内の流体１００５８ｆによって再水和することができる。シール１００７５と同様、シール１００７６ａ～１００７６ｅは、例えば壊れやすいシール又は開放可能もしくは剥がして再び使えるシールとすることができ、例えば、フィルムの熱間圧延又は同様の処理によって、フィルムを溶融して永久的なシールを形成することなく接合することにより、チャネル１００７７ａ～１００７７ｅにおいてフィルムを連結させることで形成される。一例においては、ブリスタ１００２０と１００２５との間で体積ウェル１００１５の内容物と第２段階ＰＣＲ用の試薬を繰り返し混合することにより、第２段階のＰＣＲ用のサンプルを調製できる。いくつかの実施形態では、試薬ピル１００５５ａ～１００５５ｆの代わりに液体試薬をパウチ１００００に提供することができる。例えば流体ブリスタ１０００１及び１０００２ａ～１０００２ｅは、核酸回収、磁気ビーズ洗浄、溶出、第１段階ＰＣＲ、第２段階ＰＣＲ等のための液体試薬を含むことができ、すぐに使える液体試薬の代わりに試薬ピル１００５５ａ～１００５５ｆのいくつか又は全てを省略してもよい。
[00290] ブリスタ１０００５、１０００６、１０００７、１００１０、１００２０、及び１００２５、希釈ウェル１００１５、及び第２段階アレイ１００８１は、チャネル１００５０ａ～１００５０ｆによって流体接続することができる。パウチ１００００内での、入口チャネル１００７７ａ～１０７７ｅからブリスタ間チャネル１００５０ａ～１００５０ｆを介した流体移動は、例えば図２を参照して上述したように、チャネルに作用するシールを用いることで制御し方向付けることができる。ブリスタ間の流体移動は、例えば図２を参照して上述したように、ピストン等によって作動させることができる。
[00291] 一実施形態において、パウチ１００００は、パウチ１００００を形成するように密封された多数の材料層（同一材料の層、又は異なるタイプの材料の層）から製造することができる。他の材料も使用され得るが、パウチ１００００のフィルム層は例えば、図１に示されているパウチ５１０と同様の可撓性プラスチックフィルム又は他の可撓性材料から形成できる。例えばパウチ１００００は、限定ではないが、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、それらの組み合わせ、混合物、及び積層層のような材料から製造することができ、押し出し成形、プラズマ堆積、及び積層を含む当技術分野において既知の任意のプロセスによって作製できる。アレイ１００８１に同様の材料（例えばポリカーボネート）を使用してもよい。また、アルミニウム積層を用いた金属フォイル又はプラスチックを含む他の材料も使用できる。ブリスタ及びチャネルを形成するように密封できる他のバリア材料も当技術分野において既知である。プラスチックフィルムを用いる場合、これらの層は、例示的に熱シール又はレーザ溶接によって接合することができる。例示的に、材料は低い核酸結合能と低いタンパク結合能を有する。蛍光検出が用いられる場合、パウチの適切なエリアで（例えば第２段階のアレイの近傍において）光学的に透明な材料を使用することができる。
[00292] ここで図１１Ｃを参照すると、例示的な試薬ブリスタ１００４５の断面図が示されている。図示されている実施形態において、試薬ブリスタ１００４５は第１のフィルム材料層１００８０及び第２のフィルム材料層１００８５から製造されている。図示されている実施形態では、第１のフィルム層１００８０を成形して（例えば熱成形して）ブリスタ形状を形成することができる。第１のフィルム層１００８０及び第２のフィルム層１００８５は、１００９０で概略的に示されている溶接ライン（例えばレーザ溶接ライン）によって、ブリスタ周辺部の少なくとも一部で接合することができる。例えば図１１Ａ及び図１１Ｂに示されているように、試薬ブリスタ１００４５に対する流体流の出入りを可能とするため、溶接ライン１００９０は連続していない場合がある。
[00293] 試薬ピル１００５５は、パウチ１００００及び本明細書に記載されている方法において使用するのに適した化学物質や酵素等を含み得る。試薬ピル１００５５は、凍結乾燥のために化学物質や酵素等を安定化させるため、当技術分野において既知の添加物も含み得る。一実施形態において、ピル１００５５は、層１００８０に形成されたブリスタ１００８１に追加される前に急速冷凍又は凍結乾燥させることができる。例えば、凍結乾燥させた試薬ピルをホッパー等に配置し、自動化又は半自動化製造プロセスで、１００８１のような形成されたブリスタに追加することができる。本発明者等は、この場合、例えば図１１Ａ及び図１１Ｂに示されている貯蔵部１０００２ａ～１０００２ｅからの水性溶媒に暴露されると、そのような試薬ピルが容易に再水和することを見出した。図１１Ｃは試薬ピル１００５５を示すが、いくつかの実施形態では試薬を乾燥粉末として試薬ブリスタに分配してもよい。例えば試薬は、試薬ピルに形成し、凍結乾燥し、粉末にし、次いで粉末の形態で試薬ブリスタに分配することができる。代替的な実施形態では、何らかの試薬（例えば逆転写酵素及び、任意選択的に緩衝剤及び安定剤）を媒質（例えば濾紙）に適用し、空気乾燥し、細かく分割し、次いで、乾燥試薬を有する媒質片として試薬ブリスタに分配することができる。別の代替的な実施形態では、液体試薬（例えば液体試薬の液滴及び、任意選択的に緩衝剤や安定剤等）を、試薬ブリスタを形成するため使用されるフィルムに直接加え、次いで、試薬ブリスタの領域内又は領域周辺の所定位置で、あるいは直接に反応ブリスタ内で又は反応ブリスタ周辺で、空気乾燥させことができる。
[00294] 図７、図１１Ａ、及び図１１Ｂは、内蔵された水、溶解緩衝剤、又は他の液体試薬を含み得るパウチを示す。いくつかの実施形態では、製造時に水や溶解緩衝剤等をパウチのパウチフィルム層間に追加することができる。内蔵された水や溶解緩衝剤等によって、例えばパウチを使いやすくすることができる。すなわち、オペレータが必ずしも高度な訓練を受けた技術者である必要はなくなる。図１１Ａ及び図１１Ｂの例では、ユーザがやるべきことは、提供されているスワブを用いてサンプル（例えば血液、唾液、痰、又は環境サンプル）を収集し、サンプルの付いたスワブを提供されているサンプル調製チャンバ（すなわちＩＳＰゾーン１０００５）に戻し、任意選択的にスワブを折り、サンプル調製チャンバを密封し、パウチを器具内に配置することだけである。器具は、サンプルを調製し分析するために必要なステップの残り部分を実行するようプログラムできる。このステップの残り部分は、限定ではないが、サンプル及び試薬の水和、サンプル調製、核酸回収、第１段階ＰＣＲ、及び第２段階ＰＣＲを含む。水や溶解緩衝剤等はパウチのパウチフィルム層間に加えることができるが、図１２Ａから図１２Ｄは、様々なパウチ実施形態に内蔵の水及び緩衝剤を配置するいくつかの他の可能性を示している。
[00295] 図１２Ａ及び図１２Ｂは、一実施形態において、図１１Ａ及び図１１Ｂに示されている貯蔵部１０００１と同様の貯蔵部１０００１ａに配置することができる水性溶媒パケット１２０００の実施形態の図を示す。水性溶媒パケット１２０００は、例えば精製水や緩衝剤等を充填することができ、貯蔵部１０００１ａに取り付けるように製造できる。一実施形態において、水性溶媒パケット１２０００は、水性溶媒パケット１２０００の一部の周りで二重に密封し（１２００２）、別の部分の周りで単一の密封を行うことができる（１２００４）。そのような実施形態では、水性溶媒パケット１２０００を外周全体にわたって密封することで水性溶媒パケット１２０００の内容物の完全性及び予め選択された体積を維持しながら、単一密封部１２００４が容易に破裂可能な部分を提供するので、パケットの内容物をパウチ内へ投入することができる。一実施形態において、水性溶媒パケット１２０００は、パケットの内容物を投入するため加えられた圧力が破裂可能シール部に集中するような形状とすることができる。例えば図示されている実施形態では、パケット１２０００は破裂可能シール部１２００４の方に向かって幅が狭くなるので、二重密封部分１２００２でなく部分１２００４において破裂し、加えられた圧力が緩和する傾向がある。図１２Ａは、選択的に破裂可能なシールを有する水性溶媒パケットに可能である１つの設計を示す。他の破裂可能シールも可能であり、本開示の範囲内である。
[00296] 図１２Ｂは、貯蔵部１０００１ａ及び水性溶媒パケット１２０００の断面図を示す。水性溶媒パケット１２０００は、第１の材料層１２０１０及び第２の材料層１２０１２から製造することができる。一実施形態において、第１及び／又は第２の材料層１２０１０及び１２０１２は、限定ではないが、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、それらの組み合わせ、混合物、及び積層層のような材料から製造できる。別の実施形態では、第１及び／又は第２の材料層１２０１０及び１２０１２は、限定ではないが、アルミニウムフォイル、プラスチック／金属フィルム、及び金属化プラスチックフィルム（例えばアルミめっきマイラー）等の金属フォイル材料から製造できる。そのような金属フォイル（例えばアルミニウムフォイル）は、真空下での長期（例えば最長で１年又は２年）にわたる保管のため、水性溶媒パケット１２０００の内容物１２０１４（例えば緩衝剤や水等）を保存することができる。従って、水性溶媒パケットは製造時にパウチの適切な部分に配置され、その後パウチを真空下で出荷及び保管することができる。
[00297] 一実施形態において、水性溶媒パケット１２０００は、パウチとは別個に製造された水性溶媒のパケットとすることができ、例えばパウチ１００００の貯蔵部１０００１等のような、パウチ内に形成されている選択されたポケットにぴったり収まるような大きさ及び形状である。別の実施形態において、水性溶媒パケット１２０００はパウチと同時に製造され、パウチを製造するため使用される材料層に形成されてこれらの材料層の間に密封することができる。図１２Ｂに示されているように、例えば貯蔵部１０００１ａは層１２００６及び１２００８から製造され、水性溶媒パケット１２０００は、１２０１６に示された領域において層１２００６及び１２００８に接合する（例えば熱シール又はレーザ溶接）ことができる。水性溶媒パケット１２０００を別個に製造及び充填し、次いで貯蔵部の製造中にパウチに取り付けて密封できるので、製造を容易にすることができる。同様に、パウチ層の間に水性溶媒パケット１２０００を密封することで、圧力を加えた場合にパケットから放出される流体流の誘導を促進することができる。
[00298] 図１２Ｃ及び図１２Ｄは、貯蔵部１０００１ｂのための別の水性溶媒パケットを示す。図１２Ｃの水性溶媒パケット１２０２０は図１２Ａの水性溶媒パケット１２０００と同様である。水性溶媒パケット１２０２０は、水や緩衝剤等を収容するフォイル又はプラスチックフィルムの容器とすることができ、例えば外圧に応じて適切な時点でパウチ内へ内容物を投入するように構成できる。水性溶媒パケット１２０２０は、パケット１２０２０の外周部の周りで二重に密封して（１２０２２）、パケット１２０２０の内容物を保護することができる。水性溶媒パケット１２０２０は、パケット１２０２０からの流体の自由な流れを防止するため開放可能シール（図示せず）を設けることができる。流体を放出するため、水性溶媒パケット１２０２０には出口チューブ１２０２４が設けられており、これを、例えば１２０２８で示されるパウチチャネルに接続できる。一例においてパウチチャネル１２０２８は、図１１Ａ及び図１１Ｂに示されているチャネル１００７７ａ～１００７７ｅのうち１つと同様とすることができる。流体が貯蔵部（例えば貯蔵部１０００１）内へ逆流することを防ぐため、また、流体がチャネル１２０２８に流入することを保証するため、１２０２６の領域に示されているように出口チューブ１２０２４をパウチ材料に密封する（例えば熱シール又はレーザ溶接）ことができる。
[00299] 図１２Ｄは、容易に破裂可能な薄い材料層１２０３４及び厚い材料層１２０３６から製造されている水性溶媒パケット１２０３０を示す。圧力に応じて層１２０３４が破裂すると、流体１２０３８が放出される。一例において、層１２０３４は薄いフォイル層であり、層１２０３６は厚いフォイル層である。層１２０３４は破裂可能であるので、層１２０３４及び１２０３６は例えば、パケット１２０３０の外周全体にわたって単一密封又は二重密封する（１２０３２）ことができる。これは、図１２Ａが１２００４において単一密封部を含み、ここで好ましくはパケット１２０００が破裂して流体を放出するのとは異なっている。
[00300] ここで図１３を参照すると、図１１Ａから図１１Ｂのサンプル調製チャンバ１０００５ａと同様の、サンプル調製チャンバ１０００５ａの一実施形態の断面図が示されている。サンプル調製チャンバ１０００５ａの図示されている実施形態は、１３０１０で接合されてサンプル調製チャンバ１０００５ａの背面を形成する第１及び第２のフィルム層１３００８及び１３０１２、並びに、１３０１８で接合されてサンプル調製チャンバ１０００５ａの前面を形成する第３及び第４のフィルム層１３０１４及び１３０１６から製造されている。サンプル調製チャンバ１０００５ａに溶解緩衝剤を充填すると共に溶解物を回収するため使用できる充填チャネル１３００６及び充填孔１３００７が、層１３０１２に形成されて、チャネル１３００６をチャンバ１０００５ａに接続している。サンプル調製チャンバ１０００５ａを密封するためにシールを提供できる領域が１３０２０に示されている。
[00301] サンプル調製チャンバ１０００５ａを用いるための方法は、図１１Ａ及び図１１Ｂを参照して記載した。図１３において、サンプル調製チャンバ１０００５ａは任意選択的なフィルタ１３００４を含む。使用時、溶解緩衝剤はチャネル１３００６を介してサンプル調製チャンバ１０００５ａ内に導入されて、スワブ１００６０及び吸収スワブ端部１００７０ａのサンプルを水和することができる。図１３に示されている実施形態では、サンプル調製チャンバ１０００５ａ内のピル１３００２に、サンプル調製媒質（例えば溶解粒子及び／又はシリカでコーティングされた磁気ビーズ）が配置されている。溶解緩衝剤がサンプル調製チャンバ１０００５ａ内に導入された場合、緩衝剤は水和し、サンプルを分散させ、サンプル調製媒質を分散させる。サンプル調製は例えば、ビーズビーターモータ又は本明細書の他の箇所で詳しく記載される他の方法によってサンプル調製チャンバ１０００５ａを叩くことで実行できる。溶解の後、サンプル調製チャンバ１０００５ａからフィルタ１３００４及びチャネル１３００６を介して溶解物を放出することができる。
[00302] 一実施形態において、フィルタ１３００４は、溶解粒子がフィルタを通り抜けて流れることはできないが磁気ビーズはこれを容易に貫通できるような大きさである。例えば、本明細書に記載される実施形態で典型的に使用される溶解粒子は約１００～２００μｍの大きさを有し、本明細書に記載される実施形態で使用される磁気ビーズは約１～５μｍの大きさを有し得る。従って一実施形態では、磁気ビーズを溶解混合物に含ませ、溶解後に溶解物と磁気ビーズをサンプル調製チャンバ１０００５ａから放出させると共に、これより大きい溶解粒子は残しておくことができる。他の実施形態では、溶解はケイ酸ジルコニウムビーズを用いて本明細書の他の箇所で記載されるように実行され、ビーズ破砕の後、溶解物はフィルタ１３００４を介してサンプル調製チャンバ１０００５ａから放出させると共に溶解粒子は残しておくことができる。本明細書の他の箇所で記載されるように、下流に導入された磁気ビーズを用いて核酸回収を実行できる。
[00303] ここで図１４Ａを参照すると、第２段階ＰＣＲアレイ１４０８１の代替的な実施形態が示されている。図１４Ａはパウチの一部分のみを示し、図１４Ａに示されている特徴部は本明細書に記載される様々な例示的なパウチに組み込まれ得ることは理解されよう。第２段階ＰＣＲアレイ１４０８１は、第２段階反応ウェル１４０８２の「ｎ」個の列１４００４ａ、１４００４ｂ、１４００４ｃ、．．．１４００４（ｎ）を含み、これらはそれぞれ充填チャネル１４００５ａ、１４００５ｂ、１４００５ｃ、．．．１４００５（ｎ）に流体接続されている。第２段階ＰＣＲアレイ１４０８１は、第１段階ＰＣＲ反応ゾーン１４０１０、希釈ウェル１４０１５、並びに第２段階反応混合ブリスタ１４０２０及び１４０２５に流体接続されている。第２段階ＰＣＲアレイ１４０８１、希釈ウェル１４０１５、並びに第２段階反応混合ブリスタ１４０２０及び１４０２５は、充填チャネル１４００２に流体接続されている。充填チャネル１４００２は一実施形態において、ウェルの列１４００４ａ、１４００４ｂ、１４００４ｃ、．．．１４００４（ｎ）を一度に１つずつ充填させるよう選択的に開放及び閉鎖することができる。ブリスタ１４０２５と充填チャネル１４００２との間にシール１４００８を配置し、各アレイ充填チャネル１４００５ａ、１４００５ｂ、１４００５ｃ、．．．１４００５（ｎ）と交差するようにシール１４００６ａ、１４００６ｂ、１４００６ｃ、．．．１４００６（ｎ）を位置決めし、及び／又は充填チャネル１４００２と交差するようにシール１４００７ａ、１４００７ｂ、．．．１４００７（ｎ）を配置することで、第２段階反応ウェル１４０８２の各列の充填を制御できる。シールは格納式シールとするか、又はヒートシールとするか、又は格納式シールとヒートシールの組み合わせ、又は当技術分野において既知の他のシールとすればよい。同様に、シールは手作業で適用するか、又は器具に適用することができる。
[00304] 一実施形態では、充填チャネル１４００５ａに接続されたウェル１４０８２にブリスタ１４０１０からの流体を充填する（希釈ウェル１４０１５並びに混合ブリスタ１４０２０及び１４０２５を用いるか、又はブリスタ１４０１０から流体を直接用いる）には、シール１４００８を格納し、シール１４００７ａを所定位置に保持し、ブリスタ１４０１０から流体チャネル１４００２内へ流体サンプルを移動させればよい。充填チャネル１４００５ａに接続されたウェル１４０８２を充填した後、シール１４００６ａを配置すればよい。充填チャネル１４００５ｂに接続されたウェル１４０８２を充填するには、シール１４００７ａを開放し、シール１４００７ｂ及び１４００６ａを所定位置に保持し、ブリスタ１４０１０から流体チャネル１４００２内へ流体サンプルを移動させればよい。充填チャネル１４００５ｂに接続されたウェル１４０８２を充填した後、シール１４００６ｂを閉鎖すればよい。充填チャネル１４００５ｃに接続されたウェル１４０８２を充填するには、シール１４００６ｃを開放し、シール１４００７（ｎ）、１４００６ａ、及び１４００６ｂを所定位置に保持し、ブリスタ１４０１０から流体チャネル１４００２内へ流体サンプルを移動させればよい。充填チャネル１４００５ｃに接続されたウェル１４０８２を充填した後、シール１４００６ｃを閉鎖すればよい。充填チャネル１４００５（ｎ）に接続されたウェル１４０８２を充填するには、シール１４００６（ｎ）及びシール１４００７ａ～１４００７（ｎ）を開放し、シール１４００６ａ～１４００６ｃを所定位置に保持し、ブリスタ１４０１０から流体チャネル１４００２内へ流体サンプルを移動させればよい。充填チャネル１４００５ｃに接続されたウェル１４０８２を充填した後、シール１４００６（ｎ）を閉鎖すればよい。
[00305] 別の実施形態では、アレイ充填チャネル１４００５ａ、１４００５ｂ、１４００５ｃ、．．．１４００５（ｎ）に接続されたウェル１４０８２を、前述の例とは逆の順序で充填することができる。充填チャネル１４００５（ｎ）に接続されたウェル１４０８２を充填するには、シール１４００６ａ～１４００６ｃを所定位置に保持し、シール１４００６（ｎ）を開放して、ブリスタ１４０１０から流体チャネル１４００２内へ流体サンプルを移動させればよい。充填チャネル１４００５（ｎ）に接続されたウェル１４０８２を充填した後、シール１４００６（ｎ）を閉鎖すればよい。充填チャネル１４００５（ｃ）に接続されたウェル１４０８２を充填するには、シール１４００６ａ、１４００６ｂ、及び１４００６（ｎ）を所定位置に保持し、シール１４００６（ｃ）を開放して、ブリスタ１４０１０から流体チャネル１４００２内へ流体サンプルを移動させればよい。充填チャネル１４００５（ｃ）に接続されたウェル１４０８２を充填した後、シール１４００６（ｃ）を閉鎖すればよい。充填チャネル１４００５（ｂ）に接続されたウェル１４０８２を充填するには、シール１４００６ａ、１４００６ｃ、及び１４００６（ｎ）を所定位置に保持し、シール１４００６（ｂ）を開放して、ブリスタ１４０１０から流体チャネル１４００２内へ流体サンプルを移動させればよい。充填チャネル１４００５（ｂ）に接続されたウェル１４０８２を充填した後、シール１４００６（ｂ）を閉鎖すればよい。次いで、充填チャネル１４００５（ａ）に接続されたウェル１４０８２を充填するには、シール１４００６ｂ、１４００６ｃ、及び１４００６（ｎ）を所定位置に保持し、シール１４００６（ａ）を開放して、ブリスタ１４０１０から流体チャネル１４００２内に流体サンプルを移動させればよい。充填チャネル１４００５（ａ）に接続されたウェル１４０８２を充填した後、シール１４００６（ａ）を閉鎖すればよい。これらの例では、充填チャネル１４００５ａ、１４００５ｂ、１４００５ｃ、．．．１４００５（ｎ）に接続されたウェル１４０８２は、順位（ａ、ｂ、ｃ、．．．（ｎ）、又は（ｎ）．．．ｃ、ｂ、ａ）で充填されるが、これらの例で記載されているように選択したシールを開放及び閉鎖することによって他の充填順序を使用できることは認められよう。
[00306] 一実施形態において、列１４００４ａ～１４００４（ｎ）における第２段階反応ウェル１４０８２の内容物は相互に実質的に同一である（すなわち、対応するウェル内の第２段階プライマーは同一である）。このため、例えば、第１段階ＰＣＲの選択された数のサイクル（例えば１０サイクル）の後、列１４００４ａにおいて第２段階ＰＣＲを開始し、第１段階ＰＣＲの選択された追加の数のサイクル（例えば合計で１５サイクル）の後、列１４００４ｂを充填して列１４００４ｂにおいて第２段階ＰＣＲを開始し、第１段階ＰＣＲの選択された更に追加の数のサイクル（例えば合計で２０サイクル）の後、列１４００４ｃを充填して列１４００４ｃにおいて第２段階ＰＣＲを開始することができる等である。複数の連続した第２段階ＰＣＲ反応を、反応におけるテンプレート分子数に寄与する第１段階ＰＣＲ反応サイクル数によって区切るので、平行反応においてクロッシングポイント（Ｃｐ）又は飽和に達するのに必要な第２段階ＰＣＲ反応サイクル数を用いて、例えば、オリジナルのサンプル内の微生物の相対濃度又は溶解物から回収されたオリジナルのテンプレートの濃度を逆算することができる。
[00307] 別の実施形態では、列１４００４ａ～１４００４（ｎ）における第２段階反応ウェル１４０８２の内容物は同一でない場合がある。列１４００４ａのウェルでは、開始サンプルに最も高い力価で存在することが予想されると共に予想外の陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のリスクが最も高い微生物からの標的核酸配列を増幅するため、例えば列１４００４ａの第２段階ウェルの各々に異なるプライマー対を提供することができ、列１４００４ｂのウェルでは、高い力価で存在すると共に予想外の陽性のリスクが中程度である微生物からの標的核酸配列を増幅するため、例えば列１４００４ｂの第２段階ウェルの各々に異なるプライマー対を提供することができ、列１４００４ｃのウェルでは、低い力価で存在すると共に予想外の陽性のリスクが低い微生物からの標的核酸配列を増幅するため、例えば列１４００４ｃの第２段階ウェルの各々に異なるプライマー対を提供することができる。「ｎ」までの追加の列においても、異なる特徴及び異なる力価を有するサンプル内の異なる微生物セットを同定するためのプライマー対をウェル内に提供できる。この実施形態では、列１４００４ａ～１４００４（ｎ）のウェルを実質的に同時に第２段階ＰＣＲのため充填し、熱サイクルすることができる。第２段階ＰＣＲの異なる数のサイクルの後、列１４００４ａ～１４００４（ｎ）のセット内の微生物検出のための融解を実行できる。例えば、第２段階ＰＣＲの２０サイクルの後、１４００４ａのセット内の微生物からの核酸増幅を検出する融解を実行し、第２段階ＰＣＲの２６サイクルの後、１４００４ｂのセット内の微生物からの核酸増幅を検出する融解を実行し、第２段階ＰＣＲの３２サイクルの後、１４００４ｃのセット内の微生物からの核酸増幅を検出する融解を実行することができる等である。更に検討するには、例えば援用により本願に含まれる米国特許公報第２０１５／０２３２９１６号を参照のこと。第２段階アレイのこのような構成は、適宜、本明細書に記載されるパウチの任意のものと共に使用できることは理解されよう。
[00308] 図１４Ｂは、アッセイデバイスにおいて使用できるアレイカード１４１００の別の実施形態を示す。アレイカード１４１００は、図１４Ａに示されているアッセイ装置１４０００におけるアレイの特徴部の多くを有する。アレイカード１４１００は、スタンドアロンのアレイとして使用されるか、又は本明細書に記載され図示されている様々な例示的なパウチに第２段階アレイとして組み込むことができる。アレイカード１４１００はＰＣＲ分析のためアッセイパウチにおいて使用することができ、その例は図１４Ａを参照してすでに検討した。又は、アレイカードを他のアッセイに使用することも可能である。アレイカード１４１００を使用できる用途の一例については図１４Ｃを参照して後述する。
[00309] アレイカード１４１００は、それぞれウェル１４１８２ａ～１４１８２ｅを含む別々に充填可能な５列のウェル１４１０４ａ～１４１０４ｅを含む。しかしながら、５列のウェルは単なる例示であり、アレイカードはこれよりも多数又は少数の別個のウェル列を含み得ることは認められよう。列内のウェルは、本明細書において他の実施形態で記載されているように１つ以上の流体貯蔵部（例えば第１段階増幅ゾーン）に接続できる充填チャネル１４１０２ａ～１４１０２ｅを介してアクセス可能であり、更に、列１４１０４ａ～１４１０４ｅにグループ化されたウェルを各充填チャネルに流体接続する流体ビア１４１０３ａ～１４１０３ｅを介してアクセス可能である。具体的には、流体ビア１４１０３ａ～１４１０３ｅは、流体チャネル１４１１４ａ～１４１１４ｅ及びウェル充填チャネル１４１１５ａ～１４１１５ｅを介してウェル１４１８２ａ～１４１８２ｅに流体接続されている。例えば、充填チャネル１４１０２ａに流入する流体は、流体ビア１４１０３ａ、流体チャネル１４１１ａ、ウェル充填チャネル１４１１５ａ、及びウェル１４１８２ａを含む相互接続された流体システムを介して、列１４１０４ａのウェル１４１８２ａを充填することができる。行１４１０４ｂ～１４１０４ｅのウェル１４１８２ｂ～１４１８２ｅも同様に充填できる。
[00310] 図１０Ａ及び図１０Ｂを参照して検討したように、本明細書に記載されているアッセイ装置のいくつかの実施形態は、アレイの１つ以上のウェルにインサイチュで真空を与えることができる真空システムを含む。アレイカード１４１００はそのような真空システムを含む。真空システムは、真空ポート１４１１０、真空チャネル１４１１２、及び真空チャネル１４１１３ａ～１４１１３ｅを含む。真空チャネル１４１１３ａ～１４１１３ｅは、流体チャネル１４１１４ａ～１４１１４ｅ及びウェル充填チャネル１４１１５ａ～１４１１５ｅを介してアレイウェル１４１８２ａ～１４１８２ｅに流体接続されている。アレイカード１４１００は、アッセイパウチに含まれる場合、アレイの上面及び下面を密封する２つ以上のプラスチックフィルム層の間で密封することができる。従って、真空ポート１４１１０が（例えばポートを覆うフィルムに穿孔することで）開放され、ポートに真空が加えられた場合、真空はアレイ１４１００の流体接続されたウェルの全てを部分的に排気することができる。チャネル１４１１３ａ～１４１１３ｅ上で領域１４１２０に適用されたシール（例えば熱シール）は、真空ポート１４１１０及び真空チャネル１４１１２からの経路（channel）の全てを同時に密封し、これらの経路の全てを相互に密封するので、例えば列１４１４ａに流入する流体は真空チャネルを介して他の列にアクセスできないようになっている。アッセイパウチのアレイ又は別の部分に真空をインサイチュで与えることについての更に詳しい検討は、援用により全体が本願に含まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／３４１９４号に述べられている。
[00311] 一実施形態において、図１４Ｂのアレイ１４１００は、図１４Ａに示されている１４０００のようなパウチに組み込むか、又はアレイ１４１００は、限定ではないが、図１、図５Ａ、図７、図１１Ａ及び図１１Ｂ、図１７Ａから図１７Ｃ、又は図２１Ａのパウチのような、本明細書に示されている別のパウチに一体化することができる。図１４Ｃは、どのようにアレイカード１４１００をアッセイ物品（assay article）１４２００に組み込めるかを示す一実施形態を概略的に表す。簡略化のため、図１４Ｃはアレイカード１４１００の詳細の多くを示していない。アッセイ物品１４２００は、アッセイを実行するために使用できる一連の流体ブリスタ１４２１０ａ～１４２１０ｅに流体接続されたアレイカード１４１００を示す。例えば流体ブリスタ１４２１０ａ～１４２１０ｅは、一連の連続希釈（ブリスタ１４２１０ａ～１４２１０ｄ）及び標準１４１２０ｅによってアッセイを実行するために使用できる。流体ブリスタ１４１２０ａは、このブリスタ１４２１０ａ内へ流体サンプルを注入できるサンプル入口ポイント１４２１２を含む。ブリスタ１４２１０ａは、一連の流体チャネル１４２１２ａ～１４２１２ｃによってブリスタ１４２１０ｂ～１４２１０ｄに接続されている。チャネル１４２１２ａ～１４２１２ｃに出入りする流体流は、シール１４２１４ａ～１４２１４ｃ及び１４２５１ａ～１４２１５ｃによって制御できる。シールは格納式シールとするか、又はヒートシールとするか、又は格納式シールとヒートシールの組み合わせ、又は当技術分野において既知の他のシールとすればよい。同様に、シールは手作業で適用するか、又は自動的に器具内部に適用することができる。
[00312] 一実施形態において、例えばチャネル１４２１２を介してブリスタ１４２１０ａにサンプルが投入され、ブリスタ１４２１０ａに投入されたこのサンプルの一連の希釈を実行するため、流体ブリスタ１４２１０ｂ～１４２１０ｄに選択された体積の流体を与えることができる。一実施形態において、流体チャネル１４２１２ａ～１４２１２ｃは、図１４Ａに示されているウェル１４１０５と同様の体積希釈ウェルを含むことができ、あるいは別の実施形態において、チャネル１４２１４ａ～１４２１４ｃは、選択された体積の流体を受容するような大きさ及び寸法とすることができる。例えば、ブリスタ１４２１０ａからのサンプルをチャネル１４２１２ａ内に（希釈ウェル内に又はチャネル自体内に）与えるには、シール１４２１４ａを開放し、ある体積の流体をチャネル１４１２１ａに投入し、シール１４２１４ａを閉鎖してシール１４２１５ａを開放し、チャネルの内容物をブリスタ１４２１０ｂ内の流体と混合すればよい。このようなシーケンスを１４２１０ｃ及び１４２１０ｄについて繰り返して、ブリスタ１４２１０ａ内のオリジナルのサンプルの一連の希釈を実行することができる（例えば０．１倍、０．０１倍、及び０．００１倍の希釈シリーズ）。１つの任意選択的な実施形態では、ブリスタ１４２１０ａ～１４２１０ｄ内のサンプルの基準を与えるため、流体ブリスタ１４２１０ｅを既知の標準溶液で予め充填することができる。
[00313] ブリスタ内の流体をウェル列１４１０４ａ～１４１０４ｅに投入するには、流体をブリスタ１４２１０ａ～１４２１０ｅから各充填チャネル１４１０２ａ～１４１０２ｅを介してウェル１４１８２ａ～１４１８２ｅ内へ移動させればよい。一実施形態では、ウェル１４１８２ａ～１４１８２ｅに、選択されたアッセイを実行するための試薬（例えば乾燥試薬）を提供することができる。一実施形態では、ウェル１４１８２ａ～１４１８２ｅに、ＰＣＲベースのアッセイを実行するための成分を提供できる。別の実施形態では、ウェル１４１８２ａ～１４１８２ｅに、多種多様な化学又は生物学ベースのアッセイのいずれかを実行するための試薬及び反応成分を提供できる。例えばウェル１４１８２ａ～１４１８２ｅには、当業者に既知のように、比濁又は発色エンドトキシンアッセイを実行するための１つ以上の乾燥試薬を提供できる。一実施形態では、ウェル１４１８２ａ～１４１８２ｅに同一の試薬及び／又は成分を提供するか、又は、アッセイの１つ以上の試薬もしくは成分の一連の希釈物を提供することができる。
[00314] ここで図１５Ａから図１５Ｃを参照すると、本明細書に記載されているパウチにおいてブリスタ間で流体を移動させるための「スポンジポンプ（ｓｐｏｎｇｅ ｐｕｍｐ）」が示されている。図１５Ａに示されているのは、例示的なパウチ１５０００の１対のブリスタ１５００２及び１５００４である。チャネル１５００３がブリスタ１５００２及び１５００４を接続している。チャネル１５００３は吸収部材１５００６（例えばスポンジ又は別の吸収媒質）を有し、これを用いて、１５００８及び１５０１０に示されているような流体体積を一方から他方のブリスタへ移動させることができる。図１５Ａはパウチの一部分のみを示しており、図１５Ａに示されている特徴部は本明細書における様々な例示のパウチ又は他の実施形態に組み込めることは理解されよう。
[00315] 図１５Ｂ及び図１５Ｃに示されているように、吸収部材１５００６ａはフィルム層１５０１２及び１５０１４に接合できる。図１５Ｂに示されているように、吸収部材１５００６ａは膨張して流体を吸収し、次いで図１５Ｃに見られるように圧縮して流体を放出することができる。チャネル１５００３の端部１５００５ａ及び１５００５ｂを（例えば器具内のシールを用いて）閉鎖することで、吸収部材によって移動させる流体に方向性を与えることができる。例えば図示されている実施形態では、チャネルの端部１５００５ａを開放すると共に端部１５００５ｂを閉鎖して、ブリスタ１５００２から流体１５００８を引き入れ、更に端部１５００５ａを閉鎖すると共に端部１５００５ｂを開放して、ブリスタ１５００４内のボリューム１５０１０に流体を移動させることができる。更に、吸収部材１５００６は予想可能な体積の流体を吸収及び放出するので、図１５Ａから図１５Ｃに示されているシステムを用いて、選択された体積の流体を本明細書に記載されているパウチ内で移動させることが可能である。例えば「スポンジポンプ」は、第１及び第２段階のＰＣＲ間で希釈を実行するために使用するか、又は本明細書の他の箇所で記載されるように、磁気ビーズの洗浄及び磁気ビーズからの核酸の溶出のため所定の体積の流体を分配するために使用できる。更に、乾燥試薬ピル（例えば図１１Ｃを参照のこと）の代わりに、試薬（例えば緩衝剤やポリメラーゼ等）を吸収材料１５００６内で乾燥させてもよい。吸収材料１５００６は予想可能かつ既知の体積の液体を吸収及び放出できるので、所定の体積の液体で試薬を再水和するために吸収材料１５００６を使用することができる。
[00316] 図１６は、閉鎖化学カードにおけるサンプル調製及びＰＣＲのために使用できるパウチ１６０００の別の実施形態を示す。パウチ１６０００のレイアウトは、本明細書に記載されている他のパウチ及び化学カードとは異なるが、パウチ１６０００は、異なるプロセスを実行できる異なるブリスタエリアを含むという点で同様である。
[00317] 例示的に、パウチ１６０００は、外側壁１６０２０及び内側壁１６０２２によって画定された１対のネスト化リングを含む。例示的に、外側壁１６０２０及び内側１６０２２はレーザ溶接ラインによって画定できる。外側壁１６０２０と内側１６０２２との間の空間に多数のブリスタ、チャネル、及び空間が画定されており、これらは、パウチ１６０００と共に動作するよう構成された器具と連携して作業空間として使用できる。例示的に、ブリスタ１６００５はサンプル調製ブリスタであり、上流ブリスタ１６０３６は、サンプルをパウチ１６０００内に導入するために及び／又は廃棄物レセプタクルとして使用され、チャネル１６０２６は、限定ではないが核酸回収、洗浄、及び溶出を含む別のサンプル調製のためのゾーンであり、ブリスタ１６０１０は第１段階ＰＣＲのために使用され得る。更に、ブリスタ１６０２８は、試薬（例えば逆転写酵素やポリメラーゼ等）を第１段階ＰＣＲブリスタ１６０１０に導入するために使用され、希釈ウェル１６０１５を含み得るチャネル１６０３１は、第１段階ＰＣＲの生成物を下流の第２段階ＰＣＲアレイ（図示せず）に移送するために使用され得る。パウチ１６０００は例示的に、パウチ１６０００のブリスタ及びチャネルに試薬を送出するよう位置決めされている、外側壁１６０２０の外部に配置された試薬ブリスタ１６０４５ａ～１６０４５ｄも含む。パウチ１６０００は４つの試薬ブリスタを含むが、これは単なる例示であり、他の実施形態はこれよりも多数又は少数の試薬ブリスタを含み得る。サンプル調製や第１段階ＰＣＲ等のためのこれらのブリスタ、ゾーン、及びチャネルの使用については、以下で更に詳しく説明する。
[00318] 図１６は、サンプル調製及び流体移動のような機能を達成するためパウチ１６０００に対して作用することができる器具１６１００の要素も概略的に示す。要素１６１０２はパウチ１６０００の内壁１６０２２と同心の器具内壁であり、１６１０８はパウチ１６０００の外側壁１６０２０と同心の器具外壁である。器具内壁１６１０２は開口１６１０４を含み、これは、内側壁１６０２２の開口（例えば開口１６０２４、１６０３０、及び１６０３２）と位置合わせされて、第１段階ＰＣＲブリスタ１６０１０に出入りする流路を生成するように開放できる。同様に、内壁１６１０２は、内側壁１６０２２の開口（例えば開口１６０２４、１６０３０、及び１６０３２）を覆うように位置合わせされて、流路を遮断することも可能である。同様に、器具外壁１６１０８は開口１６１０５を含み、これは、例えば試薬ブリスタ１６０４５ａ～１６０４５ｄとサンプル調製チャネル１６０２６との間の開口と位置合わせすることができる。
[00319] 器具１６１００は第１のワイパ１６１０６及び第２のワイパ１６１０７も含み、これらを用いて、パウチ１６０００内の空間から空間へ流体を押しやると共に、パウチ１６０００内の様々な作業空間を画定することができる。１つの説明のための実施形態において、ワイパ１６１０６は、サンプル調製チャネル１６０２６への入口でサンプル調製ブリスタ１６００５を閉鎖するよう位置決めすることができ、ワイパ１６１０７は、ブリスタ１６０３６からサンプル調製ブリスタ１６０６０内へサンプルを「押し込む（ｓｑｕｅｅｇｅｅ）」ことができる。本明細書に記載されている他のサンプル調製ブリスタと同様、サンプル調製ブリスタ１６０６０は溶解粒子を含み、例えばサンプル調製ブリスタ１６０６０をビーズビーター又はパドルビーター装置に接触させることによって細胞溶解を達成することができる。細胞溶解の後、ワイパ１６１０６を上流に移動させることで試薬ブリスタ１６０４５ａ～１６０４５のうち１つに隣接した作業空間を画定し、ワイパ１６１０７を用いて流体を適切な作業空間に移動させることができる。例示的に、試薬ブリスタ１６０４５ａは核酸回収のための磁気ビーズを含み、試薬ブリスタ１６０４５ｂ及び１６０４５ｃは磁気ビーズを洗浄するための試薬を含み、試薬ブリスタ１６０４５ｄは磁気ビーズから核酸を溶出するための試薬を含むことができる。
[00320] 試薬ブリスタ１６０４５ｂの近傍に、ワイパ１６１０６及び１６１０７を用いて作業空間を画定することが概略的に示されている。すなわち、ワイパ１６１０６及び１６１０７は、試薬ブリスタ１６０４５ｂの近傍に流体、試薬、及び材料を収容できる作業空間１６０６０を画定するためサンプル調製チャネル１６０２６の領域を限定するよう位置決めされている。図示されているように、ワイパ１６１０６及び１６１０７は、試薬ブリスタ１６０４５ｂと作業空間１６０６０との間にチャネル１６１０５も画定する。例示的に、器具１６１００は、試薬ブリスタを圧縮して試薬を作業空間１６０６０内に放出することができるデバイス１６１１０を含む。ワイパ１６１０６及び１６１０７の移動について前述したが、ワイパ１６１０６及び１６１０７のうち１つ以上を固定すると共に、パウチ１６０００を回転させて作業空間を画定し、領域から領域へと流体を押しやる等も可能であることは認められよう。従って、ワイパ１６１０６及び１６１０７は選択リング１６１１１の各部分を形成し、選択リング１６１１１の回転によって材料をパウチ１６０００内の様々な領域へ、例示的にチャネル１６０３４を介して移動させることができる。このため、パウチの他のレイアウトに比べて、チャネル及びコンプレッサの数を減らすことができる。
[00321] 例示的に、核酸の溶出の後、開口１６１０４を開口１６０２４と位置合わせして、サンプル調製チャネル１６０２６から第１段階ＰＣＲブリスタ１６０１０内への流路を生成できる。第１段階ＰＣＲ用の試薬は、例示的にブリスタ１６０１０内に収容するか、又はコンパートメント１６０２８内に収容するか、又はいくつかの試薬を双方に収容することができる。サンプル調製チャネル１６０２６からブリスタ１６０１０及び１６０２８内へ流体を導入することで、第１段階ＰＣＲ用の試薬を水和させることができる。第１段階ＰＣＲは、本明細書の他の箇所で、例示的に図２５、図２６、図２７Ａから図２７Ｄ、及び図２８Ａから図２８Ｂで示されるように、ワイパ及び２つの温度ゾーンを有するヒータを備えたブリスタ１６０１０において実行できる。同様に第１段階ＰＣＲは、ブリスタ１６０１０において、変性温度、アニーリング温度、及び延伸温度の間でサイクルする従来の熱サイクリングヒータ／クーラデバイスを用いて実行できる。第１段階ＰＣＲの後、反応の生成物の少なくとも一部を、開口１６０３２を介してチャネル１６０３１へ放出することができる。生成物の一部をウェル１６０１５において測定し、残りを廃棄物チャンバ（図示せず）に送出するか又はブリスタ１６０１０に戻し、次いでこれを廃棄物ブリスタとして使用すればよい。測定された生成物を第２段階ＰＣＲ用の試薬と組み合わせ、チャネル１６０３４を介して、例えば図１のアレイ５８１又は本明細書に記載されている他のアレイ実施形態のような第２段階ＰＣＲアレイである第２段階ＰＣＲ反応ゾーン（図示せず）に送出することができる。
[00322] ここで図１７Ａ及び図１７Ｂを参照して、これらの方法及び器具と共に使用できる可撓性パウチ３９００の別の実施形態について説明する。可撓性パウチ３９００は単一のチャンバ３９０２（本明細書では「多機能チャンバ」と称する）を含み、これは、サンプル調製、核酸回収、第１段階マルチプレックス核酸増幅反応のため、あるいは直接、流体接続された第２段階反応ゾーンにおけるシングルプレックスリアルタイム核酸増幅反応に使用することができる。これらの機能を単一のチャンバ内で実行することで、パウチを簡略化すると共に、パウチを動作させるために使用される器具を簡略化することができる。また、単一の多機能チャンバを使用すると、多くの流体移動ステップを簡略化もしくは排除できるか、又は複数のステップを同時に実行できるので、パウチ内で実行され得るアッセイの時間を節約することができる。同様に、サンプル調製及び核酸回収を同一チャンバ内で実行すると、本明細書に記載されている方法で核酸回収のために使用される核酸回収媒質（典型的にシリカでコーティングした磁気ビーズ）が溶解物の形成前に又は形成と同時に再水和されて溶解物中に分散されるので、時間を節約し、器具実行ステップを減らすことができる。追加の利点として、このようなプロセスでは、核酸回収媒質が溶解物の全体積中に分散されるので、感度が増大し、検出までの時間を短縮することができる。
[00323] 前述の例と同様、可撓性パウチ３９００は、２層の可撓性プラスチックフィルム又は他の可撓性材料で形成することができる。材料は例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリメチルメタクリレート、それらの混合物、組み合わせ、及び層であり、パウチ３９００は、押し出し成形、プラズマ堆積、及び積層を含む当技術分野において既知の任意のプロセスによって作製できる。例えば各層は、単一のタイプ又は２つ以上のタイプの材料の１つ以上の層を積層したもので構成できる。１つの適切な例は、本明細書の他の箇所で検討したように、ＰＥＴ層とＰＰ層を含む２層プラスチックフィルムである。アルミニウム積層を用いた金属フォイル又はプラスチックも使用できる。例示的に、材料は低い核酸結合能と低いタンパク結合能を有する。プラスチックフィルムを用いる場合、これらの層は、例示的に熱シールによって接合することができる。
[00324] いくつかの実施形態では、可撓性パウチ３９００を形成するために使用される層のうち１つ以上においてバリアフィルムを使用することができる。例えばいくつかの用途では、バリアフィルムは従来のプラスチックフィルムよりも水蒸発及び／又は酸素透過率が低いために望ましい場合がある。例えば典型的なバリアフィルムの水蒸気透過率（ＷＶＴＲ：water vapor transmission rate）は、約０．０１ｇ／ｍ２／２４時間～約３ｇ／ｍ２／２４時間の範囲内、好ましくは約０．０５ｇ／ｍ２／２４時間～約２ｇ／ｍ２／２４時間の範囲内（例えば約１ｇ／ｍ２／２４時間以下）であり、酸素透過率は、約０．０１ｃｃ／ｍ２／２４時間～約２ｃｃ／ｍ２／２４時間の範囲内、好ましくは約０．０５ｃｃ／ｍ２／２４時間～約２ｃｃ／ｍ２／２４時間の範囲内（例えば約１ｃｃ／ｍ２／２４時間以下）である。バリアフィルムの例は、限定ではないが、金属（例えばアルミニウムもしくは別の金属）の蒸着によって金属化できるか、又は酸化物（例えばＡｌ２Ｏ３もしくはＳｉＯＸ）もしくは別の化学組成でスパッタコーティングできるフィルムを含む。金属化フィルムの一般的な例は、金属コーティングされた二軸延伸ＰＥＴ（ＢｏＰＥＴ：biaxially oriented PET）であるアルミめっきマイラーである。いくつかの用途では、コーティングしたバリアフィルムに、ポリエチレン、ＰＰ、又は同様の熱可塑性物質の層を積層して、密封性を与えると共に穿刺抵抗を向上させることができる。従来のプラスチックフィルムと同様、パウチを製造するために使用されるバリアフィルムは、例示的に熱シールによって接合できる。例示的に、材料は低い核酸結合能と低いタンパク結合能を有する。ブリスタ及びチャネルを形成するように密封できる他のバリア材料も当技術分野において既知である。
[00325] 図１７Ａ及び図１７Ｂに示されている実施形態では、多機能チャンバ３９０２に溶解粒子３９０４及び核酸回収ビーズ３９０６（典型的にシリカでコーティングされた磁気ビーズ）を提供することができる。例示の目的のため、溶解粒子３９０４及び核酸回収ビーズ３９０６は別々に示されている。しかしながら、溶解粒子３９０４及び核酸回収ビーズ３９０６は多機能チャンバ３９０２において混合した状態で提供され得ることは認められよう。同様に、多機能チャンバ３９０２に溶解粒子３９０４及び核酸回収ビーズ３９０６が提供された状態が示されているが、溶解粒子３９０４及び核酸回収ビーズ３９０６の一方もしくは双方を試薬ブリスタ３９０８ａのような可撓性パウチ３９００の試薬ブリスタ内に提供してもよく、又は一方もしくは双方をサンプルと共に提供してもよいことは認められよう。いくつかの実施形態では、溶解粒子３９０４を省略することができる。多くの分析物では、溶解緩衝剤（例えば緩衝剤、カオトロープ（chaotrope）、及び洗剤）の存在下で熱を加えて又は熱を加えないで撹拌すれば溶解を誘発するのに充分であり、溶解ビーズを省略することができる。他の分析物では、回収ビーズが溶解及び回収の双方の機能を提供できる。一実施形態では、溶解緩衝剤を多機能チャンバ３９０２又はブリスタ３９０８ａのような試薬ブリスタに提供することができる。本明細書で検討されている実施形態のいずれにおいても、溶解中に磁気ビーズが存在し得ることは理解されよう。
[00326] 図示されている実施形態において、可撓性パウチ３９００の多機能チャンバ３９０２は多数の試薬ブリスタ３９０８ａ～３９０８ｆに流体接続されている。これらの試薬ブリスタは、製造時に様々な試薬を提供することができ、例えばサンプル調製、核酸回収、１回以上の洗浄、第１段階ＰＣＲ、及び第２段階ＰＣＲのための試薬を多機能チャンバ３９０２内に導入するため使用できる。しかしながら別の実施形態では、より後の時点で、例えば使用の直前にエンドユーザによって試薬を導入できる１つ以上の空の試薬ブリスタを可撓性パウチに提供してもよいことは認められよう。一実施形態において、試薬ブリスタ３９０８ａ～３９０８ｆ内の試薬のうち１つ以上は乾燥した形態で提供できる（例えば図１１Ｃを参照のこと）。別の実施形態において、試薬ブリスタ３９０８ａ～３９０８ｆ内の試薬のうち１つ以上は液体の形態で提供できる（例えば図１１Ａ及び図１１Ｂを参照のこと）。例示的な実施形態において、試薬ブリスタ３９０８ａ～３９０８ｆからの試薬は、試薬ブリスタに外圧を加えて流体をブリスタからチャンバ３９０２へ押しやることによって、チャネル３９０９ａ～３９０９ｆを介して多機能チャンバ３９０２内に導入することができる。一実施形態では、チャネル３９０８ａ～３９０８ｆを製造時に開放可能に密封することでブリスタから多機能チャンバ３９０２への試薬の漏れを防止するか、又は、試薬ブリスタ３９０８ａ～３９０８ｆの内容物を図１２Ｃのパケット１２０２０と同様のパケット内に提供することができる。
[00327] また、図示されている実施形態において、パウチ３９００はサンプル受容チャンバ３９１０を含む。一実施形態において、サンプル受容チャンバ３９１０はサンプルを受容するよう構成されたキャビティ（例えば管状ウェル又はブリスタ）を含み得る。このようなキャビティを形成するには、限定ではないが、パウチ３９００を製造するため使用される材料を加熱し、この材料を型（例えばモールド）で形作る等、当技術分野において既知の方法を使用できる。別の実施形態では、サンプル受容チャンバ３９１０を形成するため、製造時にサンプルチューブ（例えばプラスチックチューブ）をフィルム層内に密封することができる。いずれの場合でも、サンプル受容チャンバ３９１０は多機能チャンバ３９０２に流体接続されて、サンプルを多機能チャンバ３９０２内へ導入すると共に廃棄物を多機能チャンバ３９０２から排出できるようになっている。図示されている実施形態において、サンプル受容チャンバ３９１０はチャネル３９１６及び３９１８によって多機能チャンバ３９０２に接続されている。しかしながらこれは単なる例示であり、可撓性パウチは、多機能チャンバ３９０２をサンプル受容チャンバ３９１０に接続するこれよりも多数又は少数のチャネルを含み得ることは認められよう。
[00328] 一実施形態において、サンプル受容チャンバ３９１０はサンプル収集スワブ３９１２を含み得る。サンプル収集スワブを用いて、サンプル（例えば鼻水、痰、血液、便、土等）を収集し、このサンプルをサンプル受容チャンバ３９１０に送出することができる。別の実施形態では、サンプル収集スワブ３９１２を用いる代わりに又はこれに加えて、液体、固体、又は半固体のサンプルを直接サンプル受容チャンバ３９１０内に注入してもよい。別の実施形態では、全量ピペット（transfer pipette）、毛細管（例えば採血毛細管）、サンプルを含むティッシュペーパー（すなわち汚れたティッシュペーパー）等を、サンプル受容チャンバ３９１０内に受容することができる。図示されている実施形態において、スワブ３９１２は軸３９１４を含む。軸３９１４を用いて、サンプル収集のためスワブを扱う際にスワブを保持すると共に、スワブをサンプル受容チャンバ３９１０に戻すことができる。図１７Ｂに示されているように、サンプル受容チャンバ３９１０の上部３９３５を開放又は取り外して３９２３で示すように開口を生成することで、スワブ３９１２をサンプル収集のため取り出すと共に分析のため戻すことができる。
[00329] 一実施形態において、軸３９１４及びサンプル受容チャンバ３９１０は、１つ以上のシール（例えば熱シール）が軸３９１４と交差するように配置されてサンプル受容チャンバ３９１０を密封できるように構成されている。軸と交差するように密封すると、ユーザにとってパウチの使用が簡単になり、例えば図１１Ａ及び図１１Ｂのスワブで使用される軸のような破壊可能スワブ軸の必要性をなくすことができる。図示されている実施形態では、軸３９１４を横切るように３つのシール３９１１ａ～３９１１ｃを配置できる。しかしながら、これが単なる例示であり、これよりも多数又は少数のシールを配置できることは認められよう。一実施形態では、これらのシールを配置することでサンプル受容チャンバ３９１０内に異なるサブチャンバを生成できる。図示されている実施形態では、例えばシール３９１１ａはサンプル再水和／分散チャンバ３９１０ａを生成するよう配置され、シール３９１１ａ及び３９１１ｂは廃棄物チャンバ３９１０ｂを形成することができる。このため、チャネル３９１６を、サンプル再水和／分散及びサンプルの多機能チャンバ３９０２への導入のために使用し、チャネル３９１８を、多機能チャンバ３９０２から廃棄物（例えば使用済み溶解物及び洗浄緩衝剤）を放出するために使用することができる。シール３９１１ｃは、例えば漏れを防ぐように配置できる。シール３９１１ｃは図示のようにスワブ軸３９１４の一部に重ねて配置され得るが、シール３９１１ｃを軸の端部よりも上方に配置してもよいことは認められよう。一実施形態では、シール３９１１ａ～３９１１ｃのうち１つ以上を配置する前に、多機能チャンバ３９０２及びサンプル受容チャンバ３９１０から余分な空気を放出することができる。サンプル受容チャンバ３９１０の特徴部をパウチ１００００と共に使用できること、及び、サンプル調製ゾーン１０００５の特徴部をパウチ３９００と共に使用できることは理解されよう。また、サンプル受容チャンバ３９００及びサンプル調製ゾーン１０００５の特徴部を、本明細書に記載されている他のパウチの任意のものと共に使用してもよい。
[00330] 軸３９１４と交差するようにサンプル受容チャンバ３９１０を熱シールする場合、軸を少なくとも部分的に軟化又は溶融させて、可撓性パウチ３９００及びサンプル受容チャンバ３９１０を製造するため使用される材料に対して融合、固着、連結、又は接着することができる。１又は複数のシール内に軸を組み込むと、例えばシール周りの漏れを防止できる。同様に、サンプル受容チャンバ内にスワブを密封すると、全長にわたる軸を有すると共に及び破壊可能先端部を含まないスワブを使用することができ、更に、オペレータがサンプルを収集してこれをサンプル受容チャンバに戻すためにスワブを用いて実行しなければならない手作業操作の数が減る。また、破壊可能先端部を省略すると、例えば患者において誤って先端部を折ってしまう有害事象の可能性が低下する。ここで図４３Ａから図４３Ｄを参照すると、使用され得る軸のいくつかの例が示されている。一実施形態において、図４３Ａは実質的に丸い軸４１１４ａの断面である。実質的に丸い軸４１１４ａは外側層４１０２及び内腔４１０３を含む。別の実施形態において、図４３Ｂは実質的にダイヤモンド状の軸４１１４ｂの断面を示す。軸４１１４ａと同様、軸４１１４ｂは中空内腔４１０５及び外側層４１０４を含む。一実施形態において、軸４１１４ｂの角部４１０４ａ～４１０４ｄの１つ以上は、図示のように丸めるか又は長く伸ばすことができる。図４３Ｃは、楕円形の中実プロファイル４１０６を有する別の軸４１１４ｃを示す。軸４１１４ｃの楕円形は、より良い密封のため平坦化及び／又は長く伸ばすことができる。円形断面では軸に隣接したギャップ又は空隙が残る可能性があるので、例えば円形でない断面を有する４１１４ｂ及び４１１４ｃのような軸を有するスワブの方が、円形断面よりも良好なシールを与え得る。図４３Ｄは、中実コア４１０８に重なって配置された外側層４１０７を有する更に別の軸４１１４ｄを示す。一実施形態において、コア４１０８はワイヤ又は別の剛性部材及び／又は整形可能部材とすればよく、サンプル収集のためスワブをキャビティ内に押し込んで導入することを可能とする。ワイヤ又は他の薄い剛性の整形可能材料から作製された軸を有するスワブは当技術分野では既知であり、特定のサンプルタイプを収集するために使用できる。むろん、軸４１１４ａ～４１１４ｄは単なる例示であり、他の軸形状及び内腔形状が可能であり（例えば内腔の形状は必ずしも外側層の形状を反映する必要はなく、また、他の外側層又は中実の形状も使用できる）、本開示の範囲内であることは認められよう。
[00331] 一実施形態において、軸４１１４ａ～４１１４ｄを製造するため使用される１又は複数の材料は、パウチの製造に、より具体的にはサンプル受容チャンバの製造に使用されるフィルム材料とコンパチブルであるように選択される。本明細書において用いる場合、「コンパチブル」という用語は、融合させて安定した接合を形成できる材料を指す。接合される２つのポリマーは、必須ではないが、同一のタイプの材料とすることができる。これが当てはまる場合、パウチ及びスワブ軸の形成に使用されるプラスチックは、接合の良好な候補となるよう同様の特性を有することが予想される。これらのプラスチックをコンパチブルにする要因には、限定ではないが、ポリマー鎖の化学的構造、同様の及び重複するポリマー融点、並びにプラスチックの表面エネルギが含まれる。プラスチックのこれらの特徴が類似すればするほど、接合は良好になる。ほとんどの一般的な熱可塑性物質は、当技術分野において既知である多種多様な他の組み合わせと同様、相互に容易に接合する。
[00332] 例えばパウチ３９００及びサンプル受容チャンバ３９１０は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）外側層とポリプロピレン（ＰＰ）内側層を含む２層フィルムから製造することができる。このような２層材料によって、融点の高い外側ＰＥＴ層の完全性を損なうことなくパウチフィルムの内側ＰＰ層を熱シールする（例えばレーザ又は熱溶接する）ことができる。ＰＰ材料と「コンパチブルである」可能性のあるプラスチック軸材料は、限定ではないが、ポリエチレン（ＰＥ）、ＰＰ、又はＰＥコポリマー、ブロックコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）やエチレン酢酸エチル（ＥＥＡ）のような他の熱可塑性コポリマーを含む。ＰＥＴ／ＰＰの２層材料からパウチを製造すること、及び前述したコンパチブルな軸材料の例は、単なる例示である。従って、本明細書の他の箇所で検討したようにパウチが他の材料から製造され得ること、及び、他のパウチフィルム材料とコンパチブルなスワブ軸材料が当業者に既知であることは理解されよう。
[00333] ここで図４４Ａを参照すると、サンプル受容チャンバ３９１０ａ内に密封することができる軸４２１４ａの一例が断面で示されている。図示されている実施形態のサンプル受容チャンバ３９１０ａは、第１の材料層４２０２及び第２の材料層４２０４から製造されている。これらの層は、４２０６及び４２０８のエッジで接合されてチャンバ３９１０ａを形成する。図４４Ｂは、軸と交差するようにシール３９１１を形成した後のサンプル受容チャンバ３９１０ｂを示す。シール３９１１において、軸４１１４ａは完全につぶれて密封軸４２１４ｂを形成し、層４２０２及び４２０４は４２１０で示すように相互に及び軸４２１４ｂに対して完全に密封することができる。一実施形態において、軸形状、軸材料、及び密閉手順は、好ましくはシール３９１１の断面に空隙が存在しないように選択される。例えばいくつかの実施形態では、軸４１１４ａ及び４１１４ｂのような内腔を有する軸は材料が少なく、容易に溶融し得るので、これらの軸が好ましい場合がある。４１１４ｃのような軸は、容易に溶融し伸展してシールを形成できる。同様に、実質的にダイヤモンド状の軸４１１４ｂの角部４１０４ａ～４１０４ｄのうち１つ以上を、良好な密封のために丸めるか又は長く伸ばしてもよい。また、１つ以上の角部を丸めると、シール領域に孔を発生させる恐れがあるフィルム又は軸上のホットスポット形成の可能性を低下させることができる。
[00334] 再び１７Ａ及び１７Ｂを参照すると、多機能チャンバ３９０２は、サンプル調製（例えば溶解）、核酸回収（例えば、シリカでコーティングした磁気ビーズのような核酸結合剤を用いた溶解物からの核酸の回収、使用済み溶解物の放出、洗浄緩衝剤による磁気ビーズの洗浄、ビーズからの核酸の溶出）、及び第１段階マルチプレックス核酸増幅反応のために構成されている。典型的なワークフローでは、例えば開口３９２３でパウチ開口を開くことによってパウチ３９００のサンプル受容チャンバ３９１０を開放し、スワブ３９１２を取り出し、これを用いてサンプルを収集し、サンプルの付いたスワブ３９１２をサンプル受容チャンバ３９１０に戻すことができる。次いでパウチ３９００を器具に挿入し、上述のようにサンプル受容チャンバ３９１０を密封することができる。多機能チャンバ３９０２内、ブリスタ３９０８ａ内、もしくは他のブリスタ内に提供するか、又はサンプルの投入と同時にもしくはその前に注入することができる溶解緩衝剤を、多機能チャンバ３９０２に外力を加えることによって多機能チャンバ３９０２からサンプル再水和／分散チャンバ３９１０ａ内へ移動させ、撹拌し、チャンバ３９１０ａに外力を加えることによって多機能チャンバ３９０２に戻すことができる。サンプルをチャンバ３９０２内へ導入した後、シリカでコーティングした磁気ビーズ３９０６と、任意選択的に溶解粒子３９０４とを、試薬ブリスタ３９０８ａに外力を加えることによって試薬ブリスタ３９０８ａからチャネル３９０９ａを介してチャンバ３９０２内へ導入することができる。任意選択的に、シリカでコーティングした磁気ビーズ３９０６及び任意選択的な溶解粒子３９０４をチャンバ３９０２内で溶解緩衝剤中に提供し、試薬ブリスタ３９０８ａを別の成分のために使用してもよい。
[00335] 一実施形態において、多機能チャンバ３９０２における溶解は例えば、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）内に提供されるような回転ブレードを用いた詰め込みによるボルテックスによって、又は、援用により全体が本願に含まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４４３３３号に記載されているもの等の往復運動するかもしくは交互に移動するパドルを用いたパドルビーターによって、実行され得る。一実施形態において、溶解は、（例えば４０℃～１００℃の範囲内の温度に）サンプルを加熱しながら撹拌すること（例えばボルテックス）を含み得る。別の実施形態では、撹拌を省略し、熱と化学作用の組み合わせによって溶解を実行してもよい。
[00336] 溶解の後、器具において外部磁石（図２の磁石８５０と同様）を活性化することによって多機能チャンバ３９０２内で磁気ビーズ３９０６を隔離し、チャンバ３９０２に外圧を加えることによって溶解物をチャネル３９１８を介して廃棄物チャンバ３９１０ｂへ放出することができる。一実施形態では、磁石の活性化及び溶解物の放出を行う前に、溶解物を制御された温度（例えば６０℃～０℃の範囲内の温度）に設定して、シリカでコーティングした磁気ビーズに対する核酸結合を促進することができる。溶解物を放出させた後、磁石を遠ざけると共に、磁気ビーズ、任意選択的な溶解粒子、及び多機能チャンバ自体に、洗浄緩衝剤を用いた少なくとも１回の洗浄を行うことができる。一実施形態において、洗浄緩衝剤は酸性緩衝剤（例えばｐＨは約５）であり、１回又は複数回の洗浄は制御された温度で実行することができる（例えば６０℃～０℃の範囲内の温度）。洗浄緩衝剤は、試薬ブリスタ３９０８ｂから、及び任意選択的に３９０８ｃから、チャネル３９０９ｂ及び３９０９ｃを介してチャンバ３９０２内に導入できる。磁石の活性化によって磁気ビーズを隔離し、使用済み洗浄緩衝剤を廃棄物チャンバ３９１０ｂへ放出することができる。一実施形態において、１回又は複数回の洗浄は、チャンバ３９０２を撹拌して磁気ビーズ及び任意選択的な溶解粒子を洗浄緩衝剤中に分散させることを含み得る。
[00337] １回又は複数回の洗浄の後、第１段階核酸増幅反応用の試薬をチャンバ３９０２に導入することができる。一実施形態において、第１段階核酸増幅反応用の試薬は試薬ブリスタのうち１つ以上から導入できる。一実施形態において、第１段階増幅試薬は、いくつかの試薬では液体の形態で試薬ブリスタ３９０８ｄ及び３９０８ｅの各々に提供されるので、試薬ブリスタ３９０８ｄ及び３９０８ｅの各々は、プライマーダイマー形成等を回避するため不完全な増幅反応物を含む。ブリスタ３９０８ｄ及び３９０８ｅからの試薬はチャネル３９０９ｄ及び３９０９ｅを介して提供される。一実施形態において、第１段階核酸増幅反応用の試薬は、磁気ビーズからの溶解物から回収された核酸を溶出することができる。一実施形態において、第１段階核酸増幅反応用の試薬のｐＨは約７～９とすることができる（例えばｐＨ８．５）。一実施形態において、回収された核酸はＲＮＡを含み得るので、第１段階マルチプレックス核酸増幅反応の前に又はそれと同時に多機能チャンバ３９０２内で逆転写ステップを実行することがある。一実施形態において、ブリスタ３９０８ｄ及び３９０８ｅからの試薬は、逆転写ステップ及び第１段階マルチプレックス核酸増幅反応のための試薬を含む。一実施形態において、試薬ブリスタ３９０８ｄは逆転写ステップ用の成分を含み、ブリスタ３９０８ｅは第１段階マルチプレックスＰＣＲ反応用の成分を含むことができる。一実施形態において、多機能チャンバ３９０２は、多機能チャンバ３９０２の内容物を加熱及び冷却するよう熱サイクルできるペルチェ素子又は別のヒータを用いた熱サイクリングによって、又は、チャンバ３９０２の内容物を加熱及び冷却するために例えばアニーリング温度及び変性温度に設定された図２８Ｂのヒータ１２８６及び１２８７のような１対のヒータを平行移動させることによって、あるいは、ヒータに対してパウチ３９００を平行移動させることによって、増幅を行うために構成されている。
[00338] 一実施形態では、逆転写ステップをチャンバ３９０２内で溶解粒子及び磁気ビーズの存在下で実行するか、又は、逆転写ステップの実行前に磁気ビーズ及び溶解粒子のうち一方又は双方を隔絶することができる。一実施形態において、磁気ビーズを隔絶するには、図２の磁石８５０と同様のチャンバ３９０２に隣接した磁石を活性化すればよい。一実施形態において、溶解粒子が存在する場合にこれを隔絶するには、チャンバ３９０２内で沈殿させた後、例えば圧力部材を活性化して、３９０２ｂ内の溶解粒子を隔離すると共に流体を３９０２ａに放出すればよい。多くの場合、溶解粒子は多機能反応チャンバ３９０２内の他の成分よりも大きく、その大きさが沈殿を促進し得ることは理解されよう。３９０２ｂ内で又は３９０２ａの１つの分離エリア内で磁石を活性化することにより、溶解粒子が存在する場合はこれと共に磁気ビーズを隔離できる。一実施形態において、第１段階マルチプレックス核酸増幅反応は、多機能チャンバ３９０２内で、磁気ビーズ及び溶解粒子の双方の存在下で実行され得る。第１段階増幅中に磁気ビーズが存在する場合は、溶出ステップを省略して、磁気ビーズに標的核酸が結合したままの状態で第１段階増幅の一部を実行してもよいことは理解されよう。そのような実施形態では、磁気ビーズの存在下での増幅に対する阻害効果の中和を促進する成分が必要となり得る。そのような成分は、緩衝剤、ＢＳＡのようなコーティング分子、又は当技術分野において既知である他の成分を含み得る。別の実施形態では、例えば磁石及び圧力部材の活性化によって磁気ビーズ及び溶解粒子を３９０２ｂ内で隔絶し、第１段階マルチプレックス核酸増幅反応のために溶出液を３９０２ａへ放出することができる。
[00339] 第１段階マルチプレックス核酸増幅反応が所望の数のサイクルにわたって進行した後、任意選択的にサンプルを希釈するため、例えば、第１段階マルチプレックス核酸増幅反応の生成物の一部をチャンバ３９１０ａ及び３９１０ｂに放出し、生成物の少量のみを多機能チャンバ３９０２内に残すことができる。次いで、例示的に試薬ブリスタ３９０８ｆから多機能チャンバ３９０２内へ第２段階核酸増幅反応用の試薬を加えることによって生成物を希釈することができる。生成物を放出すると共に試薬を導入して、例えば、第１段階マルチプレックス核酸増幅反応の生成物の１：１０～１：１００の希釈を得ることができる。一実施形態では、試薬ブリスタ３９０８ｆを使わずに、試薬ブリスタ３９０８ｅからの第２段階核酸増幅反応用の試薬を用いて一次希釈を実行した後、ブリスタ３９０８ｆからの試薬を用いて希釈を繰り返すことができる。別の例示的な実施形態では、試薬ブリスタのうち１つ（例えばブリスタ３９０８ｅ）は希釈剤（例えば緩衝剤）を含み、別の試薬ブリスタ（例えばブリスタ３９０８ｆ）は第２段階核酸増幅反応用の試薬を含み得る。希釈ステップ数を変更することによって、又は、第２段階核酸増幅反応用の試薬と混合する前に廃棄されるサンプルの割合を変更することによって、希釈レベルを調整できることは理解されよう。いくつかの実施形態では、体積希釈チャンバを用いることができる。
[00340] 一実施形態において、第２段階核酸増幅反応用の試薬は増幅のためのマスター混合物を含み、これは例示的にポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び適切な緩衝剤であるが、他の成分も適切である場合がある。別の実施形態では、第２段階核酸増幅反応用の試薬は、第２段階増幅用の成分のうち少なくとも１つを含まない不完全な反応混合物を含み、含まれない１又は複数の成分を第２段階ウェル３９８２の各々で乾燥させることができる。１つの例示的な実施形態では、第２段階核酸増幅反応用の試薬はプライマー対を含まず、第２段階ウェル３９８２の各々に特定のＰＣＲプライマー対が予め投入されている。各プライマー対は第１段階ＰＣＲプライマー対と同様もしくは同一であるか、又は第１段階プライマー対内にネスト化することができる。１つの例示的な実施形態において、第２段階核酸増幅反応用の試薬は、プライマー対と、ポリメラーゼ（例えばクレンタク（klentaq））、Ｍｇ＋＋、又は緩衝剤のうち１つ以上とを含まず、１又は複数の含まれない成分（例えばポリメラーゼ（及び安定化試薬）、Ｍｇ＋＋、又は緩衝剤）を第２段階ウェル３９８２内で乾燥させることができる。これによって、乾燥させた成分の安定性の増大と、ポリメラーゼのような高価な試薬のコスト削減が可能となる。その理由は、こういった１又は複数の成分を含む過剰な体積でアレイをあふれさせて過剰分を排出するのではなく、１又は複数の成分が各アレイウェルにおいて反応に必要な量だけスポットされるからである。所望の場合、サンプルと第２段階核酸増幅用の試薬のこの混合物を、第２段階増幅のため第２段階ウェル３９８２へ移動させる前に多機能チャンバ３９０２内で予熱してもよい。このような予熱は、第２段階ＰＣＲ混合物におけるホットスタート成分（抗体、化学物質、又は他のもの）の必要性をなくすことができる。リアルタイム又は増幅後の検出が望まれる場合、混合物又は第２段階ウェルは色素又は他の適切な検出成分を含み、関連付けられる器具は蛍光光度計又は他の検出機構を含むことができる。
[00341] 図示されている実施形態において、多機能チャンバ３９０２は、第２段階核酸増幅反応のための多数のウェル３９８２を含むアレイ３９８１に流体接続されている。アレイ３９８１及びウェル３９８２はチャネル３９２０を介して充填することができる。第２段階アレイのウェル充填については本明細書の他の箇所で詳しく検討されている。簡潔に述べると、ウェル３９８２の各々の充填は概して、アレイを部分真空下に置くことによって達成される。これは製造時に実行される（真空下の容器内にパウチを保管することで真空レベルを維持することができる）か、又はパウチの使用中にインサイチュで、例えば器具内でアレイに真空を与えることができる。後者のために構成できるアレイ３９８１は、真空ポート３９２４、真空路３９２６、真空貯蔵部３９２８、アレイフローチャネル３９３２、及びらせん形経路３９３０を含むが、入り組んだ経路の他の方向も使用され得る。本明細書では、図２０Ａから図２０Ｅを参照してウェル充填経路のいくつかの説明のための例が示されている。アレイを充填する前に真空ポート３９２４に与えられた真空が、真空路３９２６、真空貯蔵部３９２８、アレイフローチャネル３９３２、及び例示的ならせん形経路３９３０を介して、ウェル３９８２を排気する。例えば領域３９２５に熱シールを適用して真空路３９２６を閉鎖することにより、この真空を維持することができる。第２段階アレイに真空をインサイチュで与えること、及びインサイチュで真空を与えるため構成された第２段階アレイ設計についての更なる検討は、すでに援用により全体を本願に含めたＰＣＴ／ＵＳ１８／３４１９４号で見ることができる。
[00342] 本明細書に記載されている他の実施形態と同様、ウェル３９８２の各々は充填チャネル３９２０を介して多機能チャンバ３９０２に流体連通することができ、充填チャネル３９２０は一連のアレイフローチャネル３９３２と流体連通している。一実施形態において、充填チャネル３９２０は、磁気ビーズや溶解粒子等が多機能チャンバ３９０２からアレイ３９８１内へ移動するのを防ぐためのフィルタ３９２２（等）を含み得る。図１７Ａから図１７Ｂに示されている説明のための例において、ウェル３９８２はアレイフローチャネル３９３２を介して多機能チャンバ３９０２に流体接続されている。アレイフローチャネル３９３２は、各ウェル３９８２の周りでらせん形になったらせん形経路３９３０を介して各ウェルに接続している。これは、アレイウェル間での望ましくない流体の混合（すなわちクロストーク）の防止に役立ち得る「入り組んだ」アレイウェル充填経路の別の例である。しかしながら、これらのアレイフローチャネル３９３２及びらせん形経路３９３０がウェル充填経路の単なる一例であること、他の入り組んだウェル充填経路も使用できることは理解されよう。他の入り組んだウェル充填経路は、図６Ｂ、図６Ｃ、図８Ａ、図８Ｂ、及び図２０Ｂから図２０Ｅに示されている。二次汚染なしでウェル３９８２を充填する他の方法も想定される。例えば、援用により本願に含まれる米国特許第８，８９５，２９５号を参照のこと。第２段階アレイ３９８１を加熱及び冷却するための器具内のヒータ／クーラ（例えばペルチェ素子）位置によって、又は、チャンバ第２段階アレイ３９８１の内容物を加熱してから冷却するために例えばアニーリング温度及び変性温度に設定された図２８Ｂのヒータ１２８６及び１２８７のような１対のヒータを平行移動させることによって、あるいは、ヒータに対してパウチ３９００を平行移動させることによって、第２段階アレイ３９８１の内容物を熱サイクルさせることができる。
[00343] 一実施形態において、チャネル３９０９ａ～３９０９ｆ、３９１６、３９１８、及び３９１２は、例示的に、パウチ製造中に配置することができるワックスもしくは接着剤のような接合材料の追加によって形成される、破裂可能シール、剥がして再び使えるシール、もしくは他の開放可能シールを用いて、又はパウチ３９００を製造するフィルム層を用いて、密封することができる。これらのフィルム層は、相互に多少の自然の親和性を持っていて緩く接合する傾向があり得るので、チャネルにおいて連結させたフィルム層によってそのようなシールを形成できる。例えば、フィルムを一時的に接合するのには充分であるが永久的な接合を形成するには不充分な熱をフィルム層に加える（例えば加熱ローラの間に通す）ことにより、フィルム層を連結させることができる。このシール及び本明細書で検討される他のシールは、当技術分野において既知のように、剥がして再び使えるシール、壊れやすいシール、連結させたシール、使い捨てシール、圧力シール、又は他のシールとすればよい。チャネル３９０９ａ～３９０９ｆ、３９１６、３９１８、及び３９１２は、可撓性パウチ３９００内でアッセイを実行するため使用される器具内のハードシールを用いて密封してもよい。ハードシールの例は、図３に示すパウチのチャネルに示されている。
[00344] ここで図１７Ｃを参照すると、可撓性パウチ４０００の別の実施形態が示されている。パウチ４０００はパウチ３９００と同様であり、同様の要素には同様の番号が与えられている。例えば、多機能チャンバは図１７Ａ及び図１７Ｂでは３９０２の番号を付けられると共に図１７Ｃでは４００２の番号を付けられ、サンプル受容チャンバは図１７Ａ及び図１７Ｂでは３９１０の番号を付けられると共に図１７Ｃでは４０１０の番号を付けられている。図１７Ａから図１７Ｂの実施形態と図１７Ｃの実施形態との主な違いは、図１７Ｃの実施形態が、図２５から図２７Ｄに関連付けて記載されるワイパのようなワイパデバイスを用いた第１段階核酸増幅のために構成されている点である。
[00345] 特に多機能チャンバ４００２を参照すると、多機能チャンバ４００２には溶解粒子４００４及び核酸回収ビーズ４００６を提供することができる。図１７Ａ及び図１７Ｂを参照して記載したように、溶解及び核酸回収は、溶解粒子４００４及び核酸回収ビーズ４００６の存在下で多機能チャンバ４００２内で進行し得る。しかしながらいくつかの実施形態では、溶解粒子４００４及び核酸回収ビーズ４００６の一方又は双方が存在しない状態で第１段階マルチプレックス核酸増幅反応を実行することが望ましい場合がある。多機能チャンバ４００２はこれに応じて構成することができる。
[00346] 溶解物からの核酸回収の後、例えば、溶解粒子４００４及び核酸回収ビーズ４００６の一方又は双方を沈殿させ、概略的に４００５で示されている圧力デバイス（例えばチャンバ４００２に隣接して位置決めされた器具内の外部圧力プレート）の活性化によって溶解粒子４００４及び核酸回収ビーズ４００６を多機能チャンバ４００２の第２の部分４００２ｂ内で隔絶することができる。その間に、第１段階マルチプレックス核酸増幅のため多機能チャンバ４００２の第１の部分４００２ａ内に溶出液を隔絶できる。一実施形態では、多機能チャンバ４００２のアーチ形端部４００３に対応する湾曲部を有するリングを添付器具に提供し、これを用いて第１の部分４００２ａに溶出液を隔絶することができる。第１の部分における熱サイクリングは、例えば図２５、図２６、及び図２７Ａから図２７Ｄを参照して以下に記載するように、ワイパと、高温及び低温に設定された２つのヒータと、を用いて進行し得る。他の方法は、すでに援用により本願に含めたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１８７４８号に与えられている。一実施形態では、４００５のような圧縮部材を用いて第２の部分４００２ｂから溶出液を放出して第２の部分４００２ｂ内の溶出液から溶解粒子４００４及び核酸回収ビーズ４００６を隔離することができ、溶出液を第１の部分４００２ａで熱サイクルすることができる。別の実施形態では、チャンバ４００２に隣接した器具内の外部磁石を活性化することにより、１つ以上のステップで、シリカでコーティングした磁気ビーズを隔絶又は隔離できる。一実施形態において、圧縮部材は、例示されている円形の第１の部分４００２ａを形成する圧縮部材４００５のようなプロファイルを有し得る。そのような場合、熱サイクリングは、図２５、図２６、図２７Ａから図２７Ｄを参照して上述したようなワイパを用いて実行され得る。別の実施形態において、圧縮部材は、図２５、図２６、図２７Ａから図２７Ｄに示されている熱サイクリングシステムと必ずしも適合性があるわけではないプロファイルを有し得る。そのような場合、第１の部分の内容物の熱サイクリングは、例えば図２８Ｂに示されたものと同様の平行移動ヒータアセンブリを用いて、又は３温度熱サイクリングもしくは２温度熱サイクリングのために構成された固定ヒータを用いて実行され得る。
[00347] 一実施形態において、可撓性パウチ３９００又は４０００は例えば、サンプルから核酸を抽出するため及び／又はサンプル内の未知の微生物を同定するためのアッセイ方法において使用できる。一実施形態において、方法は、（ａ）磁気粒子を含む多機能チャンバを含む可撓性容器を提供することであって、多機能チャンバはサンプル調製及び核酸回収のために構成されている、ことと、（ｂ）多機能チャンバ内にサンプルを導入することと、（ｃ）磁気粒子の存在下で多機能チャンバ内に溶解物を発生させることと、（ｄ）溶解物から磁気粒子を隔離することにより、磁気粒子を用いて核酸を回収することと、を含む。一実施形態では、多機能チャンバに隣接して外部磁石を配置することにより、溶解物から磁気粒子を隔離することができる。一実施形態において、多機能チャンバは溶解粒子（例えばケイ酸ジルコニウムビーズ）も含むことができる。一実施形態において、方法は、（ｅ）多機能チャンバにおいて第１段階マルチプレックス核酸増幅反応で核酸を増幅させるステップを更に含む。
[00348] 一実施形態において、可撓性容器は、多機能チャンバと流体連通しているサンプル受容チャンバを更に含む。一実施形態において、可撓性容器に、サンプル受容チャンバ内のサンプルスワブを提供することができる。一実施形態において、方法は、サンプルスワブを用いてサンプルを収集することと、スワブをサンプル受容チャンバ内に挿入することと、スワブが内部に入っているサンプル受容チャンバを密封することと、を更に含み得る。方法は更に、多機能チャンバからサンプル受容チャンバ内へ溶解緩衝剤を導入することと、溶解緩衝剤を撹拌することと、サンプル溶解緩衝剤でサンプル受容チャンバ内のサンプルを分散させることと、サンプル及びサンプル溶解緩衝剤を多機能チャンバ内へ戻すことと、を含み得る。一実施形態では、多機能チャンバに溶解緩衝剤を提供するか、あるいは、サンプルスワブをサンプル受容チャンバに挿入する前に溶解緩衝剤を多機能チャンバ内へ導入することができる。一実施形態において、スワブは細長い軸を含み、密閉することは更に、（例えば熱シールデバイスを用いて）スワブの細長い軸と交差するようにサンプル受容チャンバを密閉することを含む。一実施形態において、方法は更に、細長い軸と交差するように２つ以上のシールを適用して、サンプル受容チャンバを少なくともサンプル再水和／分散チャンバと廃棄物チャンバとに分割することを含む。一実施形態において、多機能チャンバは、サンプル再水和／分散チャンバ及び廃棄物チャンバに流体接続されたチャネルを含む。一実施形態において、方法は更に、サンプル受容チャンバを密閉する前に多機能チャンバ及び／又はサンプル受容チャンバに圧力を加えることによってサンプル受容チャンバ及び多機能チャンバから空気をパージすることを含む。
[00349] 一実施形態において、溶解物を発生させることは、溶解物を発生させながらサンプルに熱を加えることを更に含む。一実施形態において、溶解物を発生させることは、多機能チャンバの外部に力又はエネルギを加えて磁気粒子及び流体サンプルを共に動かすことで溶解物を発生させることを含む。一実施形態において、多機能チャンバは更に溶解粒子（例えばケイ酸ジルコニウム粒子又は他の硬質及び／又は研摩要素）を含み、回転ブレード又はパドルを用いた詰め込みによるボルテックスのために構成されている。このため一実施形態では、力を加えることで溶解粒子及び磁気粒子及び流体サンプルを動かして高速衝撃を発生させ、結果として溶解物を生成する。ケイ酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ３９０４又は４００４のような溶解粒子の存在下でサンプルの振とう、ボルテックス、超音波処理、及び同様の処理を行うことによるビーズ粉砕は、溶解物を形成する効果的な方法である。本明細書で用いる場合、「溶解」、「溶解している」、及び「溶解物」等の用語は細胞を破裂させることに限定されず、そのような用語がウイルスのような非細胞粒子の破壊を含むことは理解されよう。別の実施形態では、援用により本願に含まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４４３３３号に記載されているような往復運動するか又は交互に移動するパドルを用いたパドルビーターを、この実施形態及び本明細書に記載されている他の実施形態において溶解のために使用してもよい。
[00350] 一実施形態において、方法は、溶解物を発生させた後に多機能チャンバ内の溶解粒子を溶解物から隔絶することを更に含む。一実施形態において、方法は、多機能チャンバ内で溶解粒子を沈殿させることと、多機能チャンバに外部圧力を加えて溶解粒子を隔離すると共に溶解粒子から流体を放出させることと、を更に含み得る。一実施形態において、方法は、溶解物から核酸を回収した後に多機能チャンバ内で磁気粒子を隔絶することを更に含む。一実施形態において、磁気ビーズを隔絶するには、多機能チャンバに隣接して外部磁石を配置して磁気ビーズを捕捉すればよい。一実施形態において、磁気ビーズは溶解粒子と共に隔絶され得る。
[00351] 一実施形態において、溶解物を発生させることは、力を加えながらサンプルに熱を加えることを更に含む。一実施形態では、核酸を磁気粒子に結合するための条件下で溶解物を発生させる。好ましくは、多機能チャンバ内で溶解物を発生させている時に核酸は磁気ビーズに結合することができる。一実施形態において、溶解物は高温で発生され、核酸は溶解温度よりも低い制御された温度で溶解物から回収される。多機能チャンバの内容物を加熱及び冷却することができるヒータ／クーラデバイス（例えばペルチェデバイス）に隣接して多機能チャンバを位置決めすることにより、多機能チャンバの温度を制御できる。一実施形態において、溶解物を発生させるための高温は、４０～１００℃、好ましくは５０～１００℃、又はより好ましくは７０～１００℃の範囲内である。一実施形態において、核酸回収のための溶解温度よりも低い制御された温度は、６０～０℃、好ましくは５０～０℃、又はより好ましくは４０～０℃（例えば４０℃～２０℃）の範囲内である。
[00352] 一実施形態において、磁気粒子を用いて核酸を回収することは、多機能チャンバに隣接して磁石を位置決めすることによって溶解物から磁気粒子を捕捉することと、溶解物を（例えば図１７Ｂに示されている廃棄物チャンバ３９１０ｂに）放出させることと、多機能チャンバ内で磁気ビーズの少なくとも１回の洗浄を実行することであって、この洗浄は（例えば図１７Ａ及び図１７Ｂに示されている試薬ブリスタ３９０８ａ～３９０８ｆのうち１つから）多機能チャンバ内に洗浄緩衝剤を導入することを含む、ことと、（例えば磁石を除去し、多機能チャンバの内容物を撹拌することによって）洗浄緩衝剤に磁気ビーズを分散させることと、磁石を用いて磁気ビーズを再捕捉することと、洗浄緩衝剤を（例えば廃棄物チャンバ３９１０ｂに）放出することと、磁気ビーズから核酸を溶出させることであって、溶出は（例えば図１７Ａ及び図１７Ｂに示されている試薬ブリスタ３９０８ａ～３９０８ｆのうち１つから）多機能チャンバに溶出緩衝剤を導入することを含む、ことと、を更に含む。一実施形態において、溶出緩衝剤は第１段階マルチプレックス核酸増幅反応用の試薬を含む。
[00353] 一実施形態において、溶解物から回収された核酸はＲＮＡを含み、方法は、多機能チャンバにおいて逆転写ステップを実行してＲＮＡをＤＡＮに変換することを更に含む。一実施形態において、図１７Ａ及び図１７Ｂに示されている試薬ブリスタ３９０８ａ～３９０８ｆのうち１つから多機能チャンバ内へ逆転写ステップ用の試薬を導入することができる。一実施形態において、多機能チャンバは、逆転写ステップのために多機能チャンバの内容物の温度を調整するためのヒータ／クーラの温度制御下に置くことができる。一実施形態において、方法は、逆転写ステップを実行する前に、（例えば多機能チャンバの外部に提供された磁石を用いて）多機能チャンバにおいて磁気粒子を隔絶することを更に含み得る。一実施形態において、方法は、逆転写ステップの後に又は逆転写ステップと同時に多機能チャンバにおいて第１段階マルチプレックス核酸増幅反応を実行することを含む。一実施形態において、多機能チャンバは、第１段階マルチプレックス核酸増幅反応のために多機能チャンバの内容物の温度を熱サイクルするためのヒータ／クーラの温度制御下に置くことができる。一実施形態では、第１段階マルチプレックス核酸増幅反応のために（例えば磁石を用いて）磁気粒子を隔絶するか、又は、第１段階マルチプレックス核酸増幅反応を磁気粒子の存在下で実行することができる。
[00354] 一実施形態において、可撓性容器は、多機能チャンバに流体接続された第２段階反応ゾーンを更に含み、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応ウェルを含み、各第２段階反応ウェルはサンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている。一実施形態において、方法は更に、第１段階核酸増幅反応の生成物（例えばアンプリコン）の一部を除いた全てを廃棄物チャンバ（例えばチャンバ３９１０ｂ）に放出することと、第１段階核酸増幅反応の生成物の残り部分を、第２段階核酸増幅反応用の試薬（例えば図１７Ａ及び図１７Ｂに示されている試薬ブリスタ３９０８ａ～３９０８ｆのうち１つ以上から提供される）と組み合わせて第２段階核酸増幅混合物を形成することと、第２段階反応ウェルの各々に第２段階核酸増幅反応混合物を充填することと、第２段階反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルにおいて第２段階核酸増幅反応を実行して、１つ以上の第２段階アンプリコンを発生させることと、を含む。
[00355] 一実施形態において、方法は、充填の後に第２段階反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルを密封することを更に含み得る。第２段階反応ゾーンの複数の第２段階反応ウェルを密封する方法は、本明細書の他の箇所で詳しく検討されている。簡潔に述べると、ウェルを密封するための方法は、限定ではないが、第２段階反応ウェルのアレイ上で膨張可能な袋を膨張させて外側層パウチプラスチックをアレイに対して圧縮してウェルを密封すること、及び／又は、１もしくは複数の熱シールを適用してウェル内への充填チャネル及びウェルからの充填チャネルを密封することを含む。例えば、ウェル３９８２に出入りする流体流を止めるには、実質的にチャネル３９３２に対して垂直に、ウェル３９８２間に一連のヒートシールを配置すればよい。一実施形態において、複数の第２段階反応ウェルにおいて第２段階核酸増幅反応を実行することは、ヒータ／クーラデバイスを用いて第２段階ウェルの内容物の温度を熱サイクルすることを含む。ヒータクーラデバイスは本明細書の他の箇所で検討されているが、簡潔に述べると、第２段階ウェルの内容物の温度を熱サイクルするためのヒータ／クーラは、第２段階ウェルの内容物を加熱及び冷却するように熱サイクルするペルチェ素子、又は、第２段階ウェルの内容物を加熱及び冷却するように平行移動できる少なくとも２つの固定点ヒータを備えたヒータアセンブリを含み得る（又は、ヒータアセンブリを固定すると共にパウチを平行移動させてもよいことは認められよう）。
[00356] 一実施形態において、方法は、第２段階核酸増幅反応後に様々な第２段階反応ウェルの各々において第２段階アンプリコンを融解させて、様々な第２段階反応ウェルの各々の融解曲線を生成することを更に含み得る。一実施形態において、第２段階ウェルの各々は、各第２段階ウェル内のアンプリコンの存在を検出するために使用できるｄｓＤＮＡ結合色素を含む。ｄｓＤＮＡ結合色素の蛍光は典型的にｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの融解に応じて変化するので、ｄｓＤＮＡ結合色素を用いて第２段階ウェル内のＤＮＡアンプリコンの特徴的な融解温度を検出することができる。このため、第２段階反応ウェルの温度を制御するため使用される１又は複数のヒータ／クーラデバイスは、第２段階ウェル内のアンプリコンの融解を引き起こす低速の温度勾配（temperature ramp）を実行するように構成することができ、パウチアッセイを実行するため使用される器具は、第２段階アンプリコンから蛍光を生成し検出するための、並びに融解温度及び融解曲線を検出するための励起及び検出光学系を含み得る。本明細書に記載され図示されている第２段階反応ゾーンのいずれも、図１７Ｃの実施形態と共に使用できることは理解されよう。
[00357] 図１１Ａ、図１１Ｂ、図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃは、スワブ／サンプルチャンバを備えたパウチに挿入又は組み込むことができるスワブ１００６０、３９１２、及び４０１２の全体的な実施形態をそれぞれ示す。図１８Ａ及び図１８Ｂは、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃに示されているものと同様のパウチに一体化できるスワブ１８０００の実施形態を示す。スワブ１８０００は、上部１８００２と、この上部１８００２を挿入することができるベース１８００４と、を含む。スワブ１８０００は更に、スワブ軸１８００６及びスワブ先端部１８００８を含む。一実施形態において、スワブ軸１８００２は上部１８００２に一体化されているか又は受容されている。図示されている実施形態において、上部１８００２は、ユーザがスワブを保持し操作するために使用できるハンドル１８００３を含む。一実施形態において、ベース１８００４はパウチに一体化することができる。例えば、スワブ１８０００をパウチに一体化するように、タブ１８０１０をスワブチャンバ（例えば図１７Ａ及び図１７Ｂのチャンバ３９１０）に挿入してスワブチャンバ内で密封することができる。図１７Ａ及び図１７Ｂにおいて、例えばスワブ１８０００をスワブ３９１２の代わりに使用し、開口３９２３の近傍でスワブチャンバ３９１０に挿入することができる。一実施形態において、タブ１８０１０を、パウチの製造に使用されるフィルム層に熱シールするか、又は、タブ１８０１０もしくはスワブチャンバの開口のフィルム層に置いた接着剤でスワブチャンバの開口に接着することができる。
[00358] 図１８Ｂはスワブ１８０００の一部分解図を示す。ベース１８００４は例示的に、上部１８００２のリング１８０１２を挿入することができるアクセプタリング１８０１４を含む。図示されている実施形態において、ベース１８００４のアクセプタリング１８０１４は、上部１８００２をベース１８００４内にねじって入れた場合に上部１８００２のリング１８０１２の相補的なタブ（図示せず）に着脱可能にロックできるロックタブ１８０１６を含み得る。他のスワブシステムは例示的に、ねじ式機構、スナップ嵌め、摩擦嵌め等を含み得る。
[00359] 他の実施形態では、サンプルをパウチ内に導入するため、スワブの代わりに全量ピペット等を使用することができる。当技術分野において既知のタイプの全量ピペットを使用すればよい。図１９Ａ及び図１９Ｂは、サンプルを捕捉し移送するために使用できる全量ピペット１９０００ａ及び１９０００ｂの２つの実施形態を示す。全量ピペット１９０００ａは、球状部１９００２ａと、軸１９００４ａと、軸１９００４ａの遠位端に位置決めされ得る媒質プラグ１９００８と、を含む。図示されている実施形態において、媒質１９００８は１対のフリット１９００６及び１９０１０によって所定位置に保持することができる。全量ピペット１９０００ｂは、球状部１９００２ｂと、軸１９００４ｂと、軸１９００４ｂの遠位端のスワブ状材料１９０１２とを含む。一実施形態において全量ピペットは、全量ピペット１９０００ａの媒質１９００８と全量ピペット１９０００ｂのスワブ状材料１９０１２を組み合わせてもよい。挿入リング１８０１２と同様の挿入リングを、例えば球状部１９００２ａ又は１９００２ｂの下方に提供することで、全量ピペット１９０００ａ又は１９０００ｂを図１８Ａ及び図１８Ｂのスワブと同様に用いてパウチを密封してもよい。
[00360] 媒質１９００８は、例えばサンプルから選択した１又は複数の被分析物を捕らえて濃縮するためのイオン交換媒質、サイズ排除媒質、疎水性媒質、親和性媒質（例えば捕捉抗体、ヒスチジンタグ等）等とすることができる。スワブ状材料１９０１２は、媒質１９００８と同一の特徴の多くを有することができる。すなわちこれは、サンプルから選択した１又は複数の被分析物を捕らえて濃縮するためのイオン交換基、疎水性基、又は親和性基等を含み得る。いくつかの実施形態では、媒質１９００８又はスワブ状材料１９０１２を介してサンプルをピペットで往復移動させて、サンプルから選択した１又は複数の被分析物を捕らえて濃縮することができる。スワブ状材料１９０１２の場合、全量ピペットをサンプル内で振って（swish）、サンプルから選択した１又は複数の被分析物を捕らえて濃縮することができる。捕捉化学物質及び捕らえた１又は複数の被分析物の性質に応じて、１又は複数の被分析物を分析のためパウチに挿入する前にピペットの作用で洗浄してもよい。全量ピペット１９０００ａ及び１９０００ｂは、干渉性マトリックスを有する尿又は血液のようなサンプルを分析する場合は特に有用であり得る。捕捉特性を用いて、分析前に、微生物量の少ないサンプルから被分析物（例えば細菌又はウイルス）を濃縮することができる。例えば親和性捕捉を用いて、血液から又はわずか数時間の培養後の血液培養から直接に細菌又はウイルスを捕捉し濃縮することができる。これにより、例えば敗血症患者の診断のための時間を大幅に短縮できる。
[00361] ここで図２０Ａから図２０Ｅを参照すると、アレイ内のウェルのための様々なウェル充填経路の例が示されている。図１７Ａ及び図１７Ｂは、アレイフローチャネル３９３２及びらせん形経路３９３０を含む「入り組んだ」アレイウェル充填経路の一例を示している。図２０Ａから図２０Ｅはウェル充填経路の他の例を示す。図２０Ａから図２０Ｅの各例は、ウェル２０００４ａ～２０００４ｅ及びアレイフローチャネル２０００２ａ～２０００２ｅを含む。図２０Ａは、ウェル２０００４ａに通じる直行チャネル２０００６ａを示す。図２０Ｂは、ウェル２０００４ｂに通じるらせん形チャネル２０００６ｂの実施形態を示す。図２０Ｃは、ウェル２０００４ｃに通じるスイッチバックチャネル２０００６ｃを示す。図２０Ｄは、ウェル２０００４ｄに通じるらせん部２０００８ｄ及びスイッチバック部２００１０ｄを含むチャネル２０００６ｄを示す。図２０Ｅは、ウェル２０００４ｅに通じるらせん形スイッチバック部２０００８ｅ及び平行スイッチバック部２００１０ｅを含むチャネル２０００６ｅを示す。図２０Ａから図２０Ｅに示されているウェル及びチャネルは、パウチ内に配置された場合、少なくとも１つのフィルム層によって上部と下部で密封される。このため、ウェル内への流路はフローチャネルとウェルチャネルを通るものだけである。これらの経路の「入り組んでいる」程度は異なるが、概してフローチャネルとウェルチャネルの組み合わせによってウェルを相互に隔離し、ウェル間の混合（すなわちクロストーク）を抑制する。前述の例は入り組んだウェル充填経路を説明するための単なる例であり、他のウェル充填経路も使用できることは認められよう。
[00362] 閉鎖系におけるビーズ使用に伴う１つの問題は、ビーズが所望のサンプル成分と共に下流へ運ばれることがある点である。例えば、パウチ５１０で使用されるビーズ破砕ビーズ（例えばケイ酸ジルコニウムビーズ）又は磁気ビーズは、核酸回収もしくはＰＣＲ増幅に使用される下流のブリスタ内へ、又はビーズがシールに影響を及ぼし得るチャネル内へ運ばれることがある。同様に、溶解粒子及び磁気ビーズは空隙体積を有するので、いくつかの実施形態では、パウチ３９００等のパウチにおいてＰＣＲのようなプロセスから溶解粒子及び／又は磁気ビーズを分離することが望ましい場合がある。磁気ビーズは磁石によって隔離することができ、溶解粒子は大きさと質量によって沈殿するが、これらのプロセスは必ずしもパウチ内のビーズ移動を排除するわけではなく、また、必ずしもビーズ内に捕らえられる液体体積に対処するわけではない。
[00363] 一実施形態では、パウチ内の１つ以上のチャンバ間にフィルタ要素を挿入することによって、ビーズ（例えば溶解粒子）がブリスタからブリスタへ（また、ブリスタ間のチャネルを通って）流れるのを防止することができる。フィルタ要素を含むそのようなパウチの実施形態が図２１Ａに示されている。図２１Ｂはフィルタの断面図を示し、図２１Ｃ及び図２１Ｄはパウチ内フィルタの代替的な実施形態を示す。図２１Ａに示されているパウチ２１０００は、図１７Ａ及び図１７Ｂに示されているパウチと同様であるが、多機能チャンバが容器ゾーン２１００２と反応ゾーン２１００４に分割されている点が異なる。しかしながら、パウチ２１０００はフィルタを示すが、いくつかのパウチ実施形態ではフィルタを省略できることは理解されよう。図１７Ａから図１７Ｃに示されている実施形態と同様、スワブ２１０１２を用いてサンプルを収集し、このスワブをサンプルチャンバ２１０１０に挿入することにより、サンプルをパウチ２１０００内に導入できる。あるいは、ピペットを用いてサンプルをサンプルチャンバ２１０１０内に投入してもよい。いずれの場合も、サンプルチャンバを密封して、シール２１０１１ａによってサンプルチャンバ２１０１０ａを形成すると共にシール２１０１１ｂによって廃棄物チャンバ２１０１０ｂを形成することができる。いくつかの実施形態では、より多くのシールを配置してもよい。溶解のため、サンプル緩衝剤を２１００８ａからサンプルチャンバに移動させてサンプルを水和及び／又は調製することができる。一実施形態において、サンプル溶解は溶解ゾーン２１００２内で（例えばビーズ破砕によって）、サンプル、ジルコニウム溶解粒子２１００３、及び溶解緩衝剤を用いて実行できる。溶解の後、溶解物を溶解ゾーン２１００２からフィルタ２１０２４を介して反応ゾーン２１００４へ放出することができる。溶解粒子２１００３を溶解ゾーン２１００２から反応ゾーン２１００４へ移送できないように、フィルタ２１０２４を所定位置で密封すればよい。
[00364] 溶解ゾーン２１００２における溶解と、反応ゾーン２１００４への溶解物の放出の後、パウチ３９００についての記載と同様にパウチ２１０００を使用することができる。磁気シリケートビーズによる核酸回収、ビーズ洗浄による望ましくない溶解物成分の除去、溶出、第１段階ＰＣＲ、及び第１段階ＰＣＲ生成物の希釈といったプロセスを、反応ゾーン２０００４において実行できる。希釈した第１段階反応生成物を用いて、第２段階ＰＣＲ用のアレイ２１０８１のウェル２１０８２を充填することができる。反応ゾーン２１００４で実行されるステップのための試薬は、試薬ブリスタ２１００８ｂ、２１００８ｃ、．．．２１００８（ｎ）から提供できる。パウチ内の流体移動は、シール２１００９ａ～２１００９ｈのいくつか又は全てによって制御することができる。
[00365] 例示的にパウチ２１０００は、２層の可撓性プラスチックフィルム、又は、例えばポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリメチルメタクリレート、及びそれらの混合物のような他の可撓性材料で形成することができる。一実施形態において、パウチ２１０００は、ブリスタ及びチャネルが形成されるように少なくとも２層のプラスチックフィルムを積層することによって製造される。例えば、これらのフィルム層を熱積層し、次いでレーザ溶接して、限定ではないがブリスタ、試薬チャンバ、及びサンプルチャンバのような様々な領域を画定する。一実施形態において、パウチ２１０００の製造は、フィルタ２１０２４を挿入することができるポケット２１０２０又は同様の構造を形成することを含む。一実施形態では、２１０２６ａ及び２１０２６ｂに示されているようにフィルタ２１０２４の端部をパウチフィルム層に熱シールすることができる。フィルタ２１０２４をポケット２１０２０に挿入した後、フィルタポケットをシール２１０２９ａによって閉鎖すればよい。
[00366] 図２１Ｂは、フィルム層２１０３０と２１０３２との間でポケット２１０２０内に位置決めされたフィルタ２１０２４の断面を示す。フィルタ２１０２４の端部にシール２１０２６ａ及び２１０２６ｂを見ることができる。一実施形態において、シール２１０２６ａ及び図２１０２６ｂはフィルタの端部を押し合わせ、フィルタ材料とフィルム層を融合させる。シール２１０２９ａも図示されている。シール２１０２９ａはフィルタから離れた場所に形成されてポケットを閉じ、液体がポケットから流出するのを防止できる。図示されている実施形態において、フィルタ２１０２４並びにフィルム層２１０３０及び２１０３２は、フィルム層に平行なフィルタの面で熱シールされている（２１０３４）。これによって、材料がフィルタ周囲に流れるのを防止する。例えば、溶解ゾーン２１００２から反応ゾーン２１００４へ流れる流体はフィルタ２１０２４を通って流れるが、フィルタ２１０２４の周囲には流れない。代替的な実施形態（図示せず）では、フィルタはポケット内で熱シールされず、器具内でフィルタの面と端部を強く圧縮することによってフィルタの周囲に流体が流れるのを防止できる。いずれの場合も、フィルタはチャネルと交差するように配置され、例示的にチャネルよりも幅が広く、比較的大きい表面積を有するフィルタであるため、溶解物は詰まることなくフィルタを通って流れることができる。
[00367] フィルタ材料の選択は、サンプルのタイプ及び所望の細孔径に依存する。一般に、フィルタの細孔径は、溶解粒子以外の液体中の全ての材料を通過させ得るのに充分な大きさに選択される。一実施形態において、フィルタの細孔径は約５～１００μｍ（例えば５０～９０μｍ又は７～１２μｍ）の範囲である。好ましくは、フィルタ要素は、パウチの形成に使用される１又は複数の材料とコンパチブルな材料から作製され、パウチもフィルタも損なうことなくフィルタをポケット内で熱シールできるようになっている。適切なフィルタは、限定ではないが、Porexによって作製された様々なポリエチレンフィルタを含む（例えばPOR-4903及びXS-POR-7744）。
[00368] フィルタの設置及び位置決めと同様、アレイ２１０８１をポケット２１０２２に挿入し、パウチフィルム層間で熱シールし、次いで２１０２９ｂで密封してアレイポケットを閉じることができる。また同様に、試薬ブリスタ２１００８ａ～２１００８ｃをフィルム層間のポケットとして形成することができる（他の実施形態ではこれよりも多数又は少数の試薬ブリスタが使用され得る）。これらの試薬ポケット内に液体もしくは乾燥試薬、又はこれらの組み合わせを配置し、次いでシール２１０２８ａ～２１０２８ｃを適用して試薬ブリスタの端部を密封することができる。
[00369] 図２１Ｃ及び図２１Ｄは、パウチ内にフィルタを配置する代替的な実施形態を示す。図２１Ｃ及び図２１Ｄの実施形態は、図２１Ａ及び図２１Ｂに示されている実施形態と同様である。図２１Ｃ及び図２１Ｄに示されている実施形態の各々は、溶解ゾーン２１００２ａ及び２１００２ｂ、各溶解ゾーン内の溶解粒子２１００３ａ及び２１００３ｂ、並びに反応チャンバ２１００４ａ及び２１００４ｂを含む。図２１Ｃ、図２１Ｄ、及び図２１Ａの違いは、ポケット内にフィルタを配置する方法と、溶解ゾーン及びフィルタを密封する方法である。図２１Ｃにおいて、フィルタ２１０２４ａは溶解ゾーン２１００２ａの一端２１０２９ｅにおいてポケット２１０２０ａ内に配置される。フィルタの端部及びフィルムに平行な面は、図２１Ｂに示されているように密封できる。溶解ゾーン２１００２ａは、フィルタの反対側の２１０２９ｃで密封されている。図２１Ｄにおいて、フィルタポケット２１０２０ｂは溶解ゾーン２１００２ｂの一端においてフィルタ２１０２４ｂを受容するように形成できる。シール２１０２９ｄは、溶解ゾーン２１００２ｂを閉鎖すると共にポケット２１０２０ｂ内にフィルタを密封するよう配置できる。
[00370] 図２１Ｃでは、ビーズ２１００３ａが重力によってフィルタ２１０２４ａ上に沈殿すると共に、溶解物が重力と溶解ゾーン２１００２ａに加えられた圧力の組み合わせによってフィルタ２１０２４ａを通って流れるように、溶解ゾーン２１００２ａは反応チャンバ２１００４ａに対して位置決めされている。図２１Ｄでは、ビーズ２１００３ｂが重力によって溶解ゾーン２１００２ｂの端部２１０２９ｆに（フィルタ２１０２４ｂから離れた場所で）沈殿すると共に、流体が溶解ゾーン２１００２ｂに加えられた圧力によって溶解ゾーン２１００２ｂからフィルタ２１０２４ｂを介して反応ゾーン２１００４ｂへ（図２１Ｄに示されているように左から右へ横方向に）移動するように、溶解ゾーン２１００２ｂは反応チャンバ２１００４ｂに対して位置決めされている。図２１Ｃ及び図２１Ｄに示されている双方の実施形態では、フィルタの大きい表面積によって、溶解物中の細胞残屑や他の材料で詰まるリスクを抑えながら、流体がフィルタを通って流れることが可能となる。
[00371] 図２２Ａ及び図２２Ｂを参照すると、ウェル２２０８２ａ及び２２０８２ｂの追加の実施形態が示されている。図２２Ａのウェル２２０８２ａはアレイカード２２０８１ａの一部であり、図２２Ｂのウェル２２０８２ｂはアレイカード２２０８１ｂの一部である。ウェル２２０８２ａ及び２２０８２ｂは、ウェル内部の特徴をより良く図示するため切断図で示されている。ウェル２２０８２ａ及び２２０８２ｂは、充填チャネル２２０３０及びウェル充填チャネル２２０３２によってアクセスされる。図２２Ａのウェル２２０８２ａは、ウェル２２０８２ａの直径よりも小さい第１の直径によって画定された第１の壁２２０８３ａと、ステップ２２０８４ａと、ウェル２２０８２ａの直径と実質的に等しい第２の直径によって画定された第２の壁２２０８５ａと、ウェル充填チャネル２２０３２に通じるステップ２２０８６ａと、を含む。図２２Ｂのウェル２２０８２ｂは、カード２２０８１ｂの上部及び下部から隔離された第１の壁２２０８３ｂと、第２の上部壁及び下部壁２２０８５ｂ及び２２０８７ｂと、上部ステップ２２０８４ｂと、下部ステップ（図示せず）と、を含む。
[00372] 一実施形態において、第１の壁２２０８３ａ及び２２０８３ｂはカードの少なくとも１つの表面から隔離することができるので、アレイカードの上部及び下部の一方又は双方に試薬及び／又は反応成分が接触することなくウェル内に化学物質を提供することができる。例えばいくつかの例では、ウェルに投入された液滴が充填チャネル２２０３０及びウェル充填チャネル２２０３２に接触し得る場合、液滴がこれらのチャネル内に毛管作用で運ばれる可能性があることが観察された。充填チャネル２２０３０及びウェル充填チャネル２２０３２から隔離されたウェルの領域に（例えば第１の壁２２０８３ａ及び２２０８３ｂに）液滴を投入することによって、液体が毛管作用で充填チャネル２２０３０及びウェル充填チャネル２２０３２及び他のウェルに運ばれることなく液滴を投入できる。ウェル２２０８２ｂの第１の壁２２０８３ｂはカードの上面及び下面から隔離されているので、試薬及び／又は反応成分を更に隔離し、汚染されにくくすることができる。
[00373] 図２３Ａ及び図２３Ｂは、別々の試薬及び／又は反応成分をスポットすることができる２つの相互接続された同時充填可能ウェルを含む反応ウェルの実施形態を示す。これらの試薬及び／又は反応成分は、反応ウェルを流体であふれさせた場合に結合する可能性がある。反応ウェル２３０８２は、アレイカード２３０８１上のウェルアレイの一部とするか、又は別個のものとすることができる。反応ウェル２３０８２は、ウェル内部の特徴をより良く図示するため、図２３Ａにおいて平面図で示されると共に図２３Ｂにおいて切断図で示されている。反応ウェル２３０８２は、充填チャネル２３０３０及びウェル充填チャネル２２０３２によってアクセスできる。反応ウェル２３０８２は、第１のサブウェル２３０８２ａと、第２のサブウェル２３０８２ｂと、第１及び第２のサブウェル間の共通表面を形成するステップ２３０８４と、を含む。図２３Ｂを参照すると、第１のサブウェル２３０８２ａは第１の実質的に円筒形の壁２３０８３ａを含み、第２のサブウェル２３０８２ａは第２の実質的に円筒形の壁２３０８３ｂを含む。第１及び第２の壁２３０８３ａ及び２３０８３ｂは、ステップ２３０８４と、反応ウェル２３０８２を取り囲む第２の壁２３０８５とに接続している。
[00374] 一実施形態において、第１のサブウェル２３０８２ａは第１の乾燥試薬及び／又は反応成分を含み、第２のサブウェル２３０８２ｂは第２の乾燥試薬及び／又は反応成分を含み得る。これらの試薬及び／又は反応成分は、反応ウェル２３０８２及び棚スペース２３０８４を流体であふれさせた場合に結合する可能性がある。一実施形態において、第１及び第２のサブウェル２３０８２ａ及び２３０８２ｂ内の試薬及び／又は反応成分は、分析方法において共に機能するよう意図された成分であるが、それにもかかわらず、必要となるまではそれらを分離したまま維持することが望ましい場合がある。例えば、第１のサブウェル２３０８３ａ内の試薬及び／又は反応成分はＤＮＡポリメラーゼ（例えばタックＤＮＡポリメラーゼ）を含み、第２のサブウェル２３０８３ｂ内の試薬及び／又は反応成分はｄＮＴＰを含み得る。反応混合を完了させる成分（すなわちポリメラーゼ及びｄＮＴＰ）は反応が開始するまで別々のコンパートメントに保持されるので、このような反応ウェルは「ホットスタート」方法を必要とすることなく適切に使用され得る。別の例では、第１のサブウェル２３０８３ａ内の試薬及び／又は反応成分は酵素を含み、第２のサブウェル２３０８３ｂ内の試薬及び／又は反応成分は基質を含み得る。同様に、第１及び第２のサブウェル２３０８３ａ及び２３０８３ｂ内の試薬及び／又は反応成分は、反応において１又は複数のエピトープの存在を検出するための抗体結合対を含み得る。図２３Ａ及び図２３Ｂは、２つの相互接続された同時充填可能ウェルを含む反応ウェルの実施形態を示すが、このような反応ウェルが３つ以上（例えば３又は４又は５）の相互接続された同時充填可能ウェルを含み得ること、また、３つ以上の相互接続された同時充填可能ウェルの各々に、分析方法のためインサイチュで結合し得る試薬及び／又は反応成分を提供できることは認められよう。
アレイのスポット方法
[00375] 図２４Ａから図２４Ｆは、アレイカード２４０８１のウェル２４０８２内に試薬及び／又は反応成分を適用する（すなわちスポットする）ための方法を示す。簡略化のため１つだけウェルが図示されているが、この方法を用いて２つ以上（例えば数十から数百）のウェルを同時にスポットできることは当業者には認められよう。一実施形態において、複数のウェルを同時にスポットすることには、援用により全体が本願に含まれる米国特許公報第２０１５／０２８３５３１号に記載されているスポット装置と同様の装置を使用すればよい。同様に、図２４Ａから図２４Ｅに示されているウェル２４０８２は図２２Ａを参照して記載されているウェルと同様であるが、これは単なる例示であり、スポットされる１又は複数のウェルが他の構成を有し得ることは当業者には認められよう。
[00376] 図２４Ａは初期状態を示す。アレイカード２４０８１は、ウェル２４０８２と、第１の壁２４０８３と、ステップ２４０８４と、第２の壁２４０８５と、を含む。興味深いことに、アレイカード２４０８１及びウェル２４０８２は、試薬及び／又は反応成分を１又は複数のアレイウェルにスポットする前に適用される裏当てフィルム等を備えていない。試薬及び／又は反応成分の液滴をウェル２４０８２へ送出するため、ウェル２４０８２に対してカニューレ２４００２が位置決めされている。一実施形態において、カニューレはウェル２４０８２を通過できるような大きさ及び寸法に形成されている。一実施形態において、ウェルをスポットするための装置（図示せず）は、カニューレ２４００２に対してカード２４０８１を位置合わせするためのアライメントピン等を含み得る。米国特許公報第２０１５／０２８３５３１号に記載されているように、カニューレ２４００２を液体試薬及び／又は反応成分の貯蔵部に接続し、この貯蔵部から要求に応じてウェル２４０８２に液体スポットを供給することができる。２つ以上のウェルをスポットするため２つ以上のカニューレを含む装置では、各カニューレをそのカニューレに固有の試薬及び／又は反応成分の貯蔵部に接続するか、又は、いくつかもしくは全てのカニューレを、同一の試薬及び／又は反応成分を有する１又は複数の共通の貯蔵部に接続することができる。
[00377] 図２４Ｂでは、カニューレ２４００２をカード２４０８１に対して下降させることでカニューレ２４００２はウェル２４０８２を貫通している。あるいは、カニューレに対してカードを移動させてもよい。以下の記載ではカードに対してカニューレを移動させることに言及するが、本記載の精神から逸脱することなくカニューレに対してカードを移動させてもよいことは認められよう。また、カード２４０８１は水平に図示され、カード２４０１８よりも上方にカニューレ２４００２が位置決めされているが、カード２４０８１を垂直に提供すると共にカニューレ２４００２をカード２４０８１の側方から入るように位置決めすることを含む他の配向も可能である。
[00378] 図２４Ｃに示されているように、カニューレがカードを貫通した状態で、カニューレ２４００２の中に試薬及び／又は反応成分２４００４を送り込み、カニューレ２４００２の端部に液滴２４００６ａを形成することができる。図２４Ｄに示されているように、次いでカニューレ２４００２を後退させればよい。カニューレ２４００２が後退している時に液滴２４００６ｂが壁２４０８３で捕捉されるので、カニューレ２４００２が完全に後退すると（図２４Ｅ）、液滴２４００６ｂはウェル２４０８２内に残る。スポットの後、試薬及び／又は反応成分液滴２４００６ｂ中の溶媒を蒸発させて、乾燥した試薬及び／又は反応成分をウェル２４０８２内のフィルム又はリング２４００７に残すことができる（図２４Ｆ）。しかしながら、図２４Ｅに示されているフィルム又はリング２４００７は単なる例示であり、試薬及び／又は反応成分の組成及び濃度に応じて試薬及び／又は反応成分は他の形態に乾燥し得ることは認められよう。一実施形態において、ウェル内でスポットされる試薬及び／又は反応成分は、反応緩衝剤、安定化緩衝剤、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、核酸結合色素、Ｍｇ＋＋、又はアッセイ特異的プライマーのうち１つ以上を含み得る。しかしながら、ＰＣＲ反応混合物の場合、ウェルが高温になって流体であふれるまで反応混合が完了しないように、反応混合の成分のうち少なくとも１つ（例えばｄＮＴＰ又はポリメラーゼ）を概ね省略してもよい。すなわち、ウェルが流体であふれた時にのみ反応混合が完了するように、流体には概して１又は複数の足りない成分がある。
[00379] 一実施形態において、２４０８１のようなアレイカード（試薬及び／又は反応成分が提供されているか又は提供されていない）を用いてパウチ（例えばパウチ３９００又は２１０００）を製造するには、２つ以上のフィルム層の間に前もって形成されたポケット内にアレイを挿入し、（例えば熱シールによって）フィルムをアレイに密封してウェルの上面及び下面を密封し、（例えば熱シール、音波溶接、又はレーザ溶接によって）前もって形成されたポケットを密封すればよい。一実施形態では、２つ以上のフィルム層を積層し、画定されたエリア（例えば反応ブリスタ、試薬ブリスタ、１又は複数のポケット等）を形成した後に、フィルム層間にアレイを位置決めすることができる。別の実施形態では、少なくとも２つのフィルム間にアレイカードを位置決めし、このカードの周囲に、画定されたエリア（例えば反応ブリスタ、試薬ブリスタ、１又は複数のポケット等）を形成することができる。
[00380] 一実施形態では、アレイを流体であふれさせるように、アレイポケットを１又は複数の上流の流体ブリスタに流体接続することができる。一実施形態において、アレイは、例えば図１７Ａ及び図１７Ｂに示されているもののような流体チャネルシステムを含み、アレイの個々のウェルに流体を充填できるようになっている。一実施形態において、アレイは、例えば図１７Ａ及び図１７Ｂに示されているもののような真空ポート及び真空チャネルシステムを含み、アレイをインサイチュで部分的に排気できるようになっている。
器具類
[00381] 例えば図１、図５Ａ、図７、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、又は図２１Ａを参照して本明細書に記載されているパウチは、図２に示されている器具と同様の器具で使用されるように構成できる。以下で、本明細書に記載されるパウチと共に使用され得る器具及び器具コンポーネントの代替的な実施形態について説明する。本明細書に記載されるパウチと共に使用され得る器具の追加の実施形態は、例えば、援用により全体が本願に含まれるＰＣＴ／ＵＳ１７／１８７４８号で見ることができる。
[00382] 典型的に、ＰＣＲ及び同様のプロセスのための熱サイクリングは、ヒータと熱的に接触している１つ以上のサンプルの温度を熱調節するように温度の上昇及び下降を行うヒータサイクルを用いて達成される。例えば図２のヒータ８８６及び８８８を参照のこと。ヒータ８８６及び８８８を熱サイクルさせることにより、ＰＣＲ部分の実行時間は必然的に、ヒータが各遷移において適切な温度に到達するのに要する時間と少なくとも同じである必要がある。ヒータの温度を変更する必要がない場合は実行時間が短縮し得ることは理解されよう。図２５から図２７Ｄは、第１段階ＰＣＲ増幅の別の実施形態を示す。この例示的な実施形態では、ブリスタ５４８及び５６４を単一のブリスタ５４９に置き換えることができ、例示的な器具はヒータ９８６及び９８７を含む温度制御要素を備えることができる。しかしながら、ブリスタ５４８及び５６４のうち１つを使用すると共に、より小さいヒータ９８６、９８７を使用してもよいことは理解されよう。また、ブリスタ５４９を単独で使用するか、又は、細胞溶解及び／又は追加の増幅のためのコンポーネントを含む場合も含まない場合もある他の実施形態と組み合わせて使用してもよいことは理解されよう。そのようなコンポーネントは例えば、限定ではないが、図５Ａ、図７、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃを参照して記載されているパウチである。図２５から図２７Ｄの実施形態は、図１７Ｃの多機能チャンバ４００２ａの内容物を熱サイクルさせるのに特に適している。
[00383] ヒータ９８６、９８７は、ペルチェ素子、抵抗ヒータ、誘導ヒータ、電磁ヒータ、薄膜ヒータ、印刷要素ヒータ、正温度係数ヒータ、当技術分野において既知の他のヒータ、又は複数のヒータタイプの組み合わせ（例えばペルチェ熱電ヒータ／クーラデバイスと抵抗ヒータとを含むヒータ要素）とすればよい。しかしながら、アニーリング温度と変性温度との間で熱サイクルするよう提供されているヒータ８８６とは異なり、一例では、ヒータ９８６を例えば９４℃の適切な変性温度で提供し、ヒータ９８７を例えば６０℃である適切なアニーリング温度で提供することができるが、当技術分野において既知のように他の例示的な変性温度及びアニーリング温度も使用できる。いくつかの実施形態では、ヒータ９８６を９４℃よりも高い温度に設定すると共にヒータ９８７を６０℃よりも高い温度に設定し、流体が温度に到達すると迅速にこれらのヒータの各々によって流体を循環させ、これによってランプレートを増大させることが望ましい場合がある。このような実施形態は、高いプライマー及びポリメラーゼ濃度と共に使用するのに適切であり得る。例示的に、ヒータ９８６とヒータ９８７との間に隔離スペーサ９８３を提供してもよい。発泡体、プラスチック、ゴム、空気、真空、ガラス、又は例示的に伝導率の低い他の任意の適切な材料を含む、任意の適切な絶縁性材料を使用できる。ヒータ９８６及び９８７が概ね一定の温度に保持される実施形態では、実行時間及びエネルギ使用を著しく低減することができる。
[00384] 説明のための例では、ワイパ９８９を含むワイパヘッド９１０がブリスタ５４９の上面５４９ｂに係合する（engage）。流体がブリスタ５４９内に移動すると、ワイパ９８９の本体９１３がブリスタ５４９をヒータ９８６、９８７に接触させるようにワイパ９８９を移動させ、このためブリスタ５４９の一部はヒータの各々に接触して、ヒータの各々からブリスタ５４９の一部への熱伝達を可能とする。次いで、１つ以上のブレード９４９を用いてブリスタ５４９の１つのエリアから別のエリアへサンプル５７２を移動させることができる。
[00385] 多くの場合、流体がコンパートメント内に入った時、流体がそのコンパートメントの入口近傍に留まることや、コンパートメントの内容物が充分に混合されないことがある。これは図２７Ａに概略的に示されている。図２７Ａに図示されているブリスタ５４９は不規則な形状を有し、ヒータ９８６及び９８７と良好に接触しないことがある。ブリスタ５４９の体積、追加されたサンプル５７２の体積、サンプルの内容物等に応じて、流体５７２は不規則な形状であり、流体の大部分はサンプルがブリスタに注入された場所の近くに集まることがある。これが特に当てはまるのは、コンパートメントが膨張可能であり、流体の追加前に部分的もしくは完全に折り畳まれている場合、又は流体がコンパートメントを完全に充填するには充分でない場合である。サンプル５７２がチャネル５５２ａを介してブリスタ５４９内に入り、チャネル５５２ａの近傍に留まるので、ブレード９４９の係合によってサンプル５７２のほとんど又は全てがセクション５４９ｃ内に閉じ込められる実施形態を想像することができる。従って、ブレードの係合前に流体をコンパートメント全体に広げることが望ましい場合がある。このため、図２７Ｂに示されているように、ワイパヘッド９１０をブリスタ５４９に接触するまで下降させて、サンプル５７２をブリスタ５４９全体に広げて流体５７２をブリスタ５４９内で均等に分散させることで、ブリスタ５４９を規則的な形状にすると共に、ヒータ９８６及び９８７と良好で一貫した接触状態になるようブリスタ５４９を押圧することができる。
[00386] 一実施形態において、ワイパヘッド９１０は、ブリスタ５４９に圧力を加えてサンプル５７２をブリスタ５４９全体に広げる圧力部材９８１を備えることができる。例示的に、部材９８１の使用はいくつかの利点を有する。その１つは、サンプル５７２の多くを薄い層でヒータ９８６、９８７全体に広げることで体積に対する表面積の比が増大するので、サンプル５７２との間の熱伝達が改善するはずである点である。同様に、流体は迅速に熱サイクルされている、すなわちサンプル５７２の液体はヒータ９８６及び９８７によって温度が迅速に上昇及び下降しているので、液体をブリスタ５４９内で薄い層に広げると、所与の温度における休止時間が短縮し、サンプルの多くが迅速にターゲット温度に到達できる。また、以下で検討するように、ワイパ９８９の形状に応じて、部材９８１からブリスタ５４９に対する圧力はサンプル５７２を広げるので、ワイパ９８９のブレード９４９の係合によりブリスタ５４９内のサンプル５７２が比較的均等な又は比例した体積に分割される。ブレード９４９の係合前に部材９８１から圧力を加えると、サンプル５７２の一部がブリスタ５４９の各セクションへ押しやられる。
[00387] 一実施形態において、部材９８１は圧縮可能又は半圧縮可能である（例えば、圧縮可能又は半圧縮可能材料で形成されているか又はそのような材料を含む）。そのような材料は、圧縮可能又は半圧縮可能な発泡体、プラスチック、もしくはゴムを含むか、又は、より硬い材料であるが、部材９８１とワイパ本体９１３との間に、ばね式、エラストマ、又は他の付勢のための部材もしくは力を有することで、サンプル５７２がブリスタ５４９内に移動した場合にサンプル５７２はブリスタ５４９全体に広がるが、部材９８１は適宜圧縮してサンプル５７２のための充分な空間を可能とするようになっている。当技術分野において既知である他の圧縮可能又は半圧縮可能材料も使用できる。あるいは、部材９８１は実質的に剛性であり、部材９８１とヒータ９８６、９８７との間に、サンプル５７２をブリスタ５４９全体に広げるために充分な空間のみを提供するような位置に設定することも可能である。
[00388] 例示的な実施形態では、図６に示されているように、ワイパ９８９はｘ字形ブレード９４９を有し、これは部材９８１を貫通して延出し、ワイパ９８９を４つのセクション９４５、９４６、９４７、９４８に分割する。図２７Ｃ及び図２７Ｄに示されているように、ワイパ９８９及びブレード９４９は少なくとも２つのモードでブリスタに接触できる。図２７Ｃに示されているように、ワイパ９８９は、部材９８１が部分的に圧縮されてブレード９４９が部分的にブリスタ５４９に衝突するまで下降させることができる。図２７Ｃのモードにおいてワイパヘッド９１０を回転させた場合、ブレード９４９の作用を用いて撹拌作用を与え、ブリスタ５４９の内容物５７２を完全に混合することができる。
[00389] 図２７Ｄに示されているように、ワイパヘッドを更に下降させて部材９８１を更に圧縮させ、ブレード９４９がブリスタ５４９に充分に衝突した場合、ブレードはブリスタを別個のセクションに分割することができる。例えばｘ字形ブレード９４９では、図７に示されている通り、ブレード９４９がブリスタ５４９を対応する４つのセクション５４９ａ、５４９ｂ、５４９ｃ、５４９ｄに分割するように、ブレード９４９は充分な圧力でブリスタ５４９に接触できる。軸９９３を中心としてワイパ９８９を回転させると、ブリスタ５４９内の流体はブリスタ５４９内で円形運動を生じる。一実施形態では、ブレード９４９によって流体の各部分をヒータ９８６及び９８７の各々で同時に加熱することができ、流体の一部分を一方のヒータの温度制御から移動させながら流体の他の部分を他方のヒータの制御下に置くことができる。部材９８１はブリスタ５４９の内容物を圧縮する。従って部材９８１は、流体５７２をブリスタ５４９全体に広げ、ブリスタ５４９とヒータ９８６及び９８７との間の接触を改善することに加えて、ブリスタ５４９の内容物を別のブリスタへ押し込むことができる。例えば、第１段階熱サイクリングが完了した後に出口チャネルを開いて、流体がブリスタから流出する経路を開放することができ、これと共に部材９８１は元の形状に戻る。一実施形態において、流体は、チャネルに流体接続されているブリスタの四分円からのみ流出できる。各四分円が順番に出口チャネルに接続されるように、ワイパ９８９を回転させることができる。
[00390] 例示的にブレード９４９は、ゴムもしくはエラストマ材料とするか、又は、ブリスタ５４９を複数のセクションに分割してブリスタ５４９内の流体を移動させるのに充分な剛性を有するがブリスタ５４９に穴をあけたり破いたりしないテフロンもしくはデルリン等の汚れが付かない材料とすることができるが、そのような材料は単なる例示であり、当技術分野において既知である他の材料も使用できることは理解されよう。あるいは、ブレード９４９の代わりにローラ又はブリスタ５４９内の流体の移動を可能とする他の構成を用いてもよい。ワイパ９８９及びブレード９４９を含むワイパヘッド９１０は、任意のモータ、カム、クランク、ギア機構、油圧式機械、空気圧式機械、又は当技術分野において既知の他の手段によって、所定位置に移動させて回転させることができる。このような移動は連続的とするか、又は、ワイパ９８９及びブレード９４９を段階的に移動させ、例示的に０．１秒から１分以上停止させることでサンプルの各部分をヒータ９８６、９８７の各々の制御下に保持し、その後、次の位置に移動させてサンプルの異なる部分をヒータ９８６、９８７の各々の制御下に保持することができる。ワイパ９８９の動きは、時計回りもしくは反時計回りの円形運動とするか、又は時計回りと反時計回りが交互になるように方向を逆転させることができる。ワイパ本体９１３及びブレード９４９を単一の固定ユニットとし、単一の固定ユニットとして移動させるか、又はブレード９４９の移動とは別個に本体９１３をブリスタ５４９と接触するように及び接触しなくなるように移動させ得ることは理解されよう。また、ブリスタ５４９の円形の形状と回転運動は単なる例示であり、他のサンプル容器の形状も可能であること、更に、ブレード又はローラには、例えば線形、曲線、及び半円形の運動のような非回転の移動も可能であることは理解されよう。
[00391] 上記で検討したように、ワイパ９８９はｘ字形ブレード９４９を備え、これによって、図２５で最もよく見られるようにワイパを４つのセグメント９４５、９４６、９４７、９４８に分割し、同様に、図２６で最もよく見られるようにブリスタ５４９を４つのセグメント５４９ａ、５４９ｂ、５４９ｃ、及び５４９ｄに分割する。しかしながら、これは単なる例示であり、ブレード９４９の任意の形状を使用できることは理解されよう。ブレード９４９の形状の例として、ブリスタ５４９の直径に実質的に対応する単一の線形ブレード、ｓ字形ブレード又はらせん形ブレードを含む単一又は複数の非線形ブレード、ブリスタ５４９の半径に対応する単一のブレード（時計の針と同様）、及び、ブリスタ５４９を複数のセグメントに分割する複数のブレードが挙げられる。ブリスタ５４９を複数の同様のセグメントに分割するブレードでは、異なるセグメント間での加熱制御が向上し、セグメント全体が一度にアニーリング温度及び変性温度になる可能性があるのに対し、ｓ字形、らせん形、及び放射状ブレードでは、複数のボルテックス、渦、及び様々な混合パターンが発生し、ヒータ９８６、９８７によって生成された熱表面全体にサンプルが移動することは理解されよう。また、ブレード材料が少なくなるとヒータと緊密に接触するサンプル量が多くなり、ブレード材料が多くなると流体移動の制御が向上することは理解されよう。どのブレードパターンであっても、ブリスタ５４９内の流体の一部がアニーリング温度になり、他の部分が変性温度になり、更に別の部分がこれらの温度間の遷移状態である可能性があり、これらは全て単一のサンプル容器内にあることは理解されよう。ブレード９４９の形状の選択は、ブリスタの大きさ及び厚さ、ヒータの大きさ、並びに、第１段階熱サイクリングの完了後にブリスタ５４９から材料を放出するためワイパ９８９を使用する望ましさに依存する。
[00392] 例示的な実施形態では、ヒータ９８６及び９８７はそれぞれ例示的に９４℃及び６０℃の固定温度で提供される。しかしながらいくつかの実施形態では、使用中にヒータ９８６及び９８７の温度を調整することが望ましい場合がある。例えば、サンプルを最初にブリスタ５４９へ導入する際に一方又は双方のヒータの温度を上昇させて、流体がブリスタ５４９に入る時の低温を補償することが望ましい場合がある。以下の検討に当てはまる別の例では、ヒータがより迅速にブリスタ内の流体のターゲット温度を達成できるようにヒータを「過度に駆動する（overdrive）」ことが望ましい場合がある。例えば熱サイクリングのターゲット温度が９４℃と６０℃である場合、ヒータを高い方の温度よりも高く（例えば９５～１１０℃の範囲内に）設定すると共に、低い方の温度よりも低く（例えば５９～５０℃の範囲内に）設定することで、サンプル内の流体をいっそう迅速に加熱及び冷却することを可能とする。また、２つのヒータが図示されているが、任意の数のヒータを使用できる。１つの説明のための例では３つのヒータを使用し、そのうち１つを変性温度に設定し、１つをアニーリング温度に設定し、第３のヒータを延伸温度に設定する。別の説明のための例では、第１のヒータは第２のヒータよりも大きいので、サイクルの中でサンプルが第１の温度である時間の方が長い。更に、ブリスタ５４９及びその内容物を固定した状態に維持し、ヒータ９８６、９８７を回転させるか又は横方向に平行移動させてもよいことは理解されよう。
[00393] 例示的に、流体は、図１のパウチのブリスタ５４６と同様の核酸抽出ゾーンからチャネル５５２ａを介してブリスタ５４９内に入り、次いでチャネル５５２ａを閉じることができる。次いで部材９８１がブリスタ５４９を押圧して、ブリスタ５４９とヒータ９８６及び９８７との接触を促進した後、ブレード９４９をヒータ９８６、９８７の方へ移動させ、ブリスタ５４９をセグメント５４９ａ、５４９ｂ、５４９ｃ、及び５４９ｄに分割させる。ワイパ９８９を回転させると、４つのセグメント５４９ａ、５４９ｂ、５４９ｃ、及び５４９ｄの各々におけるサンプルはヒータ９８６との接触からヒータ９８７との接触へ移り、また元に戻る。各セグメント内のサンプルを加熱及び冷却するのに必要な時間量は、ブリスタ５４９のフィルムの厚さ、ブリスタ５４９内の流体層の厚さ、ブリスタ５４９内のサンプルの混合、及びヒータとの接触の量等、多数のファクタに依存する。しかしながら、この例示的な実施形態においてワイパ９８９の１回転はＰＣＲの１サイクルに対応することは理解されよう。
[00394] 上述した熱サイクリングデバイスに加えて、本明細書に記載されているヒータ及びミキサシステムは、閉鎖パウチにおける自動化サンプル調製のためにも使用できる。例えば、以下で更に詳しく記載されるように、ワイパ９４９によってサンプル調製ブリスタの内容物を混ぜながら、ヒータ９８６及び９８７の一方又は双方によって５４９のようなブリスタを加熱することを用いて、細胞（例えば細菌細胞及び哺乳類細胞）を溶解し、その内部の核酸を放出させることができる。この代わりに又はこれに加えて、ブリスタは、カオトロピック剤、洗剤、及び／又は溶解粒子（例えば図１のパウチ５１０の溶解ブリスタ５２２を参照のこと）を含み得る。同様に、熱電冷却デバイス（すなわちペルチェ素子）による加熱及び冷却と混合を用いて、他のサンプル調製プロセスの効率を上げることができる。例えば核酸は、低温（例えば～０～１０℃）では磁気ビーズ（例えば図１の磁気ビーズ５３３）と高効率で結合し、高温（例えば～６０～９０℃）では磁気ビーズから高効率で溶出する。従って、溶解は例示的にブリスタ５４９がヒータ／クーラ９８６と接触している場合に生じ、磁気ビーズ結合は例示的にブリスタ５４９がヒータ／クーラ９８７と接触している場合に生じる可能性があり、以下で検討するように、これらのヒータは横方向に移動することができる。
[00395] ここで図２８Ａ及び図２８Ｂを参照すると、例えば図５Ａ、図７、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃを参照して本明細に記載されているパウチと共に使用するように構成できる器具１２００が示されている。器具１２００は、例えば図２５を参照して検討したワイパ９４９と同様のワイパシステム１０００と、図２５のヒータ９８６及び９８７の特徴部の多くと、を含む。説明のための例において、器具１２００はヒンジカバー１２１０及びシャーシカバー１２２０も含む。ヒンジカバー１２１０は、自己完結型ＰＣＲ用の可撓性パウチを器具内のヒンジカバー１２１０とシャーシカバー１２２０との間に挿入するため開くことができる。シャーシカバー１２２０は、器具１２００の内部コンポーネントの上に配置され、図５Ａ、図７、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｃに示されているもののような可撓性パウチを器具内に位置決めするためのレセプタクルを画定できる。レセプクタクルはパウチの一部と同一の広がりを持つことができる。レセプタクルは、器具内に可撓性パウチを受容するよう構成され、器具の様々なコンポーネントが可撓性パウチと相互作用できるように可撓性パウチを位置合わせすることができる。同様に、レセプタクルは、器具の内部コンポーネントが可撓性容器に接触できるように開口等を含み得る。同様に、ヒンジカバー１２１０は、器具の外部コンポーネントが可撓性容器と相互作用できるように開口等を含み得る。カバー１２１０及び１２２０の上方に、器具１２００はワイパシステム１０００を含む。ワイパシステム１０００は、駆動モータ１０３０、ワイパヘッド１０００、蛍光データを収集するためのカメラ／蛍光光度計１２５０及びマウント１２６０を含む。ワイパシステム１０００は、パウチに接触するため、ベース１０８０の孔１２４０を介して、またヒンジカバー１２１０の１つ以上の孔を介して、矢印１０２０で示されるように上下に移動させることができる。
[00396] 図示されている実施形態では、ワイパシステム１０００を例示的にレール１２３０上で左右に平行移動させることで、ワイパシステム１０００は器具１２００内に挿入されたパウチの様々な領域に接触できる。一実施形態では、ワイパシステム１０００を平行移動させて、ワイパ１１００がパウチの様々な部分と相互作用することを可能とする。例えばワイパシステム１０００は、パウチ内サンプル調製と第１段階ＰＣＲステップのために使用され得る。代替的な実施形態では、ワイパシステム１０００を固定状態に保持すると共にパウチを移動させて、ワイパがパウチの様々な部分に接触することを可能とする。しかしながら、この構成は例示であり、ワイパ、ヒータ、及びサンプル容器を移動させて位置合わせする他の構成が想定されることは理解されよう。ワイパ、ヒータ、及びパウチの任意の組み合わせを可動要素上に配置できること、また、ワイパ、ヒータ、及びパウチ等の平行移動について検討する場合、そのような移動の代わりに、可動要素と連携して動作するワイパ、ヒータ、又はパウチを反対方向に平行移動させることも可能であり、このような反対方向の平行移動が他の要素の構成と矛盾しない任意の実施形態においても利用され得ることは理解されよう。いくつかの実施形態では、パウチ及び他の器具要素の回転運動も想定される。
[00397] ここで特に図２８Ｂを参照すると、器具１２００の内部を更に明確に見られるようにカバー１２１０及び１２２０は除去されている。器具１２００の内部は例示的に、例えばレール１２９２上で矢印１２９４で示されるように平行移動機によって平行移動で往復させることができるヒータアセンブリ１２７０を含む。ヒータアセンブリ１２７０は、第１のヒータ要素１２８６及び第２のヒータ要素１２８７を含む。図示されている実施形態において、ヒータアセンブリは、例示的に駆動モータ１２９６及び駆動部材（例えばねじ切りされたねじ）１２９８を含む平行移動機に機械的に結合できる。ヒータアセンブリ１２７０を、例えばレール１２９２上において平行移動で往復させて、ヒータ１２８６及び１２８７が器具内に設置されたパウチの様々な領域と相互作用することを可能とする。例えば、ヒータ１２８６及び１２８７を第１段階ＰＣＲのために図２５から図２７Ｄに示されているように位置決めできる。同様に、ブリスタ全体を一度に１つのヒータによって制御することができ、ブリスタ（例えば第１段階ＰＣＲブリスタ又は第２段階ＰＣＲブリスタ）を熱サイクルさせるため、平行移動機によってヒータアセンブリ１２７０を往復移動させて、選択されたブリスタを第１のヒータ１２８６の温度制御下に置き、次いで第２のヒータ１２８７の制御下に置くように繰り返すことができる。しかしながら、モータ及びレールは単なる例示であり、他の線形及び非線形の平行移動機も使用可能であることは理解されよう。図示されている実施形態は移動できるヒータを含むが、ヒータアセンブリを移動させる代わりにヒータに対してパウチを平行移動させることで１又は複数の同じ効果を達成可能であること、また、この移動は例えば線形、アーチ形（arcilinear）、又は回転経路に沿う場合があることは認められよう。この例では、パウチの一部の下方でヒータ１２８６及び１２８７を平行移動させることによって、又はワイパシステム１０００と組み合わせることによって、本明細書に記載されているパウチの内容物を加熱及び冷却するためにヒータ１２８６及び１２８７が示されているが、本明細書に記載されているパウチの内容物を加熱及び冷却する他の方法も想定されることは理解されよう。例えば、流体が充填されたブリスタの内容物（例えば１５０～３００μｌ）を２つのヒータ間で往復させて圧縮するため、米国特許第９，５８６，２０８号に記載されているシステムを使用することができる。米国特許第９，５８６，２０８号は援用により全体が本願に含まれる。
[00398] ヒータ１２８６及び１２８７は、ペルチェ素子、抵抗ヒータ、誘導ヒータ、電磁ヒータ、薄膜ヒータ、印刷要素ヒータ、正温度係数ヒータ、又は当技術分野において既知の他のヒータとすればよい。複数のヒータタイプを単一ユニットにおいて組み合わせてもよいことは認められよう（例えば、ヒータユニットはペルチェ素子を含み、ペルチェ素子の前側及び／又は裏側に抵抗ヒータを備えて、固定温度の維持を促進すること及び／又は加熱と冷却の効率と速度を増大させることができる）。「ヒータ」という用語は要素１２８６及び１２８７を指すために使用されるが、他の温度制御要素又は要素の組み合わせを用いてサンプルの温度を調整できることは理解されよう。ＰＣＲデバイスに典型的に含まれ、アニーリング温度と変性温度との間の熱サイクリングのため提供されるヒータとは異なり、ヒータ１２８７及びヒータ１２８６は固定温度に保持されるか、又は限定された温度範囲内で（例えばアニーリング温度と延伸温度との間で）熱サイクルさせることができる。例えば、図２５から図２７Ｄを参照して上記で詳しく説明したように、液体充填ブリスタの内容物を２つの静的温度ゾーン間で移動させることによってサンプルを熱サイクルさせることができる。一例において、ヒータ１２８７は例示的に９４℃である適切な変性温度で提供され、ヒータ１２８６は例示的に６０℃である適切なアニーリング温度で提供され得るが、当技術分野において既知のように他の例示的な変性温度及びアニーリング温度も使用できる。また、特定のプロトコルでは３つ以上のヒータが望ましい場合がある。
[00399] 一実施形態において、ヒータ１２８６及び１２８７の一方又は双方はペルチェ素子を含み得る。ヒータ１２８６及び１２８７は熱サイクルさせないことがあるが、例えば、ヒータ１２８６及び１２８７の一方又は双方にペルチェ素子を含ませることが望ましい場合がある。典型的な抵抗ヒータとは異なり、ペルチェ素子はサンプルを能動的に加熱すると共に冷却することができる。例えばサンプルを変性温度（例えば９４℃）からアニーリング温度（例えば６０℃）にする場合、サンプルをアニーリング温度まで冷却しなければならない。これは放射／伝導によって発生するが、これらのプロセスは比較的遅い。迅速な熱サイクリングのため、例えばペルチェ素子によってサンプルを能動的に冷却し、ペルチェの「冷たい」側を６０度に設定すると共に、余分な熱が例示的にヒートシンクを介してポンプされ廃棄される「熱い」側をより高い温度に設定することが好ましい場合がある。
[00400] 器具１２００はコンピュータ１２９９も含み、これは、ワイパ１１００、ヒータ１２８６及び１２８７、熱サイクリングパラメータ（例えばワイパの移動、ヒータの温度、ワイパ及びヒータとサンプル容器とのアライメント等）のうち１つ以上、サンプル容器内の流体移動等を制御するように構成できる。同様にコンピュータ１２９９は、例えば光学システム１２５０からのような器具１２００からのデータ収集及び解析のために構成できる。これらのコンポーネントの各々は、例示的にケーブル１２９１を介して電気的に接続されているが、他の物理的接続又は無線接続も本発明の範囲内である。コンピュータ１２９９は、器具１２００内に収容されているか、又は器具１２００の外部にあり得ることは理解されよう。更にコンピュータ１２９９は、コンポーネントのいくつか又は全てを制御する内蔵回路基板を含むことができ、また、器具１２００からデータを受信し表示するデスクトップ又はラップトップＰＣのような外部コンピュータも含み得る。例示的に、温度やサイクル時間等の情報及び変数を入力するためのキーを含むキーボードインタフェースのようなインタフェースを提供することができる。例示的に、ディスプレイも提供できる。ディスプレイは例えば、ＬＥＤ、ＬＣＤ、又は他のそのようなディスプレイとすればよい。
[00401] 本明細書に記載されているパウチのいくつかの実施形態（例えば図１１Ａ及び図１１Ｂを参照のこと）に含まれるブリスタは、一実施形態において脱水試薬ピルを含み、これは再水和させてからパウチ内の様々な反応ゾーンに分配することができる。図２９Ａに、試薬ピル２２０５５及び再水和流体（例えば水や緩衝剤等）２２０５８を含むブリスタ２２０４５の一例が示されている。一実施形態において、試薬ピル２２０５５は、ブリスタ２２０４５に水和流体２２０５８が加えられるとほぼ即座に分散することができる。従って、図２９Ａの図は概略的なものに過ぎず、ピル２２０５５は、水和流体２２０５８が加えられた後は長い時間量にわたって図示のように維持されるようには構成されない場合があることは理解されよう。別の実施形態では、２２０４５のようなパウチブリスタは液体試薬（例えばポリメラーゼやｄＮＴＰ等）を含むことができ、パウチで使用される少なくともいくつかの反応成分では２２０５５のような試薬ピルは省略され得る。
[00402] いずれのパウチ実施形態においても、図７、図１１Ａ、及び図１１Ｂに示されているもののようなパウチを動作させるよう構成された器具は、図２９Ａに示されているブリスタ２２０４５のような液体充填ブリスタから液体を予測可能に、かつ好ましくは体積に基づいて（volumetrically）分配するための１又は複数のデバイスを含み得る。一実施形態では、ブリスタ２２０４５のような液体充填ブリスタを、図２９Ｂのクラッシャ２２０００によって押しつぶすか、折り畳むか、又は圧縮することができる。一実施形態において、ブリスタは、２２０４６で示されるように押しつぶされた場合に折り畳まれて流体を予測可能に、かつ好ましくは体積に基づいて分配するような大きさ及び形状とすることができる。同様に、クラッシャ２２０００は、流体充填ブリスタ内の流体を予測可能に、かつ、好ましくは体積に基づいて分配するような大きさ及び形状とすることができる。
[00403] 一実施形態において、クラッシャ２２０００を含む器具は、クラッシャ２２０００をパウチに対して移動させて、選択した時に選択したブリスタから選択した流体を分配できるように構成され得る。同様に、クラッシャ２２０００は上下に移動することで選択したブリスタを押しつぶすよう構成され、クラッシャに対してパウチを移動させて、選択した時に選択したブリスタから流体を分配できるようにする。図２２は、例えば、一直線に位置決めされた一連のブリスタから流体を分配するために使用できるクラッシャホイール２２０１０の例示的な実施形態を示す。図示されている実施形態では、図２９Ｃのクラッシャホイール２２０１０はクラッシャ２２０２０ａ～２２０２０ｄを含み、ホイールが回転した場合にこれらを用いて一連の離間したブリスタを押しつぶすことができる。例えば、ブリスタ２２０４６ａはクラッシャ２２０２０ａの作用によって押しつぶされ、ホイール２２０１０が回転した場合にブリスタ２２０４５ｂを押しつぶせるようにクラッシャ２２０２０ｂはブリスタ２２０４５ｂに対して離間されている。ホイール２２０１０は４つの等しく離間したクラッシャについて例示的な間隔が図示されているが、クラッシャホイールがこれよりも多数又は少数のクラッシャを含み得ること、及び、選択されたパウチ上の多種多様な１又は複数の間隔のブリスタの流体内容物を分配するために間隔を調整できることは認められよう。
[00404] 本明細書に記載されているパウチと共に使用できる器具の更なる検討及び実施形態は、例えば、本明細書の他の箇所で援用により全体を本願に含めたＰＣＴ／ＵＳ１７／１８７４８号で見ることができる。
[00405] 以下に、本明細書に記載されているもののようなパウチ及び器具を用いて実行した実験の実施例を提示する。実施例は概して、本明細書に記載さているパウチ及び器具のうち１つ以上の有用性を示す。しかしながら、実施例は例示であり、本明細書に記載されている１又は複数の発明の範囲を限定又は変更することは意図されない。
[00406] 実施例１：高密度ＰＣＲ
[00407] １つの実施例において、一般的な呼吸器系ウイルスのための標準的な市販用の免疫蛍光アッセイは７のウイルスを検出できることが知られている。すなわち、アデノウイルス、ＰＩＶ１、ＰＩＶ２、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、インフルエンザＡ型、及びインフルエンザＢ型である。更に完全なパネルは、例えば、コロナウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス、ライノウイルス、及び非ＨＲＶエンテロウイルスを含む他のウイルス用のアッセイを含む。アデノウイルス又はＨＲＶのような極めて変異性のウイルス（variable virus）では、ウイルス系統の全ての分枝を標的にするため、複数のプライマーを用いることが望ましい（例えば、それぞれ４の外側プライマーセット及び４の内側プライマーセット）。コロナウイルスのような他のウイルスでは、時期によって変動しない４の別々の系統（２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１）があるが、それらは、別個のプライマーセットを必要とするほど充分に分岐している。FilmArray（登録商標）呼吸器パネル（BioFire Diagnostics, LLC、ユタ州ソルトレークシティ）は、アデノウイルス、コロナウイルスＨＫＵ１、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３、ヒトメタ肺炎ウイルス、ヒトライノウイルス／エンテロウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエンザＡ／Ｈ１型、インフルエンザＡ／Ｈ３型、インフルエンザＡ／Ｈ１－２００９型、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、及び呼吸器合胞体ウイルスを含む。これらのウイルスに加えて、FilmArray（登録商標）呼吸器系パネルは３つの細菌、すなわち百日咳菌、肺炎クラミドフィラ（Chlamydophila pneumoniae）、マイコプラズマ肺炎を含む。高密度アレイ５８１は、そのようなパネルを単一のパウチ５１０内に収容できる。他のパネルもFilmArray（登録商標）で利用することができ、それぞれが少なくとも２０の病原体をアッセイする。
[00408] 実施例２：高速ＰＣＲ
[00409] 図２５から図２７Ｄのパウチ及びヒータ構成を用いたプロトタイプの器具を用いてＤＮＡを増幅した。７５μｌのサンプルは、１１０ｂｐ合成ＤＮＡ分子の１０，０００のコピーを含み、（すでに援用により本願に含めたＵＳ２０１５－０１１８７１５号で教示されているような標準的なＰＣＲ濃度と比較して）１０ｘ倍高いプライマー（各プライマー５μＭ）及びＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）濃度、並びに、０．４５ｍＭのｄＮＴＰ及び５ｍＭのＭｇ＋＋を用いた。検出には１ＸのLCGreenを使用した。反応混合物は単なる例示であることは理解されよう。サイクル時間に応じて、プライマー及びポリメラーゼ濃度の増大が有益であり得る。プライマー及びポリメラーゼ濃度の増大に関する更なる情報については、すでに援用により本願に含めた米国特許出願第２０１５－０１１８７１５号を参照のこと。例えば２０秒未満のサイクル時間では、少なくとも０．５μＭのポリメラーゼと、マルチプレックス反応における少なくとも１μＭの各プライマー、又はシングルプレックス反応における２μＭの各プライマーを有することが望ましい。ヒータ９８６を９０℃に設定し、ヒータ９８７を５７℃に設定した。この混合物をブリスタ５４９内に密封し、ワイパ９８９を１０秒に１回転の速度で回転させて実行した。回転速度はサイクル時間に対応することは理解されよう。
[00410] 対照として、ＰＣＲ化学反応物（プライマー及びポリメラーゼ濃度の増大を用いる）を、標準的なブロックサーモサイクラーにおいて、ハードウェアが許す限り高速で９６℃と６０℃との間で循環させた（１秒ホールド、１サイクル当たり４８秒）。２つのシステムにおける増幅の効率を比較するため、各器具において、５、１０、１５、及び２０サイクルの「サイクルコース」にわたって同一のＰＣＲ反応物を増幅させた。第１段階ＰＣＲの後、Roche LC480リアルタイムＰＣＲ器具において、これらの反応物をネスト化第２段階ＰＣＲ反応物内で１００倍に希釈し増幅した。
[00411] 図３０及び図３１は、図２５から図２７Ｄのプロトタイプの器具におけるＰＣＲの結果を示す。図３０では、様々な速度のワイパシステムにおける第１段階反応の融解曲線が、ＬＣ４８０における増幅の融解曲線と比較される。図３１はサイクルコースの結果を示す。図２５から図２７Ｄのプロトタイプ及びＬＣ４８０ブロックサーモサイクラーにおける増幅は重複し、Ｒ２値＞０．９９のラインによって適合される。図３１において、これらのラインの勾配は、プロトタイプの１サイクルと比較したＬＣ４８０の１サイクルの相対的な効率を示す。ブロックサイクラーの効率（１．０８の勾配）は、約３分２０秒で、ブロックサーモサイクラーの全効率よりもわずかに低いことを示すワイパブレードシステム（０．９３）よりもわずかに高い。
[00412] 実施例３：２つの温度ゾーンを用いた３温度ＰＣＲ
[00413] 上記で検討したように、いくつかのＰＣＲプロトコルは３つの温度を使用する。すなわち、アニーリングのための第１の温度、例示的に酵素活性に基づいて選択される伸長のための多少高い温度、及び変性のための第３の最も高い温度である。これら３つの温度のために１つのヒータを熱サイクルさせることが通例であるが、いくつかの実施形態では、より大きい体積を迅速に熱サイクルさせることが望ましい場合がある。例えば、第１段階ＰＣＲを３つの温度に熱サイクルさせることが望ましいことがあるが、この場合、ヒータアセンブリ９８８のようなヒータは望まれるほど迅速にブリスタ５６４の内容物を加熱及び冷却しない可能性がある。
[00414] １つのそのような実施形態では、図１のパウチ５１０における第１段階ＰＣＲに３ステップＰＣＲプロトコルを使用することが望ましい場合がある。上記で検討したように、図２の第１段階ヒータ８８６は、第１段階ＰＣＲ用のブリスタ５６４の内容物を加熱及び冷却するように位置決めされている。一実施形態において、ヒータ８８７はブリスタ５４８の内容物の温度を制御するよう提供することができ、ヒータ８８６及び８８７は一緒に制御すると共に一緒に循環させることができる。別の実施形態では、ヒータ８８６及び８８７は別個の制御のもとに置くことができ、例示的にヒータ８８７は適切なアニーリング温度を維持するよう提供され、ブリスタ８８６は適切な変性温度を維持するよう提供され得るが、これが単なる例示であり、これらのヒータを逆にしてもよいことは理解されよう。他の構成も可能である。２つの加熱ゾーンを用いる２温度ＰＣＲについては、援用により全体が本願に含まれる米国特許出願第２０１４－００３８２７２号で更に充分に検討されている。
[00415] 一実施形態では、ヒータ８８７、８８８及び本明細書で検討されている他のヒータのために、ペルチェヒータ又は米国特許出願第１５／０９９，７２１号に開示されているもののようなヒータを使用できるが、ヒータの温度が調整できるならば、当技術分野において既知の他のヒータ又はヒータアセンブリを用いて２つの温度ゾーンにおける３温度循環を得ることも可能である。一実施形態では、これらのヒータの能動的な制御が望ましい。
[00416] 図３２に一例が示されている。図３２において点線はサンプルの温度を示す。この例では、ヒータ８８７がアニーリング温度のために使用され、ヒータ８８７の温度は例示的に６０℃である所望のアニーリング温度に設定され得るが、この温度が単なる例示であり、プライマーの長さ及びＧＣ含量に応じて他のアニーリング温度を使用できることは理解されよう。サンプルをブリスタ５４８内に移動させた場合、サンプル全体がアニーリング温度に達するまでサンプルはブリスタ５４８内に保持され得る。いくつかの例示的なプロトコルでは、サンプルがアニーリング温度に達した後のある時間期間にわたってサンプルをブリスタ５４８内に保持することが望ましい場合がある。別の例示的な実施形態では、図３２に破線で示されているように、ヒータ８８７は、アニーリング温度よりも数度低い、例えばアニーリング温度よりも２～２０度低い温度に、例えば５５℃に保持することができる（「低アニーリング温度」）が、他の温度も適切であり得る。ヒータ８８６の制御下にあって実質的にアニーリング温度よりも高温であるブリスタ５６４からサンプルを移動させた場合、ヒータ８８７はアニーリング温度未満であるので、サンプルをいっそう迅速にアニーリング温度まで冷却することができる。任意選択的に、袋８４８の動きによりブリスタ５４８内の流体サンプルを混合して、ブリスタ５４８内の温度をいっそう均一にしてもよい。実質的に全ての流体がアニーリング温度であるか又はほぼアニーリング温度である時間長にわたってサンプル流体がブリスタ５４８内に置かれたら、図３２に破線（－－）で示すようにヒータ８８７をアニーリング温度に調整することができる。例示的に２秒～５秒のホールドによって適正なアニーリングが可能となるが、使用される化学物質に応じてホールドは不必要であることもある。次いでサンプルをブリスタ５６４に移動させればよい。図３２に示されているように、一度サンプルがブリスタ５４８を出たら、ヒータ８８７の温度を再び低アニーリング温度に調整して、次のサイクルの準備をすればよい。多くのヒータは加熱よりも冷却の方が時間を要し得るが、ブリスタ５４６が空であると共にヒータ８８７の熱負荷が最小である場合はヒータ８８７を冷却する方が速くなり得ることは理解されよう。
[00417] 一例においては、例えば７２℃である適切な伸長温度が選択されるが、アンプリコン長、ＧＣ含量、及びポリメラーゼの選択に応じて、他の伸長温度が適切である可能性もある。図３２の実線（――）で示すように、サンプルがブリスタ５４８内にある間に、ヒータ８８６を、伸長温度よりも数度高い、例示的に伸長温度よりも２～１０度高い温度（「高伸長温度」）に調整することができる。実質的に全ての流体が伸長温度であるか又はほぼ伸長温度である時間長にわたってサンプル流体がブリスタ５６４内に置かれたら、図３２に実線で示すようにヒータ８８７を高伸長温度から伸長温度に調整することができる。ブリスタ５４８について上記で検討したように、袋８６４の任意選択的な動きによりブリスタ５６４内の流体サンプルを混合して、ブリスタ５６４内の温度をいっそう均一にしてもよい。プロトコルに応じて、例示的に０秒～５秒のホールドによって適正な伸長を可能とする。このホールドの後、ヒータ８８６を変性温度に又は変性温度よりも数度高い温度に調整して核酸を変性することができる。ヒータ８８６を変性温度よりも高い温度に調整した場合、流体サンプルがいっそう迅速に変性に到達し得ることは理解されよう。この場合も、袋８６４の任意選択的な動きによりブリスタ５６４内の流体サンプルを混合して、ブリスタ５６４内の温度をいっそう均一にしてもよい。一度サンプルが変性したら、任意選択的に変性温度でホールドを行うか又は行うことなく、サンプルをブリスタ５４８に戻し、ヒータ８８６の温度を高伸長温度に調整することができる。これは、ブリスタ５６４内にサンプルが存在しない状態では高い効率で達成できる。このサイクルを増幅のために充分な回数だけ繰り返す。これが第１段階ＰＣＲであれば、標的の濃縮のために充分なサイクル数を減らすことが望ましい場合があるが、これが第２段階であるか又は単一段階であれば、分裂停止期（plateau phase）まで又は分裂停止期を過ぎるまで熱サイクルさせることが望ましい場合があることは理解されよう。
[00418] 例示的に１サイクル当たり２０秒又はそれ以上の標準的なＰＣＲサイクリングプロトコルで、標準的なＰＣＲ化学物質を用いて３温度循環を実行することができる。所望の場合、援用により本願に含まれる米国特許公報第２０１５－０１１８７１５号に開示されているように、高濃度のポリメラーゼ又はプライマーを用いた極端なＰＣＲ化学物質を追加し、より高速な熱サイクリングプロトコルを用いてもよい。サイクル時間を短縮しない限り、高濃度のポリメラーゼ又はプライマーによってプライマーダイマー及び他の非特異的増幅生成物が増大して形成され得ること、また、使用するポリメラーゼ又はプライマーの濃度が高くなればなるほどサイクル時間が高速になることは理解されよう。ポリメラーゼ及びプライマーの増大は、サイクル時間の短縮と概ね比例し得る。１０秒以下のサイクル時間が可能でなければならない。
[00419] 実施例４：高速マルチプレックスＰＣＲ
[00420] 図２５から図２７Ｄのものと同様のパウチ及びヒータ構成を用いたプロトタイプの器具を、サンプルにおけるＤＮＡのマルチプレックス増幅のために用いた。テンプレートは天然及び合成のテンプレートの混合物であった。テンプレートは、長さが１０５ｂｐの合成アンプリコン（「メフィスト（mephisto）」と呼ぶ）、長さが１６４ｂｐの合成アンプリコン（「バール３（Ｂａａｌ３）」と呼ぶ）、Ｓ．セレヴィシエ配列（天然の、長さが３６４ｂｐのアンプリコンであり、内部で「ビール（beer）」と呼ぶ）、Ｍ１３（天然の、長さが２６４ｂｐのアンプリコン）、及びＭＳ２（天然の、長さが３０９ｂｐのアンプリコン）であった。各テンプレートの１０００のコピー、各テンプレートに特有のフォワード及びリバースプライマー（各プライマー５μＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）、０．４５ｍＭのｄＮＴＰ、及び５ｍＭのＭｇ＋＋を含む、１５０μｌ及び７５μｌのサンプルを調製した。検出には１ＸのLCGreenを使用した。反応混合物は単なる例示であり、他の混合物を使用できることは理解されよう。これらの混合物の１５０μｌ及び７５μｌのアリコートをブリスタ（例えばブリスタ５４９）内に密封した。１５０μｌ反応では、第１のヒータ（例えばヒータ９８６）を１０３℃に設定し、第２のヒータ（例えばヒータ９８７）を５５℃に設定した。７５μｌ反応では、第１のヒータ（例えばヒータ９８６）を１０２℃に設定し、第２のヒータ（例えばヒータ９８７）を５５℃に設定した。これらの反応物を、例えば図２５から図２７Ｄに記載されている手順に従って熱サイクルさせた。１又は複数のワイパブレード９４９をブリスタに接触させ、ワイパヘッド９８９を８秒に１回転の速度で回転させた（例えば、１８０度回転させ、４秒間ホールドし、１８０度回転させ、４秒間ホールドする等、又は、９０度回転させ、２秒間ホールドし、９０度回転させ、２秒間ホールドする等のサイクル。回転時間は無視できる）。回転速度はサイクル時間に相当し、１回転は１サイクルを表すことは理解されよう。また、この例では各４分の１回転の後のホールドを用いるが、これは単なる例示であり、連続的な回転も想定される。第１段階ＰＣＲの後、Roche LC480リアルタイムＰＣＲ器具において、これらの反応をネスト化第２段階ＰＣＲ反応内で１００倍に希釈し増幅した。
[00421] 図３３は、第２段階ＰＣＲにおける融解実験の結果を示し、第１段階ＰＣＲ反応の全てが成功であったことを示している。テンプレートは全て第１段階ＰＣＲ及び第２段階ＰＣＲにおいて増幅され、生成物は全てそれらの予想温度で融解した。これは、プロトタイプのシステムをマルチプレックス第１段階ＰＣＲに使用できることを実証している。
[00422] 実施例５：高速ＰＣＲ
[00423] この実施例では、標準的なＰＣＲプロトコルに従って、ＬＣ４８０器具において合成ＤＮＡテンプレート（メフィスト）を第１段階ＰＣＲのために増幅した。第１段階反応からの増幅生成物を、第２段階増幅混合物（例えば特有のフォワード及びリバースプライマー（各プライマー５μＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）、０．４５ｍＭのｄＮＴＰ、５ｍＭのＭｇ＋＋、及び検出用の１ＸのLC Green）を用いて１：１００に希釈し、図５Ａのアレイ５０８１又は図６Ａのアレイ６０００と同様の５ウェルアレイに注入した。アレイの各ウェルの体積は約０．５μＬである。図２８Ａから図２８Ｂに示されている器具と同様のプロトタイプの器具において、サンプルを第２段階ＰＣＲのために熱サイクルさせた。ヒータアセンブリ１２７０と同様の２要素ヒータを使用し、第１のヒータを９６℃に設定すると共に第２のヒータを６０℃に設定して、アレイを熱サイクルさせた。アレイが第１のヒータの制御下に置かれ、第２のヒータの制御下に置かれ、再び第１のヒータの制御下に置かれるようにヒータを平行移動させることによって、アレイに第２段階ＰＣＲを実行した。第２段階ＰＣＲサンプルを含むアレイを、８秒／サイクル（９６℃で４秒、６０℃で４秒等）で、４０サイクル熱サイクルさせた。
[00424] 図３４及び図３５は第２段階ＰＣＲ反応の結果を示す。図３４はアレイの各ウェルにおける蛍光の変化をサイクル数の関数として示し、図３５はアレイの各ウェルにおけるＤＮＡ生成物（存在する場合）の融解曲線を示す。図３４及び図３５は、反応がアレイのウェル１において最も成功であったこと（図３４）と、生成物がメフィスト生成物において予想温度の融解遷移を有したこと（図３５）を示している。この実施例は、２温度ヒータによって第２段階ＰＣＲの実行を首尾よく実行できることを示しており、ヒータアセンブリをアレイに対して移動させることで、ヒータはアレイを温度間で遷移させることができる。熱サイクリングを達成するには、例えば、サンプル容器又は器具内にサンプル容器を位置決めするレセプタクルを横方向に平行移動させることで、ヒータ要素に対してアレイを移動させてもよいことは認められよう。
[00425] 実施例６：高速第１段階及び第２段階ＰＣＲ
[00426] この実施例では、図５Ａに示されているパウチ５０００と同様の反応容器において、合成ＤＮＡテンプレート（メフィスト）を第１段階ＰＣＲ及び第２段階ＰＣＲのために増幅させた。第１段階ＰＣＲでは、テンプレートＤＮＡの～７５，０００のコピー、テンプレートに特有のフォワード及びリバースプライマー（各プライマー５μＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）、０．４５ｍＭのｄＮＴＰ、及び５ｍＭのＭｇ＋＋を組み合わせ、第１段階ＰＣＲ反応用のブリスタ（例えばブリスタ５０１０）に７５μＬを注入して密封した。この反応容器を、ＰＣＲ増幅のため器具１２００と同様の器具に配置した。
[00427] 第１段階ＰＣＲでは、第１のヒータ（例えばヒータ１２８７）を５８℃に設定し、第２のヒータ（例えばヒータ１２８６）を１０６℃に設定した。反応ブリスタの約半分の温度を第１のヒータによって制御すると共に残りの半分の温度を第２のヒータによって制御することができるように、ヒータアセンブリ（例えばヒータアセンブリ１２７０）を位置決めした。反応ブリスタの内容物を、例えば図２５から図２７Ｄに記載されている手順に従って器具内で熱サイクルさせた。１又は複数のワイパブレード（例えばワイパブレード９４９と同様）をブリスタに接触させ、ワイパヘッド（例えばワイパヘッド１１００）を８秒に１回転の速度で回転させた（例えば、９０度回転させ、２秒間ホールドし、９０度回転させ、２秒間ホールドする等のサイクル）。回転速度はサイクル時間に相当し、１回転は１サイクルと同等であることは理解されよう。
[00428] 第１段階ＰＣＲ反応ブリスタ（例えばブリスタ５０１０）における第１段階ＰＣＲの２０サイクルの後、第１段階ＰＣＲ反応物の一部（例えば～１μＬ）を体積ウェル（例えば体積ウェル５０１５）に移し、パウチのより大きい２つの体積ブリスタ（例えばブリスタ５０２０及び５０２５）間で混合することによって、第２段階ＰＣＲ試薬（ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μＬ）、０．４５ｍＭのｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇ＋＋、及び検出用の１ＸのLCGreen）と混合した。体積ウェルの体積を変更することによって、又は、第１段階ＰＣＲからのサンプルに加える希釈試薬（例示的に、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び適切な緩衝剤であるが、特に非ＰＣＲ増幅方法では他の成分も適切であり得る）の体積を変更することによって、希釈レベルを調整できることは理解されよう。所望の場合、サンプルと第２段階ＰＣＲマスター混合物のこの混合物を、第２段階増幅のため第２段階アレイへ移動させる前に体積ウェル５０１５並びにブリスタ５０２０及び５０２５内で予熱してもよい。このような予熱及びマスター混合物からのプライマーの分離は、第２段階ＰＣＲ混合物におけるホットスタート成分（抗体、化学物質、又は他のもの）の必要性をなくすことができる。
[00429] 例えば体積ウェル５０１５並びにブリスタ５０２０及び５０２５において第２段階ＰＣＲ用のサンプルを調製した後、サンプルを第２段階ＰＣＲのためのアレイ５０８１と同様のアレイに移動させることができる。アレイの各ウェルには特有のフォワード及びリバースＰＣＲプライマーが予め投入されている。プライマーをアレイのウェル内に２．５μＭ又は５μＭのいずれかでスポットした。アレイのウェルは、アレイを第２段階ＰＣＲマスター混合物であふれさせることによって充填される。アレイ上で透明な可撓性の袋を膨張させて充填チャネルに対するアクセスを封鎖することにより、アレイのウェルを熱シール及び／又は密封することができる。アレイ上で透明な可撓性の袋を膨張させることにより、アレイから余分な第２段階ＰＣＲマスター混合物をパージすることも可能である。この場合、透明な可撓性の袋は約２０ｐｓｉの圧力に膨張させた。第２段階ＰＣＲの熱サイクリングを実行するため、アレイの下方でヒータアセンブリ１２７０を平行移動で往復させて、アレイ及び各ウェルの内容物を第２のヒータ（例えば変性のためのヒータ１２８６）の温度制御下に置き、次いで第１のヒータ（例えばアニーリング及び延伸のためのヒータ１２８７）の温度制御下に置き、次いで再び第２のヒータ（変性のため）に置く等とすることができる。この実施例では、第２のヒータを１０２℃に設定すると共に第２のヒータの２秒間のホールドを実行し、第１のヒータを６５℃に設定すると共に６秒間のホールドを実行した。第２段階の反応を合計で３０サイクル熱サイクルさせた。図２８Ａ及び図２８Ｂに示されているカメラ１２５０と同様のカメラを用いて、アレイにおける核酸増幅及びＤＮＡ融解を監視した。
[00430] 図３６から図３８は第２段階ＰＣＲ反応の結果を示す。図３６は、アレイのウェルにおける蛍光の増大をサイクル数の関数として示す。見てわかるように、アレイの全てのウェルでＤＮＡ増幅が発生した。同様に、各ウェルで増幅の同様の時間経過（例えばクロッシングポイント）が観察された。図３７及び図３８は、増幅されている生成物が正しい生成物であることを保証する融解実験の結果を示す。図３７は未処理の融解曲線であり、図３８は融解曲線の負の一次導関数（ｄＦ／ｄｔ）を示す。図３７及び図３８で見られるように、ウェルの全てにおける生成物は本質的に同一の温度において融解遷移を有する。ウェルの全てにおける融解遷移は約８４℃で発生し、これはこの特定の合成アンプリコンに予想された融解温度である。
[00431] 実施例７：第２段階ＰＣＲアレイにおける温度較正及び熱サイクリング速度
[00432] 次に図３９から図４２を参照すると、アレイ５０８１又はアレイ６０００と同様のアレイの１又は複数のウェルにおける流体の温度応答を試験するように設計された一連の実験の結果が示されている。これらの実験では、小さい熱電対をアレイの１つ以上のウェルに挿入し、フィルム層の間に密封した。熱サイクリングのため、アレイに水性ＰＣＲ緩衝剤を充填し、器具１２００と同様の器具に挿入し、ヒータアセンブリを平行運動で往復させて、アレイを第１のヒータの温度制御下に置き、第２のヒータの温度制御下に置き、再び第１のヒータの温度制御下に置く等とすることで、熱サイクリングを実行した。これらの実験では、器具内の透明な可撓性の袋をアレイ上で約２０ＰＳＩに膨張させた。これらの実験は、高温度ヒータ及び低温ヒータにおける異なる休止時間によるアレイ内の流体の温度応答を示す。説明されている実施例の休止時間にかかわらず、ヒータの（例えば高温から低温へ、又は低温から高温への）遷移時間は休止時間に対して迅速である。これらのデータ及び図示されていない他のデータを用いて、ヒータの設定点、各温度における休止時間、及びアレイと内部の流体の熱応答を含む温度モデルを開発し、これによってユーザは、様々なプライマーセットを用いた様々なテンプレートの熱サイクリング及び増幅のためにアレイ内の流体の高ターゲット温度と低ターゲット温度を信頼性高く設定することが可能となる。
[00433] 図３９に示されている実験では、ターゲット終点温度は９５℃と６２℃であった。ヒータを９８℃と６２℃に設定し、各温度ゾーンで４秒のホールド時間（すなわち休止時間）を用いた。ターゲット終点温度は９５℃と６２℃であった。この実験は比較的長いホールド時間を含むので、ヒータの設定点とターゲット温度は比較的近い。図３９で見られるように、これらのヒータ設定点、ホールド時間、及び本明細書の他の箇所で記載されている平行移動ヒータプロトコルを用いて、１又は複数のウェル内の流体（～０．５μＬ）を、～９５℃と～６２℃の間で熱サイクルさせることができた。
[00434] 図４０に示されている実験では、ヒータを９７℃と６２℃に設定し、各温度ゾーンで４秒のホールド時間を用いた。この実験で目的としたターゲット終点温度は９４℃と６２℃であった。図４０で見られるように、これらのヒータ設定点、ホールド時間、及び平行移動ヒータプロトコルを用いて、１又は複数のウェル内の流体（～０．５μＬ）を、～９４℃と～６３℃の間で熱サイクルさせることができた。
[00435] 図４１に示されている実験では、ヒータを９９℃と５６℃に設定し、各温度ゾーンで２秒のホールド時間を用いた。ターゲット終点温度は９６℃と６１℃であった。図４１で見られるように、これらのヒータ設定点、ホールド時間、及び平行移動ヒータプロトコルを用いて、１又は複数のウェル内の流体（～０．５μＬ）を、～９６℃と～６１℃の間で熱サイクルさせることができた。
[00436] 図４２に示されている実験では、ヒータを１０８℃と５２℃に設定し、各温度ゾーンで１秒のホールド時間を用いた。ターゲット終点温度は９５℃と６３℃であった。図４２で見られるように、１秒という短いホールド時間であっても、これらのヒータ設定点及び平行移動ヒータプロトコルを用いて、１又は複数のウェル内の流体（～０．５μＬ）を、～９５℃と～６３℃の間で熱サイクルさせることができた。例えば、上述の通り援用によって全体を本願に含めた米国特許公報第２０１５／０１１８７１５号及び米国特許公報第２０１６／０２８９７３６号に記載されているように、ポリメラーゼ及びプライマー濃度を上昇させた化学物質の調整により、ポリメラーゼ連鎖反応は、８秒、４秒、２秒、又はより短いサイクル時間に適合する速度で進行することができる。
[00437] 実施例８：単一の容器における溶解粒子及び核酸捕捉ビーズ
[00438] ここで図４５Ａから図４７Ｂを参照すると、一連の実験の結果が示されている。これらの実験は、ＰＣＲ増幅が、ＰＣＲ反応物におけるシリカでコーティングされた磁気ビーズ（すなわち核酸捕捉ビーズ）の存在と矛盾しないこと、予想外であったが、負に荷電されたケイ酸ジルコニウムビーズが明らかに核酸と結合すること、及び、シリカでコーティングされた磁気ビーズの存在下で溶解を実行することによって核酸捕捉効率が大幅に向上し得ることを示すために設計されたものである。
[00439] 第１の実験では、ＴＳＡプレート（仏国bioMerieux）上で黄色ブドウ球菌細胞を一晩成長させた。次いで、濃度計（仏国bioMerieux）を用いて、懸濁培地中にコロニーを加えることにより、較正済み細菌懸濁液（ＭＦ０．５）を得た。内部バイオバンクから、コロナウイルス株２２９Ｅウイルス懸濁液を得た（仏国Verniolles）。各病原体懸濁液１００μｌを加えることにより、８００μｌのサンプル緩衝剤中に黄色ブドウ球菌及びコロナウイルスを混ぜた（co-spike）（援用により本願に含まれる米国特許第９，７５８，８２０号を参照のこと）。使用した濃度は、黄色ブドウ球菌では１０５ＣＦＵ／ｍｌであり、コロナウイルスでは５ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。６００ｍｇのジルコニウムビーズ（米国Biospec Product）及び１．５ｍｇの磁気シリカ（仏国bioMerieux）を含む溶解ブリスタ内に各懸濁液を移した。援用により本願に含まれる米国特許出願第１５／７６９，０４４号に記載されているパドル溶解を用いて、機械的溶解を実行した。溶解の後、磁気シリカペレットを磁石（Quickpick（仏国Proteigene））で捕捉し、１４０μｌの洗浄緩衝剤を含むチューブに移した（米国特許第９，７５８，８２０号に記載されている）。洗浄緩衝剤を除去し、シリカペレットに１００μｌの第１段階ＰＣＲマスター混合物を加え、第１段階ＰＣＲ反応を実行した。第１段階ＰＣＲの完了後、第２段階ＰＣＲ反応をセットアップした。磁気シリカの存在に対するＰＣＲの効果を評価するため、溶出緩衝剤中で磁気シリカから溶出を行い、次いで溶出液に第１段階ＰＣＲマスター混合物を加えることにより、対照を実行した。
[00440] 図４５Ａから図４５Ｂは、磁気シリカの存在下で、及び溶出させた対照において、増幅が成功したことを示す。表１に示されているように、黄色ブドウ球菌では、磁気シリカの存在下でＰＣＲを実行すると約４サイクルの遅延が生じ、コロナウイルスでは、磁気シリカの存在下でＰＣＲを実行すると約５サイクルの遅延が生じた。
[00441] これらの実験によって、２つのみの容器で分子診断プロセスを実行できることが示される。そのうち１つの容器は標的の溶解と磁気シリカへの結合のためのものであり、第２の容器は洗浄ステップと磁気シリカで直接行われる増幅のためのものである。別個の溶出ステップは必要なく、また、増幅反応物から磁気シリカを隔絶及び分離する必要もない。
[00442] 第２の実験では、単一の容器におけるケイ酸ジルコニウムビーズを用いた溶解及び磁気シリカを用いた結合を、別々の容器における溶解及び結合と比較した。この実験の目的は、同一の混合物において溶解及び結合を実行する適合性（compatibility）を示すことである。
[00443] ＴＳＡプレート上で黄色ブドウ球菌細胞を一晩成長させてコロニーを形成した。濃度計（bioMerieux）を用いて、懸濁培地中にコロニーを加えることにより、較正済み細菌懸濁液（ＭＦ０．５）を得た。６００ｍｇのケイ酸ジルコニウムビーズと６００μｌのサンプル緩衝剤（ＳＢ１Ａ）を加えることで、６の溶解チューブを調製した。これらのチューブに１００μｌの細菌懸濁液を加えた。６の溶解チューブのうち３つに１．５ｍｇの磁気シリカを加え、残りの３つのチューブには磁気シリカを加えなかった。３０００ｒｐｍで５分間のボルテックスを用いて溶解を実行した。ジルコニウムと磁気シリカを含む溶解チューブでは、溶解の後、磁石を用いてシリカを洗浄緩衝剤中で移動させた。ジルコニウムビーズのみを含む溶解チューブでは、溶解の後、結合プロセスのため磁気シリカを加えた。次いで磁気シリカを洗浄緩衝剤中で移動させた。洗浄ステップの後、ビーズから核酸を溶出させ、溶出液に対して別々にＰＣＲ増幅を行った。
[00444] 図４６は、１つの容器における溶解及び結合（－■－）と、別々の容器における溶解及び結合（－▲－）について、ＰＣＲの平均的な結果を示す。これらの実験により、溶解のためのジルコニウムビーズと、核酸の結合及び捕捉のための磁気シリカとを含む容器において、溶解を実行できることが示される。驚くべきことに、また予想しなかったことに、同一の容器において溶解及び結合を実行する場合、２ＰＣＲサイクルの利得が観察される。
[00445] 第３の実験では、１つの反応ブリスタにおいてケイ酸ジルコニウムビーズ及び磁気シリカビーズの双方の存在下で行ったFilmArrayパウチ内での溶解を、溶解粒子なしの条件及びFilmArray対照と比較した。対照では、ケイ酸ジルコニウムの存在下で１つのFilmArrayブリスタ内で溶解を実行し、溶解後に溶解ブリスタに磁気ビーズを加える。溶解粒子なしのパウチでは、ビーズビーターバー（bead beater bar）を用いて溶解ブリスタを叩いた後に溶解ブリスタに磁気ビーズを加えるが、溶解粒子なしでパウチを製造した。実験条件では、溶解後に溶解ブリスタに磁気ビーズを加えるのではなく、溶解粒子と共に磁気ビーズを溶解ブリスタ内に配置してパウチを製造した。
[00446] サンプルは、ゲノムサケ精子ＤＮＡと大腸菌の混合物を含んだ。サケ精子ＤＮＡはフラグメント解析装置で分析した。フラグメント解析装置で見るため、ＤＮＡは高品質で存在する必要がある。大腸菌ＤＮＡは卓上ＰＣＲアッセイｎｅｕＣを用いて分析した。いずれの場合も、FilmArrayプロトコルを通常通り溶解、捕捉、洗浄によって実行し、次いで溶出後に終了した。いずれの場合も、溶出液をパウチから取り出し、２つの下流の分析装置に分割した。そのうち１つの体積分率をフラグメント解析装置（図４７Ａ）で処理し、他方の体積分率を卓上ＰＣＲ（図４７Ｂ）で処理した。
[00447] 図４７Ａでは、それぞれの場合で捕捉されたサケ精子ＤＮＡが溶液中の核酸の有効濃度として報告されている（ｎｇ／μｌ）。値が大きくなると溶液中のＤＮＡ量は多くなる。FilmArray対照では、３．６ｎｇ／μｌのサケ精子ＤＮＡの有効濃度が観察された。同一容器における溶解及び磁気ビーズの実験条件では、６．２ｎｇ／μｌの有効濃度が観察された。これは、サンプル調製と核酸抽出についてほぼ１．７倍の効率の増大を表している。図４７Ａは、実験条件の方が溶解粒子なしの対照よりも良好となり得ることを示している。これは、サケ精子ＤＮＡは磁気シリカビーズによって捕捉するために溶解する必要がないことを考慮すると、驚くべきことである。
[00448] 図４７Ｂは、３つの条件におけるＣｐ（すなわちアッセイが検出されたサイクル）を示す。図４６Ｂに示されているように、対照はＣｐが～２３．７５という最悪の結果を生じ、実験条件はＣｐが～２２．７５という最良の結果を生じ、溶解粒子なしの条件は中間であった。１Ｃｐのシフトは概ねＤＮＡの倍増を示すので、２３．７５の対照条件から２２．７５の試験条件になるとサンプル調製抽出は２倍に増大することが示される。これは、溶解中に磁気ビーズが存在しても良好な溶解及び核酸回収が得られることを示している。驚くべきことに、これらのデータは、ケイ酸ジルコニウムビーズが核酸と結合すること、溶解中に磁気ビーズが存在すると捕捉のためにケイ酸ジルコニウムと競合する（compete）こと、更に、結果として溶解中に磁気ビーズが存在すると核酸捕捉の効率が増大し、アッセイの感度と同一ＰＣＲサイクリング時間を増大させ得ることも示すようである。
実施例９：代替的な増幅方法における核酸捕捉ビーズ
[00449] ここで図４８から図５０を参照すると、援用によりすでに全体を本願に含めた米国特許第９，５８６，２０８号に記載されている器具と同様の器具における一連の実験の結果が示されている。米国特許第９，５８６，２０８号の一実施形態では、２つのヒータ間で流体充填ブリスタの内容物（例えば１５０～３００μｌ）を往復させて圧縮することにより、熱サイクリングを達成する。一方のヒータは例えば変性のため高い温度に設定し、第２のヒータは例えばアニーリングのため低い温度に設定する。典型的なサーモサイクラーは通常、３つ温度を使用する１つのヒータから構成され、より大きいサンプル体積を使用する。
[00450] ここで、より高速のサイクルを得るために、システムは、２つの固定ヒータ（それぞれ９２℃と５５～６０℃）によって２つの加熱ゾーンで小さいサンプル体積を移動させ循環させるように設計されている。この実施例におけるＤＮＡ標的の増幅は、変性のため９２℃で５秒間及びアニーリングのため５５℃で１０秒間のサイクルを４０サイクル実行した。当技術分野において既知のように、LC Green及び蛍光検出を用いてリアルタイムで増幅生成物を検出した。ＰＣＲの後、１００秒間にわたる温度ランプを用いて、アンプリコンのＤＮＡ融解の蛍光検出により、特異的な増幅生成物を同定した。
[00451] １０６ｇｅｑの入力と同等のＫＰＣ（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase）の純ＤＮＡ標的を、１．５ｍｇの磁気シリカビーズに結合させた。その後、磁気シリカビーズに結合したＤＮＡ標的を８０μＬのTrisHCL pH8.5に再懸濁し、次いで増幅のためＰＣＲマスター混合物と混合した。増幅では、シリカ磁気ビーズを磁石で隔絶するか、又は磁気シリカを増幅中に自由に混合させた。ここで、増幅中に磁気シリカビーズを隔絶しない場合に最良の結果が達成された。図４８に、この実験における増幅での蛍光の増大を示す。この実験のＣｐは約１８～１９であり、融解ピークはＫＰＣに特異的である（８６～８７℃）。
[00452] 図４９を参照すると、磁気シリカビーズの存在下での別の増幅実験における蛍光の増大が示されている。この実験では、溶解粒子及び磁気シリカビーズの存在下でＫＰＣ細胞を溶解した。ここに示されている例は、～５００，０００ＣＦＵのＫＰＣ細胞の入力に対応する。核酸を結合させた磁気シリカビーズを、第１の例と同様にサイクリング用の容器へ移した。増幅の前に、いくつか（プロトコルに応じて１～３）の洗浄ステップを用いて、ＰＣＲ反応を阻害する可能性のある残留溶解成分（例えばグアニジン）を除去した。洗浄後、磁気シリカビーズを８０μＬのTrisHCL pH8.5に再懸濁し、次いで増幅のためＰＣＲマスター混合物と混合した。図４９に、この実験における増幅での蛍光の増大を示す。この実験のＣｐは約２２～２４である。この実験におけるＣｐは図４８に対応する実験よりも遅かったが、第１の実験はＤＮＡを用いて実行されて溶解を必要としなかったが、この実験はＫＰＣ細胞を用いて実行されて溶解を必要とした点に留意することが重要である。
[00453] 第３の実験では、磁気シリカビーズが蛍光検出と干渉しないことが示された。図５０は、シリカなしの場合と磁気シリカビーズが存在する場合の相対的な蛍光を比較している。有意な差は見られなかった。しかしながら、より多いシリカ（例えば３ｍｇ）の存在下では、蛍光信号は測定されなかった（データは図示していない）。これはおそらく、シリカビーズがサンプルを通る光の透過を阻害するためである。
[00454] 本発明は、その精神又は本質的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形態で具現化することができる。記載される実施形態は、全ての点において限定でなく単なる例示と見なされるものとする。従って、本発明の範囲は前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲によって示される。本発明を説明する目的のため、本明細書及び添付の発明の開示において特定の実施形態及び詳細を含ませたが、添付の特許請求の範囲で規定される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される方法及び装置の様々な変更が実施できることは当業者には認められよう。特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内に該当する全ての変更は、それらの範囲内に包含されるものとする。

Claims (30)

  1. 閉鎖系においてサンプルに対する核酸増幅を実行するための容器であって、
    多機能チャンバを間に画定する第１の層及び第２の層を備え、
    前記容器には、サンプル調製、核酸回収、及び第１段階核酸増幅反応のための磁気粒子及び試薬が提供され、
    前記磁気粒子は、前記多機能チャンバに流体接続されているチャンバに提供されるか又は前記多機能チャンバに提供され、
    前記試薬は、前記多機能チャンバに流体接続されているチャンバに提供され、
    前記容器は更に、
    前記第１の層と前記第２の層との間に配置され、前記多機能チャンバに流体接続された第２段階反応ゾーンであって、前記第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応チャンバを含み、各第２段階反応チャンバは前記サンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、前記第２段階反応ゾーンは前記複数の第２段階反応チャンバの全ての同時熱サイクリングのために構成されている、第２段階反応ゾーンを備え、
    前記第１の層及び前記第２の層は、約０．０５ｇ／ｍ 2 ／２４時間～約２ｇ／ｍ 2 ／２４時間の範囲内の水蒸気透過率（ＷＶＴＲ）を有するバリアフィルムであり、
    前記磁気粒子及び前記試薬は、前記多機能チャンバと流体連通している１つ以上の流体充填試薬ブリスタに提供され、
    前記流体充填試薬ブリスタは、前記容器の製造時に充填される、容器。
  2. 前記多機能チャンバに細胞溶解成分及び前記磁気粒子が提供されている、請求項１に記載の容器。
  3. 前記細胞溶解成分は、溶解粒子又は溶解粒子を含む、請求項２に記載の容器。
  4. 前記容器は、前記多機能チャンバと流体連通しているサンプル溶解チャンバを更に含み、
    前記サンプル溶解チャンバに、溶解粒子を含む細胞溶解成分と、前記磁気粒子と、が提供され、
    前記多機能チャンバに磁気ビーズ洗浄成分及び第１段階核酸増幅成分が提供されている、請求項１に記載の容器。
  5. 前記サンプル溶解チャンバと前記多機能チャンバとの間に位置決めされたフィルタを更に備える、請求項４に記載の容器。
  6. 前記フィルタは、前記溶解粒子を保留すると共に前記磁気粒子を通過させるような大きさの多孔度を有する、請求項５に記載の容器。
  7. チャネルが前記サンプル溶解チャンバと前記多機能チャンバを接続し、
    前記フィルタは、前記第１の層と前記第２の層との間で前記チャネルと交差するように位置決めされている、請求項５に記載の容器。
  8. 前記フィルタは、前記チャネルよりも幅が広い、請求項７に記載の容器。
  9. チャネルが前記サンプル溶解チャンバと前記多機能チャンバとの間に延出し、
    前記フィルタは、前記サンプル溶解チャンバにおいて前記チャネルに隣接して位置付けられている、請求項５に記載の容器。
  10. 前記チャネルは、前記サンプル溶解チャンバよりも小さく、
    前記フィルタは、前記チャネルよりも幅が広い、請求項９に記載の容器。
  11. 前記磁気粒子は、核酸結合磁気粒子である、請求項１に記載の容器。
  12. 前記多機能チャンバと流体連通しているサンプル受容チャンバを更に含む、請求項１に記載の容器。
  13. 前記サンプル受容チャンバは、サンプル収集スワブを含む、請求項１２に記載の容器。
  14. 前記サンプル収集スワブは、細長い軸を含み、
    前記サンプル受容チャンバ及び前記スワブの前記細長い軸は、熱シールによって少なくとも部分的に融合させることができる化学的にコンパチブルな材料から製造される、請求項１３に記載の容器。
  15. 前記試薬ブリスタと前記多機能チャンバとの間に開放可能シールを更に含む、請求項１に記載の容器。
  16. 前記開放可能シールは、破裂可能シールである、請求項１５に記載の容器。
  17. 前記開放可能シールは、連結させたフィルムによるシールである、請求項１５に記載の容器。
  18. 材料の第１の層及び材料の第２の層であって、それらの間に空間が形成される、第１及び第２の層と、
    サンプル内に存在する細胞又は芽胞の溶解のために構成されたサンプル溶解チャンバと、
    前記サンプル溶解チャンバに流体接続された第１の反応チャンバであって、前記サンプル内に存在する核酸の第１段階増幅のために構成された、第１の反応チャンバと、
    前記第１の反応チャンバに流体接続された第２段階反応ゾーンであって、前記第２段階反応ゾーンは複数の第２段階反応ウェルを含み、各第２段階反応ウェルは前記サンプルの更なる増幅のために構成された１対のプライマーを含み、前記第２段階反応ゾーンは前記複数の第２段階反応ウェルの全ての同時熱サイクリングのために構成されている、第２段階反応ゾーンと、
    前記サンプル溶解チャンバ、前記第１の反応チャンバ、又は前記第２段階反応ゾーンのうち１つ以上に流体接続された複数の液体試薬ブリスタであって、製造時に前記液体試薬ブリスタ内に液体試薬が提供される、複数の液体試薬ブリスタと、を備え、
    前記第１の層及び／又は前記第２の層の少なくとも１つは、０．０１ｇ／ｍ２／２４時間～約３ｇ／ｍ２／２４時間の範囲内の水蒸気透過率（ＷＶＴＲ）を有するバリアフィルムを含む、自己完結型反応容器。
  19. 前記複数の液体試薬ブリスタのうちの１つは、前記サンプル溶解チャンバに接続されているとともに、製造時にサンプル溶解緩衝剤及びサンプル溶解要素を備えている、請求項１８に記載の自己完結型反応容器。
  20. 前記サンプル溶解要素は、溶解粒子、磁気ビーズ、及び溶解緩衝剤のうち１つ又は複数を含む、請求項１９に記載の自己完結型反応容器。
  21. 前記液体試薬ブリスタのうち１つの内部の液体試薬パックに、前記液体試薬のうち１つが提供されている、請求項１８に記載の自己完結型反応容器。
  22. 前記液体試薬パックは、前記第１の層と前記第２の層との間に密封されたある体積の液体を含む、請求項２１に記載の自己完結型反応容器。
  23. 前記第１の層又は前記第２の層のうち他方もまた、バリアフィルムを含む、請求項２２に記載の自己完結型反応容器。
  24. 前記液体試薬ブリスタ内に配置された前記液体試薬と、前記サンプル溶解チャンバ、前記第１の反応チャンバ、又は前記第２段階反応ゾーンのうち１つ以上と、の間に開放可能シールを更に含む、請求項１８に記載の自己完結型反応容器。
  25. 前記開放可能シールは、破裂可能シールである、請求項２４に記載の自己完結型反応容器。
  26. 前記開放可能シールは、連結させたフィルムによるシールである、請求項２４に記載の自己完結型反応容器。
  27. 前記サンプル溶解チャンバと流体連通しているサンプル受容チャンバを更に含む、請求項１８に記載の自己完結型反応容器。
  28. 前記サンプル受容チャンバは、サンプル収集スワブを含む、請求項２７に記載の自己完結型反応容器。
  29. 前記サンプル溶解チャンバは、溶解させたサンプルから磁気ビーズとともに核酸を回収するようにさらに構成され、
    １つ又は複数のチャンバは、前記磁気ビーズの収集、洗浄、前記磁気ビーズからの核酸の溶出、のためのものであり、
    前記１つ又は複数のブリスタは、前記サンプル溶解チャンバと前記第１の反応チャンバの間にあり両者に流体接続されている、請求項１８に記載の自己完結型反応容器。
  30. 前記第１の反応チャンバからの増幅生成物を希釈するために構成された希釈ウェルをさらに備え、
    前記希釈ウェルは、前記第１の反応チャンバと前記第２段階反応ゾーンの間に配置される、請求項１８に記載の自己完結型反応容器。
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